專利名稱：利用具有低奧斯特瓦爾德系數(shù)的氟代醚穩(wěn)定的氣乳液的制作方法
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領域本發(fā)明包括一種用于制備可以提高超聲造影效果的，穩(wěn)定而且長壽的氣乳液的方法及其用途，并涉及如此制得的氣乳液組合物。另外，本發(fā)明還包括用于制備這類乳液的先質(zhì)。2.技術(shù)背景超聲波技術(shù)提供了一種重要而且更經(jīng)濟的，用于替代使用電離輻射的造影技術(shù)。雖然已有許多常規(guī)的造影技術(shù)可以使用，例如磁共振造影(MRI)、計算機化層析X射線照相法(CT)以及正電子發(fā)射層析照相法(PET)，但是所有這些技術(shù)都使用非常昂貴的設備。而且，CT和PET要使用電離輻射。與這些技術(shù)不同，超聲造影設備是相當便宜的。而且，超聲造影不需使用電離輻射。
超聲造影利用那些能夠影響聲波反射的組織在密度和組成上的差別。在組織密度或壓縮系數(shù)具有明顯區(qū)別的部位，例如在組織界面處，顯示的圖象特別清晰。固體組織之間的界面、骨骼系統(tǒng)以及各種器官和/或腫瘤都很容易用超聲波造影。
因此，在很多造影應用中，超聲波在不使用造影增強劑的條件下也可以起作用；然而，對于其他的應用，例如血流的目視觀察，正在致力于研究一類能夠增強造影效果的試劑。對于這類造影劑的一種特別有意義的應用是在灌注造影領域。這類超聲造影劑可以改善在心肌、腎、肝和其他組織中血流的造影圖象。而這種作用將有助于對與被造影的組織有關的研究、診斷、手術(shù)和治療。一種血庫(blood pool)造影劑也能根據(jù)血液含量(例如腫瘤和發(fā)炎組織)來造影并且僅僅通過促進母系循環(huán)而有助于胎盤和胎兒的目視觀察。
已經(jīng)提出了各種不同的超聲造影增強劑。最成功的造影增強劑通常具有分散的小氣泡，它可用于靜脈注射。這些氣泡被注射入被造影活體的血流中，從而在血流中提供一種具有不同密度并且其壓縮系數(shù)比周圍的流體組織和血液高得多的乳液。其結(jié)果，這些氣泡可以很容易用超聲波造影。
遺憾的是，能有效地散射超聲波的氣泡在體內(nèi)難以產(chǎn)生。某些解釋是很明顯的。首先，由于被俘獲的氣體擴散入周圍的液體中而使得這些氣泡傾向于迅速縮小。特別是那些含有空氣或其成分氣體(例如氮)的氣泡更是如此，因為這些氣體很易溶于水中?？梢灶A料，氣泡的壽命可以簡單地通過增加氣泡的體積來提高，因為必須有更多的氣體散逸才會使這些氣泡消失。然而，該方法已被證明是不能令人滿意的，因為直徑大于約10μm的氣泡將被肺從血流中清除掉，從而阻止它們進一步循環(huán)。另外，較大的氣泡不能通過較小的血管和毛細血管循環(huán)。
在體內(nèi)具有滿意性能的微氣泡還應具有優(yōu)良的生物學特征。首先，能夠在氣泡內(nèi)補充氣體的化合物必須是生物相容的。最終，含有氣相的微氣泡將消失，而其中的氣相將作為被溶解的氣體或作為冷凝液的亞微型液滴而釋放入血液中。因此，這些氣體主要通過肺部的呼吸作用或者通過呼吸作用和在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的其他代謝途徑相結(jié)合的方式被除去。即使是在氣泡的存留時間足以允許它借助若干通道通過動物或人類的循環(huán)系統(tǒng)的情況下，肝臟中網(wǎng)狀內(nèi)皮組織的吞噬血細胞對微氣泡的吸收也會限制造影劑的效率。不利的免疫系統(tǒng)反應也能減少氣泡在體內(nèi)的壽命，因此應予避免。例如，“裸露的”微氣泡已被證明能夠產(chǎn)生不利的干擾，例如補體活化作用(例如見K.A.Shastri等(1991)海底生物醫(yī)學研究(Undersea Biomed.Res.，18，157)。然而，正如本領域中所熟知的，這些不希望的干擾可以通過使用合適的包封劑來將其降低。
因此，為了延長微氣泡在體內(nèi)的壽命，人們致力于利用其穩(wěn)定性并因此使用各種不同的包封材料。例如已經(jīng)使用過明膠或清蛋白微球，它們最初在液體懸浮液中形成而當其固化時將氣體俘獲。使用表面活性劑作為使氣泡分散的穩(wěn)定劑的事實也已公開，例如授予Hilmann等人的美國專利US 4,466,442和授予Wheatley等人的US 5,352,436。某些含有表明活性劑的造影增強劑能夠俘獲處于微脂粒的含水核中的氣泡，例如授予Unger的美國專利US 5,334,381和授予Ryan等人的美國專利US4,900,540。
最近，被俘獲的氣體對氣泡壽命的影響已受到相當?shù)淖⒁狻３丝諝饧捌浣M分之外，還使用過諸如氪和氬等各種惰性氣體?，F(xiàn)在注意力的焦點集中在那些具有低水溶性的生物相容性氣體上。在理論上已經(jīng)證明，低溶解度對氣泡的穩(wěn)定性是一個重要的因素。Epstein和Plesset，《關于氣泡在液-氣溶液中的穩(wěn)定性》(On the Stability of Gas Bubblesin Liquid-Gas Solutions)，(1950)，化學物理雜志(J.Chem.Phys.)，18(11)1505～1509，導出了氣泡的收縮速率是氣體密度、氣體在環(huán)境介質(zhì)中的溶解度及擴散系數(shù)的函數(shù)。已經(jīng)表明，液-液乳液的穩(wěn)定性隨分散相溶解度的降低而提高[Kabalnov和Shchukin，奧斯特瓦爾德熟化理論對氟碳化合物乳液穩(wěn)定性的應用(Ostwald RipeningTheoryApplications to Fluorocarbon Emulsion Stability)，膠體與界面科學的進展(Advances in Colloid and Interface Science)，3869～97，1992]。
根據(jù)某些簡化的假設，由Epstein和Plesset公式可以導出由Quay在美國專利US 5,393,524中給出的關于氣泡壽命(τ)的公式ταρ/DC(I)式中，ρ是被俘獲氣體的密度，D是該氣體在周圍介質(zhì)中的擴散系數(shù)，以及C是該氣體在周圍介質(zhì)中的溶解度。根據(jù)這一公式，Quay使用一些根據(jù)下述準則選擇的氣體來形成氣泡，所說準則是，該氣體在大氣壓力和體溫(37℃)的條件下呈氣體狀態(tài)，它與空氣相比，具有較低的水溶性、較高的密度和在溶液中較低的氣體擴散系數(shù)。在相同的靜脈中，Schneider等人在EP 0554213A1中公開了一些按照低水溶性和高分子量的準則選擇的氣體。具體地說，所公開的氣體包括SF6和SeF6以及各種各樣的全氟代烴。
雖然較低的水溶解度和擴散系數(shù)可以影響氣體離開氣泡的速率(象Epstein和Plesset原先提出的那樣)，Quay和Schneider的氣體選擇準則的錯誤之處在于，這樣選擇的氣體包括某些不適用的氣體并排除某些十分適用的氣體。例如，在美國專利US 5,393,524中，Quay建議根據(jù)對所擬用的氣體計算出的Q值來選擇微氣泡氣體，此處Q＝4×107×ρ/DC， (2)式中，ρ是氣體的密度(kg/m3)，C是氣體的水溶解度(M)，以及D是該氣體在溶液中的擴散系數(shù)(cm2/s)。Quay提出，Q值應至少是30才能是對超聲造影的增強有用的氣體。利用文獻給出的水溶解度數(shù)據(jù)進行的簡單計算[E.Wilhelm、R Battino和R.J.Wilcock，化學評論(Chemical Reviews)，1977，V.77，p.219]表明，實際上所有已知氣體(氫和氦除外)的Q值都接近或超過這一數(shù)值。例如在25℃，氧的Q值為20，氮的Q值為35。因此，Quay公開的準則對有效微氣泡氣體的選擇起不了多大作用。
另外，Quay的Q系數(shù)準則以及Schneider在EP 0554213 A1中公開的準則沒有考慮到引起氣泡收縮的某些重要原因，也就是氣泡表面張力、表面活性劑和氣體的滲透作用以及灌充氣體凝聚成液體的可能性所產(chǎn)生的影響。也就是說，灌充氣體的分壓必須足夠高，以便抵抗氣泡內(nèi)部過剩的拉普拉斯(Laplace)超壓。如果飽和蒸氣壓過低，則灌充氣體可能凝聚成液體并因此將使造影能力受損。因此，在技術(shù)上必須存在一種生物相容的，易于制備的，并且在進行超聲造影時能夠提供優(yōu)良的體內(nèi)造影增強效果的，穩(wěn)定的造影增強劑。另外還必須有一種用于微氣泡的先質(zhì)以及用于制備和使用這類造影增強劑的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明利用一類具有低奧斯特瓦爾德系數(shù)的氟代醚化合物來提供一種用于增強超聲波和磁共振造影效果的含有微氣泡制劑的長壽氣乳液。當使用本發(fā)明的化合物來制備微氣泡制劑時，可以對心臟和其他內(nèi)臟器官獲得比過去所能達到的，更長持續(xù)時間的造影。在本發(fā)明中公開了一種含有一類過去沒有考慮過的化合物的氣乳液，所說化合物既具有較低的水溶解度，同時又沒有明顯降低的飽和蒸氣壓(并因此具有特別低的奧斯特瓦爾德系數(shù))。高的蒸氣壓還有助于減少由于灌充氣體凝聚入液體中而引起的造影效果的損失。這些化合物是氟代單醚和氟代聚醚。當將全氟聚醚與含同樣碳原子數(shù)的全氟碳化合物同類物相比時，全氟聚醚增加的醚的氧原子對蒸氣壓沒有明顯的影響，而其水溶解度卻降低至原來的約2～3分之一。這一點出乎意料并令人驚訝，因為將烴類轉(zhuǎn)變成醚類通常導致其水溶解度明顯增加。
這樣，本發(fā)明公開了一種用于增強超聲造影效果的氣乳液，這種氣乳液含有許多在液體介質(zhì)中的氣泡，其中的氣體含有一種氟代單醚或氟代聚醚，或者它們的混合物。在某些實施方案中，所說氣體含有一種在37℃時其奧斯特瓦爾德系數(shù)低于約100×10-6的化合物，結(jié)果導致特別長時間的體內(nèi)造影增強效果。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，全氟二乙醚、全氟二甲醚、全氟甲基·乙基醚、全氟單甘醇二甲醚、全氟二甘醇二甲醚、C4F10O3、C5F12O4和C6F14O5的蒸氣壓特別有利。
本發(fā)明的氣泡可以被一種表面活性劑層包圍著，該表面活性劑層優(yōu)選含有第一和第二表面活性劑，第一表面活性劑基本上由這樣一種磷脂或磷脂混合物組成，所說磷脂至少具有一個含有至少10個碳原子的?；?，并且至少占所有表面活性劑總量的約5％(重量)，而第二表面活性劑具有比第一表面活性劑更大的水溶性。最優(yōu)選的是，所說第一表面活性劑含帶有一個或多個?；湹牧字Ｄ憠A，其中至少一個?；満?2～18個碳原子，并且所說第二表面活性劑含帶有一個或多個?；湹牧字Ｄ憠A，其中至少一個?；満?～12個碳原子。
另外，本發(fā)明在廣義方面提供了微氣泡的先質(zhì)和用于形成氣乳液的方法。本領域的技術(shù)人員將懂得，本發(fā)明的微氣泡可以用許多不同的技術(shù)來制備。例如，所說微氣泡可以用公開的氟代醚化合物與下列物質(zhì)相結(jié)合來制備，所說物質(zhì)包括粉末、蛋白質(zhì)微球、噴霧干燥微球、含孔隙的微粒、細粒子、脂質(zhì)體、飽和蔗糖溶液等。當有氟代醚分散在所說結(jié)構(gòu)物質(zhì)中時，這些結(jié)構(gòu)物質(zhì)中的任何一種還可用來提供干燥的微氣泡先質(zhì)。在加入液體介質(zhì)，優(yōu)選是加入水時，即可以形成氣乳液。
在一個較佳實施方案中，所說微氣泡可以通過下述方法來制備，也就是首先將一種含有生物相容的成膜物質(zhì)的液體進行噴霧干燥，以便由此液體形成一種微球粉末，然后將此微球與本文中公開的低奧斯特瓦爾德系數(shù)的氟代醚摻合，然后將一種水相與該粉末混合。該微球粉末基本上溶解于水相中，從而形成微氣泡。優(yōu)選地，該微氣泡被一單層的表面活性劑包圍著。
另外，本發(fā)明提供了用于造影的方法，包括使用所公開的氣乳液進行諧波超聲造影。
根據(jù)下面對較佳實施方案的詳細描述并結(jié)合首先進行簡單描述的附圖。本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)點對于本領域的技術(shù)人員將變得顯而易見。
附圖的簡單描述

圖1表示由本發(fā)明的兩種氟代醚氣乳液獲得的體內(nèi)脈沖多普勒信號強度與時間的函數(shù)圖，并附與空氣的比較。
圖2a、2b和2c表示在將氣乳液造影介質(zhì)注射入兔子體內(nèi)之后，超聲波信號隨時間的衰減圖。每一曲線都對含有氟代醚的微氣泡制劑與先有技術(shù)的含有氟碳化合物類似物的微氣泡劑進行對比。
圖3a、3b和3c各自表示小豬心臟的兩種超聲波造影，其中圖3a表示在注射氣泡造影介質(zhì)之前的造影，圖3b表示在注射之后1分鐘時的造影，而圖3c表示在注射之后6分鐘時的造影。在這些圖中，上部的圖象(不是對比造影圖)是使用一種含有全氟聚醚C5F12O4的微氣泡產(chǎn)生的造影，而下部的圖象是使用一種含有全氟己烷C6F14產(chǎn)生的造影。
發(fā)明詳述I.概要此處所說的微氣泡是指那些處于水介質(zhì)中，其直徑在約0.5至300μm之間，優(yōu)選是直徑不超過約200、100或50μm的氣泡。微氣泡在其氣/液界面處可以具有或者沒有層狀物或包覆層。如果有，則該包覆層的厚度可以相當于一個或多個分子的厚度。另外，這些微氣泡可以被一個雙分子層(例如在單層脂質(zhì)體的情況下)俘獲，或者可以被幾層雙分子層(多層氣泡)俘獲。本發(fā)明的微氣泡可以被多層諸如變性蛋白質(zhì)等較持久的殼狀結(jié)構(gòu)包圍著。
乳液通常的特征是一種由表面活性劑界面穩(wěn)定的兩種或多種不混溶流體的分散體系，本發(fā)明含有表面活性劑的實施方案本質(zhì)上是氣乳液，該氣乳液的不連續(xù)相是氣體而不是液體。因此，本文所用的術(shù)語“氣乳液”是指一種在具有或沒有表面活性劑界面的水相介質(zhì)中含有許多微氣泡的分散體。也就是說，本發(fā)明的氣乳液簡單地是一種含有氟代醚的微氣泡制劑。
對于血管內(nèi)的應用來說，最佳的氣泡大小由兩種相互對抗的關系來決定。較小的氣泡有利于通過小血管和毛細血管進行循環(huán)，但是超聲波的回波強烈地依賴于氣泡的大小。因此適合于對血管進行超聲造影增強的微氣泡直徑優(yōu)選為約1～10μm，特別優(yōu)選是3～5μm。II.選擇微氣泡氣體和氣體組合物大多數(shù)微氣泡制劑短壽命的原因部分地是由于作用于氣泡上的表面張力導致氣泡內(nèi)部氣體壓力增加而引起的。這種提高的內(nèi)部壓力隨著氣泡直徑的減小而增加。提高的內(nèi)部氣體壓力迫使處于氣泡內(nèi)的氣體溶解，隨氣體被迫溶入溶液中而導致氣泡破滅。拉普拉斯公式ΔP＝2σ/γ(式中，ΔP是在氣泡內(nèi)氣體壓力的增加值，σ是氣泡薄膜的表面張力，γ是氣泡的半徑)描述由周圍氣泡表面或薄膜施加于氣泡上的壓力。拉普拉斯壓力與氣泡半徑成反比；隨著氣泡的收縮，拉普拉斯壓力增加，從而引起氣體從氣泡擴散出去的速率和氣泡收縮的速率增加。
有關氣泡壽命的Quay公式(公式1)忽略了這一因素。血液在接近大氣壓力的條件下自然地含有某些氣體，例如氮，當人們結(jié)合這一事實來考慮氣泡拉普拉斯壓力的影響時，將導致有關氣體適用性的不同結(jié)論。更具體地說，它所導出的結(jié)論是如下所述的氣體混合物可導致最優(yōu)的氣泡壽命，所說的氣體混合物由一種“主調(diào)節(jié)氣”，例如氮或空氣，或者原來在血液中大量存在的其他氣體，與一種具有低的水溶解度和高蒸氣壓的“氣體滲透劑”共同組成。這類氣體混合物的某些實施方案記載于共同未決的美國專利申請序號08/099,951；08/284,083；08/395,680中，此處將其引為參考。
通過對水溶液中某些假想氣泡的討論可以更容易地理解由適當?shù)臍怏w組合物引起的穩(wěn)定化影響。所討論的氣泡都可以看成由一層能降低表面張力的表面活性劑包圍著。然而，要考慮具有不同溶解度、不同表面活性劑膜層的滲透性和不同表觀濃度的氣體或氣體組合物所產(chǎn)生的影響。
主調(diào)節(jié)氣、輔助滲透劑和介質(zhì)相互間的物理作用可以納入氣泡行為的基本理論。在一種含有相對較高濃度主調(diào)節(jié)氣(與溶液中氣體滲透劑的濃度相比)的溶液中，氣泡的壽命可以作為輔助氣體滲透劑某些物理特性的函數(shù)從理論上確定。
現(xiàn)在考慮一種半徑為r的微氣泡，其中含有兩種理想氣體空氣(氮)(na摩爾)和滲透劑(nF摩爾)。該微氣泡處于一種無限量的水介質(zhì)中，該水介質(zhì)不含滲透劑并且被無限量地供應的空氣所飽和?？諝饷黠@地更易溶于水中并從微氣泡中迅速擴散出去。以一種類似于半透膜的方式來處理該微氣泡時，我們可以認為，空氣在微氣泡中的化學勢與在無限量水介質(zhì)中的化學勢相同，而氟碳化合物在微氣泡中的化學勢則高于在無限量水介質(zhì)中的化學勢。假定通過界面的壓力梯度的物理平衡是迅速的。這樣，滲透劑從微氣泡中向外擴散的速度決定了該微氣泡的壽命。微氣泡內(nèi)部的壓力是空氣和氟碳化合物二者分壓之和pb=pFb+pab----(3)]]>由于空氣很易溶于水介質(zhì)中，因此滲入或者滲出氣泡的擴散速度也非常快，所以空氣的凈質(zhì)量流量很小，并且微氣泡內(nèi)空氣的分壓大體上等于施加到水介質(zhì)上的大氣空氣壓力。這就意味著過剩的拉普拉斯壓力僅僅是由滲透劑引起的pFb=2σr=nF43πr3RT----(4)]]>另外，滲透劑從球形質(zhì)點擴散入滲透劑濃度為零的介質(zhì)中時，滲透劑的穩(wěn)定狀態(tài)擴散質(zhì)量流量J(mol/s)等于J=4πr2DcF,subsurfr----(5)]]>式中，D是滲透劑在水中的擴散系數(shù)，Cf，表面下是平衡時表面下滲透劑在水中的濃度。我們假定，表面下滲透劑在水中的濃度與微氣泡中氟碳化合物處于平衡狀態(tài)。由于蒸氣是未飽和的，因此，微氣泡表面下的滲透劑濃度低于其飽和濃度，并且與內(nèi)部的滲透劑蒸氣壓力有關，其關系如下cF,subsurf=cF,sat(T)pFbpF,sat(T)=cF,sat(T)2σpF,sat(T)r----(6)]]>由式4、5和6，可導出ddtr2=3DRTcF,satpF,sat----(7)]]>應予說明，該集合RTcF,satpF,sat]]>是無量綱的，其中包含飽和滲透劑的蒸氣壓對相應的平衡滲透劑水溶解度之比。該比例被稱為奧斯特瓦爾德系數(shù)(常常以“L”表示)。微氣泡半徑的平方值隨時間減小的速率正比于氣體滲透劑的奧斯特瓦爾德系數(shù)。因此，具有低奧斯特瓦爾德系數(shù)的氣體滲透劑能夠提供出色的氣泡的長壽命。氣體滲透劑的奧斯特瓦爾德系數(shù)優(yōu)選小于約500×10-6、100×10-6或50×10-6，最優(yōu)選小于約40×10-6、30×10-6、20×10-6、10×10-6、5×10-6或1×10-6。
表1 在25℃時的奧斯特瓦爾德系數(shù)和蒸氣壓灌充氣體b.p.℃*Pf，satatm**L×106***O2-183 31110N2-196 15880SF6-6823.5 5950CF4-128 159 5172C2F6-7826.2 1273CF3OCF3-5910.9 932n-C3F8-37 6.8 583CF3OC2F5-21.5 3.9 316n-C4F10-2 2.2 212C2F5OC2F51 1.973CF3OC2F4OCF3171.1636(全氟單甘醇二甲醚)n-C5F12290.8466CF3OC2F4OC2F538.5 0.55 9.0n-C6F14570.2724C3F7OC3F7560.30 6.7CF3O(CF2CF2O)2CF3640.20 0.9(全氟二甘醇二甲醚)*T.M.Reed，III，《氟化學》(Fluorine Chemistry)，J.H.Simons編輯，第5卷，科學院出版社(Academic Press)，紐約和倫敦，1964，第133頁；A.A..Woolf，氟化學雜志(J.Fluorine Chem.)，63(1993)19；V.V.Berenblit，Yu.P.Dolnakov，V.P.Sass，L.N.Senyushov和S.V.Sokolov，有機化學雜志(Zh.Org.Khim.)，10(1974)2031，和實驗測量。
**如果在參考文獻1中無此數(shù)據(jù)，則根據(jù)D.D.Lawson，J.Moacanin，K.V.Scherer，Jr，T.F.Terranova，和J.D.Ingham，氟化學雜志(J.Fluorine Chem.)，12(1978)221提出的模型來計算。
***最前面4個數(shù)值記載于E.Wilhelm，R.Battino，和R.J.Wilcock，化學評論(Chem.Rev.)，77(1977)，219。其他數(shù)據(jù)按照A.S.Kabalnov，K.N.Makarov和E.V.Shcherbakova，氟化學雜志(J.Fluorine Chem.)，50(1990)中所述的方法進行測定。
表1示出了許多種化合物，包括某些生物相容的氟碳化合物的溶解度、蒸氣壓和奧斯特瓦爾德系數(shù)。表1的數(shù)據(jù)表明，在體溫和大氣壓的條件下為氣體并被Quay和Schneider考慮作為氣泡氣使用的全氟丁烷和全氟戊烷具有低的奧斯特瓦爾德系數(shù)，因此也適合作為氣體滲透劑而與主調(diào)節(jié)氣聯(lián)合起作用。然而，作為被考慮選擇的在體溫和大氣壓的條件下為液體的化合物的性能，允許從其中選擇某些具有最低奧斯特瓦爾德系數(shù)的化合物，而這些化合物在過去無論如何也沒有被認為適用于微氣泡制劑。
應當注意，公式7對于含有如下所述氣體組合物的氣泡是正確的，其中的一種氣體原來就存在于血液中而且該氣體(即“主調(diào)節(jié)氣”)擴散通過氣/液界面的速度要比該組合物中的其他氣體(即“氣體滲透劑”)快得多。因此，只有當氣泡中氣體滲透劑的分壓僅等于拉普拉斯壓力而不是等于氣泡內(nèi)總壓力的情況下才是這樣。因為拉普拉斯壓力可以小于1大氣壓(至少對于氣泡壽命中的大百分比部分)，所以可以使用那些在體溫和大氣壓下為液體的氣體滲透劑。這類化合物在沒有另外存在主調(diào)節(jié)氣的情況下根本不能形成氣泡。
另一方面，雖然氣體滲透劑在體溫下可以是液體，但是它的飽和蒸氣壓必須足夠大，以保證拉普拉斯壓力不會立即迫使氣泡中的氣體滲透劑凝聚成液體。氣體滲透劑的飽和蒸氣壓最好大于約100托。過去被考慮作為微氣泡灌充氣的全氟代烴通常具有相互關聯(lián)的水溶解度和飽和蒸氣壓。也就是說，選擇一種具有低水溶解度的氟代烴也即意味著選擇一種具有低飽和蒸氣壓的氟代烴。
在本發(fā)明中，我們公開了一類過去未被考慮的化學物，這類化合物既具有較低的水溶解度而其飽和蒸氣壓卻沒有明顯降低，因此這些化合物具有特別低的奧斯特瓦爾德系數(shù)。這些化合物是氟代單醚和氟代聚醚。氟代單醚和氟代聚醚已知都是安全的和無毒的。在本領域中也熟知〔D.D.Lawson等，氟化學雜志(J.Fluorine Chem.)，12，P221(1978)〕，這些化合物在給定碳原子數(shù)的條件下具有很高的蒸氣壓和低的沸點。因此，氟代聚醚的沸點和飽和蒸氣壓都幾乎與那些具有同樣碳原子數(shù)的氟代烴同類物相同。
然而，氟代醚的水溶解度，并因此其奧斯特瓦爾德系數(shù)卻低于氟代烴同類物的相應值——每增加一個氧原子，其數(shù)值就降低至原來的2～3分之一。也就是說，可以預期，能夠與水形成氫鍵的氧原子數(shù)的增加將導致溶解度的增加。實驗上已經(jīng)證實，當氣泡中含有空氣或氮氣與氟代單醚或氟代聚醚的混合物時，即可制得特別長壽的造影增強氣乳液。因此已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，全氟代二甘醇二甲醚CF3(OCF2CF2)2OCF3、全氟代單甘醇二甲醚CF3OCF2CF2CF3、全氟代二乙醚C2F5OC2F5、全氟代乙基·甲基醚CF3OC2F5、全氟代二甲醚CF3OCF3和全氟代聚醚，例如CF3OCF2OCF3、CF3(OCF2)2OCF3、CF3(OCF2)3OCF3和CF3(OCF2)4OCF3，特別適合作為氣體滲透劑。
有許多不同的氟代醚具有上述的性質(zhì)，這就使得它們特別適合作為用于穩(wěn)定氣乳液的氣體滲透劑。根據(jù)碳原子數(shù)的不同，氟代醚在體溫和大氣壓的條件下可以是氣體或液體。那些在體溫和大氣壓下為氣體的氟代醚也可作為氣乳液制劑的單一氣體組分使用。雖然主調(diào)節(jié)氣可以與所有各種氣體滲透劑一起提高氣乳液的功效，但是，如果所用的氟代醚在體溫和大氣壓下為氣體就沒有此要求。另外，適用的氟代醚滲透劑可以是完全氟化的或僅僅是部分地氟化的。適用作為本發(fā)明氣體滲透劑的某些部分地氫化的氟代醚有CH3CH2OCF2CHF2，CH3CH2OCF2CF3，CHF2CH2OCF2CHF2，CF3CH2OCF2CH2F，CF3CH2OCH2CF3，CF3CH2OCF2CHF2，CHF2CH2OCF2CF3，CF3CH2OCF2CF3，CH3OCH2CF2CHF2，CH3OCH2CF2CF3，CH3OCF2CF2CHF2，CH3OCF2CHFCF3，CH3OCF2CF2CF3，CHF2OCH2CF2CHF2，CHF2OCH2CF2CF3，CF3OCH2CF2CHF2，CF3OCH2CF2CF3，CH3OCH(CF3)2，CH3OCF(CF3)2，CHF2OCH(CF3)2，CH3OCH2CHF2，CH3OCF2CH2F，CH3OCH2CF3，CH3OCF2CHF2，CHF2OCH2CHF2，CHF2OCF2CH2F，CHF2OCH2CF3，CHF2OCHFCF3，CF3OCH2CHF2，CH3OCF2CF3，CF3OCH2CF3，and CF3OCHFCF3.
一旦選定了合適的低奧斯特瓦爾德系數(shù)的氣體，優(yōu)選是氟代醚，就可以按各種不同的方法來形成包含該氣體的微氣泡，包括帶有或沒有殼層或表面活性劑界面層的微氣泡，這一點將在下文詳細解釋。III.微氣泡的形成和包封微氣泡的制備方法包括如Molecular Biosystems，Inc.提交的歐洲專利申請EP 0,359,246和EP 0,633,030中所述的通過超聲波處理清蛋白或其他蛋白質(zhì)來形成細粒微球；如美國專利US 4,446,442中所述的使用表面活性劑和粘度提高劑；如美國專利US 4,684,479中所述的類脂質(zhì)包覆的，非脂質(zhì)體的微氣泡；如美國專利US 5,088,499和US 5,123,414中所述的具有俘獲氣體的脂質(zhì)體；如美國專利US 5,445,813中所述的使用兩親化合物；如PCT公開申請WO 96/08234中所述的使用類脂質(zhì)懸浮液；如美國專利US 5,271,928和US 5,380,519中所述的使用層狀化的表面活性劑；如美國專利US 4,442,843、US 5,141,738和US 4,657,756中所述的使用微粒子；以及如美國專利US 4,718,433中所述的使用清蛋白粒子微球。本文引用上述專利和申請中的公開內(nèi)容作為參考。
本領域的技術(shù)人員還可理解，本發(fā)明還包括制備含有氟代醚的單一氣體微氣泡的方法。也就是說，在選擇的實施方案中，本發(fā)明的氣乳液可以不使用如美國專利US 5,393,524和US 5,049,688中所述的表面活性劑來形成,此處引用這些專利作為參考。
在優(yōu)選的實施方案中，微氣泡制劑可以用聲處理來制備。聲處理可以用許多方法來完成。例如，可以通過一個薄膜來對一個裝有表面活性劑溶液及液面上空間含有氣體的小瓶進行聲處理。優(yōu)選地，該薄膜的厚度小于約0.5或0.4mm，更優(yōu)選是小于約0.3mm或者甚至小于0.2mm，也就是其厚度比超聲波在該材料中的波長還小，以便獲得可以接受的傳播速度和將薄膜的發(fā)熱量降低至最小的程度。該薄膜可以使用下述各種材料來制造，例如橡膠、聚四氟乙烯、聚酯、尿烷、鋁化薄膜、或者任何其它能夠傳播聲波的合成的和天然的聚合物薄膜或者能形成薄膜的材料。超聲處理可以使用一個超聲波探頭或者使用聚焦超聲“束”接觸或者甚至推壓薄膜來進行。超聲波探頭可以隨意使用。在每一種情況下，可以將探頭正對著薄膜放置或者將探頭插過薄膜并進入液體中。一旦完成了聲處理即可以將微氣泡溶液從小瓶中倒出并提供患者使用。
聲處理也可以在一個類似于噴墨印刷機的注射器中進行，在該注射器上帶有一個低能超聲波振動吸氣裝置。另外，也可將一個注射器或小瓶放置在一個低能超聲波槽中并在其中進行聲處理，該超聲槽能將其能量聚焦到該容器內(nèi)的一個點上。
也可以考慮使用機械方法來形成微氣泡。例如，可以使用一個機械高剪切閥(或者兩個注射器針頭)和兩個注射器，或者一個裝在注射器上的吸氣裝置來形成氣泡。甚至可以使用簡單搖動的方法。下文所述的氣泡縮小技術(shù)特別適用于機械法形成氣泡，它比聲處理氣泡法所耗的能量少。這類氣泡通常的直徑要比最終希望的生物相容造影劑大得多，但是可以按照本發(fā)明使這些氣泡縮小到適宜的大小。
在另一種方法中，微氣泡可以通過使用一種被調(diào)節(jié)氣飽和的液態(tài)滲透劑乳液來形成，所說的飽和作用是在提高的壓力下將調(diào)節(jié)氣通入一種表面活性劑溶液來達到。這種生產(chǎn)方法可以按照類似于打開蘇打汽水瓶的方式來進行，在打開汽水瓶時，其中的氣體泡沫在釋放壓力時就形成了氣泡。
在另一種方法中，氣泡可以使用全氟丁烷、氟利昂或者其它能在釋放壓力時便會沸騰的類似物質(zhì)，象剃須膏起泡沫那樣。但是，按照該方法，希望乳液的沸騰溫度足夠低，或者其中含有許多氣泡成核點，以便防止水相的過熱和過飽和，這種過飽和將導至在有限數(shù)量的成核點上形成少量的大氣泡而不是形成所希望的大量的小氣泡(每一小滴上一個氣泡)。
在可供選擇的方法中，可以將一種表面活性劑的凍干凝塊和一些由含有細孔或孔隙的結(jié)構(gòu)物形成的填充劑放入一個裝有無菌溶液和液面空間含有滲透氣體混合物的小瓶中。可以將該溶液迅速冷凍以產(chǎn)生一種細冰晶結(jié)構(gòu)，并因此在凍干時產(chǎn)生了細孔(冰晶被除去后形成的空隙)。
可供選擇地，可以使用任何可溶解的或溶解后形成孔隙的結(jié)構(gòu)物或物質(zhì)，例如粉末狀或細粒狀的蔗糖。不必要求這類結(jié)構(gòu)物質(zhì)在加入液體介質(zhì)之前就具有許多孔隙。另外，雖然優(yōu)選的是形成孔隙的結(jié)構(gòu)物含有表面活性劑，但是在實施本發(fā)明時并不要求這一點。在該實施方案中，形成孔隙的物質(zhì)不是由表面活性劑形成，其中也不含表面活性劑，只是將表面活性劑和液體二者加到一個裝有結(jié)構(gòu)物和所需氣體或多種氣體混合物的容器中。在進行復制時這些孔隙俘獲了所說的滲透氣體并且隨著固體團塊或粉末的溶解，在這些孔隙中就形成了含有氣體或氣體混合物的微氣泡。
在另一種方法中，可以用一種氣體滲透劑來穩(wěn)定那些干燥的含孔隙顆粒或者其它能夠優(yōu)選在水溶液中迅速溶解或水合的結(jié)構(gòu)物(例如空心小球或蜂窩狀物)，例如清蛋白、細粉狀蔗糖晶粒、空心的噴霧干燥蔗糖、鹽、空心的表面活性劑小球、干燥的多孔聚合物小球、干燥的多孔透明質(zhì)酸，或者取代的透明質(zhì)酸小球，或者甚至市售的干燥乳糖小球。另外，雖然變性的蛋白質(zhì)微球并不特別易溶，但是根據(jù)本文的說明，它們?nèi)赃m合在本發(fā)明并作為含有空隙的結(jié)構(gòu)物使用。
因此，在廣義方面，本發(fā)明提供了一類微氣泡原質(zhì)的組合物，該組合物含有一種具有許多孔隙的結(jié)構(gòu)物；一種分散在所說孔隙中并含有氟代醚的氣體或氣體混合物；以及一種表面活性劑，在將一種液體加入所說的溶器中時，此處所說的結(jié)構(gòu)物、所說的氣體或氣體混合物以及所說的表面活性一起配合形成微氣泡。
可以理解，此處所用的術(shù)語‘結(jié)構(gòu)物’應包括任何具有許多孔隙并在與液體介質(zhì)摻合時能夠促使氣泡形成的物質(zhì)。這類結(jié)構(gòu)物包括含有空隙的或能形成空隙的結(jié)構(gòu)物，它們可以溶解或不溶在含水的環(huán)境中。適用于本發(fā)明的典型結(jié)構(gòu)物包括，但不限于，噴霧干燥粉末、粉末狀或細粒狀蔗糖、包括變性蛋白質(zhì)微球在內(nèi)的各種蛋白質(zhì)微球、凍干團塊、凍干粉末、鹽、空心表面活性劑小球、干燥的多孔聚合物小球和干燥的多孔透明質(zhì)酸。特別優(yōu)選的實施方案中，所說的結(jié)構(gòu)物包含表面活性劑。
優(yōu)選地，含有低奧斯特瓦爾德系數(shù)氣體的氣乳液組合物可通過將一種含有親水單體或聚合物或它們的混合物的含水分散體進行噴霧干燥來制備。該方法也詳細地記載于共同未決的美國專利申請序列號No.08/405,477中。在此情況下，形成氣泡的組合物可以通過噴霧干燥含如淀粉疏水成分的含水分散體來形成，優(yōu)選還包括表面活性物質(zhì)。更具體地說，形成一種干燥的、空心的粉末，該粉末微球的多孔殼體的直徑約為1～10μm，并且殼體的厚度約為0.2μm。市售的噴霧干燥器對于本領域的技術(shù)人員是熟知的，對于任何顆粒狀淀粉/表面活性劑分散體的適用裝量可以很容易地通過標準的實驗測定來確定，具體也可參考后面的實施例。在形成之后，通過將微球放入小瓶中，抽出小瓶中的空氣，然后用所需氣體或氣體混合物置換的方法來使所需氣體滲透入結(jié)構(gòu)物質(zhì)中。
在需要進行噴霧干燥的溶液中的親水部分，例如可以是碳水化合物，例如葡萄糖、乳糖或淀粉。諸如PVA或PVP等聚合物也可以考慮。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，各種淀粉和衍生的淀粉特別適用。可用于形成微氣泡的特別優(yōu)選的淀粉包括那些分子量大于約500,000道爾頓或右旋糖當量(DE)值小于約12的淀粉。該DE值是一個對淀粉聚合物水解度的定量量度。它是一個以右旋標準為100進行比較而獲得的能量降低值。DE值越高，則該淀粉的水解度越大。這些優(yōu)選的淀粉包括在食品工業(yè)中市售類型的食品級植物淀粉，包括那些由國家淀粉和化學公司(National Starch and Chemical Co.)(Bridgewater，美國新澤西州)以商標N-LOK和CAPSULE出售的淀粉；衍生淀粉，例如羥乙基淀粉(包括由杜邦藥物公司以商標HETASTARCH和HESPAN出售的羥乙基淀粉和由日本東京Ajinimoto出售的M-羥乙基淀粉)。但是，由于分子量為500,000或更高的淀粉具有特別優(yōu)良的穩(wěn)定特性，因此較為優(yōu)選(注意，短鏈淀粉能較好地噴霧干燥并可用來生產(chǎn)本發(fā)明的微氣泡)。在該實施方案中，親水單體或聚合物是以一種濃度在約0.1％至10％w/v溶液范圍內(nèi)的先質(zhì)溶液的形式存在，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，以1％至5％w/v特別合適。
優(yōu)選地，含水分散體還包括濃度約為0.01％至20％w/v溶液的任選表面活性劑或表面活性劑混合物。許多表面活性劑或表面活性劑混合物都是已知的并且都可以使用。表面活性劑可從下列物組中選擇，即磷脂、膽堿磷酸、溶血磷脂、非離子型表面活性劑、中性或陰離子型表面活性劑、氟代表面活性劑，它們可以是中性的或陰離子型的，也可以是這類乳化劑或起泡劑的混合物。表面活性劑的其他具體例子包括聚氧丙烯和聚氧乙烯的嵌段共聚物(這類化合物的例子有Pluronic，例如Pluronic F-68)、蔗糖酯、脂肪醇、脂族氧化胺、透明質(zhì)酸脂族酯、透明質(zhì)酸脂族酯鹽、十二碳聚(乙烯氧基)乙醇、壬基苯氧基聚(乙烯氧基)乙醇、衍生淀粉、羥乙基淀粉脂肪酸酯、脂肪酸鹽、商業(yè)食品級植物淀粉、葡聚糖脂肪酸酯、山梨糖醇脂肪酸酯、明膠、血清清蛋白，以及上述物質(zhì)組合物。可以考慮的還有聚氧乙烯脂肪酸酯，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，聚氧乙烯脂肪醇酯、聚氧乙烯化脫水山梨醇脂肪酸酯、聚乙二醇羥基硬脂酸甘油酯、聚乙二醇蓖麻醇酸甘油酯、乙氧基化大豆甾醇、乙氧基化蓖麻油，以及它們的氫化衍生物。另外，非離子型烷基葡糖苷，例如Tweens、Spans和Brijs也屬于本發(fā)明的范圍。Spans包括脫水山梨醇四油酸酯、脫水山梨醇四硬脂酸酯、脫水山梨醇三硬脂酸酯、脫水山梨醇棕櫚酸酯、脫水山梨醇三油酸酯和脫水山梨醇二硬脂酸酯。Tween包括聚氧乙烯脫水山梨醇三硬脂酸酯、聚氧乙烯脫水山梨醇三棕櫚酸酯、聚氧乙烯脫水山梨醇三油酸酯。Brij族是另一類有用的物質(zhì)，它們包括聚氧乙烯十硬脂基醚。陰離子型表面活性劑，特別是具有6～24個碳原子的脂肪酸(或其鹽)，也可以使用。適用的陰離子型表面活性劑的一個例子是油酸或其鹽，油酸鈉。陽離子型表面活性劑及其鹽，例如十二烷基三甲基氯化銨也是適用的。
從上文可以看出，很大范圍內(nèi)的表面活性劑都可使用。的確，實際上任何表面活性劑(包括那些仍在進行研究的)或者表面活性劑組合物都可用于本發(fā)明。對于一種給定用途的最佳表面活性劑可以通過實驗研究來確定，但這并不需要過多的實驗。因此，人們在實施本發(fā)明的工藝時可以主要根據(jù)表面活性劑的性質(zhì)，例如生物相容性，來選擇表面活性劑。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對這種溶液來說，特別合適的是含有一種表面活性劑的混合物，其中包括作為第一表面活性劑的疏水磷脂和至少一種附加的較為親水的第二表面活性劑。優(yōu)選地，該疏水磷脂至少有一個其碳原子總數(shù)至少約為10的?；?例如二癸?；字?。在某些實施方案中，所說的磷脂第一表面活性劑將有含碳原子數(shù)從約10或14至約20或24的?；湣＠?，可以使用二棕櫚?；字Ｂ?含有兩個?；?，每個酰基鏈含有16個碳原子)。該?；B可以氫化或氟化。其他的磷脂端基也可以考慮。例如，磷脂酰絲氨酸、磷酸酰甘油或磷脂酰乙醇胺都具有適合于本發(fā)明的性質(zhì)。這類磷脂的組合物也可以含有“第一表面活性劑”，當然也可以是衍生的磷脂產(chǎn)品，例如雞蛋卵磷脂或大豆卵磷脂，或者肺的(lung)表面活性劑。另外，磷脂第一表面活性劑可以用諸如蔗糖的二酯，三酯和四酯等其他高度水不溶性的表面活性劑來補充。膽甾醇也可用來補充第一表面活性劑，并且已發(fā)現(xiàn)，當膽甾醇對磷脂的比例在約0.01～0.5w/w的范圍內(nèi)時，該膽甾醇也可用來提高穩(wěn)定性。優(yōu)選地，磷脂的?；準秋柡偷?，可是不飽和的?；矊儆诒景l(fā)明的范圍。第一表面活性劑的濃度優(yōu)選從約0.005％至約20％w/v溶液的范圍內(nèi)，最優(yōu)選在0.02％至約10％w/v的范圍內(nèi)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，優(yōu)選是使用這樣一種磷脂混合物。其中含有一種較為疏水的長酰基鏈磷脂以及一種比第一磷脂較為親水的短鏈磷脂。作為一個具體例子，一種具有12或14個碳原子的?；湹牡谝涣字梢耘浜弦环N作為輔助表面活性劑的具有8或10個碳原子的?；湹牡诙字?。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，不管是第一或第二表面活性劑，特別優(yōu)選具有含12個碳原子?；湹牧字?。例如，一種具有12個碳原子?；湹牧字梢园谝槐砻婊钚詣崽酋セ騊luronic化合物可以包含第二表面活性劑。作為另一種任選方案，一種具有16個碳原子?；湹牧字梢园谝槐砻婊钚詣环N具有12個碳原子?；湹牧字梢园诙砻婊钚詣?。
如果一種發(fā)泡劑，優(yōu)選為氟利昂113之類的氟碳化合物被分散在上述的淀粉/表面活性劑中，那么最終生產(chǎn)出的噴霧干燥產(chǎn)品就是一種較有效的發(fā)泡劑。該發(fā)泡劑可以是任何一種在噴霧干燥過程中能轉(zhuǎn)變成氣體的物質(zhì)?？梢允褂靡环N例如市售的微型流化器在約5000～15,000psi的壓力下將所說發(fā)泡劑均勻地分散在整個表面活性劑溶液中。該方法可以形成一種含有被單分子層表面活性劑包裹著的水不混溶性氟利昂(或其他發(fā)泡劑)亞微液滴的常規(guī)乳液。使用這種或那種技術(shù)的分散體對本領域的技術(shù)人員來說都是眾所周知的。
在形成較大量的空心微球時，處于需要進行噴霧干燥的溶液中的發(fā)泡劑夾雜物導致對每一克噴霧干燥的粉末需要消耗較多的超聲波信號。隨著進入噴霧干燥器中的溶液的霧化液滴在該干燥器中與熱空氣流混合，所說發(fā)泡劑就成為在這些霧化液滴中形成氣泡流的晶核。合適的發(fā)泡劑是那些在為了使液滴干燥的高溫(約100℃)下能使霧化液滴中的溶液被氣體或蒸氣過飽和的發(fā)泡劑。適用的發(fā)泡劑包括1.具有與水溶液有限可混溶性的溶解的低沸點(低于100℃)溶劑，例如二氯甲烷、丙酮和二硫化碳，它們用于在室溫下使溶液飽和。
2.用于在室溫和提高壓力下(例如3巴)使溶液飽和的氣體，例如CO2或N2。然后在1大氣壓和100℃的條件下用該氣體使液滴過飽和。
3.不混溶的低沸點(低于100℃)液體的乳液，例如氟利昂113、全氟戊烷、全氟己烷、全氟丁烷、戊烷、丁烷、FC-11、FC-11B1、FC-11B2、FC-12B2、FC-21、FC-21B1、FC-21B2、FC-31B1、FC-113A、FC-122、FC-123、FC-132、FC-133、FC-141、FC-141B、FC-142、FC-151、FC-152、FC-1112、FC-1121和FC-1131。
將發(fā)泡劑按照相當于表面活性劑的0.5％至10％v/v的數(shù)量加入淀粉/表面活性劑溶液中。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，為了生產(chǎn)一種能夠形成穩(wěn)定微氣泡的噴霧干燥粉末，約需3％v/v的發(fā)泡劑。該發(fā)泡劑在噴霧干燥的過程中基本上蒸發(fā)掉，因此在最終噴霧干燥粉末中的存在量不多于痕量。
在該溶液中的其他任選組分是在該水相內(nèi)的各種鹽或其他試劑。這類試劑優(yōu)選地可以包括常規(guī)的粘度調(diào)節(jié)劑；緩沖劑，例如磷酸鹽緩沖劑或其他常規(guī)生物相容的緩沖劑或者pH調(diào)節(jié)劑，例如酸或堿；滲透劑(用于提供等滲性、高滲性或低滲性)。優(yōu)選的溶液具有約為7的pH值并且是一種等滲溶液。這些附加成分每一種的含量通常都少于該溶液的5％w/v。適用鹽的例子包括磷酸鈉(包括一元和二元)、氯化鈉、磷酸鈣以及其他在生理學上可接受的鹽。
在噴霧干燥之后，在最終噴霧干燥產(chǎn)品中優(yōu)選地按下列重量百分比含有微球的各個組分親水結(jié)構(gòu)物 1％至100％表面活性劑 0％至90％鹽類、緩沖劑等 0％至90％在特別優(yōu)選的實施方案中，該組合物按下列重量百分比含有下列組分親水結(jié)構(gòu)物 10％至60％表面活性劑 0.1％至10％鹽類、緩沖劑等 10％至60％正如上述，通過將微球放入一個安置在真空室內(nèi)以抽去其中空氣的小瓶中而使所需氣體滲透入所說的干燥微球中。因此就使其中的空氣被所需的氣體或氣體混合物取代。然后該氣體就擴散入微球的孔隙中。擴散作用可通過加壓或真空循環(huán)來促進。然后將該小瓶進行鋸齒形密封并且優(yōu)選用γ射線或加熱來滅菌。
優(yōu)選地，第一主調(diào)節(jié)氣(它可以是空氣或空氣的任何組成氣體，例如氮)和第二滲透穩(wěn)定劑氣體(優(yōu)選具有低的奧斯特瓦爾德系數(shù))分別按照約1∶100、1∶75、1∶50、1∶30、1∶20或1∶10至約1000∶1、500∶1、250∶1、100∶1、75∶1或50∶1的摩爾比存在。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所說的氣體是已經(jīng)在20℃下用全氟二甘醇二甲醚飽和過的氮氣。IV.組裝和使用應予說明，用于制備本發(fā)明微氣泡制劑的設備可以制備出來。這些設備包括一個內(nèi)裝上述用于形成微氣泡的氣體或氣體混合物、液體和表面活性劑的容器。該容器可以在它的一個室中容納所有的無菌干燥組分和氣體，而在同一容器的第二個室中容納無菌的水溶液。另一方法是所說表面活性劑可在加入之前預先溶解在液體中。
從而，在廣義方面，本發(fā)明提供了一種用于制備氣乳液的方法，該方法包括提供一個容器，其中裝有一種具有許多空隙的結(jié)構(gòu)物質(zhì)、一種表面活性劑以及一種分散于空隙中的含有氟代醚的氣體或氣體混合物；將一種含水液體加入此容器中；以及將上述的結(jié)構(gòu)物質(zhì)、表面活性劑和含水液體一起攪拌，借此在容器中形成一種氣乳液，氣乳液含有被一層表面活性劑包圍的上述氣體或氣體混合物。
可購得適用的雙室小瓶容器，例如商標名稱為WHEATONRS177FLW或S-1702FL從Wheaton Glass Co.(Millville，美國新澤西州)。另一個例子是由B-DHYPAK提供的液體/干燥5+5ml雙室預充滿注射器系統(tǒng)(Becton Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，美國新澤西州；記載于美國專利US 4,613,326中)。該系統(tǒng)的優(yōu)點包括1.使用方便；2.一種水不溶性氣體滲透劑被一個小室密封著，在該小室的一側(cè)具有水溶液，而在該小室的另一側(cè)具有被面積非常小的彈性密封著的針頭；以及3.在制造注射器時可以將一種過濾針頭，例如Monoject#305(Sherwood Medical，St.Louis，美國密蘇里州)裝配在該注射器上，以保證沒有不溶解的固體被注射。
用于形成微氣泡的雙室注射器的使用方法記載于實施例VIII中。
本領域的普通技術(shù)人員可以懂得，其他能夠以無菌方式將噴霧干燥粉末和水溶液聯(lián)合裝在一起的雙室復制系統(tǒng)也屬于本發(fā)明的范圍。在這類系統(tǒng)中，特別優(yōu)選的是水相可以介于水不溶性滲透氣體和環(huán)境之間，以便增加產(chǎn)品本身的壽命。此處所說用于形成微氣泡所必須的物質(zhì)并不是預先存在于所說容器中，它可以與所說設備的其他元件一起組裝，優(yōu)選是按一種便于容易地與設備的其他元件配合的形式組裝或與容器一起組裝。
本發(fā)明微氣泡的具體應用的例子包括心臟和心肌組織的灌注法造影，以及用于測定心臟及組織在受到應力作用時或在傳統(tǒng)測試時的灌注特征，或者用于測定由于心肌梗塞所引起的灌注缺陷或變化。同樣地，可以在經(jīng)口或經(jīng)靜脈投入用于向心肌組織增加血液流量的藥物之后對心肌組織進行觀察。另外，對心肌組織由于各種插入物或在插入過程中所引起的變化，例如對冠狀組織靜脈搭橋、冠狀血管，或者使用血栓溶解劑(TPA或鏈激酶)引起的心肌組織的變化所進行的目測觀察效果也可以提高。由于這些造影劑可以方便地通過外圍靜脈注入體內(nèi)來提高導致整個循環(huán)系統(tǒng)的目測觀察效果，因此它們也有助于進行普通血管病理學的診斷和有助于通過超聲波方法對胎盤組織的生存能力進行監(jiān)督。
在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一種使用所公開的氣乳液作為造影劑進行諧波超聲造影的方法。本發(fā)明的氣泡特別適用于諧波造影方法，例如在共同未決的美國專利申請08/314,074中所述的那些方法。通過使所公開的微氣泡轉(zhuǎn)變輻照在受體(基體)上的超聲波輻射頻率的能力最優(yōu)化，就可以使造影效果提高。因此，本發(fā)明有利地提供了一種能夠產(chǎn)生在醫(yī)學上有用的諧波超聲激勵波幅的微氣泡的用途。
應予強調(diào)，本發(fā)明還具有超聲造影以外的用途。的確，本發(fā)明足夠廣泛地包括含有磷脂的氣乳液在任何系統(tǒng)中的用途，包括非生物學的用途。
還應理解，在本發(fā)明的微氣泡制劑中可以包含其他的成分。例如，可以加入滲透劑、穩(wěn)定劑、螯合劑、緩沖劑、粘度調(diào)節(jié)劑、空氣溶解度調(diào)節(jié)劑、鹽和糖等，以改善微氣泡懸浮液，使其達到最長的壽命，以及提高造影的效果。有關滅菌、等滲性和生物相容性方面的考慮可以決定這類用于加入注射組合物中的常規(guī)添加劑的應用。這類試劑的使用對于本領域的技術(shù)人員來說是清楚的，而試劑的具體用量、比例和類型可以通過少量的實驗來決定。
本發(fā)明的任何微氣泡制劑都可作為造影劑引入脊椎動物中，例如鳥或哺乳動物等，以便對這些脊椎動物的各個部位進行超聲造影。優(yōu)選地，所說的脊椎動物是人，而所說的造影部位是脊椎動物的血管。在該實施方案中，將少量的微氣泡(例如，0.1ml/kg〔2mg/kg噴霧干燥粉末〕，以動物的體重為基準)引入動物的血管內(nèi)。微氣泡的其他用量，例如從約0.005ml/kg至約1.0ml/kg，也可以使用。對心臟、動脈、靜脈和諸如肝和腎等富血器官的造影也可以采用該技術(shù)進行超聲造影。V.實施例參考下列實施例將使上述內(nèi)容變得更易理解。然而這些實施例只是用于實施本發(fā)明的較佳方法，它們不能限定本發(fā)明或所附權(quán)利要求的范圍。
實施例I通過聲處理來制備微氣泡通過對一種含有2％Pluronic F-68和1％蔗糖硬脂酸酯作為表面活性劑、空氣作為調(diào)節(jié)氣和全氟己烷作為氣體滲透劑的等滲水相進行聲處理制備出一種加權(quán)數(shù)均(average number weighted)直徑為5微米的微氣泡。
在該實施例中，將1.3ml含有0.9％NaCl、2％Pluronic F-68和1％蔗糖硬脂酸酯的無菌水溶液加入到2.0ml小瓶中。該小瓶具有0.7ml原來含有空氣的剩余液面上空間。使用一種在25℃下被全氟己烷蒸氣飽和過的空氣(220托的全氟己烷和540托的空氣)置換該小瓶的液面上空間。用一層厚度為0.22mm的聚四氟乙烯(PTFE)隔膜將該小瓶密封。將該小瓶水平地倒轉(zhuǎn)，然后用一個連接在一臺由Sonics &Materials購得的，VC50型的50瓦近距離聲波定位器上的1/8″(3mm)聲處理探頭輕度地正向壓在所說隔膜上。在該位置上，所說隔膜將探頭與溶液隔開。然后將電能與探頭接通并將該溶液進行約15秒聲處理，形成了一種細分散微氣泡的白色溶液，用Horiba LA-700激光散射粒度分析儀測得這些微氣泡的加權(quán)數(shù)均直徑為5微米。
實施例II含磷脂溶液的噴霧干燥用水制備1升用于注射的下列溶液2.0％w/v的Maltrin M-100麥芽糖糊精(Grain Processing Corp.Muscatine，美國衣阿華州)、0.95％w/v的氯化鈉(Mallinckrodt，St.Louis，美國密蘇里州)、1.0％的Superonic F-68(Serva，Heidelberg，德國)、1.0％w/v的Ryoto蔗糖硬脂酸酯S-1670(Mitsubishi-Kasei Food Corp.，東京，日本)和0.5％的類脂E-100-3氫化磷脂(Ludwigshafen，德國)。
然后使用一臺配備有兩個流體噴嘴(Niro噴嘴，哥本哈根，丹麥)的Niro噴嘴輕便式噴霧干燥器將所說溶液進行噴霧干燥，噴霧干燥時使用下列條件熱空氣流量 39.5CFM入口空氣溫度 245℃出口空氣溫度 100℃噴嘴空氣流量 350升/分液體進料速率 l升/小時這些干燥的空心小球狀產(chǎn)品的直徑在約1μm至15μm之間，這些產(chǎn)品按照該干燥器的標準通過旋風分離器收集。稱取等量份的粉末(250mg)并將每一份加入到一個10ml的管形瓶中，抽真空然后用一種由全氟己烷在13℃飽和過的氮氣噴霧并于最后將其密封。該氮氣事先用全氟己烷飽和，其方法是將所說氮氣通過三個裝有全氟己烷并浸沒在13℃水浴中的洗氣瓶來進行。
在用5ml水進行復制以用于注射時，用光學顯微鏡觀察到許多氣泡，這些氣泡的直徑在1～20微米的范圍內(nèi)。在一段相當長的時間內(nèi)可以觀察到許多直徑約為1微米的氣泡這一事實表明，通過在分子式中引入磷脂作為附加的非牛頓型粘彈性表面活性劑可獲得更高的穩(wěn)定性。
實施例III含有蔗糖酯/Poloxamer表面活性劑的全氟二甘醇二甲醚氣乳液使用下列成分制備下列兩種溶液各1升以用于注射溶液13.9％w/v的m-HES羥乙基淀粉(Ajinimoto，東京，日本)
3.25％w/v的氯化鈉(Mallinckrodt，St.Louis，美國密蘇里州)2.83％w/v的磷酸鈉，二元(Mallinckrodt，St.Louis，美國密蘇里州)0.42％w/v的磷酸鈉，一元(Mallinckrodt，St.Louis，美國密蘇里州)溶液22.11％w/v的Poloxamer188(BASF，Parsipany，美國新澤西州)0.32％w/v的Ryoto蔗糖硬脂酸酯S-1670(Mitsubishi-Kasei FoodCorp.，東京，日本)0.16％w/v的Ryoto蔗糖硬脂酸酯S-570(Mitsubishi-Kasei FoodCorp.，東京，日本)將溶液2加入一臺高剪切混合器中混合，然后將其置于冰浴中冷卻。制備一種由30ml 1，1，2-三氯三氟乙烷(氟利昂113；EMScience，Gibbstown，美國新澤西州)在1升溶液2中的粗懸浮液。使用一種微型流化器(Microfluidics Corporation，Newton，MA；型號M-110F)，在10,000 psi的壓力和5℃的條件下將此懸浮液乳化5次。所獲乳液加入到溶液1中。然后使用一臺配備有兩個流體噴嘴(Niro噴嘴，哥本哈根，丹麥)的Niro噴嘴輕便式噴霧干燥器將所獲混合物噴霧干燥，噴霧干燥時使用下列條件熱空氣流量 31CFM入口空氣溫度 270℃出口空氣溫度 120℃噴嘴空氣流量 290升/分液體進料速率 1.5升/小時這些干燥的空心小球狀產(chǎn)品的直徑在約1μm至約15μm之間，這些產(chǎn)品按照該干燥器的標準通過旋風分離器收集。稱取等量份的粉末(200mg)并將每一份加入一個10ml的管形瓶中，使用一種由全氟二甘醇二甲醚在20℃的飽和過的氮氣噴霧，然后將其密封。該氮氣事先用全氟二甘醇二甲醚飽和，其方法是將所說氮氣通過三個裝有全氟二甘醇二甲醚并浸沒在20℃水浴中的洗氣瓶來進行。每個小瓶的全氟二甘醇二甲醚的蒸氣量為12～14mg。
將該小瓶用5ml水復制以供注射用，其方法是先向該小瓶插入一個18號針頭以作為釋放壓力的通氣孔，然后將水注入，這時在每ml溶液中形成了約6×108個氣泡，這些氣泡在體外穩(wěn)定了幾天。
用1ml所獲的微氣泡懸浮液給一個重約3kg的兔子進行靜脈注射，對該兔子安裝有監(jiān)測儀，以便監(jiān)視該兔子的頸動脈的多普勒超聲信號。將一個10MHz的流動封套(flow cuff)(Triton Technology Inc.，圣地亞哥，美國加州；型號ES-10-20)連接到一個系統(tǒng)6多普勒流量模件(Triton Technology Inc.)上，以便將RF多普勒信號輸入LeCroy9410示波器(LeCroy，Chestnut Ridge，紐約)。把由示波器計算得的該信號的均方根(RMS)電壓 值輸入計算機，然后根據(jù)所獲曲線求得峰值回波信號強度和微氣泡在血液中的半衰期。在造影之前的信號小于0.1伏RMS。
注射之后60秒時的信號強度為1.1V rms，其衰變常數(shù)約為.00859s-1。
實施例IV含有磷脂/Poloxamer表面活性劑的全氟二甘醇二甲醚氣乳液使用下列成分制備下列兩種溶液各1升以用于注射溶液136g m-HES羥乙基淀粉(Ajinimoto，東京，日本)30g氯化鈉(Mallinckrodt，St.Louis，美國密蘇里州)26g磷酸鈉，二元(Mallinckrodt，St.Louis，美國密蘇里州)3.9g磷酸鈉，一元(Mallinckrodt，St.Louis，美國密蘇里州)溶液24.5g Poloxamer188(BASF，Parsipany，美國新澤西州)4.5g二棕櫚酰基磷脂酰氯(AVanti Polar Lipids，Alabaster，美國阿拉巴馬州)將溶液2加入一臺高剪切混合器中混合，然后將其置于冰浴中冷卻。制備一種由30ml 1，1，2-三氯三氟乙烷(氟利昂113；EMScience，Gibbstown，美國新澤西州)在1升溶液2中的粗懸浮液。使用一種微型流化器(Microfluidics Corporation，Newton，MA；型號M-110F)，在10,000psi的壓力和5℃的條件下將此懸浮液乳化5次。將所獲乳液加入到溶液1中。然后使用一臺配備有兩個流體噴嘴(Niro噴嘴，哥本哈根，丹麥)的Niro噴嘴輕便式噴霧干燥器將所獲混合物噴霧干燥，噴霧干燥時使用下列條件熱空氣流量31CFM入口空氣溫度 325℃出口空氣溫度 120℃噴嘴空氣流量 290升/分乳液進料速率 1.5升/小時這些干燥的空心小球狀產(chǎn)品的直徑在約1μm至約15μm之間，這些產(chǎn)品按照該干燥器的標準通過旋風分離器收集。稱取等量份的粉末(200mg)并將每一份加入一個10ml的管形瓶中，使用一種由全氟二甘醇二甲醚在20℃的飽和過的氮氣噴霧，然后將其密封。該氮氣事先用全氟二甘醇二甲醚飽和，其方法是將所說氮氣通過三個裝有全氟二甘醇二甲醚并浸沒在20℃水浴中的洗氣瓶來進行。每個小瓶的全氟二甘醇二甲醚的蒸發(fā)量為12～14mg。
將該小瓶用5ml水復制以供注射用，其方法是先向該小瓶插入一個18號針頭以作為釋放壓力的通氣孔，然后將水注入，這時在每ml溶液中形成了約3×108個氣泡，這些氣泡在體外穩(wěn)定了幾天。
用1ml所獲的微氣泡懸浮液給一個重約3kg的兔子進行靜脈注射，對該兔子安裝有監(jiān)測儀，以便監(jiān)視該兔子的頸動脈的多普勒超聲信號。將一個10MHz的流動封套(flow cuff)(Triton Technology Inc.，圣地亞哥，美國加州；型號ES-10-20)連接到一個系統(tǒng)6多普勒流量模件(Triton Technology Inc.)上，以便將RF多普勒信號輸入LeCroy9410示波器(LeCroy，Chestnut Ridge，紐約)。把由示波器計算得的該信號的均方根(RMS)電壓·值輸入計算機，然后根據(jù)所獲曲線求得峰值回波信號強度和微氣泡在血液中的半衰期。在造影之前的信號小于0.1伏RMS。
注射之后60秒時的信號強度為0.4V rms，其衰變常數(shù)約為.01835s-1。
實施例V含有磷脂混合物表面活性劑的全氟二甘醇二甲醚氣乳液使用下列成分制備下列兩種溶液各1升以用于注射溶液136g m-HES羥乙基淀粉(Ajinimoto，東京，日本)
30g氯化鈉(Mallinckrodt，St.Louis，美國密蘇里州)26g磷酸鈉，二元(Mallinckrodt，St.Louis，美國密蘇里州)3.9g磷酸鈉，一元(Mallinckrodt，St.Louis，美國密蘇里州)溶液24.8g二棕櫚?；字Ｂ?AVanti Polar Lipids，Alabaster，美國阿拉巴馬州)3.4g二辛酰基磷脂酰氯(AVanti Polar Lipids，Alabaster，美國阿拉巴馬州)將溶液2加入一臺高剪切混合器中混合，然后將其置于冰浴中冷卻。制備一種由30ml 1，1，2-三氯三氟乙烷(氟利昂113；EMScience，Gibbstown，美國新澤西州)在1升溶液2中的粗懸浮液。使用一種微型流化器(Microfluidics Corporation，Newton，MA；型號M-110F)，在10,000psi的壓力和5℃的條件下將此懸浮液乳化5次。將所獲乳液加入到溶液1中。然后使用一臺配備有兩個流體噴嘴(Niro噴嘴，哥本哈根，丹麥)的Niro噴嘴輕便式噴霧干燥器將所獲混合物噴霧干燥，噴霧干燥時使用下列條件熱空氣流量31CFM入口空氣溫度 270℃出口空氣溫度 120噴嘴空氣流量 290升/分液體進料速率 1.5升/小時這些干燥的空心小球狀產(chǎn)品的直徑在約1μm至約15μm之間，這些產(chǎn)品按照該干燥器的標準通過旋風分離器收集。稱取等量份的粉末(200mg)并將每一份加入一個10ml的管形瓶中，使用一種由全氟二甘醇二甲醚在13℃的飽和過的氮氣噴霧，然后將其密封。該氮氣事先用全氟二甘醇二甲醚飽和，其方法是將所說氮氣通過三個裝有全氟二甘醇二甲醚并浸沒在13℃水浴中的洗氣瓶來進行。每個小瓶的全氟二甘醇二甲醚的蒸發(fā)量為12～14mg。
將該小瓶用5ml水復制以供注射用，其方法是先向該小瓶插入一個18號針頭以作為釋放壓力的通氣孔，然后將水注入，這時在每ml溶液中形成了約2×108個氣泡，這些氣泡在體外穩(wěn)定了幾天。
用1ml所獲的微氣泡懸浮液給一個重約3kg的兔子進行靜脈注射，對該兔子安裝有監(jiān)測儀，以便監(jiān)視該兔子的頸動脈的多普勒超聲信號。將一個10MHz的流動封套(flow cuff)(Triton Technology Inc.，圣地亞哥，美國加州；型號ES-l0-20)連接到一個系統(tǒng)6多普勒流量模件(Triton Technology Inc.)上，以便將RF多普勒信號輸入LeCroy9410示波器(LeCroy，Chestnut Ridge，紐約)。把由示波器計算得的該信號的均方根(RMS)電壓·值輸入計算機，然后根據(jù)所獲曲線求得峰值回波信號強度和微氣泡在血液中的半衰期。在造影之前的信號小于0.1伏RMS。
注射之后60秒時的信號強度為0.2V rms，其衰變常數(shù)約為.00387s-1。
實施例Vl由長鏈/短鏈磷脂混合物制備的氣乳液的生物相容性按照實施例II所述的方法制備l升用于噴霧干燥的下列乳液3.6％w/v的m-HES羥乙基淀粉(Ajinimoto，東京，日本)3.0％w/v的氯化鈉(Mallinckrodt，St.Louis，美國密蘇里州)2.6％w/v的磷酸鈉，二元(Mallinckrodt，St.Louis，美國密蘇里州)3.9％w/v的磷酸鈉，一元(Mallinckrodt，St.Louis，美國密蘇里州)0.22％w/v的二棕櫚?；字Ｂ?Syngena Ltd.，Cambridge，MA)0.3l％w/v的二辛?；字Ｂ?AVanti Polar Lipids Inc.，Alabaster，美國阿拉巴馬州)3.0％v/v的1，1，2-三氯三氟乙烷)氟利昂1l3；EM Science，Gibbstown，美國新澤西州)按照二棕櫚?；字Ｂ葘Χ刘；字Ｂ鹊谋壤砻婊钚詣﹥H形成混合膠粒。在用5ml水復制時，觀察到在每ml中存在約51,000,000個氣乳液微滴，其直徑在1至20μm的范圍內(nèi)。在使用劑量為5mg/kg的條件下，測得在兔子體內(nèi)氣乳液的回波信號的第一級衰變常數(shù)為.0029s-1。這相應于4分鐘的靜脈半衰期。
使用一套由Quidel Corp.提供的體外C3a診斷設備分析該氣乳液對其余成分的活化作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在氣乳液和負對照物(鹽水)之間沒有差別，這一事實表明，氣乳液不會活化其余成分。眾所周知，裸露的微氣泡活化其余成分。
測試樣品〔C3a〕(ng/ml)酵母聚糖(正對照物) 43403鹽水(負對照物) 604氣乳液 412也采用20mg/kg的劑量測定了氣乳液對一些被麻醉的狗體內(nèi)血液動力學的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，平均動脈壓力或肺動脈壓力皆沒有發(fā)生變化。這些結(jié)果表明，使用10～100倍于臨床應用劑量的氣乳液仍未觀察到對血液動力學的影響。
時間(分) 平均動脈壓力肺動脈壓力(mmHg) (mmHg)0109.4 13.31109.2 14.22110.4 14.15115.0 14.310 117.9 15.760 111.0 13.290 120.9 13.6因此，使用相同的氣乳液制劑可以提供優(yōu)良的效果和生物相容性。
實施例VII使用雙室小瓶來形成微氣泡稱取800mg的噴霧干燥粉末并將其裝入一個20ml的WheatonRS-177 FLW雙室小瓶的下室中。在插入一塊室間密封板之前首先用一種由全氟己烷在13℃下飽和過的氮氣沖洗該小瓶。在上室注入10ml用于注射的無菌水。插入一塊上室擋板以消除處于上室中的所有空氣泡。在壓下上擋板時，將室間密封板強制壓入下室中，以便允許水流入下室并復制該粉末。當用光學顯微鏡觀察時，發(fā)現(xiàn)了許多穩(wěn)定的微氣泡。這一程序說明了該組裝方式的方便性，并且在將水相加到粉末中時不需要提供一個用于消除壓力增大的通氣孔。
實施例VIII使用雙室注射器來形成微氣泡稱取100mg的噴霧干燥粉末并將其加入一個5ml+5ml的HYPAK液體/干燥雙室注射器(Becton Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)中，然后將其振搖入粉末(針頭端)室中。接著將室間密封板剛好放置在旁路通道的上方。然后將一枚含有一個5μm過濾器的針頭裝配在注射器上。接著將這個含粉末的小室用氣體滲透劑來充滿，其方法是將該裝置放入一個真空室中，抽真空，然后用氣體滲透劑，即一種在13℃下被全氟己烷飽和過的氮氣，重新充滿該小室。該過濾器針頭允許抽真空并允許大氣重新充滿含粉末的小室中。接著將一個密封的針頭蓋安放在該針頭上。然后用4ml注射用水注入液體室中并利用一個臨時性開孔(插入在玻璃注射器針筒與柱塞之間的金屬絲以消除所有的空氣泡)將柱塞裝配入其中。
為了復制，除去針頭密封蓋以消除積累在粉末室中的壓力。然后將柱塞壓下，迫使室間密封板達到旁路的位置，該旁路允許水繞過室間密封板而流入含粉末的小室中。當所有的水都處于粉末室中時就停止柱塞的移動。將該注射器振搖以使粉末溶解。然后用手握住注射器，保持針頭端向上并進一步推壓柱塞，從而將多余的氣體和任何大氣泡完全排出。然后將柱塞推壓至極限位置以使含有許多穩(wěn)定微氣泡(可用光學顯微鏡觀察)的溶液從注射器中排出。
實施例IX含氟代醚的氣乳液與含空氣和氟代烷的氣乳液在體內(nèi)效果的對比按照實施例III所述的方法制備1升分散液A并將其噴霧干燥，以及按照實施例V所述的方法制備1升分散液B和C并將其噴霧干燥。
A.蔗糖酯微氣泡制劑(表中的“AF0145”)36g m-HES羥乙基淀粉(Ajinimoto，東京，日本)30g氯化鈉(Mallinckrodt，St.Louis，美國密蘇里州)26g磷酸鈉，二元(Mallinckrodt，St.Louis，美國密蘇里州)3.9g磷酸鈉，一元(Mallinckrodt，St.Louis，美國密蘇里州)4.5g蔗糖酯11025003(Alliance Pharmaceutical Corp.，圣地亞哥，美國加州)19.5g Poloxamer188(BASF，Parsipany，美國新澤西州)30ml 1，2，2-三氯三氟乙烷(氟利昂113；EM Science，Gibbstown，美國新澤西州)注射用水490mlB.磷脂混合物微氣泡制劑(表中的“24b”)36g m-HES羥乙基淀粉(Ajinimoto，東京，日本)30g氯化鈉(Mallinckrodt，St.Louis，美國密蘇里州)26g磷酸鈉，二元(Mallinckrodt，St.Louis，美國密蘇里州)3.9g磷酸鈉，一元(Mallinckrodt，St.Louis，美國密蘇里州)4.5g Dimiristoyl磷脂酰氯(Avanti Polar Lipids，Alabaster，美國阿拉巴馬州)4.5g二辛?；字Ｂ?Avanti Polar Lipids，Alabaster，美國阿拉巴馬州)5.8％v/v的全氯己烷(3M)注射用水490mlC.磷脂混合物微氣泡制劑(表中的“24f”)36g m-HES羥乙基淀粉(Ajinimoto，東京，日本)30g氯化鈉(Mallinckrodt，St.Louis，美國密蘇里州)26g磷酸鈉，二元(Mallinckrodt，St.Louis，美國密蘇里州)3.9g磷酸鈉，一元(Mallinckrodt，St.Louis，美國密蘇里州)3.4g Dimiristoyl磷脂酰氯(Avanti Polar Lipids，Alabaster，美國阿拉巴馬州)4.8g二辛?；字Ｂ?Avanti Polar Lipids，Alabaster，美國阿拉巴馬州)5.8％v/v的全氟己烷(3M)注射用水490ml
將100mg的噴霧干燥樣品裝入一個10ml的小瓶中，用全氟代醚-空氣混合物充氣并借助于一個配備有三通閥的注射器針頭重復抽空-充氣循環(huán)。作為灌充氣體，使用了全氟代二甲醚(85％，ExfluorResearch，Texas，Austin)、全氟代(甲基·乙基醚)(80％，ExfluorResearch，Texas，Austin)、全氟代(二乙醚)(90％，Strem Chemicals，Newburyport，MA)、n-全氟丙烷和n-全氟丁烷(97％，PCRIncorporated)。在每一小瓶中全氟代醚和氟碳化合物的蒸氣量示于表中。在用5ml水復制之后，形成了一些能在體外穩(wěn)定幾天的氣泡。按照實施例III所述的方法，使用脈沖多普勒信號增強兔子模型(PulsedDoppler Signal Enhancement Rabbit Model)來評價這些氣泡在體內(nèi)的回波性能。樣品粉末灌充氣體 每小瓶中滲透灌多普勒信多普勒信序號充氣的量， 號，V，注射號，注射后mg/atm 后100秒 300秒124fCF3OCF316.5mg/0.26atm 0.30.1224fCF3OC2F538mg/0.46atm 0.80.2324fn-C3F849.7mg/0.65atm 0.60424f空氣- 0 0524bC2F5OC2F548.2mg/0.46atm1.25 0.6624bn-C4F1050mg/0.51atm 1.00.57 AF0145 CF3OC2F541.7mg/0.50atm 0.75 0.18 AF0145空氣 - 0 0所有全氟代醚樣品在注射入血液中之后300秒仍能給出清楚的超聲波信號。用空氣灌充的相同制劑在注射之后5秒即已不能給出任何回波。另外，灌充全氟代醚的樣品具有比同樣碳原子數(shù)的氟碳化合物同類物高出20～30％的效率，即使其使用量較小時也是如此，，附圖中示出了在上表所示的實驗1和2中以伏特計的脈沖多普勒信號與時間的函數(shù)的關系。
實施例X在注射氟代醚氣乳液之后心臟和干燥的體內(nèi)回波與注射含氟代烷的氣乳液的比較將實施例IX的表中所示的樣品2和3注射入兔子的耳靜脈中，然后使用一臺配有7MHz傳感器的ACUSON 128XP儀器測定超聲波散射信號。在注射剛結(jié)束后，兩種組合物都導致了血管和心臟的清楚造影。這種造影(在幾分鐘過程內(nèi))逐漸地消失并被肝臟的造影代替，該肝臟造影在使用全氟丁烷時持續(xù)～10分鐘(實施例3)，而使用全氟代(甲基·乙基醚)時則持續(xù)～15分鐘(實施例2)。
本發(fā)明提供了一種適合作為超聲波和磁共振成象(MRI)造影增強劑使用的，穩(wěn)定的氣體分散體或氣乳液，在這種乳液中的氣泡具有延長的體內(nèi)壽命。常規(guī)的超聲造影增強劑只能在一次通過動脈系統(tǒng)時，或在幾秒鐘至約一分鐘內(nèi)顯示出造影增強能力。因此，這種造影增強劑通常在進行靜脈注射之后，不能在通過患者的主動脈后進行循環(huán)。與此相對照，按照本發(fā)明制備的穩(wěn)定的造影劑能夠在進行靜脈注射之后，在足以多次通過患者的整個循環(huán)系統(tǒng)的期間內(nèi)持續(xù)地顯示造影增強效果。在體內(nèi)的氣泡很容易地顯示幾分鐘的壽命。在進行超聲波照射這樣長時間的造影增強能力是十分有利的。此外，本發(fā)明的造影增強劑能提供很清晰的圖象。例如，流過心臟、肝臟和腎臟的血液都能顯示出清楚、鮮明和清晰的圖象。因此，可以將少量無毒性劑量的本發(fā)明的組合物注射入外圍靜脈中以用來增強全身的造影。
實施例XI含全氟代醚氣乳液的體內(nèi)效應與含全氟代烷氣乳液的對比兔子模型按照實施例V所述的方法制備1升分散液D并將其噴霧干燥分散液D組合物43.2g m-HES羥乙基淀粉(Ajinimoto，東京，日本)31.32g磷酸鈉，二元(Mallinckrodt，St.Louis，美國密蘇里州)4.68g磷酸鈉，一元(Mallinckrodt，St.Louis，美國密蘇里州)1.2g Poloxamer188(BASF，Parsipany，美國新澤西州)6g二肉豆蔻?；字Ｂ?Avanti Polar Lipids，Alabaster，美國阿拉巴馬州)61.2g全氟己烷(3M)44.4g氯化鈉(Mallinckrodt，St.Louis，美國密蘇里州)注射用水945g將各含200mg噴霧干燥粉末的多個樣品分別裝入多個20ml的小瓶中，然后用一種預先在一個1升的氣袋中制備好的滲透劑-氮氣混合物向小瓶充氣。將這些裝有粉末的小瓶反復地抽空和用一種總壓力為1atm的滲透劑和氮氣的混合物充氣；該滲透劑的分壓等于0.13±0.03atm。所研究的滲透劑列于下面表III中。
表III 用于與氮混合的滲透劑和粉末D分子式來源 沸點，℃ 多普勒信號相對于基線的衰(名稱) 變時間，秒，在Pf＝0.13±0.03atm時n-C4F1097％，混有PCR -2 300(全氟丁烷)CF3-O-CF2CF2-O-CF399％，Exfluor 17 400(全氟一甘醇二甲醚)Research，Austin，TXn-C5F12(全氟戊烷) 97％，混有PCR 29 400CF3-(OCF2)3OCF395％，常規(guī)合成 59 1200(C5F12O4)n-C6F1498％，3M57 600(全氟己烷)CF3-(OCF2CF2)2OCF399％，Exfluor64 ≥1800(全氟二甘醇二甲醚) Research，Austin，TX在用10ml水復制了粉末之后，形成了氣泡。按照實施例III所述的方法，使用脈沖多普勒信號增強兔子模型來評價它們在體內(nèi)的回波性能，但與實施例III不同之處是將注射劑量減少至0.2ml(每Kg兔子約1mg的干粉末)。圖2a、2b和2c比較了不同的灌充氣體在相接近的分壓下，超聲波信號隨著時間的衰變情況。這些數(shù)據(jù)成對地排列，以便把含有氟代醚(粗線)的微氣泡制劑與它們的全氟碳化合物類似物(細線)直接進行對比。由這些曲線圖可以看出，充有全氟代醚的氣泡在血流中的持續(xù)時間要比它們的氟碳化合物類似物氣泡的持續(xù)時間長。
實施例XII含全氟代醚氣乳液的體內(nèi)效應與含全氟代烷氣乳液的對比小豬模型按照實施例XI所述的方法制備粉末D并用全氟己烷-N2混合物(每小瓶28mg滲透劑，分壓0.16atm)和C5F12O4-N2混合物(每小瓶22mg滲透劑，分壓0.12atm)灌充。在用10ml水復制該粉末之后，形成了氣泡。
將一些導管插入被麻醉的小豬(14～16kg)的股動脈和股靜脈以及頸靜脈中，以便進行血液動力學的監(jiān)測和造影劑的注射。使用一臺HP Sonos 2500超聲波儀獲得了與乳頭肌等高位置的胸側(cè)短軸心臟造影圖象。使用一種能發(fā)射2Mhz聲波和接受4MHz聲波的寬頻帶線性調(diào)相排列探頭，獲得了二級諧波模型(Second Harmonic mode)的圖象。造影是在每次心臟循環(huán)的舒張期結(jié)束時周期性地(開啟)起動。用0.5ml無菌鹽水稀釋0.5ml的復制造影劑，并在1分鐘內(nèi)通過頸靜脈注射。
圖3a、3b和3c表示心臟在注射造影劑之前(3a)、在注射之后1分鐘(3b)和注射之后6分鐘(3c)時的造影圖象。
兩種灌充氣在注射之后1分鐘皆能顯示出清晰的心臟造影。然而，雖然使用含有全氟代醚的微氣泡制劑在6分鐘時所獲的圖象仍有許多組織造影(圖3c)，但是在使用含全氟己烷的微氣泡制劑所獲圖象中的造影已明顯減弱。這一事實表明，灌充全氟聚醚的微氣泡能在一段較長的時間內(nèi)提供臨床上有用的造影圖象。
上文詳細地描述了本發(fā)明的某些較佳實施方案和最典型的設想。但是應予說明，不管對本文中記載的上述內(nèi)容作了如何詳細的解釋，本發(fā)明仍可按許多方法實施，并且本發(fā)明只應根據(jù)所附權(quán)利要求及其任何的等同物來限定。
權(quán)利要求
1.一種用于增強超聲造影效果的氣乳液，該氣乳液含有許多在液體介質(zhì)中的氣泡，所說的氣泡含有一種在37℃時的奧斯特瓦爾德系數(shù)小于約500×10-6的化合物。
2.如權(quán)利要求1所述的氣乳液，其中所說的氣泡含有氟代醚。
3.如權(quán)利要求1所述的氣乳液，其中所說的化合物在37℃時的蒸氣壓小于約760mmHg。
4.如權(quán)利要求1所述的氣乳液，其中所說的氣泡被一種表面活性劑層包圍著。
5.如權(quán)利要求4所述的氣乳液，其中所說的表面活性劑層包含一種選自下列物組的表面活性劑，即磷脂類、膽堿磷酸類、溶血磷脂類、非離子型表面活性劑類、中性表面活性劑類、陰離子型表面活性劑類、中性氟化表面活性劑類、陰離子型氟化表面活性劑類以及它們的組合。
6.如權(quán)利要求4所述的氣乳液，其中所說的表面活性劑層至少含有第一和第二表面活性劑，其中所說第一表面活性劑基本上由一種磷脂或多種磷脂的混合物組成，所說磷脂至少具有一種含有至少10個碳原子的?；?，并且該第一表面活性劑至少占所有表面活性劑總量的約5％w/w，其中所說第二表面活性劑比第一表面活性劑更易溶于水。
7.如權(quán)利要求6所述的氣乳液，其中所說的的第二表面活性劑選自脂肪酸類、脂肪酸類的鹽、脂肪酸類的蔗糖酯、聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物類、非離子型烷基葡糖苷類、聚山梨酸酯類以及它們的組合。
8.如權(quán)利要求6所述的氣乳液，其中所說的第二表面活性劑選自磷脂類、膽堿磷酸、溶血磷脂以及它們的組合物，并且其中的每一個?；満胁欢嘤?4個碳原子。
9.如權(quán)利要求6所述的氣乳液，其中所說的第一表面活性劑含有帶一個或多個酰基鏈的磷脂酰膽堿，其中至少一個?；満?2至18個碳原子，而所說第二表面活性劑含有帶一個或多個?；湹牧字Ｄ憠A，其中至少一個?；満?至12個碳原子。
10.一種用于增強超聲造影效果的氣乳液，該氣乳液含有許多在液體介質(zhì)中的氣泡，所說氣泡含有一種氟代醚。
11.如權(quán)利要求10所述的氣乳液，其中所說的氟代醚是一種從CF3OCF2OCF3、CF3(OCF2)2OCF3、CF3(OCF2)3OCF3和CF3(OCF2)4OCF3中選擇的氟代聚醚。
12.如權(quán)利要求10所述的氣乳液，其中所說的氟代醚選自全氟二乙醚、全氟二甲醚、全氟二甘醇二甲醚、全氟甲基·乙基醚和全氟一甘醇二甲醚。
13.如權(quán)利要求10所述的氣乳液，其中所說的氣體還含有空氣或氮氣。
14.如權(quán)利要求11所述的氣乳液，其中所說的氣體還含有空氣或氮氣。
15.如權(quán)利要求10所述的氣乳液，其中所說的氣泡被一種表面活性劑層包圍著。
16.如權(quán)利要求15所述的氣乳液，其中所說的表面活性劑層包含一種選自下列物組的表面活性劑，即磷脂類、膽堿磷酸類、溶血磷脂類、非離子型表面活性劑類、中性表面活性劑類、陰離子型表面活性劑類、中性氟化表面活性劑類、陰離子型氟化表面活性劑類以及它們的組合。
17.如權(quán)利要求15所述的氣乳液，其中所說的表面活性劑層至少含有第一和第二表面活性劑，其中所說第一表面活性劑基本上由一種磷脂或多種磷脂的混合物組成，這種磷脂至少有一種含有至少10個碳原子的?；湥⑶以摰谝槐砻婊钚詣┲辽僬妓斜砻婊钚詣┛偭康募s5％w/w，其中所說第二表面活性劑比第一表面活性劑更易溶于水。
18.如權(quán)利要求17所述的氣乳液，其中所說的的第二表面活性劑選自脂肪酸類、脂肪酸類的鹽、脂肪酸類的蔗糖酯、聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物類、非離子型烷基葡糖苷類、聚山梨酸酯類以及它們的組合。
19.如權(quán)利要求17所述的氣乳液，其中所說的第二表面活性劑選自磷脂類、膽堿磷酸、溶血磷脂以及它們的組合物，并且其中的每一個?；満胁欢嘤?4個碳原子。
20.如權(quán)利要求15所述的氣乳液，其中所說的第一表面活性劑含有帶一個或多個?；湹牧字Ｄ憠A，其中至少一個酰基鏈含有12至18個碳原子，而所說第二表面活性劑含有帶一個或多個酰基鏈的磷脂酰膽堿，其中至少一個酰基鏈含有6至12個碳原子。
21.如權(quán)利要求10所述的氣乳液，其中所說的氣泡是一種單一氣體的氣泡。
22.一種用于形成氣乳液的方法，該方法包含下列步驟準備一個容器，其中裝有一種具有許多空隙的結(jié)構(gòu)物質(zhì)、一種表面活性劑和一種分散于所說空隙中并含有氟代醚的氣體或氣體混合物；向容器中加入一種含水液體；以及將上述結(jié)構(gòu)物質(zhì)、表面活性劑和含水液體攪拌，借此在容器中形成一種氣乳液，這種氣乳液包含許多被一層表面活性劑包圍著的氣體或氣體混合物的氣泡。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所說的結(jié)構(gòu)物質(zhì)基本上是可溶于水的。
24.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所說的氟代醚是一種從CF3OCF2OCF3、CF3(OCF2)2OCF3、CF3(OCF2)3OCF3和CF3(OCF2)4OCF3中選擇的氟代聚醚。
25.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所說的氟代醚選自全氟二乙醚、全氟二甲醚、全氟甲基·乙基醚、全氟二甘醇二甲醚和全氟一甘醇二甲醚。
26.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所說的結(jié)構(gòu)物質(zhì)含有所說的表面活性劑。
27.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所說的表面活性劑選自磷脂類、膽堿磷酸類、溶血磷脂類、非離子型表面活性劑類、中性表面活性劑類、陰離子型表面活性劑類、中性氟化表面活性劑類、陰離子型氟化表面活性劑類以及它們的組合。
28.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所說的物質(zhì)選自含有空隙的結(jié)構(gòu)物和可通過溶解形成空隙的結(jié)構(gòu)物。
29.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所說的結(jié)構(gòu)物質(zhì)選自蔗糖類、噴霧干燥微球類、凍干粉末類、凍干團塊、粉末狀和顆粒狀蔗糖類、蛋白質(zhì)微球類和干燥多孔的透明質(zhì)酸。
30.一種微氣泡先質(zhì)組合物，該組合物含有一種具有許多孔隙的結(jié)構(gòu)物質(zhì)；一種分散在上述空隙中并含有氟代醚的氣體或氣體混合物；以及一種表面活性劑，其中，所說的物質(zhì)、氣體或氣體混合物和表面活性劑在加入到含液體容器中時能共同配合形成微氣泡。
31.如權(quán)利要求30所述的組合物，其中所說的結(jié)構(gòu)物質(zhì)基本上是水溶性的。
32.如權(quán)利要求30所述的組合物，其中所說的氟代醚是一種從CF3OCF2OCF3、CF3(OCF2)2OCF3、CF3(OCF2)3OCF3和CF3(OCF2)4OCF3中選擇的氟代聚醚。
33.如權(quán)利要求30所述的組合物，其中所說的氟代醚選自全氟二乙醚、全氟二甲醚、全氟二甘醇二甲醚、全氟甲基·乙基醚和全氟一甘醇二甲醚。
34.如權(quán)利要求30所述的組合物，其中所說的結(jié)構(gòu)物質(zhì)包含所說的表面活性劑。
35.如權(quán)利要求30所述的組合物，其中所說的表面活性劑選自磷脂類、膽堿磷酸類、溶血磷脂類、非離子型表面活性劑類、中性表面活性劑類、陰離子型表面活性劑類、中性氟化表面活性劑類、陰離子型氟化表面活性劑類以及它們的組合。
36.如權(quán)利要求30所述的組合物，其中所說的結(jié)構(gòu)物質(zhì)選自含有空隙的結(jié)構(gòu)物和通過水溶可形成空隙的結(jié)構(gòu)物。
37.如權(quán)利要求30所述的組合物，其中所說的結(jié)構(gòu)物質(zhì)選自噴霧干燥微球類、顆粒狀和粉末狀蔗糖類、凍干粉末類、凍干團塊、蛋白質(zhì)微球類和干燥的多孔透明質(zhì)酸。
38.如權(quán)利要求37所述的組合物，其中所說的結(jié)構(gòu)物質(zhì)包含噴霧干燥微球，這種噴霧干燥微球含有一種從淀粉類、衍生淀粉類和蔗糖酯中選擇的化合物。
39.如權(quán)利要求30所述的組合物，其中所說的結(jié)構(gòu)物質(zhì)包含一種選自碳水化合物類和蛋白質(zhì)類的化合物。
40.一種用于對物體或人體進行超聲造影的方法，該方法包含下列步驟將權(quán)利要求10所述的造影介質(zhì)導入所說的物體或人體中；以及對所說物體或人體的至少一部分進行造影。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其中所說的造影步驟包含超聲諧波造影。
42.一種用于對物體或人體進行磁共振造影的方法，該方法包含下列步驟將權(quán)利要求10所述的造影介質(zhì)導入所說的物體或人體中；以及對所說物體或人體的至少一部分進行造影。
全文摘要
一類使用低奧斯特瓦爾德系數(shù)的氟代單醚和氟代聚醚化合物用于增強超聲和磁共振造影效果的長壽氣乳液。公開了一類含有微氣泡制劑的氣乳液,其中的微氣泡含有氟代醚,例如全氟二甘醇二甲醚(CF
文檔編號A61K49/22GK1192159SQ96195879
公開日1998年9月2日 申請日期1996年6月5日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月7日
發(fā)明者A·卡巴諾夫, E·G·舒特, J·G·維爾斯 申請人:聯(lián)合藥品公司