基于納米金形成的可視化檢測過氧化氫酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于納米金形成的可視化檢測過氧化氫酶的方法，包括：將可能含有過氧化氫酶的測試樣品與過氧化氫、輔助催化劑和氯金酸在滿足選定液相環(huán)境中混合反應(yīng)，通過觀測混合反應(yīng)體系的顏色和/或可見光吸收強度，實現(xiàn)對樣品中所含過氧化氫酶的檢測，其中，所述選定液相環(huán)境為適于過氧化氫酶催化降解過氧化氫的液相反應(yīng)環(huán)境。本發(fā)明方法操作簡便，快速靈敏，測試結(jié)果采用肉眼或簡單儀器即可檢測，成本低廉，彌補了現(xiàn)有的檢測過氧化氫酶技術(shù)的不足。
【專利說明】基于納米金形成的可視化檢測過氧化氫酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種過氧化氫酶的檢測方法，特別是一種基于納米金形成的可視化檢測過氧化氫酶的方法，屬于化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]過氧化氫酶(catalase，CAT)廣泛存在于哺乳動物的各組織中，是重要的抗氧化酶，能將有毒性的H2O2轉(zhuǎn)化為無毒害的水和氧氣，構(gòu)成機體第一道抗氧化防線。大量研究發(fā)現(xiàn)，CAT與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，而這些微生物受到外界H2O2的激發(fā)，則會加快過氧化氫酶的產(chǎn)生，即使非常少量的微生物也會產(chǎn)生大量的過氧化氫酶，通過這一點，過氧化氫酶被認(rèn)為是一種乳腺腫瘤標(biāo)志性的生物分子?；加腥橄傺椎哪膛．a(chǎn)出的牛奶中細(xì)菌總數(shù)、體細(xì)胞計數(shù)明顯高于正常牛奶，CAT通過奶牛體細(xì)胞出現(xiàn)在牛奶中，而CAT的水平與牛奶的體細(xì)胞計數(shù)相關(guān)。因此，通過檢測牛奶中的CAT有助于發(fā)現(xiàn)奶牛是否患有乳腺炎，也可以用于判斷原料乳是否感染。
[0003]目前國內(nèi)外有文獻(xiàn)報道了一些較快速靈敏的CAT檢測方法，如將微流注射結(jié)合伏安電化學(xué)法、高效液相結(jié)合伏安電化學(xué)法，利用CAT的活性分解過氧化氫產(chǎn)生的電流信號變化實現(xiàn)CAT的檢測。另外亦有文獻(xiàn)報道在表面等離子共振生物傳感器表面固定CAT的核酸適配體(Aptamer)捕獲CAT實現(xiàn)檢測。但是，前述方法均需要復(fù)雜和昂貴的儀器，檢測成本高，限制它們的實際應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提出一種基于納米金形成的可視化檢測過氧化氫酶的方法，其能實現(xiàn)對過氧化氫酶進(jìn)行方便快速的檢測，成本低廉，易于操作，從而克服了現(xiàn)有技術(shù)中的不足。
[0005]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案:
[0006]一種基于納米金形成的可視化檢測過氧化氫酶的方法，包括:將可能含有過氧化氫酶的測試樣品與過氧化氫、輔助催化劑和氯金酸在滿足選定液相環(huán)境中混合反應(yīng)，通過觀測混合反應(yīng)體系的顏色和/或可見光吸收強度，實現(xiàn)對樣品中所含過氧化氫酶的檢測，
[0007]其中，所述選定液相環(huán)境為適于過氧化氫酶催化降解過氧化氫的液相反應(yīng)環(huán)境。
[0008]進(jìn)一步的，所述輔助催化劑包括檸檬酸鈉、抗壞血酸或沒食子酸。
[0009]作為較為優(yōu)選的實施方案之一，該方法可以包括如下步驟:
[0010](I)提供濃度為800μΜ的過氧化氫溶液,且所述過氧化氫溶液還含有濃度為
0.5?2mM的2-嗎啉乙磺酸，pH值5.0?7.0 ;
[0011](2)取可能含有過氧化氫酶的測試樣品與步驟(I)中所述的過氧化氫溶液按照1:1的體積比混合均勻，并在室溫下靜置IOmin以上；
[0012](3)提供濃度為5?IOmM的氯金酸溶液、濃度為1.0mM的輔助催化劑溶液和濃度為0.5?2mM的MES溶液按照3?6:3:91的體積比混合；[0013](4)取步驟(2)所得混合溶液與步驟(3)所得混合溶液均勻混合反應(yīng)5min以上，觀測混合反應(yīng)體系的顏色和/或可見光吸收強度，實現(xiàn)對樣品中所含過氧化氫酶的檢測。
[0014]進(jìn)一步的，該方法包括:
[0015]1、取一系列不同濃度的過氧化氫酶標(biāo)準(zhǔn)樣品與過氧化氫、輔助催化劑和氯金酸在滿足選定液相環(huán)境中混合反應(yīng)，并檢測每一標(biāo)準(zhǔn)樣品最終所形成的混合反應(yīng)體系的顏色和/或可見光吸收強度，并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度與混合反應(yīng)體系顏色和/或可見光吸收濃度的對應(yīng)關(guān)系建立標(biāo)準(zhǔn)圖譜；
[0016]I1、取可能含有過氧化氫酶的測試樣品與過氧化氫、輔助催化劑和氯金酸在滿足選定液相環(huán)境中混合反應(yīng)，并檢測最終所形成的混合反應(yīng)體系的顏色和/或可見光吸收強度，再與標(biāo)準(zhǔn)圖譜比對，從而測得測試樣品中所含過氧化氫酶的濃度。
[0017]作為較為優(yōu)選的實施方案之一，所述可見光的波長為540nm。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有如下優(yōu)點:該基于納米金形成的可視化檢測過氧化氫酶的方法依據(jù)過氧化氫酶分解過氧化氫，而過氧化氫還原氯金酸，產(chǎn)生得到顏色不同或深淺不同的納米金，可用肉眼定性分辨結(jié)果，并且可以通過測定光吸收強度等定量分析結(jié)果，反應(yīng)快速靈敏，測試結(jié)果采用肉眼或簡單儀器即可檢測，成本低廉，易于操作，彌補了現(xiàn)有的檢測過氧化氫酶技術(shù)的不足。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1是本發(fā)明實施例1中CAT可視化檢測顯色圖，圖中從左到右所對應(yīng)過氧化氫酶的濃度(nM)分別為 40、20、7、2.5,0.8,0.25,0.08、0 ；
[0020]圖2是本發(fā)明實施例1中CAT檢測校正曲線，其中，B:加入過氧化氫酶(0.08，0.25，0.8，2.5，7，20，40nM)所對應(yīng)的 A540 ；B0:加入過氧化氫酶(OnM)所對應(yīng)的 A5400
【具體實施方式】
[0021]如前所述，鑒于現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明提供了一種基于納米金形成的過氧化氫酶檢測方法，其通過過氧化氫酶分解過氧化氫，利用檸檬酸鈉、抗壞血酸或沒食子酸作為輔助催化劑，過氧化氫還原氯金酸，而過氧化氫還原氯金酸的量不同，所顯示的光吸收強度及顏色的不同，從而實現(xiàn)可視化檢測過氧化氫酶的含量，該檢測方法操作簡便，快速靈敏，為檢測牛奶等液態(tài)飲料中過氧化氫酶的含量提供了 一項可視化的檢測方法。
[0022]在本發(fā)明的一較為優(yōu)選的實施方案中，該方法可以包括
[0023](I)配制MES(2_嗎啉乙磺酸)緩沖溶液，用0.0lM碳酸鉀調(diào)節(jié)pH值。吸取100 μ L不同濃度(如40，20, 7，2.5，0.8，0.25，0.08, OnM)的過氧化氫酶溶液到96微孔板中，每個孔中加入100 μ L800 μ M的過氧化氫溶液,振蕩混勻后,靜置10?15min。
[0024](2)移取6μ L氯金酸溶液(5?10πιΜ)，3μ L1.0mM檸檬酸鈉、抗壞血酸或沒食子酸溶液，以及91 μ L1.0mM MES溶液到96微孔板中，再加入上述(I)中100 μ L混合液，振蕩混勻，反應(yīng)IOmin后，觀察顯色結(jié)果，檢測540nm處光吸收強度。
[0025]進(jìn)一步的，在前述步驟(I)中，所述MES溶液的pH值還可以為6.0?7.0，濃度還可以為0.5mM?2mM。
[0026]前述步驟(2)中所使用的氯金酸溶液體積還可以為3?6μ L，濃度還可以為5?10mM。
[0027]更為具體的，該實施方案中的方法還可以為:
[0028](I)配制濃度為0.5mM~2mM的MES緩沖溶液，用0.0lM碳酸鉀調(diào)節(jié)pH值為6.0~
7.0。吸取100 μ L不同濃度(如40，20，7，2.5，0.8，0.25，0.08，OnM)的過氧化氫酶溶液到96微孔板中，每個孔中加入100 μ L800 μ M的過氧化氫溶液，振蕩混勻后，靜置10~15min。
[0029](2)移取3~6μ L濃度為5~IOmM氯金酸溶液，3 μ L1.0mM檸檬酸鈉、抗壞血酸或沒食子酸溶液，以及91 μ L MES溶液到96微孔板中，再加入上述(I)中100 μ L混合液，振蕩混勻，反應(yīng)5min后,觀察顯色結(jié)果,或檢測540nm處光吸收強度(A54tl)。
[0030]以下結(jié)合若干較佳實施例及附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案作更為具體的說明。
[0031]實施例1該過氧化氫酶的檢測方法原理如下式所示:
[0032]
【權(quán)利要求】
1.一種基于納米金形成的可視化檢測過氧化氫酶的方法，其特征在于，包括:將可能含有過氧化氫酶的測試樣品與過氧化氫、輔助催化劑和氯金酸在滿足選定液相環(huán)境中混合反應(yīng)，通過觀測混合反應(yīng)體系的顏色和/或可見光吸收強度，實現(xiàn)對樣品中所含過氧化氫酶的檢測， 其中，所述選定液相環(huán)境為適于過氧化氫酶催化降解過氧化氫的液相反應(yīng)環(huán)境。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于納米金形成的可視化檢測過氧化氫酶的方法，其特征在于，所述輔助催化劑包括檸檬酸鈉、抗壞血酸或沒食子酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于納米金形成的可視化檢測過氧化氫酶的方法，其特征在于，包括如下步驟: (O提供濃度為800 μ M的過氧化氫溶液,且所述過氧化氫溶液還含有濃度為0.5?2mM的2-嗎啉乙磺酸，pH值5.0?7.0 ； (2)取可能含有過氧化氫酶的測試樣品與步驟(I)中所述的過氧化氫溶液按照1:1的體積比混合均勻，并在室溫下靜置IOmin以上； (3)提供濃度為5?10mM的氯金酸溶液、濃度為1.0 mM的輔助催化劑溶液和濃度為0.5?2mM的MES溶液按照3?6:3:91的體積比混合； (4)取步驟(2)所得混合溶液與步驟(3)所得混合溶液均勻混合反應(yīng)5min以上，觀測混合反應(yīng)體系的顏色和/或可見光吸收強度，實現(xiàn)對樣品中所含過氧化氫酶的檢測。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的基于納米金形成的可視化檢測過氧化氫酶的方法，其特征在于，包括: 1、取一系列不同濃度的過氧化氫酶標(biāo)準(zhǔn)樣品與過氧化氫、輔助催化劑和氯金酸在滿足選定液相環(huán)境中混合反應(yīng)，并檢測每一標(biāo)準(zhǔn)樣品最終所形成的混合反應(yīng)體系的顏色和/或可見光吸收強度，并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度與混合反應(yīng)體系顏色和/或可見光吸收濃度的對應(yīng)關(guān)系建立標(biāo)準(zhǔn)圖譜； I1、取可能含有過氧化氫酶的測試樣品與過氧化氫、輔助催化劑和氯金酸在滿足選定液相環(huán)境中混合反應(yīng)，并檢測最終所形成的混合反應(yīng)體系的顏色和/或可見光吸收強度，再與標(biāo)準(zhǔn)圖譜比對，從而測得測試樣品中所含過氧化氫酶的濃度。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的基于納米金形成的可視化檢測過氧化氫酶的方法，其特征在于，所述可見光的波長為540 nm。
【文檔編號】G01N21/78GK103472055SQ201310430745
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月18日
【發(fā)明者】彭池方, 段小慧, 劉麗強, 宋珊珊 申請人:江南大學(xué)