專利名稱：抑制細(xì)胞增殖和手術(shù)粘連的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能抑制和/或防止手術(shù)過(guò)程中形成的細(xì)胞增殖和粘連的方法和組合物。
背景技術(shù)：
美國(guó)大約實(shí)施過(guò)180萬(wàn)的腹部外科手術(shù)，在接受過(guò)腹部外科手術(shù)的所有患者中， 67-93%的患者出現(xiàn)術(shù)后粘連現(xiàn)象。美國(guó)每年花費(fèi)在去除腹部粘連上的費(fèi)用超過(guò)了 20億美金。全球所有手術(shù)治療分布如下；腰部手術(shù)(800，000)，肌腱/神經(jīng)手術(shù)(500，000)，腹部手術(shù)(2，000，000)，骨盆手術(shù)(2，600，000)，移植手術(shù)(2，000，000)，心臟手術(shù)(2，000，000)。 以上所有這些外科手術(shù)都會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的粘連。雖然粘連現(xiàn)象在一些手術(shù)中是不可避免的， 但良好的手術(shù)操作技術(shù)可以盡可能減少粘連的情況下最大可能取得手術(shù)成功。器官或組織通過(guò)瘢痕組織相互粘連在一起，引發(fā)各種臨床問(wèn)題。而瘢痕組織的形成是正常愈合過(guò)程的一部分，也是傷口良好愈合所必須的過(guò)程，在一些情況下，瘢痕組織在愈傷區(qū)域過(guò)度生長(zhǎng)從而引發(fā)粘連。這種粘連的形成限制了身體受累部位的正常移動(dòng)和功能，從而稱為外科手術(shù)并發(fā)癥。粘連可以導(dǎo)致疼痛有時(shí)甚至是致命的，并會(huì)導(dǎo)致身體各器官的功能喪失。手術(shù)損失造成的創(chuàng)傷，會(huì)使器官或組織之間通過(guò)瘢痕組織形成有害的附著。這種外科手術(shù)粘連，又會(huì)引發(fā)患者的疼痛、功能缺陷、腸梗阻、女性不孕和長(zhǎng)期復(fù)雜的再次手術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及能抑制和/或防止手術(shù)過(guò)程中形成的細(xì)胞增殖和粘連的組合物和方法。所述組合物可以包括陰離子單體或聚合物和能防止血小板活化和/或血小板聚集的化合物(比如，抗血小板劑)。在本發(fā)明一個(gè)方面，所述抗血小板劑可以和所述陰離子單體或聚合物共價(jià)連接以形成綴合化合物。該綴合化合物能與半固態(tài)載體如GELF0AM相混合，從而形成用于植入手術(shù)部位的裝置。在本發(fā)明另外一個(gè)方面，所述陰離子單體/聚合物和抗血小板劑可以在陰離子聚合物/單體和抗血小板劑之間無(wú)共價(jià)連接的情況下存在于制劑中。本發(fā)明還涉及利用所述組合物來(lái)抑制導(dǎo)致纖維化和伴隨并發(fā)癥(如瘢痕形成和手術(shù)粘連)的侵潤(rùn)和增殖的方法。本發(fā)明所述組合物包括與抗血小板劑組合的分子量為約500道爾頓到約500，000 道爾頓的聚合物(或單體)，所述聚合物(或單體)在性質(zhì)上為陰離子的并具有抗血小板損傷的性能，所述抗血小板劑如人類血小板中糖蛋白(GP)Ilb/IIIa受體的抑制劑，本發(fā)明證明所述組合物能有效抑制瘢痕、特別是手術(shù)粘連的形成，還證明所述組合物能抑制細(xì)胞侵潤(rùn)和硬膜外纖維化。所述組合物可用于抑制成纖維細(xì)胞侵潤(rùn)，從而調(diào)節(jié)傷口愈合過(guò)程和防止纖維化。所述組合物能抑制細(xì)胞增殖，細(xì)胞侵潤(rùn)，單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞向手術(shù)位點(diǎn)的侵潤(rùn)。所述陰離子聚合物或單體可包括硫酸葡聚糖、戊聚糖多硫酸酯以及氨基葡聚糖， 比如硫酸葡聚糖、硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素、硫酸乙酰肝素、肝素、和藻酸鹽。這些分子能抑制成纖維細(xì)胞增殖、侵潤(rùn)或遷移。在一個(gè)實(shí)施例中，用在組合物中的陰離子聚合物可包括硫酸葡聚糖。所述抗血小板劑可以是合成化合物、蛋白質(zhì)、多肽、或抗體。該抗血小板劑可以包括人類血小板中糖蛋白(GP) Ilb/IIIa受體的抑制劑，以及抑制血小板聚集的抗凝血?jiǎng)?。在一個(gè)實(shí)施例中，所述抗血小板劑可以包括Tirofiban (AGGRASTAT，Merck)，該Tirofiban是一種糖蛋白(GP) Ilb/IIIa抑制劑。本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用抑制性陰離子綴合物的方法，所述抑制性陰離子綴合物優(yōu)選與結(jié)合有Tirofiban的硫酸葡聚糖部分一同使用，來(lái)抑制成纖維細(xì)胞的侵潤(rùn)和纖維化， 并因保持血小板來(lái)促進(jìn)傷口愈合。本發(fā)明因此提供了抑制成纖維細(xì)胞侵潤(rùn)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞侵潤(rùn)、和促進(jìn)傷口愈合的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗血小板劑可以附著于硫酸葡聚糖分子，來(lái)抑制瘢痕形成和促進(jìn)傷口愈合。本發(fā)明還提供了包括抑制性陰離子化合綴合物和抗血小板劑的組合物，以及施用該組合物以通過(guò)抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞侵潤(rùn)從而抑制瘢痕形成的方法。本發(fā)明還提供了包含有效量的抑制性綴合化合物的組合物，比如，包含硫酸葡聚糖-Tirofiban綴合物，和有效量的粘連蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體。


圖1圖示了匪2040抑制3T3細(xì)胞增殖；圖2圖示了匪2040抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖；圖3圖示了 NM2040抑制C3a和C5a形成；圖4圖示了 NM2040抑制C3a和C5a形成；圖5圖示了 NM2040抑制AP活化；圖6圖示了匪2040的抑制不影響血小板數(shù)量；圖7圖示了 NM2040抑制血小板損傷；圖8圖示了匪2040抑制中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和血小板活化；圖9圖示了匪2040抑制大鼠椎板切除手術(shù)后的手術(shù)粘連；圖10圖示了 NM2040的合成和結(jié)構(gòu)。圖11圖示了放置實(shí)驗(yàn)材料之前的大鼠椎板切除手術(shù)位點(diǎn)(L3)(左圖)和匪2040 膠放置在L3椎板切除位點(diǎn)(右圖)。圖12圖示了放置A.鹽水、B.匪3014、或C.匪2040后兩周的椎板切除位點(diǎn)，顯示出鹽水處理后出現(xiàn)厚且堅(jiān)韌的硬膜外瘢痕，而匪3014或匪2040處理后出現(xiàn)硬膜上薄且易于去除的結(jié)締組織。圖13圖示了匪2040處理在防止椎板切除后硬膜外瘢痕形成中與匪3014同樣有效。數(shù)據(jù)顯示每個(gè)處理實(shí)驗(yàn)組中3只動(dòng)物的總評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)的平均值士SEM。利用非參數(shù)數(shù)據(jù)的Mann-Whitney統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)定處理組之間的差異。< 0. 05。圖14圖示了放置鹽水和匪2040后兩周椎板切除位點(diǎn)的矢狀視圖。鹽水處理的動(dòng)物出現(xiàn)瘢痕(箭頭)。匪2040處理位點(diǎn)呈現(xiàn)沒有韌性瘢痕的光滑區(qū)域。圖15圖示了放置鹽水和匪2040后兩周的椎板切除位點(diǎn)。鹽水處理的動(dòng)物脊髓附近出現(xiàn)瘢痕(來(lái)自兩只動(dòng)物的左邊兩個(gè)圖)。而匪2040處理位點(diǎn)呈現(xiàn)沒有韌性瘢痕的光滑區(qū)域。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及藥物組合物，該藥物組合物可以有效地抑制瘢痕形成，尤其有效抑制手術(shù)粘連。該組合物包括可以與防止血小板活化和/或血小板聚集的化合物(即抗血小板劑)混合或綴合的陰離子化合物，比如陰離子聚合物(或單體)。所述組合物可以防止特定位點(diǎn)上的纖維化和中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞侵潤(rùn)。該組合物可以有效抑制伴隨有害愈合過(guò)程 (比如纖維化和瘢痕化)的細(xì)胞侵潤(rùn)。本發(fā)明的組合物還對(duì)抑制成纖維細(xì)胞侵潤(rùn)有效，從而調(diào)節(jié)愈合過(guò)程并防止纖維化。本發(fā)明所述的組合物還可以抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的侵潤(rùn)，中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的侵潤(rùn)。在一個(gè)實(shí)施例中，包含與抗血小板劑Tirofiban組合的陰離子聚合物的組合物可以抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞侵潤(rùn)、3T3細(xì)胞侵潤(rùn)、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞侵潤(rùn)。因此，本發(fā)明教導(dǎo)了用于抑制瘢痕形成、纖維化、和手術(shù)粘連的多種材料。應(yīng)用在本發(fā)明所述組合物中的陰離子化合物可以包括陰離子聚合物(和/或單體)，比如，硫酸葡聚糖(DX)和戊聚糖多硫酸酯(PS)、硫酸皮膚素(DS)、硫酸軟骨素(CS)、 硫酸角質(zhì)素(KS)、硫酸乙酰肝素(HS)、法安明(Fragmin)、和肝素(HN)。在合適的濃度下， 上述分子可以抑制成纖維細(xì)胞侵潤(rùn)或遷移。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及使用DX和包含DX的分子和組合物的方法，以便抑制、防止或調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的侵潤(rùn)和纖維化以及所有上述需要的治療。根據(jù)本發(fā)明的硫酸葡聚糖的分子量可以大于約500道爾頓，硫含量可以大于大約2重量％。在一個(gè)實(shí)施例中， 硫酸葡聚糖的分子量可以為約500道爾頓到約500，000道爾頓，硫酸含量可以為大約12% 到約18重量％。在一個(gè)實(shí)施例中，所述抗血小板劑可以包括噻氯匹定和/或氯吡格雷。噻氯匹定 (美國(guó)羅氏公司以Ticlid進(jìn)行銷售)的假設(shè)作用機(jī)制為在活化的血小板中，選擇性干擾對(duì) GPIIb/IIIa復(fù)合物表達(dá)的ADP-誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化。噻氯匹定尤其應(yīng)用在不能耐受阿司匹林的患者之中。它還可以抑制凝血酶、膠原蛋白、花生四烯酸、和血小板活化因子誘導(dǎo)的血小板凝集。 施用250mg劑量的噻氯匹定，一天兩次，可以減少?gòu)?fù)合終點(diǎn)中風(fēng)、心肌梗塞、或者血管性死亡的發(fā)生的大約30%。由于噻氯匹定使用會(huì)增加血栓性血小板減少性紫癜(TTP)和中性粒細(xì)胞減少癥的風(fēng)險(xiǎn)，噻氯匹定被更新藥物氯吡格雷替代。氯吡格雷(以Plavix銷售—— Bristol Myers)是另外一種ADP拮抗劑，可以抑制纖維蛋白原與其血小板受體糖蛋白IIb/ IIIa整合素的結(jié)合。但它并不直接修飾糖蛋白Ilb/IIIa復(fù)合物，說(shuō)明氯吡格雷間接減少纖維蛋白原結(jié)合。在另外一個(gè)實(shí)例當(dāng)中，所述抗血小板劑可以包括GPIIb/IIIa抑制因子。糖蛋白 Ilb/IIIa受體在激動(dòng)劑的刺激后表達(dá)。所述受體與導(dǎo)致血小板聚集的多粘附配體分子結(jié)合，所述多粘附配體分子包括纖維蛋白原、vWF(在高剪切條件下，可能存在于狹窄動(dòng)脈之中)、纖維鏈接粘連蛋白、玻連蛋白、和凝血酶致敏蛋白。血小板募集可以被抗GPIIb/ IIIa試劑抑制，所述抗GPIIb/IIIa劑比如單克隆抗體(c7E-Reoftx))、環(huán)肽序列(依非巴特 (Eptifibatide)-Integrilin)、和合成競(jìng)爭(zhēng)性類似物(替羅非班(Tirofiban)-AGGRASTAT) Calvete, JJ.，血小板整合素GPIIb/IIIa 結(jié)構(gòu)-功能相關(guān)。對(duì)其他整合素的更新參考。 Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine,1999. 222(1) p. 29 ；Gabriel, H. M.禾口 Ε· I. Oliveira, Role of abciximab in the treatment of coronary artery disease. Expert Opinion on Biological Therapy,2006. 6(9) :p. 935 ； Lai, H.等人，Integrins :novel therapeutic targets for cardiovascular diseases. Cardiovascular & Hematological Agents in Medicinal Chemistry,2007.5 (2) p. 109 ；Menozzi, A. , P.A.Merlini, 禾口 D.Ardissino, Tirofiban in acute coronary syndromes. Expert Review of Cardiovascular Therapy,2005. 3(2) :p. 193 ；Ringleb, P. A. , Thrombolytics, anticoagulants, and antiplatelet agents. Stroke,2006. 37(2) p. 312).單克隆抗體c7E3(Centocor 生產(chǎn)的Abciximab或ReoPro)抑制GPIIb/IIIa受體，已經(jīng)接受了大量臨床試驗(yàn)并獲得臨床使用批準(zhǔn)。已顯示其可防止血管損傷后的血栓形成，并可有效減少冠狀動(dòng)脈介入程序后的早期再閉塞(Expert Opinion on Biological Therapy, 2006.6(9) :p. 935)。Abciximab是BUMC常用藥并在年度藥物支出中位于前列(The Baylor Drug Newsletter,June 1998 ； 10(Crit Rev Immunol,1981. 1(4) :p. 321—66))。Abciximab 在血漿中的血漿半衰期較短，但該抗體可在治療終止后長(zhǎng)時(shí)間結(jié)合GPIIb/IIIa受體。已經(jīng)開發(fā)了模仿精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的電荷和幾何結(jié)構(gòu)特征的非肽類拮抗劑。這些試劑都具有口服給藥潛力，因此可以對(duì)慢性抗血小板治療有效。 Tirofiban (MERCK以AGGRASTAT銷售)，1998年5月得到臨床應(yīng)用的新藥許可?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)生的GPIIb/IIIa-拮抗劑多肽Eptifikitideantegrilin—— Millennium Pharmaceuticals)，并在體內(nèi)和體外進(jìn)行了表征。Eptifibatide是帶有賴氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列而非精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的環(huán)狀七肽。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中，所述組合物可以包含陰離子聚合物和抗血小板劑通過(guò)共價(jià)連接而綴合的綴合物。比如，該綴合物可以包含和Tirofiki綴合的硫酸葡聚糖。該綴合物可以以有效量在需要位點(diǎn)上對(duì)受試對(duì)象施用，以抑制瘢痕形成和手術(shù)粘連。在另外一個(gè)實(shí)施方式中，綴合物可以包含陰離子聚合物和抗血小板劑的混合物。 比如，所述綴合物可以包含硫酸葡聚糖和Tirofiban的混合物。可以將該混合物以有效量在需要位點(diǎn)上對(duì)受試對(duì)象施用，以抑制瘢痕形成和手術(shù)粘連。本發(fā)明進(jìn)一步提供了藥物組合物，所述藥物組合物包含在藥學(xué)上可接受的載體中的陰離子聚合物或單體和抗血小板劑，還提供了施用該組合物以抑制瘢痕形成和纖維化從而抑制膠質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的非所需侵潤(rùn)和神經(jīng)突起過(guò)生長(zhǎng)的方法。本發(fā)明所述組合物及方法適于治療動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人?？梢砸砸压_的任何方法，將治療有效量的包含本發(fā)明綴合化合物的組合物施用于動(dòng)物的病變。防止纖維化和細(xì)胞侵潤(rùn)的組合物本發(fā)明提供了用于抑制成纖維細(xì)胞侵潤(rùn)、膠質(zhì)細(xì)胞侵潤(rùn)、神經(jīng)突起過(guò)生長(zhǎng)、中性粒細(xì)胞侵潤(rùn)、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞侵潤(rùn)的組合物。尤其是，所述組合物在防止纖維化和瘢痕形成如手術(shù)粘連中是有效的。所述組合物中所用的陰離子聚合物應(yīng)該優(yōu)選為大于約lmg/ml的濃度，更優(yōu)選為20-200mg/ml的范圍。在一個(gè)實(shí)施例中，所述陰離子聚合物是硫酸葡聚糖，抗血小板劑是Tirofiban。在一個(gè)具體實(shí)施例中，硫酸葡聚糖的硫含量為至少約10重量％?？梢詫庪x子聚合物和抗血小板劑的組合物與載體或賦形劑混合，比如鹽水和明膠海綿，以形成粘性液體或凝膠。應(yīng)當(dāng)理解的是，該陰離子聚合物和抗血小板劑可以與固態(tài)或者半固態(tài)賦形劑或載體相組合，比如糊劑、凝膠、泡沫或者片。該陰離子聚合物和抗血小板劑可以與載體或賦形劑在膠體懸浮液或混配物中混合；作為另一種選擇，所述載體或賦形劑可以浸漬有形成所述組合物的綴合化合物。優(yōu)選半固態(tài)載體包括葡聚糖膠，比如 HYSK0N-70 (Pharmacia)、INTERCEED (Johnson & Johnson)、天然膠原膠、和變性膠原膠，比如 GELFOAM(Upjohn)。一般適應(yīng)癥本發(fā)明所述組合物可以用做創(chuàng)傷、手術(shù)、感染(病毒或細(xì)菌)、代謝疾病、惡變、有毒試劑接觸、以及其他增生性情況引起的細(xì)胞遷移或侵潤(rùn)的屏障物。用所述組合物包被器官或組織可以具有防止或預(yù)防作用。粘連抑制性組合物提供了優(yōu)選的包被組合物。手術(shù)在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)對(duì)手術(shù)損傷施用本發(fā)明組合物可以抑制硬膜外 (或硬膜周)纖維化。所述組合物可以是溶液形式、與基底相結(jié)合、包被在載體蛋白或聚合物中。在一個(gè)實(shí)施方式中，該綴合化合物可以應(yīng)用在載體或賦形劑中，比如糊劑、凝膠、或片。在另外一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了抑制輸卵管組織纖維化和瘢痕化的組合物和方法。尤其是，可以抑制手術(shù)后輸卵管內(nèi)部及周圍損傷的纖維化和瘢痕化。感染或其他原因引起的輸卵管纖維化，在25% -30%的情況下會(huì)導(dǎo)致不孕。盆腔側(cè)壁粘連也會(huì)導(dǎo)致不孕。由于瘢痕組織在手術(shù)之后形成，因而單純的手術(shù)切除粘連并非是足夠的治療方法。因此，本發(fā)明在治療不孕癥中有重要應(yīng)用。其他手術(shù)適應(yīng)癥包括但不限于腹部手術(shù)、關(guān)節(jié)手術(shù)、肌腱手術(shù)、切除盆腔側(cè)壁粘連手術(shù)、腹腔手術(shù)、胸部手術(shù)、血管手術(shù)、和心臟手術(shù)，特別是旁路手術(shù)、瓣膜置換手術(shù)、心血管手術(shù)、或其他心臟直視手術(shù)。在另外一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的組合物可以用于抑制植入物周圍的纖維化的方法，所述方法包括施用包含治療有效量的陰離子聚合物和抗血小板劑的組合物。需要抑制瘢痕形成和纖維化的植入物的實(shí)例包括、但不僅限于，腎造瘺管、腹腔引流管、人工髖關(guān)節(jié)、人工心瓣膜、外周神經(jīng)修復(fù)物和其他假體和靜脈導(dǎo)管。植入物可以用本發(fā)明提供的組合物包被或浸潤(rùn)處理。對(duì)關(guān)節(jié)纖維化病變的治療關(guān)節(jié)病變可通過(guò)手術(shù)過(guò)程矯正，該過(guò)程可引發(fā)粘連。所述過(guò)程的缺點(diǎn)在于在愈傷過(guò)程中會(huì)引發(fā)進(jìn)一步纖維化。施用本發(fā)明包含陰離子聚合物和抗血小板劑的組合物可以抑制關(guān)節(jié)中的后續(xù)纖維化和粘連的形成，從而增加治療成功的幾率。施用模式利用本領(lǐng)域公知方法，可以將本發(fā)明所述組合物與膠原蛋白凝膠混合， 以制作可植入裝置，用以防止手術(shù)后形成的粘連。本發(fā)明所述組合物會(huì)以任何適當(dāng)?shù)姆绞椒胖迷谒璋形稽c(diǎn)及周圍。這可以通過(guò)如以下方法、但不僅限于以下方法實(shí)現(xiàn)局部灌流或者手術(shù)應(yīng)用、注射、氣溶膠、經(jīng)導(dǎo)管方法、或經(jīng)植入物的方法，所述植入物作為有孔隙、無(wú)孔隙、或者膠狀材料，包括膜，比如硅橡膠膜或纖維。在優(yōu)選實(shí)施方式中，植入物用本發(fā)明的組合物包被或浸潤(rùn)。經(jīng)組合物處理的聚合物植入物可以應(yīng)用或者插入所需治療位點(diǎn)。所述聚合物可以有多種組成、孔隙大小、和幾何結(jié)構(gòu)?？梢允褂玫木酆衔锇?、但不僅限于由硝酸纖維素膜、聚酸酐、和丙烯酸聚合物制成的聚合物。本發(fā)明提供了通過(guò)手術(shù)過(guò)程的包含陰離子聚合物和抗血小板劑的組合物的應(yīng)用。 該組合物可以應(yīng)用于手術(shù)創(chuàng)傷。該組合物可以直接應(yīng)用于組織損傷位點(diǎn)，以包被整個(gè)器官或封閉手術(shù)切口。在合適的情況下，該組合物可以于關(guān)節(jié)鏡過(guò)程施用。實(shí)施例包括以下實(shí)施例來(lái)闡釋本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的是，實(shí)施例中所公開的技術(shù)以及本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的下述代表性技術(shù)在本發(fā)明的實(shí)施中起到良好作用，因此可以考慮構(gòu)成用于其實(shí)施的優(yōu)選模式?？墒?，本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明的啟示下應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)所公開的具體實(shí)施方式
可做出多種變化，且仍能獲得相似或相同結(jié)果而不背離本發(fā)明的精神和范圍。實(shí)施例-1NM2040 抑制 3T3 增殖約50，000個(gè)細(xì)胞接種在96孔ELISA板中。細(xì)胞在含10% FCS的DMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)5天，之后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行Cy Quant分析，并利用降低的熒光強(qiáng)度來(lái)測(cè)量對(duì)細(xì)胞增殖的抑制。為在細(xì)胞增殖分析中評(píng)價(jià)各個(gè)濃度的匪2040的效果，用1 μ g/ml到600 μ g/ml的濃度處理培養(yǎng)物。將總熒光強(qiáng)度對(duì)濃度作圖。實(shí)施例-2NM2040抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖本實(shí)驗(yàn)用以證明匪2040是否能抑制細(xì)胞增殖。在6孔板中，放置直徑為6mm的克隆環(huán)，制備60 μ 1等分試樣的細(xì)胞懸液(含320，000個(gè)細(xì)胞/ml的C6細(xì)胞的儲(chǔ)液)，并將其放置在克隆環(huán)中的6孔板每個(gè)孔的中央。4小時(shí)后，去除培養(yǎng)基并將細(xì)胞與含有或不含有所述化合物的Opti-MEM IX培養(yǎng)基一起溫育。這些培養(yǎng)物在37°C和10%的CO2下溫育 5天，之后拍照，如圖2所示。該化合物效果表現(xiàn)為劑量依賴性，在3 μ g/ml時(shí)顯示了最大效果。第1幅圖為對(duì)照組(未處理)，第2幅圖為3mg/ml，第3幅圖為1. 5mg/ml，第4幅圖為0. 75mg/ml，第5幅圖為0. 36mg/ml。該化合物匪2040在所有劑量下均表現(xiàn)出抑制，在約 lmg/ml的濃度具有最大效果。實(shí)施例-3NM2040抑制C3a和Cfe的形成受傷部位產(chǎn)生趨化肽，趨化肽可以將炎癥細(xì)胞吸引到受傷位點(diǎn)從而引發(fā)炎癥。通過(guò)檢測(cè)來(lái)確定該化合物NM2040是否可以抑制C3a和C5a的產(chǎn)生。該化合物在37°C與血液在旋轉(zhuǎn)管圈中溫育。將健康供體的全血采集到含有5單位肝素/毫升全血的聚丙烯管中。 該全血用血漿裂解物(Plasmalyte)I 1稀釋，并等分為進(jìn)行藥物處理或不進(jìn)行藥物處理的2ml等分試樣。在4mm直徑的PVC管加入含2. Oml的肝素化的人血，用小段硅膠管封閉成圈。樣品和對(duì)照管圈在37°C水浴中垂直旋轉(zhuǎn)2小時(shí)。溫育過(guò)后，血樣轉(zhuǎn)移至硅化印pendorf 管中。該樣品分成2個(gè)等分試樣一個(gè)等分試樣用以進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)研究，另一個(gè)等分試樣離心分離血漿以測(cè)量C3a和C5a。該血漿樣品用樣品稀釋緩沖液稀釋至5%，并用ELISA分析試劑盒(Quidel Corporation, San Diego CA)按廠商說(shuō)明測(cè)定C3a和C5a的量。如圖3 和圖4所示，匪2040能夠以劑量依賴的方式防止C3a和Cfe產(chǎn)生。C3a和Cfe是導(dǎo)致中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的趨化的趨化肽。如圖5所示，匪2040抑制替代途徑的激活。在同樣實(shí)驗(yàn)中，還評(píng)估了匪3015。該化合物是硫酸葡聚糖和Tirofiban的混合物。實(shí)施例-4NM2040抑制血小板損傷將經(jīng)管圈的血液等分試樣用熒光標(biāo)記抗體染色，用以流式細(xì)胞術(shù)研究。血小板用 FITC標(biāo)記的⑶61和PE標(biāo)記的⑶62P染色。在典型方法中，將20 μ 1的各標(biāo)記抗體加入到含50 μ 1全血的100 μ 1染色緩沖液中。20分鐘之后，加入2. Oml的染色液并讓紅血細(xì)胞裂解20分鐘。該溶液離心并將細(xì)胞沉淀用PBS清洗，并懸浮在0.5ml多聚甲醛溶液中。利用 CellQuest, BD-LSR I對(duì)該樣品進(jìn)行細(xì)胞流式術(shù)，數(shù)據(jù)用WinList 5.0分析。使用Ln Median 計(jì)算中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的CDllb染色的變化。檢測(cè)血小板總數(shù)。如圖6(下圖)和圖 7所示，匪2040不影響血小板。FITC陽(yáng)性血小板是未受損傷的血小板，落入正常的血小板區(qū)域。相反，匪3014這一分子量為40，000道爾頓、硫酸含量為18重量％ -20重量％的硫酸葡聚糖，引起總血小板中超過(guò)95%的損失(上圖)。實(shí)施例-5匪2040抑制中性粒細(xì)胞、單粒細(xì)胞和血小板活化將經(jīng)管圈的血液等分試樣用熒光標(biāo)記抗體染色，用以流式細(xì)胞術(shù)分析。例如中性粒細(xì)胞用FITC標(biāo)記的⑶15和PE標(biāo)記的⑶lib抗體標(biāo)記，單核細(xì)胞用FITC標(biāo)記的⑶14和 PE標(biāo)記的⑶lib抗體染色，血小板用FITC標(biāo)記的⑶61和PE標(biāo)記的⑶62P染色。在典型方法中，將20 μ 1各標(biāo)記抗體加入到含50 μ 1全血的100 μ 1染色緩沖液中。20分鐘之后， 加入2. Oml染色液并讓紅血細(xì)胞裂解20分鐘。該溶液離心并將細(xì)胞沉淀用PBS清洗，并懸浮在0. 5ml多聚甲醛溶液中。利用CellQuest，BD-LSR I對(duì)該樣品進(jìn)行細(xì)胞流式術(shù)，數(shù)據(jù)用 WinList 5.0分析。使用Ln Median計(jì)算中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的⑶lib染色的變化。量化百分?jǐn)?shù)門控雙標(biāo)記細(xì)胞的血小板群體。如圖8所示，所有三種細(xì)胞類型均顯示了對(duì)細(xì)胞活化的顯著抑制。實(shí)施例-6匪2040抑制大鼠椎板切除的脊髓與周圍組織的粘連(硬膜外纖維化)據(jù)信與脊髓相連的瘢痕組織會(huì)導(dǎo)致椎板切除術(shù)后的長(zhǎng)期反復(fù)疼痛。硬膜外纖維化是指椎板切除術(shù)后形成的瘢痕組織。椎板切除是指椎板的背部手術(shù)。瘢痕組織在椎板切除位點(diǎn)內(nèi)形成并將豎脊肌的下表面與硬脊膜的后部和側(cè)部表面相連，以及與通過(guò)硬脊膜的神經(jīng)根相連。在大鼠椎板切除手術(shù)后檢查硬膜外纖維化。在本模型中，在第三腰椎(U)和第五腰椎(U)處進(jìn)行椎板切除手術(shù)，繼而將測(cè)試劑應(yīng)用到椎板切除手術(shù)位點(diǎn)。然后，通過(guò)大體解剖觀察來(lái)檢測(cè)椎板切除手術(shù)位點(diǎn)的纖維化。在腰椎L3和L5處進(jìn)行椎板切除手術(shù)，提供每個(gè)動(dòng)物內(nèi)的自身對(duì)照。制備明膠海綿-NM2040混合物，并將其用于大鼠的椎板切除手術(shù)位點(diǎn)。Lewis近交系大鼠用異氟烷麻醉。切開背部皮膚，將椎旁肌肉與腰椎L2到L6棘突分離，以暴露L3和L5。去除L3和L5 的棘突，并去除腰椎板以建立矩形椎板切除缺陷區(qū)。將測(cè)試材料放置到椎板切除手術(shù)位點(diǎn)。 通過(guò)縫合表面筋膜使上覆椎旁肌肉在位點(diǎn)處閉合，并將皮膚切口以傷口夾閉合。兩周后，將動(dòng)物進(jìn)行整體評(píng)估。大鼠用異氟烷麻醉，手術(shù)位點(diǎn)通過(guò)切割皮膚重新打開并將椎旁肌肉分離。該位點(diǎn)和組織用0到2評(píng)分。0是“沒有粘連”，1是松散粘連，2是韌性粘連。評(píng)估之后，大鼠用過(guò)量麻藥處死。在所有動(dòng)物中，皮膚切口和底層筋膜和椎旁肌肉愈合良好。在所有椎板切除位點(diǎn)，椎旁肌肉的分離暴露出瘢痕組織層。以測(cè)試材料處理的位點(diǎn)顯示出很少有粘連或完全沒有粘連，并且該組中絕大部分評(píng)分為0或者0. 5 (總分為2、。椎板切除手術(shù)位點(diǎn)本身尺寸沒有可辨別的變化；位點(diǎn)邊沿光滑。鹽水處理的位點(diǎn)作為陰性對(duì)照。當(dāng)瘢痕組織去除時(shí)，該位點(diǎn)和周圍開始出血，并且由于粘連組織的形成，該位點(diǎn)尺寸變小。將 NM2040移入椎板切除位點(diǎn)使分?jǐn)?shù)顯著低于植入鹽水對(duì)照組。這些結(jié)果表明NM2040是減少大鼠椎板切除模型中的硬膜外纖維化的有效試劑。匪2040制劑由鹽水中10%明膠海綿粉末、20mg/ml匪2040組成。大鼠硬膜外纖維化模型清楚顯示匪2040的存在通過(guò)抑制纖維化提供了實(shí)質(zhì)治療益處。如圖9所示，匪2040抑制大鼠椎板切除模型的手術(shù)粘連。實(shí)施例-7NM2040 的合成硫酸葡聚糖已經(jīng)被應(yīng)用于防止手術(shù)粘連。該材料活化血小板。如圖10所示，硫酸葡聚糖與Tirofiban綴合，所述Tirofiban具有血小板保持功能。這種綴合化合物如下制備。在25mL雙頸圓底玻璃燒瓶中，加入l.Og硫酸葡聚糖、2. OmL水和10 μ L冰乙酸。將該內(nèi)容物室溫過(guò)夜攪拌。最終混合物呈清澈溶液。在另一 IOmL單頸燒瓶中，加入13mg的 TirofibanUmL甲醇水(1 1)混合物、和IOyL的DMS0。將該內(nèi)容物室溫混合。最終混合物呈透明溶液。將步驟2的溶液加入到步驟1的溶液中，攪拌2. 5小時(shí)。將315mg氰基硼氫化鈉經(jīng)過(guò)15分鐘分批加入，讓反應(yīng)進(jìn)行48小時(shí)同時(shí)用HPLC監(jiān)測(cè)。最終溶液呈透明溶液。通過(guò)膜濾器進(jìn)行第一過(guò)濾，繼而通過(guò)尺寸排阻柱，從而進(jìn)行綴合物的純化。在48小時(shí)結(jié)束時(shí)，將溶液混合物以500 μ L分批轉(zhuǎn)移到過(guò)濾器(MWC0 3000, MICRON YM-3)上并以 4000rpm(1431g/RCF)離心以減少總體積至250 μ L。分子尺寸更小的分子如氰基硼氫化鈉和多余Tirofiban通過(guò)過(guò)濾器，而硫酸葡聚糖-Tirofiban的綴合產(chǎn)物會(huì)保留未被濾過(guò)。加入250 μ L新鮮高純水，重復(fù)離心程序以除去小分子量雜質(zhì)。重復(fù)上述過(guò)程四次以上以確保雜質(zhì)完全被清除。將250 μ L最終體積轉(zhuǎn)移到印pendorf管中，-80°C冷凍，并凍干M小時(shí)，以得到白色固狀材料。將樣品稱重并重新溶解在最少量的高純水中，利用尺寸排阻柱色譜法進(jìn)行進(jìn)一步純化。將水中Wkphadex G-IO漿液倒入玻璃柱O. 5x75cm)，裝柱高度為 36cm。使用高純水為移動(dòng)相，流速為0.5mL/分鐘。柱的空隙容積是約720mL。用自動(dòng)流分收集器(Foxy 200)每10分鐘收集5mL的流分。每個(gè)流分用UV-VIS分光光度計(jì)檢測(cè)?；赥irofiban的UV分布相似性儲(chǔ)集流分4_9。然后將30mL儲(chǔ)集量轉(zhuǎn)移到塑料管中，_80°C 冷凍，并凍干得到白色粉末。利用UV-Vis分光光譜法獲得綴合物的成分的摩爾比例。用純Tirofiban作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。各種濃度的Tirofiban水溶液在波長(zhǎng)λ max275nm處以UV-Vis分光光度儀讀數(shù)。下表顯示吸光度讀值。然后測(cè)量綴合物的吸光度。對(duì)于8.33;3mg/mL綴合物濃度的溶液，A275 為0. 34AU。這與硫酸葡聚糖-Tirofiban綴合物的1:1.2的摩爾比例一致。將Tirofiban 和硫酸葡聚糖-Tirofiban綴合物過(guò)反相C18 HPLC柱，以確定綴合物中的硫酸葡聚糖是否會(huì)導(dǎo)致Tirofiban峰位置的移動(dòng)。在C18-HPLC中以280nm濾鏡檢測(cè)Tirofiban。因?yàn)榱蛩崞暇厶潜旧聿粠в蟹枷慊鶊F(tuán)，所以在^Onm下不表現(xiàn)過(guò)多吸收。將20 μ L等分試樣的Tirofiban和綴合物注入到柱中。將甲醇水(1 1)混合物以0. 75mL/分鐘的流速作為洗脫劑。硫酸葡聚糖-Tirofiban綴合物和非綴合的Tirofiban的曲線如圖所示。由于其顯著的高極性，綴合物比非綴合Tirofiban更早洗脫。將綴合物溶于的0. 5mL重水(D2O)中制備樣品。在常溫下用IN0VA-400MHZ儀器記錄NMR。最終綴合物的分離產(chǎn)率>95%。根據(jù)其NMR數(shù)據(jù)，該綴合物具有以下結(jié)構(gòu)。NMR顯示了在對(duì)應(yīng)糖質(zhì)子的3. 5-5. 5ppm區(qū)域存在硫酸葡聚糖峰，而Tirofiban的芳香質(zhì)子出現(xiàn)在 7. O和7. 2ppm。Tirofiban的烷基質(zhì)子出現(xiàn)在1至2ppm。硫酸葡聚糖-Tirofiban綴合物的化學(xué)名稱為硫酸葡聚糖和2- ( 丁烷-1-磺酰氨基)-3- [4- (4-哌啶-4-基-丁氧基)-苯基]-丙酸的綴合物。在這個(gè)結(jié)構(gòu)中，Tirofiban的二級(jí)氨基連接于硫酸葡聚糖還原端的糖單體的C-I碳上。實(shí)施例8匪2040抑制椎板切除后的硬膜外纖維化成年Lewis大鼠椎板切除手術(shù)后檢查硬膜外纖維化。在第3 (L3)和第5 (L5)腰椎處進(jìn)行椎板切除。將測(cè)試劑凝膠應(yīng)用在一個(gè)位點(diǎn)，將鹽水(對(duì)照)應(yīng)用在另外一個(gè)位點(diǎn)。 兩周之后，如上所述通過(guò)大體解剖來(lái)檢查椎板切除位點(diǎn)的纖維化。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，將大鼠麻醉。 切開背部皮膚并將椎旁肌肉與腰椎L2到L6處棘突分離，以暴露L3和L5。去除L3和L5 棘突和椎板，形成一個(gè)約5mmX2mm的矩形椎板切除術(shù)缺陷區(qū)(圖1IA)。將測(cè)試材料NM2040 或載質(zhì)按照隨機(jī)編碼程序放置在椎板切除位點(diǎn)(圖11B)。NM2040制劑由無(wú)菌鹽水中10% 凝膠泡沫粉末、20mg/ml終濃度組成?；旌衔锛尤氲礁邏簻缇^(guò)的注射器中，冷卻至室溫后放入椎板切除位點(diǎn)。將椎旁肌肉上面的筋膜采用5-0聚二氧雜環(huán)己酮PDS可吸收縫合線 (Ethicon)縫合，并且皮膚切口用7. 5mm的Michel傷口夾封閉。兩周之后，將動(dòng)物麻醉并進(jìn)行整體評(píng)估。對(duì)于整體評(píng)估，通過(guò)切割皮膚并將椎旁肌肉分離，將傷口位點(diǎn)重新打開。硬膜外瘢痕形成為測(cè)試材料和硬脊膜之間的結(jié)締組織。深層瘢痕的厚度和韌性用鈍性分離評(píng)估，并在0-2之間打分。O為“沒有粘連”且硬膜清晰可見，1為覆蓋硬膜的可以輕易去除的薄且松散的結(jié)締組織，2為厚且致密的韌性粘連，不撕裂硬膜很難、甚至不能去除。不需要具有處理任何椎板切除位置的知識(shí)即完成打分。圖12顯示，匪2040和匪3014同樣均可有效防止硬膜外纖維化。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，在所有動(dòng)物中，皮膚切口和下面的筋膜以及椎旁肌肉均愈合良好。在所有椎板切除位點(diǎn)，椎旁肌肉的分離可暴露瘢痕組織層。鹽水處理的位點(diǎn)作為陰性對(duì)照。鹽水處理的位點(diǎn)具有致密堅(jiān)韌的粘連。將該瘢痕組織去除之后，該位點(diǎn)開始流血，在去除瘢痕組織時(shí)硬膜撕裂。如之前觀察的，本發(fā)明的陽(yáng)性對(duì)照材料匪3014處理的位點(diǎn)在硬膜之上具有薄且可輕易去除的結(jié)締組織，甚至沒有粘連。如同NM3014處理位點(diǎn)，NM2040處理位點(diǎn)也顯示了硬膜上的薄且可輕易去除的結(jié)締組織，甚至沒有粘連。圖13顯示了整體評(píng)估檢測(cè)，確認(rèn)了匪2040抑制大鼠椎板切除模型中的手術(shù)粘連。 鹽水處理過(guò)的所有椎板切除位點(diǎn)均具有厚且堅(jiān)韌的硬膜外瘢痕，評(píng)分為2。相反，匪3014或匪2040凝膠處理過(guò)的椎板切除位點(diǎn)得到的平均評(píng)分分別為約0. 75和0. 5。與載質(zhì)處理相比，匪3014或匪2040處理可顯著降低粘連評(píng)分。這些結(jié)果顯示匪2040是減少大鼠椎板切除模型的硬膜外纖維化的試劑。大鼠硬膜外纖維化模型清楚證明，NM2040的存在通過(guò)抑制纖維化提供了顯著治療益處。
圖14顯示鹽水和匪2040處理大鼠的MRI圖像。如第二圖所示，與鹽水對(duì)照組相比箭頭所在區(qū)域的組織較為光滑。圖15顯示L3水平脊柱的組織切片。如圖所示，匪2040處理的切片與對(duì)照組相比呈現(xiàn)光滑填充(箭頭)，而對(duì)照組則在脊髓上出現(xiàn)骨性組織。利用標(biāo)準(zhǔn)方法以Masson三色染色法進(jìn)行組織學(xué)研究。本發(fā)明的初步數(shù)據(jù)表明與Tirofiban綴合的硫酸葡聚糖保持了硫酸葡聚糖的抗成纖維細(xì)胞增殖性和抗粘連性，從而防止椎板切除后的粘連。與NM3014相比，NM2040不會(huì)損害血小板。
權(quán)利要求
1.一種抑制哺乳動(dòng)物的成纖維細(xì)胞和/或神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞增殖的方法，所述方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用組合物，其中所述組合物包括有效抑制所述哺乳動(dòng)物成纖維細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤的細(xì)胞增殖的量的陰離子聚合物和抗血小板劑。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗血小板劑與所述陰離子聚合物共價(jià)連接。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述陰離子聚合物選自硫酸皮膚素、硫酸軟骨素、 硫酸角質(zhì)素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸葡聚糖、法安明、多聚硫酸戊聚糖、藻酸鹽、和透明質(zhì)酸。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述陰離子聚合物具有大于約2%的硫酸含量。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述陰離子聚合物具有范圍為約500道爾頓至約 500，000道爾頓的平均分子量。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述陰離子聚合物是線性聚合物或交聯(lián)聚合物中的至少一種。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組合物在腹部手術(shù)、關(guān)節(jié)手術(shù)、肌腱手術(shù)、切除盆腔側(cè)壁粘連手術(shù)、腹膜手術(shù)、胸部手術(shù)、血管手術(shù)、心臟手術(shù)、心臟旁路手術(shù)、心臟瓣膜置換手術(shù)、心內(nèi)直視手術(shù)、椎板切除手術(shù)、輸卵管手術(shù)、整形外科手術(shù)、關(guān)節(jié)炎&骨關(guān)節(jié)炎、或治療顳下頌關(guān)節(jié)功能失調(diào)的手術(shù)的手術(shù)后程序后施用。
8.一種抑制哺乳動(dòng)物的單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞侵潤(rùn)的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物的需要抑制單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞侵潤(rùn)的手術(shù)部位施用有效抑制單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞侵潤(rùn)的量的陰離子聚合物、和有效防止需要抑制單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞侵潤(rùn)的部位處血小板活化的量的試劑。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述陰離子聚合物選自硫酸皮膚素、硫酸軟骨素、 硫酸角質(zhì)素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸葡聚糖、法安明、多聚硫酸戊聚糖、藻酸鹽、和透明質(zhì)酸。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述抗血小板劑與所述陰離子聚合物共價(jià)連接。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述陰離子聚合物具有大于約2%的硫酸含量。
12.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述陰離子聚合物具有范圍為約500道爾頓至約 500，000道爾頓的平均分子量。
13.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述陰離子聚合物是線性聚合物或交聯(lián)聚合物中的至少一種。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組合物在腹部手術(shù)、關(guān)節(jié)手術(shù)、肌腱手術(shù)、切除盆腔側(cè)壁粘連手術(shù)、腹膜手術(shù)、胸部手術(shù)、血管手術(shù)、心臟手術(shù)、心臟旁路手術(shù)、心臟瓣膜置換手術(shù)、心內(nèi)直視手術(shù)、椎板切除手術(shù)、輸卵管手術(shù)、整形外科手術(shù)、關(guān)節(jié)炎&骨關(guān)節(jié)炎、或治療顳下頌關(guān)節(jié)功能失調(diào)的手術(shù)的手術(shù)后程序后施用。
15.一種抑制哺乳動(dòng)物的中性粒細(xì)胞侵潤(rùn)的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物的需要抑制中性粒細(xì)胞侵潤(rùn)的手術(shù)部位施用有效抑制中性粒細(xì)胞侵潤(rùn)的量的陰離子聚合物、和有效防止需要抑制中性粒細(xì)胞侵潤(rùn)的部位處血小板活化的量的試齊LU
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述陰離子聚合物選自硫酸皮膚素、硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸葡聚糖、法安明、多聚硫酸戊聚糖、藻酸鹽、和透明質(zhì)酸。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述抗血小板劑與所述陰離子聚合物共價(jià)連接。
18.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述陰離子聚合物具有大于約2%的硫酸含量。
19.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述陰離子聚合物具有范圍為約500道爾頓至約 500，000道爾頓的平均分子量。
20.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述陰離子聚合物是線性聚合物或交聯(lián)聚合物中的至少一種。
21.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述組合物在腹部手術(shù)、關(guān)節(jié)手術(shù)、肌腱手術(shù)、切除盆腔側(cè)壁粘連手術(shù)、腹膜手術(shù)、胸部手術(shù)、血管手術(shù)、心臟手術(shù)、心臟旁路手術(shù)、心臟瓣膜置換手術(shù)、心內(nèi)直視手術(shù)、椎板切除手術(shù)、輸卵管手術(shù)、整形外科手術(shù)、關(guān)節(jié)炎&骨關(guān)節(jié)炎、 或治療顳下頌關(guān)節(jié)功能失調(diào)的手術(shù)的手術(shù)后程序后施用。
22.—種抑制哺乳動(dòng)物的神經(jīng)突過(guò)生長(zhǎng)的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物的需要抑制神經(jīng)突過(guò)生長(zhǎng)的部位施用有效抑制神經(jīng)突過(guò)生長(zhǎng)的量的陰離子聚合物、和有效防止所述部位處血小板活化的量的試劑。
23.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述陰離子聚合物選自硫酸皮膚素、硫酸軟骨素、 硫酸角質(zhì)素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸葡聚糖、法安明、多聚硫酸戊聚糖、藻酸鹽、和透明質(zhì)酸。
24.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述抗血小板劑與所述陰離子聚合物共價(jià)連接。
25.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述陰離子聚合物具有大于約2%的硫酸含量。
26.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述陰離子聚合物具有范圍為約500道爾頓至約 500，000道爾頓的平均分子量。
27.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述陰離子聚合物是線性聚合物或交聯(lián)聚合物中的至少一種。
28.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述組合物在腹部手術(shù)、關(guān)節(jié)手術(shù)、肌腱手術(shù)、切除盆腔側(cè)壁粘連手術(shù)、腹膜手術(shù)、胸部手術(shù)、血管手術(shù)、心臟手術(shù)、心臟旁路手術(shù)、心臟瓣膜置換手術(shù)、心內(nèi)直視手術(shù)、椎板切除手術(shù)、輸卵管手術(shù)、整形外科手術(shù)、關(guān)節(jié)炎&骨關(guān)節(jié)炎、 或治療顳下頌關(guān)節(jié)功能失調(diào)的手術(shù)的手術(shù)后程序后施用。
29.—種抑制哺乳動(dòng)物的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和侵潤(rùn)的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物的需要抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的部位施用有效抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的量的陰離子聚合物和量的抗血小板劑。
30.如權(quán)利要求四所述的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞的類型選自神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞癌、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、泌尿膀胱癌、黑色素瘤、白血病、 和淋巴瘤。
31.如權(quán)利要求四所述的方法，其中所述腫瘤是原發(fā)性腫瘤的轉(zhuǎn)移瘤。
32.如權(quán)利要求四所述的方法，其中所述腫瘤來(lái)自實(shí)體瘤、非實(shí)體瘤、或者淋巴瘤。
33.如權(quán)利要求四所述的方法，其中所述腫瘤為惡性腫瘤或肉瘤。
34.如權(quán)利要求四所述的方法，其中需要抑制植入物周圍的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。
全文摘要
一種抑制哺乳動(dòng)物的成纖維細(xì)胞和/或神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞增殖的方法，所述方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用組合物，其中所述組合物包括有效抑制所述哺乳動(dòng)物成纖維細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤的細(xì)胞增殖的量的陰離子聚合物和抗血小板劑。
文檔編號(hào)A61K31/737GK102405050SQ201080010061
公開日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2010年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月17日
發(fā)明者R·班薩爾 申請(qǐng)人:諾沃姆德治療公司