本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，涉及基因的克隆和載體構(gòu)建。

背景技術(shù)：

液泡膜h⁺轉(zhuǎn)運無機焦磷酸酶(v-h⁺-ppase)是一種獨特的酸化液泡的質(zhì)子泵，存在于陸生植物和少數(shù)藻類、原生動物及細菌中。該酶的主要功能如下：(1)質(zhì)子泵功能：能夠?qū)o機焦磷酸(ppi)水解產(chǎn)生的自由能和h⁺質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運體相耦聯(lián)，將ppi水解為2個pi的同時，將細胞質(zhì)中的h⁺經(jīng)液泡膜泵入液泡內(nèi)，起質(zhì)子泵的作用，同液泡膜h⁺-atpase一起形成h⁺跨液泡膜電化學梯度，為各種溶質(zhì)(氨基酸、糖類、陽離子及陰離子等)分子跨液泡膜的主動運輸提供驅(qū)動力。(2)離子區(qū)域化功能：鹽脅迫下，植物將細胞質(zhì)內(nèi)的大量無機離子區(qū)隔化至液泡，是植物抵御鹽分的主要策略之一。在各種離子的主動運輸過程中，液泡膜和質(zhì)膜轉(zhuǎn)運蛋白發(fā)揮著重要作用，而這種轉(zhuǎn)運蛋白的驅(qū)動力，則來自于液泡膜質(zhì)子泵所建立的h⁺跨液泡膜電化學梯度。這預示著增加液泡膜質(zhì)子泵基因的表達，能為液泡膜na⁺/h⁺逆向轉(zhuǎn)運蛋白提供更強的驅(qū)動力，從而更進一步增強植物的耐鹽性。(3)在植物生長發(fā)育中的作用：液泡膜h⁺-ppase與植物生長素的運輸有密切關(guān)系，二者的相互作用會對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生影響。(4)參與蔗糖的生物合成：植物體內(nèi)的蔗糖在蔗糖合成酶和udpg焦磷酸化酶的作用下，轉(zhuǎn)化為葡萄糖和己糖磷酸鹽，而此過程中會有較多的ppi產(chǎn)生，而這些ppi通常都被vhp清除。綜合這些研究結(jié)果可見，液泡膜vhp在植物抗逆中起重要作用。

唐古特白刺(nitrariatangutorum)隸屬于蒺藜科(zygophyllaceae)白刺屬(nitraria)，是中國特有的鹽生植物，主要分布于西北鹽漬化荒漠。唐古特白刺根系發(fā)達，葉小且肉質(zhì)化，具有抗風沙、抗干旱和耐鹽堿等抗逆能力，是典型的聚鹽型(將鹽離子聚于液泡中)鹽生植物，可在土壤含鹽量達2％的地域正常生長，是我國西北荒漠植被的重要建群種之一。眾多研究發(fā)現(xiàn)，na⁺在液泡中的區(qū)隔化是植物在高鹽脅迫下耐鹽的必要環(huán)節(jié)，本申請人前期已對唐古特白刺中的液泡膜na⁺/h⁺逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因ntnhx1成功克隆并對其表達進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ntnhx1基因存在于唐古特白刺的不同器官中且其受nacl誘導并在鹽處理初期其轉(zhuǎn)錄水平明顯增加，這些結(jié)果均暗示ntnhx1基因在唐古特白刺的耐鹽中起著重要的作用。如前所述可知，液泡膜h⁺-ppase質(zhì)子泵為液泡膜na⁺/h⁺逆向轉(zhuǎn)運蛋白提供驅(qū)動力，因此對唐古特白刺液泡膜h⁺-ppase蛋白基因進行研究對于生產(chǎn)耐鹽植物具有重要作用。但現(xiàn)有技術(shù)中還沒有唐古特白刺液泡膜h⁺-ppase蛋白基因及有關(guān)的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供唐古特白刺液泡膜h⁺-ppase蛋白基因及其克隆方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題。

本發(fā)明的第一個方面是提供唐古特白刺液泡膜h⁺-ppase蛋白基因ntvp1，上述基因的全長cdna序列如seqidno:6所示。

進一步地，所述基因的編碼區(qū)序列如seqidno:6的第106-2409位所示。

本發(fā)明的第二個方面是提供唐古特白刺液泡膜h⁺-ppase蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如seqidno:7所示。

本發(fā)明的第三個方面是提供一種克隆唐古特白刺液泡膜h⁺-ppase蛋白基因ntvp1的方法，包括步驟：

1)根據(jù)與唐古特白刺有近緣關(guān)系的植物的液泡膜h⁺-ppase蛋白基因的保守區(qū)設計簡并引物對，優(yōu)選地，所述簡并引物對為ntvp1-f1和ntvp1-r1：

ntvp1-f1：cattcgccattcagg(seqidno:1)，

ntvp1-r1：acatagcagccaaagt(seqidno:2)；

2)以唐古特白刺葉片的總rna為模板，利用步驟1)的簡并引物對通過rt-pcr的方法得到cdna片段；優(yōu)選地，所述cdna片段長度為1156bp(seqidno:3)；

3)根據(jù)步驟2)所獲得的cdna片段，設計upm引物、3’race和5’race引物，通過巢式擴增得到全長cdna序列，所述全長cdna的核苷酸序列如seqidno:6所示；優(yōu)選地，所述引物序列如下：

upm(seqidno:10)：

ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagt；

3’race：tgccaatccagtggcaatagtgctga(seqidno:4)；

5’race：acaactgctgccatcggaaagggatt(seqidno:5)。

優(yōu)選地，所述與唐古特白刺有近緣關(guān)系的植物是霸王。

本發(fā)明的第四個方面是提供一種表達載體或表達菌株，所述表達載體或表達菌株包含seqidno:6所示的唐古特白刺液泡膜h⁺-ppase蛋白基因ntvp1的cdna序列或其編碼區(qū)序列。優(yōu)選地，所述表達載體是帶有g(shù)fp基因的載體，所述表達菌株是農(nóng)桿菌。

本發(fā)明的第五個方面是提供一種表達載體的構(gòu)建方法，所述表達載體包含seqidno:6所示的唐古特白刺液泡膜h⁺-ppase蛋白基因ntvp1的cdna序列或其編碼區(qū)序列，包括：1)在ntvp1基因的cdna序列或其編碼區(qū)序列的兩端分別加上xbai和kpni酶切位點，并連接到t載體，形成t-ntvp1載體；2)將t-ntvp1載體，以及pcg-gfp和psn1301分別用xbai和kpni進行酶切，并回收；3)將從t-ntvp1載體上酶切下來的基因片段與pcg-gfp和psn1301載體的酶切片段連接。

本發(fā)明的第六個方面是提供一種將本發(fā)明的唐古特白刺液泡膜h⁺-ppase蛋白基因ntvp1轉(zhuǎn)染至植物的方法，包括將包含seqidno:6所示的唐古特白刺液泡膜h⁺-ppase蛋白基因ntvp1的cdna序列或其編碼區(qū)序列的載體轉(zhuǎn)化至擬南芥中。

本發(fā)明的第七個方面是提供本發(fā)明的唐古特白刺液泡膜h⁺-ppase蛋白基因ntvp1在制備或培育轉(zhuǎn)基因植物中的應用。

本發(fā)明利用與唐古特白刺親緣關(guān)系較近的不同物種的液泡膜h⁺-ppase蛋白基因的保守區(qū)設計簡并引物，利用rt-pcr和race方法，首次克隆到唐古特白刺液泡膜h⁺-ppase蛋白基因ntvp1，并對該基因進行了功能分析，以及分別在非鹽生環(huán)境與高鹽脅迫情況下對其轉(zhuǎn)錄水平進行研究，從而在分子水平上明確該基因及其編碼的酶蛋白在唐古特白刺抵御鹽脅迫中的作用，為培育植物新品種提供新的選擇。

附圖說明

圖1顯示了唐古特白刺液泡膜h⁺-ppase(vp1)的cdna序列和氨基酸序列。

圖2顯示了不同物種來源的液泡膜h⁺-ppase(vp1)系統(tǒng)進化樹分析圖。

圖3顯示了唐古特白刺液泡膜h⁺-ppase(ntvp1)生物信息學分析圖：a、vp1蛋白結(jié)構(gòu)域分析；b、vp1蛋白疏水性分析；c、vp1蛋白跨膜區(qū)分析；d、vp1蛋白二級結(jié)構(gòu)預測。

圖4顯示了唐古特白刺液泡膜h⁺-ppase蛋白基因(ntvp1)在不同器官中的qrt-pcr表達分析圖；a、不同器官中ntvp1基因的相對表達量；b、nacl脅迫下唐古特白刺葉片中ntvp1基因的相對表達量。

圖5顯示了pcg-gfp載體結(jié)構(gòu)示意圖。

圖6顯示了psn1301載體結(jié)構(gòu)示意圖。

圖7顯示了唐古特白刺ntvp1基因已經(jīng)連到t載體上的電泳圖；其中，marker為dl2000plus；1-6為6個檢測的大腸桿菌克隆，其中2、4、5、6為4個陽性克隆。

圖8顯示了對t-ntvp1載體進行xbai和kpni雙酶切后獲得ntvp1的基因片段的電泳圖。

圖9顯示了對pcg-gfp和psn1301載體進行xbai和kpni雙酶切后獲得開環(huán)質(zhì)粒的電泳圖。

圖10顯示了用ntvp1基因的特異引物t1和t2，對pcg-35s::ntvp1-gfp以及psn1301-35s::ntvp1轉(zhuǎn)化的陽性斑進行檢測的電泳圖。m:表示dl2000plus；左邊vp1-pcg為pcg-35s::ntvp1-gfp陽性克隆檢測結(jié)果；右邊vp1-psn1301為psn1301-35s::ntvp1陽性克隆檢測結(jié)果。

圖11顯示了在30mmol/lnacl脅迫后，t3代擬南芥植株和野生型擬南芥植株的葉綠素、脯氨酸與丙二醛含量及sod活性的對比圖；a、葉綠素含量對比圖；b、脯氨酸含量對比圖；c、丙二醛含量對比圖；d、sod活性對比圖。

具體實施方式

本發(fā)明通過以下具體實施例進一步說明，但本發(fā)明的范圍不限于此。如無特殊說明，下述實施例中所使用的試劑、儀器、耗材等均為本領(lǐng)域普通試劑、儀器和耗材，可以從常規(guī)的化學用品商店或供貨商處獲得。如無特殊說明，以下實施例中所使用的方法是本領(lǐng)域中的常規(guī)方法；技術(shù)人員根據(jù)實驗描述可以明確地知道如何進行所述實驗。

在本申請中，ntvp1表示唐古特白刺液泡膜h⁺-ppase蛋白基因，ntvp1表示唐古特白刺液泡膜h⁺-ppase蛋白。

實施例一：唐古特白刺液泡膜h⁺-ppase蛋白基因(ntvp1)的克隆

根據(jù)對已克隆的10種物種(陸地棉(gossypiumhirsutumadn96173.1)、葡萄(vitisviniferaxp_002273207.1)、毛果楊(populustrichocarpaxp_006381091.1)、擬南芥(np_173021.1)、鹽角草(aei17666.1)、鹽爪爪(kalidiumfoliatumabk91685.1)、水稻(baa31523.1)、角果堿蓬(suaedacorniculataadq00196.1)、鹽穗木(halostachyscaspicaabo45933.1)、霸王(abu92563.1))的該基因進行多序列比對，在氨基酸保守區(qū)設計一對簡并引物ntvp1-f1(seqidno:1)和ntvp1-r1(seqidno:2)。提取唐古特白刺葉片的總rna(takara公司的rnaisoplus)，通過rt-pcr的方法從唐古特白刺的總rna擴增得到保守區(qū)cdna片段(1156bp)(seqidno:3)。所述rt-pcr的方法如下：

取8μl的總rna、1μl50μm寡聚(dt)20、1μl10mmdntp混合物(均在冰上進行)，加入至0.2ml的無rna酶的離心管中，輕輕混勻，馬上65℃變性5min，然后立即放置冰上至少1min，緊接著按下表進行以下各組分的混勻。

將以上10μl的混合物，加至含有rna/引物的混合物的離心管中，輕輕捶打混勻后，馬上50℃50min，85℃5min。以上程序結(jié)束后，立即將離心管放置冰上1分鐘，稍加離心后，將1μl的rna酶h加入離心管中，37℃溫育20min。合成第一鏈cdna。將合成的cdna作為模版，利用引物ntvp1-f1(seqidno:1)和ntvp1-r1(seqidno:2)進行保守區(qū)域pcr擴增和測序。

基于已克隆得到的保守區(qū)cdna片段，設計upm引物(seqidno:10)、末端擴增引物5’race(seqidno:4)和3’race(seqidno:5)，通過cdna末端快速擴增法(race)(clontech公司的smarter^tmracecdnaamplificationkit試劑盒)，從唐古特白刺葉片總rna中擴增得到唐古特白刺液泡膜h⁺-ppase蛋白基因的全長cdna序列。經(jīng)測序，該全長cdna的長度為2810bp(seqidno:6)。

將所得全長cdna序列提交至ncbi進行比對，發(fā)現(xiàn)該cdna序列與陸地棉(gossypiumhirsutum)、鹽爪爪(kalidiumfoliatum)、葡萄(vitisvinifera)及鹽芥(thellungiellasalsuginea)等植物的i型h⁺-ppase蛋白基因的同源性均＞80％，將該基因全長cdna序列命名為ntvp1。

利用ncbi將該cdna序列翻譯成氨基酸，獲得唐古特白刺液泡膜h⁺-ppase蛋白，命名為ntvp1，其氨基酸序列如seqidno:7所示。

實施例二：不同物種的液泡膜h⁺-ppase蛋白序列比較

從genbank中選取10個來源于不同植物的液泡膜h⁺-ppase蛋白的氨基酸序列，分別為陸地棉(gossypiumhirsutumadn96173.1)、葡萄(vitisviniferaxp_002273207.1)、毛果楊(populustrichocarpaxp_006381091.1)、擬南芥(np_173021.1)、鹽角草(aei17666.1)、鹽爪爪(kalidiumfoliatumabk91685.1)、水稻(baa31523.1)、角果堿蓬(suaedacorniculataadq00196.1)、鹽穗木(halostachyscaspicaabo45933.1)、霸王(abu92563.1)，利用dnaman軟件，將這10個蛋白與本發(fā)明的ntvp1蛋白進行多重比較。結(jié)果顯示，ntvp1氨基酸序列與已克隆的陸地棉h⁺-ppase蛋白同源性達93％，與擬南芥液泡膜h⁺-ppase蛋白atvp1同源性為89.29％，而與擬南芥液泡膜h⁺-ppase蛋白atvp2同源性只有33.53％(aaf31163.1)。另外，ntvp1與其它植物液泡膜h⁺-ppase蛋白也有較高的同源性(圖1)。從圖1可以看出，該蛋白含有3個保守區(qū)(cs1、cs2和cs3)，其中cs1保守區(qū)中含有dvgadlvgkve序列，與(e/x)(x)7kxe構(gòu)型相符合。該構(gòu)型在許多植物液泡膜h⁺轉(zhuǎn)運無機焦磷酸酶中都高度保守，且可能是作為焦磷酸(ppi)水解過程的底物結(jié)合位點存在。另外，從圖1中還發(fā)現(xiàn)該蛋白含有‘eyyts’基序，該基序涉及焦磷酸的水解與h⁺運輸?shù)呐悸?lián)，且其存在于大多數(shù)其它液泡質(zhì)子泵焦磷酸水解酶(v-ppases)中。

實施例三：不同物種來源的液泡膜h⁺-ppase蛋白系統(tǒng)進化樹

在液泡膜h⁺-ppase蛋白序列的比對基礎上，利用clustalx軟件對上述10個來源于不同植物中的液泡膜h⁺-ppase蛋白(分別為陸地棉(gossypiumhirsutumadn96173.1)、葡萄(vitisviniferaxp_002273207.1)及(cao41672.1)、毛果楊(populustrichocarpaxp_006381091.1)、擬南芥(np_173021.1)及(aaf31163.1)、鹽角草(aei17666.1)、鹽爪爪(kalidiumfoliatumabk91685.1)、水稻(baa31523.1)、角果堿蓬(suaedacorniculataadq00196.1)、鹽穗木(halostachyscaspicaabo45933.1)、霸王(abu92563.1))以及本發(fā)明的ntvp1蛋白的氨基酸序列進行多序列匹配排列，然后采用mega5.1軟件進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建，該方法是根據(jù)neighbor-joining法，通過poissondistance法經(jīng)過1000次bootstrap分析。結(jié)果(圖2)表明，唐古特白刺液泡膜h⁺-ppase蛋白基因ntvp1與同屬于ⅰ型的陸地棉ghvp1、擬南芥atvp1、葡萄vvvp1等的遺傳距離較近，而與同屬于ⅱ型的擬南芥atvp2、葡萄vvvp2的遺傳距離相對較遠。

實施例四：唐古特白刺液泡膜h⁺-ppase蛋白基因ntvp1的序列分析

ntvp1cdna序列全長編碼的蛋白序列為一個768個氨基酸的蛋白。根據(jù)序列推測，其分子量為80.5kda，等電點為5.33；利用疏水性分析軟件(http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)可知，該蛋白的整個肽鏈中均勻地分布著疏水性氨基酸，且多于親水性氨基酸(圖3中的a)。因此，整個多肽鏈表現(xiàn)為疏水性，說明ntvp1蛋白符合膜蛋白的特征，屬于疏水性蛋白(圖3中的b)。利用tmhmm軟件進行跨膜性分析，表明ntvp1含有14個跨膜區(qū)(圖3中的c)，這與其它物種中液泡膜h⁺-ppase蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域一致。用swiss-model(http://swissmodel.expasy.org/)對ntvp1蛋白結(jié)構(gòu)進行分析，可見其與4a01.1.a模板的序列的相似性高達90.21％，屬于質(zhì)子焦磷酸酶模型(圖3中的d)。

實施例五：唐古特白刺ntvp1在nacl高鹽脅迫下的表達分析

分別從唐古特白刺幼葉、幼莖和幼根中提取總rna(北京天恩澤基因有限公司的柱式植物rnaout試劑盒)，分別取500ng為模板并反轉(zhuǎn)錄合成cdna第1鏈(superscriptiiireversetranscriptase)?；趎tvp1cdna全長序列，設計1對特異引物ntvp1-f8(seqno8)、ntvp1-r8(seqno9)，擴增得到長度為207bp的片段(seqidno:13)。以小果白刺actin基因(genbank：ab617805.1)為內(nèi)參照，采用熒光定量pcr的方法對正常生長條件下唐古特白刺不同器官中ntvp1的表達進行檢測。熒光定量pcr的實驗條件為：95℃10min預變性，然后95℃15s、60℃1min，40個循環(huán)。熒光染料為sybrgreeni。

結(jié)果表明，ntvp1在不同器官中均有表達，且在葉片中表達量>根中表達量>莖中表達量(圖4中的a)。為探究唐古特白刺vp1基因是否受鹽誘導和調(diào)節(jié)，進一步檢測了200mmol·l^-1nacl脅迫1、3、6、12、24、48h時唐古特白刺葉片中ntvp1的表達水平。具體方法為：將唐古特白刺的種子播種在蛭石：草炭為3：1(v/v)的混合介質(zhì)中，置于溫室培養(yǎng)。選擇生長正常且大小一致的3月齡苗用自來水培養(yǎng)，培養(yǎng)期間每隔4天換水1次。水培1周左右，采用0(ck)和200mmol〃l^-1nacl處理幼苗1、3、6、12、24、48h，每個處理3個重復，每個重復3株，共計108株。于上午10:00～11:00統(tǒng)一采取嫩葉組織。結(jié)果顯示隨著鹽脅迫時間的延長，唐古特白刺ntvp1基因在葉片中表達量持續(xù)增加，脅迫12h時表達量最高，而后逐漸減弱(圖4中的b)，這些結(jié)果說明ntvp1基因可能在唐古特白刺耐鹽機制中發(fā)揮重要作用。

實施例六：唐古特白刺ntvp1基因表達載體的構(gòu)建

首先確定pcg-gfp載體(圖5)(輝駿生物)與psn1301載體(圖6)(輝駿生物)，在基因兩端分別加上xbai和kpni酶切位點，并連接到t載體(transgen，ct11-01，http://www.transgen.com.cn/products/63.html)上；用基因特異引物t1和t2進行插入位點片段擴增，通過pcr檢查獲得含有ntvp1基因條帶，確認ntvp1基因已經(jīng)連到t載體上(圖7)。其中，t1和t2的引物序列分別為：t1:5’-gtttgccttcgtccttca-3’(seqidno:11)；t2:5’-cattgtcccatgcacctc-3’(seqidno:12)。

將t-ntvp1載體，以及pcg-gfp和psn1301分別用xbai和kpni進行酶切，獲得ntvp1基因片段(圖8)與psn1301和pcg-gfp開環(huán)載體(圖9)，將ntvp1基因連接psn1301和pcg-gfp，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后挑菌pcr檢測，獲得檢測圖(圖10)，證明載體構(gòu)建完成，獲得陽性菌克隆。對ntvp1基因連接psn1301載體進行測序分析，所測到的基因側(cè)翼序列都是載體的序列。證明ntvp1基因已經(jīng)連接到表達載體上了。

實施例七：唐古特白刺ntvp1基因轉(zhuǎn)化

將實施例六構(gòu)建的兩種雙元載體分別轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌c58中，培養(yǎng)，接種到5ml含有抗生素(利福平20mg/l，卡那霉素50mg/l)的lb液體培養(yǎng)基中，28℃下震蕩培養(yǎng)2天。將1ml培養(yǎng)的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移到100ml含有抗生素的lb液體培養(yǎng)基中，28℃繼續(xù)震蕩培養(yǎng)24小時。將菌液倒入離心管中，6000rpm/min，室溫條件下，離心10分鐘，然后將上清倒出。沉淀用200ml浸染液(10％蔗糖，含0.02％silwet)重懸，形成均勻的農(nóng)桿菌懸浮液(od600＝0.8)，并將農(nóng)桿菌懸浮液轉(zhuǎn)移到一個敞口的器皿中(500ml燒杯)。選取初果期的健壯擬南芥，帶盆缽倒扣于盛有農(nóng)桿菌懸浮液的容器上方，只將整個花序浸入上述農(nóng)桿菌懸浮液中約20-30秒，將盆缽取下，橫放于暗箱中約24小時。24小時后將處理過的擬南芥植株放于22～25℃的光照條件下正常生長，三周后收取成熟種子。

實施例八：擬南芥鹽脅迫驗證分析

將實施例七中收獲的擬南芥種子播種到含有25mg/l潮霉素的1/2ms培養(yǎng)基中進行篩選，待長出兩片真葉時移栽到含有草炭土和蛭石的培養(yǎng)基中(草炭土：珍珠巖＝1：1)，將擬南芥植株放于22～25℃的光照條件下正常生長，三周后收取成熟種子。重復上述操作，直至收取到t3代種子(tr)。將t3代擬南芥種子(tr)與野生型擬南芥種子(wt)分別播種培養(yǎng)，待移栽后兩周，進行nacl脅迫處理。分別設置對照組(0)和處理組(1)，各設三個重復，其中處理為30mmol/lnacl。脅迫處理4d后收取葉片，立即液氮冷凍，分別測量葉綠素含量、脯氨酸含量、丙二醛含量與sod活性變化。

結(jié)果表明，t3代植株的葉綠素含量在對照(tr0)時為0.0334mg/g，鹽脅迫處理后(tr1)為0.0338mg/g，無顯著性差異(p>0.05)；丙二醛含量在對照(tr0)時為0.0025umol/g，在鹽脅迫處理(tr1)后變?yōu)?.0031umol/g，也無顯著性差異(p>0.05)；而t3代植株脯氨酸含量在鹽脅迫前后分別為33.38ug/gfw(tr0)與105.47ug/gfw(tr1)，鹽脅迫后含量顯著升高，存在顯著性差異(p<0.05)；sod活性在對照(tr0)時為7.445u/gfw，鹽脅迫處理(tr1)后變?yōu)?7.056u/gfw，sod活性經(jīng)鹽脅迫處理后顯著升高，存在顯著性差異(p<0.05)(圖11)。

野生型植株在鹽脅迫后，葉綠素含量由0.039mg/g(wt0)變?yōu)?.029mg/g(wt1)，存在顯著性差異(p<0.05)；丙二醛含量由0.0034umol/g(wt0)上升到0.0048umol/g(wt1)，也存在顯著性差異(p<0.05)；脯氨酸含量由55.43ug/gfw(wt0)變?yōu)?8.52ug/gfw(wt1)，差異不顯著(p>0.05)；sod活性在對照組中為5.42u/gfw(wt0)，在鹽脅迫處理后為6.77u/gfw(wt1)，同樣無顯著性差異(p>0.05)(圖11)。

本結(jié)果說明鹽脅迫促進了t3代植株滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸的合成，丙二醛含量增加不顯著，葉綠素的合成與降解未受到顯著影響，表明膜系統(tǒng)更加穩(wěn)定；同時sod活性顯著增加證明了其清除超氧負離子自由基能力增強。以上試驗證明，ntvp1基因在擬南芥植株中成功轉(zhuǎn)化使t3代植株耐鹽性得到顯著提高，即ntvp1基因在提高植物耐鹽性方面具有積極作用。

序列表

seqidno:1：cattcgccattcagg

seqidno:2：acatagcagccaaact

seqidno:3：

gatgattgggagggtcttttgaggctatccragcatttgggctgacgggatcgactacgcatgctatgggacgaccgggcggcggtctctatccgattgctgctgatgttggtgctgatcttgtgggcaaggtcgagagaaacattccagaagacgagccaagaaaccctgctgtcattgctgacaacgttggtgacaatgttagggacgttgctcgcatgggctcagatcttttcggttcatatgccgggtcatcttgtgctgcgctcgtagttgcatccatttcatcctttggaatcaaccatgacttcactgccatgttgtatcctctgctcatcagttcgatgggtatccttgtttgtttgatcacaactctctttgccactgatatctttgagatcaaggctgttaaagagatcgagccagcattgaagaagcagcttatcatctctactattcttatgactgttggaattgcaattgtttcatgggttggtttgccttcgtccttcacaatctacaattttgggactcagaaggttgtcaagaactgggaacttttcttgtgtgtgggtgttggtctttgggctggactcatcattggatttgtgaccgagtactatactagcaacgcatacagccctgtacaagatgttgctgactcctgcagaacaggagctgccaccaatgttatctttggtcttgctttgggatacaaatctgtcatcattccaatttttgccattgctatcagtatttttgtcagttttagtttggctgctatgtatggcattgcagtggctgcccttggtatgctcagcactattgccactggattggcaattgatgcctacggtcccatcagtgacaatgctggaggcattgctgagatggctggcatgagtcaccgcatccgtgagaggactgatgcccttgatgcagctggaaacacaactgctgccatcggaaagggatttgcaattggatcagcagcccttgtctctttggctctgtttggtgcttttgttagccgtgcagcaatctcaacagttgatgtcttgactccaaaggtgttcatcggtttgattgttggtgctatgctcccgtactggttctcggccacatgaccatcggaagagtgtnggaagtgcaatct

seqidno:4：tgccaatccagtggcaatagtgctga

seqidno:5：acaactgctgccatcggaaagggatt

seqidno:6：

acatggggaaacatcttcacttgaaaatacttccctctcctctgtcttctgcctcttctctttttcttttttttttttttcgttgtttttctggttttggtaggtatgggagtggcgttgctgtccgagctggcgacggagatactggttccggtctgtgccgtgatcggtatcgtgttctcgctcgttcagtggtacctcgtctcgcgcgtgtcgctcacgcacgaccggtcggccgggaacaacaacaacaacaagaagaatggattcaacgattatttgatcgaggaagaggaaggaattaatgaccagagcgtcgtgaccaagtgtgctgaaattcagaacgctatttctgaaggtgcaacatcctttcttttcactgaatatcagtatgttgggatcttcatggttgcttttgcaatcttgattttcctcttcctgggttctgtggagggcttcagcacaaagagccagcaatgtacttacgataaaacaaggacgtgcaagcctgcacttgccactgctatcttcagcacagtagcatttgtgcttggtggcgtcacatctgtcctttctggcttccttgggatgaaaattgctacttatgcaaatgccagaactaccctggaagcaagaaggggtgtcggaaaggcttttattactgcatttaggtctggtgcagtaatgggcttcctccttgcagcaaatggtctcttggtgctttacattgctatcaatctctttaagttgtactatggtgatgactgggaaggcctatttgaggctattactggatacggtcttgggggttcttcaatggctctctttggacgagtgggtggtggtatctataccaaggctgctgatgttggtgctgatcttgtgggcaaggtcgagagaaacattccagaagacgatccaagaaaccctgctgtcattgctgacaacgttggtgacaatgttggggacattgctggcatgggctcggatctttttggttcttatgctgagtcatcctgtgctgcgcttgttgttgcatccatttcatcctttggaatcaaccatgacttcactgccatgttgtatcctctgctcatcagttcgatgggtatccttgtttgtttgatcacaactctctttgccactgatatctttgagatcaaggctgttaaagagatcgagccagcattgaagaagcagcttatcatctctactattcttatgactgttggaattgcaattgtttcatgggttggtttgccttcgtccttcacaacctacaattttgggactcagaaggttgtcaagaactgggaacttttcttgtgtgtgggtgttggtctttgggctggactcatcattggatttgtgaccgagtactatactagcaatgcatacagccctgtacaagatgttgctgactcctgcagaacaggagctgccaccaatgttatctttggtcttgctttgggatacaaatctgttatcattccaatttttgccattgctatcagtatttttgtcagttttagtttggctgctatgtatggcattgcagtggctgcccttggtatgctcagcactattgccactggattggcaattgatgcctacggtcccatcagtgacaatgctggaggcattgctgagatggctggcatgagtcatcgcatccgtgagaggactgatgcccttgatgcagctggaaacacaactgctgccatcggaaagggatttgcaattggatcagcagcccttgtctctttggcactgtttggtgcttttgttagccgtgcagcaatctcaacagttgatgtcttgactccaaaggtgttcatcggtttgatcgttggtgctatgcttccgtactggttctctgccatgaccatgaagagtgcaggaagtgctgcattgaaaatggttgaggaggttcgcaggcagttcaacaccattcctggcctcatggagggcactgccaagcctgattacgctaactgtgtcaagatctctactgatgcttccatcaaggagatgattcctcctggtgctcttgtcatgctcacacccctcatcgtcggaaccttcttcggtgtggaaaccctctctggtgttcttgctggctctcttgtatctggtgttcagatcgcaatatctgcatcaaacactggaggtgcatgggacaatgccaagaagtacattgaggcaggtgcttctgagcacgcaaggacccttggacccaaagggtcagagccacacaaggcagctgtgatcggtgacaccatcggagacccactcaaggacacgtcggggccatcactgaacatccttatcaagcttatggccgtagaatcgcttgtttttgctccctttttcgccacccacggtgcctttcttttcaaaattttttgaagaaagttaaataatgaccagaagaagggggggaagggagggggtttgttaagctagttttatttagggaagttaaaatactatttttgattttgaggagggatgaggaggaggatttggacaccaatggagattggggtaaaacaaaaatttgatgggatgggatgtgtgaaccaaaattggaggcataaatatggggcatcaggacttgggtgggttgggggtatgttctggtcctttttaattttaatttttggttttttttttttttgtttcatgtagggggtagaacaattttcccttttttattttattttaacatttgtactgttcatcgtttaatcaagaaaagaccatttggattttttaccaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagtactt

seqidno:7：

mgvallselateilvpvcavigivfslvqwylvsrvslthdrsagnnnnnkkngfndylieeeegindqsvvtkcaeiqnaisegatsflfteyqyvgifmvafailiflflgsvegfstksqqctydktrtckpalataifstvafvlggvtsvlsgflgmkiatyanarttlearrgvgkafitafrsgavmgfllaangllvlyiainlfklyygddweglfeaitgyglggssmalfgrvgggiytkaadvgadlvgkvernipeddprnpaviadnvgdnvgdiagmgsdlfgsyaesscaalvvasissfginhdftamlypllissmgilvclittlfatdifeikavkeiepalkkqliistilmtvgiaivswvglpssfttynfgtqkvvknwelflcvgvglwagliigfvteyytsnayspvqdvadscrtgaatnvifglalgyksviipifaiaisifvsfslaamygiavaalgmlstiatglaidaygpisdnaggiaemagmshrirertdaldaagnttaaigkgfaigsaalvslalfgafvsraaistvdvltpkvfiglivgamlpywfsamtmksagsaalkmveevrrqfntipglmegtakpdyancvkistdasikemippgalvmltplivgtffgvetlsgvlagslvsgvqiaisasntggawdnakkyieagasehartlgpkgsephkaavigdtigdplkdtsgpslniliklmaveslvfapffathgaflfkif

seqidno:8：gttcgcaggcagttcaacaccattc

seqidno:9：accagatacaagagagccagcaaga

seqidno:10：

ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagt

seqidno:11：gtttgccttcgtccttca

seqidno:12：cattgtcccatgcacctc

seqidno:13：

gttcgcaggcagttcaacaccattcctggcctcatggagggcactgccaagcctgattacgctaactgtgtcaagatctctactgatgcttccatcaaggagatgattcctcctggtgctcttgtcatgctcacacccctcatcgtcggaaccttcttcggtgtggaaaccctctctggtgttcttgctggctctcttgtatctggtgttcagatcgcaatatctgcatcaaacactggaggtgcatgggacaatgccaagaagtacattgaggcaggtgcttctgagcacgcaaggacccttggacccaaagggtcagagccacacaaggcagctgtgatcggtgacaccatcggagacccactcaaggacacgtcggggccatcactgaacatccttatcaagcttatggccgtagaatcgcttgtttttgctccctttttcgccacccacggtgcctttcttttcaaaattttttgaaga

序列表

<110>中國林業(yè)科學研究院

北京騏驥生物技術(shù)有限公司

<120>唐古特白刺液泡膜h+-ppase蛋白基因ntvp1、其編碼蛋白、克隆方法

<130>td1612546f

<160>13

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>簡并引物ntvp1-f1

<400>1

cattcgccattcagg15

<210>2

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>簡并引物ntvp1-r1

<400>2

acatagcagccaaagt16

<210>3

<211>1156

<212>dna

<213>唐古特白刺

<400>3

gatgattgggagggtcttttgaggctatccragcatttgggctgacgggatcgactacgc60

atgctatgggacgaccgggcggcggtctctatccgattgctgctgatgttggtgctgatc120

ttgtgggcaaggtcgagagaaacattccagaagacgagccaagaaaccctgctgtcattg180

ctgacaacgttggtgacaatgttagggacgttgctcgcatgggctcagatcttttcggtt240

catatgccgggtcatcttgtgctgcgctcgtagttgcatccatttcatcctttggaatca300

accatgacttcactgccatgttgtatcctctgctcatcagttcgatgggtatccttgttt360

gtttgatcacaactctctttgccactgatatctttgagatcaaggctgttaaagagatcg420

agccagcattgaagaagcagcttatcatctctactattcttatgactgttggaattgcaa480

ttgtttcatgggttggtttgccttcgtccttcacaatctacaattttgggactcagaagg540

ttgtcaagaactgggaacttttcttgtgtgtgggtgttggtctttgggctggactcatca600

ttggatttgtgaccgagtactatactagcaacgcatacagccctgtacaagatgttgctg660

actcctgcagaacaggagctgccaccaatgttatctttggtcttgctttgggatacaaat720

ctgtcatcattccaatttttgccattgctatcagtatttttgtcagttttagtttggctg780

ctatgtatggcattgcagtggctgcccttggtatgctcagcactattgccactggattgg840

caattgatgcctacggtcccatcagtgacaatgctggaggcattgctgagatggctggca900

tgagtcaccgcatccgtgagaggactgatgcccttgatgcagctggaaacacaactgctg960

ccatcggaaagggatttgcaattggatcagcagcccttgtctctttggctctgtttggtg1020

cttttgttagccgtgcagcaatctcaacagttgatgtcttgactccaaaggtgttcatcg1080

gtttgattgttggtgctatgctcccgtactggttctcggccacatgaccatcggaagagt1140

gtnggaagtgcaatct1156

<210>4

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>3'race引物

<400>4

tgccaatccagtggcaatagtgctga26

<210>5

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>5'race引物

<400>5

acaactgctgccatcggaaagggatt26

<210>6

<211>2810

<212>dna

<213>唐古特白刺

<400>6

acatggggaaacatcttcacttgaaaatacttccctctcctctgtcttctgcctcttctc60

tttttcttttttttttttttcgttgtttttctggttttggtaggtatgggagtggcgttg120

ctgtccgagctggcgacggagatactggttccggtctgtgccgtgatcggtatcgtgttc180

tcgctcgttcagtggtacctcgtctcgcgcgtgtcgctcacgcacgaccggtcggccggg240

aacaacaacaacaacaagaagaatggattcaacgattatttgatcgaggaagaggaagga300

attaatgaccagagcgtcgtgaccaagtgtgctgaaattcagaacgctatttctgaaggt360

gcaacatcctttcttttcactgaatatcagtatgttgggatcttcatggttgcttttgca420

atcttgattttcctcttcctgggttctgtggagggcttcagcacaaagagccagcaatgt480

acttacgataaaacaaggacgtgcaagcctgcacttgccactgctatcttcagcacagta540

gcatttgtgcttggtggcgtcacatctgtcctttctggcttccttgggatgaaaattgct600

acttatgcaaatgccagaactaccctggaagcaagaaggggtgtcggaaaggcttttatt660

actgcatttaggtctggtgcagtaatgggcttcctccttgcagcaaatggtctcttggtg720

ctttacattgctatcaatctctttaagttgtactatggtgatgactgggaaggcctattt780

gaggctattactggatacggtcttgggggttcttcaatggctctctttggacgagtgggt840

ggtggtatctataccaaggctgctgatgttggtgctgatcttgtgggcaaggtcgagaga900

aacattccagaagacgatccaagaaaccctgctgtcattgctgacaacgttggtgacaat960

gttggggacattgctggcatgggctcggatctttttggttcttatgctgagtcatcctgt1020

gctgcgcttgttgttgcatccatttcatcctttggaatcaaccatgacttcactgccatg1080

ttgtatcctctgctcatcagttcgatgggtatccttgtttgtttgatcacaactctcttt1140

gccactgatatctttgagatcaaggctgttaaagagatcgagccagcattgaagaagcag1200

cttatcatctctactattcttatgactgttggaattgcaattgtttcatgggttggtttg1260

ccttcgtccttcacaacctacaattttgggactcagaaggttgtcaagaactgggaactt1320

ttcttgtgtgtgggtgttggtctttgggctggactcatcattggatttgtgaccgagtac1380

tatactagcaatgcatacagccctgtacaagatgttgctgactcctgcagaacaggagct1440

gccaccaatgttatctttggtcttgctttgggatacaaatctgttatcattccaattttt1500

gccattgctatcagtatttttgtcagttttagtttggctgctatgtatggcattgcagtg1560

gctgcccttggtatgctcagcactattgccactggattggcaattgatgcctacggtccc1620

atcagtgacaatgctggaggcattgctgagatggctggcatgagtcatcgcatccgtgag1680

aggactgatgcccttgatgcagctggaaacacaactgctgccatcggaaagggatttgca1740

attggatcagcagcccttgtctctttggcactgtttggtgcttttgttagccgtgcagca1800

atctcaacagttgatgtcttgactccaaaggtgttcatcggtttgatcgttggtgctatg1860

cttccgtactggttctctgccatgaccatgaagagtgcaggaagtgctgcattgaaaatg1920

gttgaggaggttcgcaggcagttcaacaccattcctggcctcatggagggcactgccaag1980

cctgattacgctaactgtgtcaagatctctactgatgcttccatcaaggagatgattcct2040

cctggtgctcttgtcatgctcacacccctcatcgtcggaaccttcttcggtgtggaaacc2100

ctctctggtgttcttgctggctctcttgtatctggtgttcagatcgcaatatctgcatca2160

aacactggaggtgcatgggacaatgccaagaagtacattgaggcaggtgcttctgagcac2220

gcaaggacccttggacccaaagggtcagagccacacaaggcagctgtgatcggtgacacc2280

atcggagacccactcaaggacacgtcggggccatcactgaacatccttatcaagcttatg2340

gccgtagaatcgcttgtttttgctccctttttcgccacccacggtgcctttcttttcaaa2400

attttttgaagaaagttaaataatgaccagaagaagggggggaagggagggggtttgtta2460

agctagttttatttagggaagttaaaatactatttttgattttgaggagggatgaggagg2520

aggatttggacaccaatggagattggggtaaaacaaaaatttgatgggatgggatgtgtg2580

aaccaaaattggaggcataaatatggggcatcaggacttgggtgggttgggggtatgttc2640

tggtcctttttaattttaatttttggttttttttttttttgtttcatgtagggggtagaa2700

caattttcccttttttattttattttaacatttgtactgttcatcgtttaatcaagaaaa2760

gaccatttggattttttaccaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagtactt2810

<210>7

<211>767

<212>prt

<213>唐古特白刺

<400>7

metglyvalalaleuleusergluleualathrgluileleuvalpro

151015

valcysalavalileglyilevalpheserleuvalglntrptyrleu

202530

valserargvalserleuthrhisaspargseralaglyasnasnasn

354045

asnasnlyslysasnglypheasnasptyrleuilegluglugluglu

505560

glyileasnaspglnservalvalthrlyscysalagluileglnasn

65707580

alailesergluglyalathrserpheleuphethrglutyrglntyr

859095

valglyilephemetvalalaphealaileleuilepheleupheleu

100105110

glyservalgluglypheserthrlysserglnglncysthrtyrasp

115120125

lysthrargthrcyslysproalaleualathralailepheserthr

130135140

valalaphevalleuglyglyvalthrservalleuserglypheleu

145150155160

glymetlysilealathrtyralaasnalaargthrthrleugluala

165170175

argargglyvalglylysalapheilethralapheargserglyala

180185190

valmetglypheleuleualaalaasnglyleuleuvalleutyrile

195200205

alaileasnleuphelysleutyrtyrglyaspasptrpgluglyleu

210215220

pheglualailethrglytyrglyleuglyglysersermetalaleu

225230235240

pheglyargvalglyglyglyiletyrthrlysalaalaaspvalgly

245250255

alaaspleuvalglylysvalgluargasnileprogluaspasppro

260265270

argasnproalavalilealaaspasnvalglyaspasnvalglyasp

275280285

ilealaglymetglyseraspleupheglysertyralagluserser

290295300

cysalaalaleuvalvalalaserileserserpheglyileasnhis

305310315320

aspphethralametleutyrproleuleuilesersermetglyile

325330335

leuvalcysleuilethrthrleuphealathraspilephegluile

340345350

lysalavallysgluilegluproalaleulyslysglnleuileile

355360365

serthrileleumetthrvalglyilealailevalsertrpvalgly

370375380

leuproserserphethrthrtyrasnpheglythrglnlysvalval

385390395400

lysasntrpgluleupheleucysvalglyvalglyleutrpalagly

405410415

leuileileglyphevalthrglutyrtyrthrserasnalatyrser

420425430

provalglnaspvalalaaspsercysargthrglyalaalathrasn

435440445

valilepheglyleualaleuglytyrlysservalileileproile

450455460

phealailealaileserilephevalserpheserleualaalamet

465470475480

tyrglyilealavalalaalaleuglymetleuserthrilealathr

485490495

glyleualaileaspalatyrglyproileseraspasnalaglygly

500505510

ilealaglumetalaglymetserhisargilearggluargthrasp

515520525

alaleuaspalaalaglyasnthrthralaalaileglylysglyphe

530535540

alaileglyseralaalaleuvalserleualaleupheglyalaphe

545550555560

valserargalaalaileserthrvalaspvalleuthrprolysval

565570575

pheileglyleuilevalglyalametleuprotyrtrppheserala

580585590

metthrmetlysseralaglyseralaalaleulysmetvalgluglu

595600605

valargargglnpheasnthrileproglyleumetgluglythrala

610615620

lysproasptyralaasncysvallysileserthraspalaserile

625630635640

lysglumetileproproglyalaleuvalmetleuthrproleuile

645650655

valglythrphepheglyvalgluthrleuserglyvalleualagly

660665670

serleuvalserglyvalglnilealaileseralaserasnthrgly

675680685

glyalatrpaspasnalalyslystyrileglualaglyalaserglu

690695700

hisalaargthrleuglyprolysglysergluprohislysalaala

705710715720

valileglyaspthrileglyaspproleulysaspthrserglypro

725730735

serleuasnileleuilelysleumetalavalgluserleuvalphe

740745750

alaprophephealathrhisglyalapheleuphelysilephe

755760765

<210>8

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>特異引物ntvp1-f8

<400>8

gttcgcaggcagttcaacaccattc25

<210>9

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>特異引物ntvp1-r8

<400>9

accagatacaagagagccagcaaga25

<210>10

<211>45

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>upm引物

<400>10

ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagt45

<210>11

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>t1引物

<400>11

gtttgccttcgtccttca18

<210>12

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>t2引物

<400>12

cattgtcccatgcacctc18

<210>13

<211>483

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>207bp的片段

<400>13

gttcgcaggcagttcaacaccattcctggcctcatggagggcactgccaagcctgattac60

gctaactgtgtcaagatctctactgatgcttccatcaaggagatgattcctcctggtgct120

cttgtcatgctcacacccctcatcgtcggaaccttcttcggtgtggaaaccctctctggt180

gttcttgctggctctcttgtatctggtgttcagatcgcaatatctgcatcaaacactgga240

ggtgcatgggacaatgccaagaagtacattgaggcaggtgcttctgagcacgcaaggacc300

cttggacccaaagggtcagagccacacaaggcagctgtgatcggtgacaccatcggagac360

ccactcaaggacacgtcggggccatcactgaacatccttatcaagcttatggccgtagaa420

tcgcttgtttttgctccctttttcgccacccacggtgcctttcttttcaaaattttttga480

aga483