嵌合抗原受體hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及腫瘤的細(xì)胞免疫治療領(lǐng)域。利用基因工程技術(shù)獲得編碼嵌合抗原受體 h⑶19scFv-⑶8a-⑶28-⑶3e的融合基因，將該基因片段插入慢病毒表達(dá)載體，包裝成慢 病毒，感染人T細(xì)胞，使T細(xì)胞表達(dá)該嵌合抗原受體。這種嵌合抗原受體T細(xì)胞能夠識(shí)別腫 瘤細(xì)胞表面的CD19,特異性殺傷CD19陽性的腫瘤細(xì)胞，用于腫瘤的治療。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤特異性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)是機(jī)體清除腫瘤細(xì)胞的主要手段，在正常的免 疫反應(yīng)中，抗原特異性T細(xì)胞需要至少兩個(gè)信號(hào)的刺激才能進(jìn)行增殖并對抗原產(chǎn)生免疫應(yīng) 答。第一個(gè)信號(hào)是T細(xì)胞受體（TCR)及MHC-I或II類分子識(shí)別腫瘤特異性抗原，第二個(gè)信 號(hào)是由T細(xì)胞與抗原提呈細(xì)胞（APC)或其它細(xì)胞表面的共刺激分子對所介導(dǎo)。腫瘤細(xì)胞通 過下調(diào)參與T細(xì)胞識(shí)別及抗原反應(yīng)的分子表達(dá)、降低免疫原性等途徑產(chǎn)生免疫逃逸，從而 使機(jī)體的免疫系統(tǒng)不能很好的清除腫瘤。
[0003] 研宄發(fā)現(xiàn)，以腫瘤特異性單克隆抗體的單鏈可變區(qū)（SCFv)取代TCR的a，0鏈可 變區(qū)，并將scFv直接和共刺激分子（如⑶28、4_1BB等）以及T細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)域⑶3G連 接，形成嵌合抗原受體（CAR)表達(dá)于T細(xì)胞表面，可通過scFv識(shí)別腫瘤特異性抗原，直接產(chǎn) 生T細(xì)胞活化的第一、第二信號(hào)，促進(jìn)T細(xì)胞活化、增殖，特異性殺傷腫瘤細(xì)胞。該過程主要 依賴CAR-T細(xì)胞表面的scFv對腫瘤抗原的特異性識(shí)別，免疫反應(yīng)的特異性和殺傷性較強(qiáng)。
[0004] 急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL)、慢性淋巴細(xì)胞白血病（CLL)以及B細(xì)胞淋巴瘤的 臨床治療，目前以化療、干細(xì)胞移植及生物治療等為主，雖然可以取得一定的療效，但復(fù)發(fā) 難治仍然是難以攻克的重點(diǎn)，腫瘤的細(xì)胞免疫治療作為一種新的治療策略，成為當(dāng)今研宄 的熱點(diǎn)。CD19幾乎表達(dá)于所有的B細(xì)胞腫瘤細(xì)胞表面，而其他實(shí)質(zhì)細(xì)胞和造血干細(xì)胞幾 乎不表達(dá)，因此作為B細(xì)胞腫瘤抗原的特異性高。利用抗CD19scFv構(gòu)建的嵌合抗原受體 h⑶19scFv-⑶8a-⑶28-⑶3G表達(dá)于T細(xì)胞表面，可使T細(xì)胞特異性殺傷⑶19陽性的腫瘤 細(xì)胞，國外已經(jīng)有臨床實(shí)驗(yàn)報(bào)道抗CD19-CAR-T細(xì)胞在B細(xì)胞腫瘤中的應(yīng)用取得了較好的療 效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種應(yīng)用抗⑶19scFv構(gòu)建出的抗⑶19嵌合 抗原受體（h⑶19scFv-⑶8a-⑶28-⑶3 〇，表達(dá)該嵌合抗原受體的T細(xì)胞也具有其獨(dú)特 性，初步研宄其腫瘤特異性殺傷功能，以進(jìn)一步探討其在臨床治療中的應(yīng)用。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種嵌合抗原受體 h⑶19scFv-⑶8a-⑶28-⑶3e，所述嵌合抗原受體由抗人⑶19單克隆抗體HI19a輕鏈和重 鏈可變區(qū)h⑶19scFv、人⑶8a鉸鏈區(qū)、人⑶28跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)、以及人⑶3G胞內(nèi)區(qū)結(jié)構(gòu) 串聯(lián)構(gòu)成；所述嵌合抗原受體的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO. 1所示。
[0007] 所述嵌合抗原受體的核酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0008] 所述嵌合抗原受體含有針對人CD19抗原的單鏈抗體hCD19scFv，其氨基酸序列如 SEQIDNO. 3所示，該單鏈抗體的輕鏈和重鏈之間有個(gè)GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGly GlySerGlyGlyGlyGlySer連接肽。
[0009] 所述嵌合抗原受體含有針對人CD19抗原的單鏈抗體hCD19scFv，其核酸序列如 SEQIDNO. 4 所示。
[0010] 所述嵌合抗原受體以人CD8a鉸鏈區(qū)、人CD28跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)、以及人CD3G胞 內(nèi)區(qū)串聯(lián)而成的結(jié)構(gòu)為信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其氨基酸序列如SEQIDNO. 5所示。
[0011] 所述嵌合抗原受體以人CD8a鉸鏈區(qū)、人CD28跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)、以及人CD3G胞 內(nèi)區(qū)串聯(lián)而成的結(jié)構(gòu)為信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其核酸序列如SEQIDNO. 6所示。
[0012] 所述嵌合抗原受體的氨基末端含有一個(gè)CD8a信號(hào)肽，其氨基酸序列如序列表中 的SEQIDNO. 7 所示。
[0013] 所述嵌合抗原受體的氨基末端含有一個(gè)⑶8a信號(hào)肽，其核酸序列如SEQIDNO. 8 所示。
[0014] 所述的嵌合抗原受體h⑶19scFv-⑶8a-⑶28-⑶3G在制備嵌合抗原受體T細(xì)胞 及其在腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明采用抗人CD19scFv基因序列（參考本發(fā)明人的專 利，專利號(hào)：ZL200610015650. 9)，將其進(jìn)行密碼子優(yōu)化，從NCBIGenBank數(shù)據(jù)庫中搜索到 人⑶8a信號(hào)肽基因、人⑶8a鉸鏈區(qū)基因、人⑶28跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)基因、以及人⑶3G胞 內(nèi)區(qū)基因序列信息，全基因合成嵌合抗原受體h⑶19scFv_⑶8a-⑶28-⑶3G(h⑶19-CAR) 基因片段，插入到慢病毒表達(dá)載體P⑶H-EFl-MCS-T2A-copGFP(p⑶H-空載體）中，構(gòu)成抗人 ⑶19-CAR表達(dá)質(zhì)粒（p⑶H-CAR質(zhì)粒），利用該質(zhì)粒與慢病毒的包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G在 293T細(xì)胞中包裝病毒，感染T細(xì)胞，使T細(xì)胞表達(dá)該嵌合抗原受體。獲得的CAR-T細(xì)胞在體 外與CD19陽性的腫瘤細(xì)胞Nalm-6共培養(yǎng)，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞殘留水平、ELISA 方法檢測共培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子水平以及CytoTox%K非放射性細(xì)胞毒性法檢測CAR-T 細(xì)胞對Nalm-6細(xì)胞的殺傷活性，以證實(shí)該嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的特異性 殺傷作用。因此本發(fā)明所述的嵌合抗原受體hCD19scFv-CD8a-CD28-CD3G可在腫瘤治療 中得到應(yīng)用。
【附圖說明】
[0016] 圖1為p⑶H-CAR慢病毒表達(dá)載體示意圖。
[0017] 圖2為p⑶H-CAR慢病毒表達(dá)質(zhì)粒的部分測序結(jié)果峰值圖。
[0018] 圖3為熒光顯微鏡下觀察慢病毒感染96h后T細(xì)胞的綠色熒光（GFP)表達(dá)情況。
[0019] 圖4為流式細(xì)胞儀顯示慢病毒感染96h后T細(xì)胞的GFP陽性率。
[0020] 圖5A為流式細(xì)胞儀顯示感染后⑶3陽性T細(xì)胞所占的比例。
[0021] 圖5B為流式細(xì)胞儀檢測感染后T細(xì)胞表面CAR蛋白表達(dá)情況。
[0022] 圖6A為高效靶比例共培養(yǎng)條件下，靶細(xì)胞比例隨時(shí)間的變化圖。
[0023] 圖6B為低效靶比例共培養(yǎng)條件下，靶細(xì)胞比例隨時(shí)間的變化圖。
[0024] 圖6C為實(shí)驗(yàn)組靶細(xì)胞比例隨時(shí)間變化的流式示意圖。
[0025]圖7A為實(shí)驗(yàn)組、對照組和單細(xì)胞組上清中TNF-a濃度比較。
[0026] 圖7B為實(shí)驗(yàn)組、對照組和單細(xì)胞組上清中IL-2濃度比較。
[0027] 圖7C為實(shí)驗(yàn)組、對照組和單細(xì)胞組上清中IFN-y濃度比較。
[0028] 圖8為在不同效靶比例情況下，實(shí)驗(yàn)組和對照組的細(xì)胞毒性比較。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明：
[0030] 實(shí)施例I:h⑶19scFv_⑶8a-⑶28-⑶3G基因序列的確定
[0031] Ll從美國國立醫(yī)學(xué)圖書館網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez) GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索到人⑶8a信號(hào)肽基因、人⑶8a鉸鏈區(qū)基因、人⑶28跨膜區(qū)和胞內(nèi) 區(qū)基因、以及人⑶3G胞內(nèi)區(qū)基因序列。抗⑶19單鏈抗體（抗⑶19scFv)基因序列來自專 利（專利號(hào)：ZL200610015650. 9)，將其進(jìn)行密碼子優(yōu)化，以保證在編碼氨基酸序列不變的 情況下更適合人類細(xì)胞表達(dá)。
[0032] 各基因序列信息見SEQUENCELISTING(序列表SEQIDNO. 1-8)。
[0033] 1. 2將上述基因序列依次按人⑶8a信號(hào)肽基因、抗⑶19scFv、人⑶8a鉸鏈區(qū)基 因、人CD28跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)基因、以及人CD3G胞內(nèi)區(qū)基因序列進(jìn)行連接，并在頭端引入 Kozac序列，在各序列連接處引入不同的酶切位點(diǎn)，形成最終完整的h⑶19-CAR基因序列信 息。
[0034] 實(shí)施例 2 :hCD19scFv-CD8a-CD28-CD3G表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0035] 2. 1全基因合成：
[0036] 全基因合成優(yōu)化后的完整的hCD19-CAR序列，克隆到pCDH-EFl-MCS-T2A-copGFP 慢病毒表達(dá)載體（P⑶H-空載體）中，獲得抗人⑶19-CAR表達(dá)質(zhì)粒（p⑶H-CAR質(zhì)粒）和含 有該質(zhì)粒的DH5a菌液。質(zhì)粒信息見圖1。
[0037] 2. 2重組質(zhì)粒的測序：
[0038] 將重組質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與擬合成的 h⑶19-CAR序列比對以證實(shí)序列正確。測序引物為p⑶H-EFl-MCS-T2A-copGFP載體上的通 用測序引物：
[0039] Sense:5'ctccacgctttgcctgaccctgctt3'
[004