源

[0128] 1.1.2.2主要試劑配制
[0129] (1)細(xì)胞完全培養(yǎng)基(無菌，4度冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫?br>[0130] RPMI-1640培養(yǎng)基 90%
[0131] 胎牛血清 10%
[0132] 青霉素鏈霉素雙抗 1%
[0133] (2)細(xì)胞凍存液(無菌，現(xiàn)配現(xiàn)用）
[0134] 胎牛血清 9份
[0135]DMS0 1份
[0136] (3)PBS溶液(高壓蒸汽滅菌，4度冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫?br>[0137] PBS粉 1 包
[0138] 雙蒸水 2000ml
[0139] (4)1X電泳緩沖液(常溫保存?zhèn)溆茫?Tris堿 3.03g 甘氨酸 i8.77g
[0140] SDS 1.00g 雙蒸水 調(diào)至1000ml
[0141] (5)IX轉(zhuǎn)膜緩沖液(常溫保存?zhèn)溆茫?Tris堿 5 80〇 甘氨酸 2.:90g
[0142] SDS 0.37g 甲醇 200ml 雙蒸水 調(diào)至10:00ml
[0143] (6)1XTBST緩沖液(常溫保存?zhèn)溆茫?br>[0144]TBST粉 1 包
[0145]Tween2.0ml
[0146] 雙蒸水 調(diào)至2000ml
[0147] (7)8%303^^^分離膠(7.51111體系，現(xiàn)配現(xiàn)用） 雙蒸水 2.50ml 30%Acr-Bis(29:l) 2,00ml 1MTrisipHS.S) 2.85ml
[0148] 10%SDS 0.075ml 10%過硫酸銨 0.075ml TEMED 0.0045ml
[0149] (8)5%SDS-PAGE濃縮膠(3ml體系，現(xiàn)配現(xiàn)用） 雙芬水 2.10ml 30%Acr-Bisr29:1} 0.50ml
[0150] 1MTris(pH6.8) 0.38ml 10%SDS 0.0.3ml 10%過硫酸銨 0.03m丨
[0151] TEMED 0.003ml
[0152] 1.1.3主要實驗儀器
[0154] 1.2實驗方法
[0155] 1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)
[0156] (1)凍存細(xì)胞復(fù)蘇
[0157]從液氮罐取出凍存的細(xì)胞迅速放入提前調(diào)好溫度的37°C恒溫水浴箱，輕輕搖晃凍 存管，使細(xì)胞盡快融化。待細(xì)胞懸液完全融化后，噴灑75%的酒精消毒，放入已用紫外燈照 射消毒好的生物安全柜中，用巴氏吸管將凍存管內(nèi)細(xì)胞混懸液轉(zhuǎn)移至無菌的15ml離心管 中。加入5ml提前配制好的完全培養(yǎng)基，混勾，常溫離心機800rpm，離心5min。棄上清液，加入 5ml完全培養(yǎng)基混勻，轉(zhuǎn)入無菌培養(yǎng)瓶中，置于37°C，5 %C02的細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。
[0158] (2)細(xì)胞換液
[0159]從細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)， 噴灑酒精消毒后放入生物安全柜中。倒掉培養(yǎng)瓶中舊的培養(yǎng)基，無菌PBS溶液輕輕沖洗3次， 加入5ml新鮮的完全培養(yǎng)基，置于37°C，5 %C02的細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。
[0160] (3)細(xì)胞培養(yǎng)傳代
[0161]從細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)， 如果細(xì)胞生長密度達(dá)80-90%則可以傳代。噴灑酒精消毒后放入生物安全柜中，倒掉培養(yǎng)瓶 中舊的培養(yǎng)基，無菌PBS溶液輕輕沖洗3次，加入lml0.05%的胰蛋白酶液，置于恒溫培養(yǎng)箱 中消化3-5min，若熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)已收縮變圓形，可加入約3ml的完全培 養(yǎng)基終止細(xì)胞消化過程。巴氏吸管輕輕吹打使細(xì)胞分散成單個，將細(xì)胞懸液平均分配到2個 新的培養(yǎng)瓶中，每個培養(yǎng)瓶加入完全培養(yǎng)基至5ml，標(biāo)記好細(xì)胞種類、傳代日期和細(xì)胞代數(shù)， 置于37°C，5 %C02的細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。
[0162] (4)細(xì)胞凍存
[0163]在細(xì)胞凍存前24h需換液一次，取生長狀態(tài)良好，處于對數(shù)期分裂細(xì)胞進行凍存。 將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶底部消化下來(步驟同前）。配制細(xì)胞凍存液，胎牛血清:DMSO= 9:1。用凍存 液重懸細(xì)胞，并用巴氏吸管輕輕吹打細(xì)胞使之混勻，轉(zhuǎn)移至凍存管中，進行梯度降溫(-4度 冰箱放置20min，-20度冰箱放置20min，-80度冰箱暫時保存，1周內(nèi)轉(zhuǎn)移至液氮罐中可長期 保存），注意標(biāo)記好細(xì)胞種類、凍存日期和細(xì)胞代數(shù)。
[0164] 1.2.2基因測序法檢測EGFR突變狀態(tài)
[0165]A549、PC-9、PC-9GR細(xì)胞的EGFR突變狀態(tài)基因測序工作由生工生物（上海）股份有 限公司完成。
[0166] (6)DNA提取(按照DNA提取試劑盒protocol進行操作）
[0167] 10)準(zhǔn)備工作:①向裂解液RL-plus中加入一定量的β-巰基乙醇使其終濃度為1 %; ②按試劑瓶上標(biāo)注向漂洗液PW、緩沖液GD加入適量無水乙醇;③用RNase-FreeddH20配制 70%的無水乙醇。
[0168] 11)收集細(xì)胞(數(shù)量〈1x107個），roS溶液洗滌細(xì)胞，吸出roS溶液，向細(xì)胞中加入含 有0.05 %胰蛋白酶消化細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞脫離瓶底時，加入完全培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞溶液轉(zhuǎn) 移至RNase-Free的離心管中，800rpm離心lOmin，收集管中細(xì)胞沉淀，仔細(xì)吸棄所有上清液。 [0169] 12)裂解處理:對于離心后得到的細(xì)胞沉淀，手指輕彈離心管底部，使細(xì)胞沉淀變 松散，加入約600μ1裂解液RL-plus，渦旋震蕩3〇sec 〇
[0170] 13)將所有溶液轉(zhuǎn)移至DNA吸附柱CB3(吸附柱CB3放在2mlRNase-Free的離心管 中），12000rpm離心60sec〇
[0171]14)向DNA吸附柱CB3中加入500μ1緩沖液⑶，12000rpm離心60sec，倒掉收集管中的 離心廢液，將吸附柱CB3再放回收集管中。
[0172] 15)加入500μ1漂洗液PW于吸附柱CB3中，室溫下靜置約2min，12000rpm離心60sec， 倒掉收集管中的離心廢液，將吸附柱CB3再放回收集管中。
[0173] 16)重復(fù)步驟6。
[0174]17) 12000rpm離心2min，倒掉收集管中的離心廢液，將吸附柱CB3在室溫下放置3-5min，使吸附材料中殘余的漂洗液徹底晾干。
[0175] 18)將吸附柱CB3放入一個新的1.5mlRNase-Free的離心管中，加入100μ1洗脫緩 沖液ΤΒ，室溫放置2min，12000rpm離心2min，得到DNA溶液。
[0176] (7)引物設(shè)計
[0177]
[0178]表1:EGFR突變位點特異性引物序列
[0179] (8)PCR反應(yīng)體系：
[0180] 表2:50μ1體系的配制
[0182] (9)PCR反應(yīng)條件：
[0183] 表3:PCR反應(yīng)條件
[0185] (10)基因測序：由美國ABI3730XL測序儀完成。
[0186] 1 · 2 · 3CCK-8法檢測細(xì)胞增殖率(按照試劑盒protocol進行操作）
[0187] (1)CCK_8操作方法
[0188]收集腫瘤細(xì)胞，加完全培養(yǎng)基懸浮，細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)后按照5000cells/wel1接種 于96孔板(邊緣孔用無菌PBS填充以防止過度蒸發(fā)影響實驗結(jié)果），每孔100μΙ，每組設(shè)置6個 復(fù)孔。在5 %C02、37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。給予無血清培養(yǎng)基饑餓處理4小時后，加入各組處 理藥物，置于5%C02、37°C分別培養(yǎng)2處、4811、7211。以不加藥物組為對照組，以僅含完全培養(yǎng) 基不含細(xì)胞組為本底。檢測時各組按ΙΟμΙ/well加入CCK-8試劑，37°C孵育lh測定0D450?？?除本底后，加藥組OD值除以對照組OD值的比值即為細(xì)胞生存率。
[0189]計算公式:生存率=(加藥組0D-本底0D)/(對照組0D-本底OD)X100%。
[0190] (2)CCK_8法測肺癌細(xì)胞對吉非替尼的IC50值
[0191 ]收集肺癌細(xì)胞，加完全培養(yǎng)基懸浮，細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)后按照5000cells/wel1接種 于96孔板(邊緣孔用無菌PBS填充以防止過度蒸發(fā)影響實驗結(jié)果），每孔100μΙ，每組設(shè)置6個 復(fù)孔。在5 %C02、37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，細(xì)胞貼壁后棄培養(yǎng)基，加入不同濃度梯度的吉非 替尼（本底組、對照組、0·001uM、0·01uM、0·luM、luM、10uM、100uM)，處理48h后按ΙΟμΙ/well 加入CCK-8試劑，37°C孵育lh測定OD450，按上述公式計算細(xì)胞生存率，抑制率=1-生存率。 用IC50計算軟件進行肺癌細(xì)胞對吉非替尼的IC50值的計算。
[0192] 1.2.4ffesternblot
[0193] (1)細(xì)胞總蛋白提取
[0194]收集細(xì)胞，倒掉培養(yǎng)瓶中舊的培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS溶液沖洗2次，加入0.05%胰蛋 白酶消化5min，加入完全培養(yǎng)基終止消化，巴氏吸管轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至15ml離心管中，SOOrpm 離心5min，仔細(xì)吸凈上清液，向細(xì)胞沉淀中加入細(xì)胞裂解液(RIPA)120yl+濃度為ImM的蛋白 酶抑制劑PMSF1.2μ1 (注:RIPA液:PMSF= 100:1)，渦旋震蕩10s，轉(zhuǎn)移至1.5ml的EP管中，冰 上靜置裂解3〇11^11。4度低溫離心機12000rpm離心20min，用100μΙ移液槍小心將上清蛋白液 轉(zhuǎn)移至新的ΕΡ管中，-80度冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0195] (2)BCA法測蛋白濃度
[0196]根據(jù)樣品量配制適量BCA工作液(A液:B液=50:1)，渦旋震蕩混勾。根據(jù)BCA試劑盒 protocol上樣，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，酶聯(lián)免疫檢測儀測定A562吸光度，計算蛋白濃度。
[0197]表4:BCA法測蛋白濃度加樣
[0199] (3)配制SDS-PAGE凝膠
[0200]因mPRa分子量為40kD，故我們配制8 %的分離膠。將玻璃板用雙蒸水沖洗干凈晾干 備用，安裝并固定于制膠架上。按照protocol配制8%的分離膠，用1000μ1移液槍吸取制膠 溶液緩慢注入兩塊玻璃板之間(盡量不要有氣泡），液面距離膠架上緣約2.0cm停止注入(為 濃縮膠預(yù)留空間），加入適量雙蒸水封閉液面。室溫靜置約30min，若可見分離膠與雙蒸水間 有明顯分界線提示分離膠已凝固。將制膠夾子從膠架取下，傾斜倒掉上層的雙蒸水，并用濾 紙小心吸凈殘留的雙蒸水。按照protocol配制上層5%的濃縮膠，用1000μ1移液槍吸取上層 膠溶液緩慢注入分離膠上方，小心插入梳子(盡量避免產(chǎn)生氣泡），室溫靜置約30min上層濃 縮膠可凝固，SDS-PAGE凝膠制備完畢。
[0201 ] (4)蛋白上樣和電泳
[02.02]已測定濃度的蛋白樣品加入5xLoadingBuffer(蛋白液體積：LoadingBuffer體 積= 4:1)，混勻后置于100度的加熱器上lOmin使蛋白充分變性。計算上樣50yg蛋白樣品所 需上樣體積。準(zhǔn)備好電泳槽，將制備好的凝膠玻璃板固定于電泳槽內(nèi)，小心拔出上層膠的梳 子，加入配制好的電泳液沖洗梳孔，玻璃板內(nèi)外均加入電泳液。依次加入蛋白樣品，兩端梳 孔各加入蛋白Marker5-8μ1，并做好標(biāo)記。插入電源，設(shè)置80V電泳，待含溴酚藍(lán)染料的蛋白 條帶電泳至下層分離膠時調(diào)節(jié)電壓為120V，待含溴酚藍(lán)染料的蛋白條帶電泳至下層膠底部 時可停止電泳。
[0203] (5)轉(zhuǎn)膜與牛奶封閉
[0204]裁剪PDVF膜(根據(jù)上樣孔數(shù)及切膠大?。煌ぷ龊脴?biāo)記，甲醇中浸泡lOmin，雙 蒸水漂洗，轉(zhuǎn)膜液中浸泡備用。電泳完畢后將玻璃板取下，去除玻璃板，根據(jù)蛋白Marker條 帶切下目的蛋白及內(nèi)參蛋白所在區(qū)域的膠。制備轉(zhuǎn)膜"三明治"，即海綿-濾紙-膠 濾紙-海綿(盡量避免氣泡）。將轉(zhuǎn)膜夾子固定于轉(zhuǎn)膜槽中，注意黑板對黑板，白板對紅板。倒 入配制好的轉(zhuǎn)膜液，恒流300mA進行轉(zhuǎn)膜(mPRa轉(zhuǎn)膜時間為lh)。轉(zhuǎn)膜完畢后，浸泡入配制好 的脫脂牛奶溶液(5%)內(nèi)，室溫下?lián)u床輕搖封閉l_2h。
[0205] (6)-抗、二抗孵育
[0206]封閉完畢的H)VF膜，用lxTBST溶液室溫下置于搖床快速搖動洗膜3次，每次5min。 浸泡入配制好的一抗孵育液(兔抗人mPRa抗體1:500;鼠抗人β-tubulin抗體1:3000)，4度輕 搖過夜。一抗孵育完畢，用TBST溶液充分洗膜，每次lOmin，共洗3次。浸泡入配置好的二抗孵 育液(辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgGl: 5000;辣根酶標(biāo)記羊抗鼠IgG1:5000)，室溫下?lián)u床輕搖孵育 2h，TBST溶液洗膜3次，每次lOmin。
[0207] (7)發(fā)光與定量分析
[0208]根據(jù)發(fā)光試劑盒protocol配制發(fā)光液，打開化學(xué)發(fā)光成像儀，按照程序說明進行 顯像。采用ImageLab4.1軟件測量蛋白條帶灰度值，設(shè)定內(nèi)參蛋白條帶灰度值為100%，樣 品蛋白的相對表達(dá)量為該蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值。
[0209] 1.2.5熒光定量卩0?
[0210] ⑴按照超純RNA提取試劑盒protocol提取細(xì)胞中的總RNA。測定RNA濃度，計算加1 yg所需體積。
[0211] (2)通過PrimerPremier5.0、01igo6及BLAST設(shè)計驗證，引物均跨內(nèi)含子設(shè)計。 本研究中所有引物設(shè)計和合成工作均由生工生物(上海)股份有限公司完成。具體序列如下 表：
[0212] 表5 :mPRa和GAPDH特異性引物序列
[0213]
[0214] (3)參照第一鏈cDNA合成試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用兩步法完成。
[0215] 4)RNA_PrimerMix(冰上配制）
[02