本發(fā)明屬于微生物領域，涉及一種重組人激肽原酶-1(recombinanthumankallikrein-1，以下簡稱rhklk1)基因的重組菌株及其生產和純化工藝。

背景技術：

激肽釋放酶－激肽系統(tǒng)(kallikreinkininsystem，kks)又稱激肽系統(tǒng)，廣泛存在于動物體內的多個系統(tǒng)，尤其是在心血管系統(tǒng)內分布更為密集。其主要成分為：激肽原(活性因子前體)、激肽原酶(活性因子前體的激活物，又稱為激肽釋放酶)、激肽(主要活性因子)、激肽酶(活性因子的滅活物)。正常情況下激肽生成后迅速被循環(huán)中的激肽酶滅活。

激肽原酶，又稱激肽釋放酶，是一種絲氨酸蛋白酶，能使激肽原釋放出激肽，它具有很高的生理活性，在人體組織中起著十分重要的生理作用。目前分為兩類：血漿激肽原酶(pk)和組織激肽原酶(tk)。兩種酶在分子量大小、底物特異性、免疫學特征和釋放出的激肽方面都不同。血漿激肽原酶參與血凝塊的表面激活、纖維蛋白溶解、激肽生成和炎癥過程。組織激肽原酶廣泛存在于腎、胰腺、胃腸道黏膜及中樞神經系統(tǒng)等許多組織中，它以激肽原酶原的形式在組織中合成，再經胰蛋白酶激活形成組織激肽原酶，并可釋放至血液循環(huán)。組織激肽原酶基因是一類大的多基因家族，目前證明人組織激肽原酶基因家族至少由15個基因(klk1-klk15)組成。共分為五個亞系：第一組klk4、klk5、klk14；第二組klk9、klk11、klk15；第三組klk10、klk12；第四組klk6、klk13；最后一組klk8和klk1、klk2、klk3。而這15個基因中迄今為止只有klkl、klk2和klk3具有特異性生物學功能，與疾病的研究較為深刻，其他基因的研究報道極少。

klk1主要是通過低分子激肽原釋放賴氨酰緩激肽即胰激肽原發(fā)揮其生物學功能。然而，klk1不同的表達形式提示在不同類型細胞中該酶表現(xiàn)不同的專一性。klk1除發(fā)揮其激肽原酶功能外，根據它在垂體和胰腺等組織的存在表明它能對肽類激素和生長素進行加工處理。klk1能降解胰島素原、ldl、心房尿鈉素前體、凝乳酶原、血管腸肽、前膠元酶、血管緊張素原等。在每一類型細胞中klk1都可能有單一的或多重的或常見的或獨特的功能。但是，研究表明激肽釋放才是最主要的生理功能，起到擴張毛細血管，改善微循環(huán)的作用，產生舒張毛細血管和擴張小動脈等藥理作用。klk2，klk3和klk1的天然底物不同，與klk1相比，具有非常低的活性，而其他激肽原酶有的與生理過程有關，有的與疾病的病理過程有關，但無一具有特異性基質水解作用。

激肽原酶klk1臨床用于糖尿病并發(fā)癥、高血壓及急性缺血性腦卒中等疾病的治療。較為常見的產品主要有兩類：一類是從豬胰臟提取的激肽原酶(例如常州千紅制藥的“怡開”)，另一類是人尿激肽原酶(例如廣州天普的“尤瑞克林”)，其主要由人尿中提取，上述產品均存在來源有限，生產工藝難以穩(wěn)定可控，病毒污染風險，從而導致最終產品生產工藝復雜，批次生產一致性較差，成本較高。

迄今為止，國內外采用基因工程的方法利用酵母表達系統(tǒng)生產重組人激肽原酶(rhklk1)蛋白進行了不少研究，但由于種屬差異，rhklk1天然序列很難直接在酵母中表達，表達產物常出現(xiàn)序列不正確、糖基化修飾均一度差、生物活性低、產量低或生產工藝復雜、難以產業(yè)化應用等問題。例如，1998年chan等得到的rhklk1蛋白電泳時明顯有差不多的兩條帶，且無法證明產品均一性(proteinexpressionandpurification12,361–370，1998)。另外根據中國專利申請200610027754.1可知，2006年上海萬興生物研發(fā)的畢赤酵母表達rhklk1蛋白工藝，宿主內源蛋白表達量高，rhklk1分離純化困難；而且，同樣的通過其專利中的文字描述，以及申請人后期對其工藝的驗證，發(fā)現(xiàn)所表達產物為高低糖基化修飾激肽原酶在蛋白電泳時顯示仍然有相差無幾的兩條帶產生。為了在一定程度上克服上述問題，申請人在先申請201310737079.1中，雖然對其編碼基因進行了優(yōu)化，使其更適合于畢赤酵母表達系統(tǒng)表達，雖然表達量有所上升，但所表達的產物仍然存在有高低不同分子量的兩個蛋白，且表達量也是接近的。根據已有文獻分析可知，之所以有這兩個高低分子量的rhklk1蛋白產生，主要是因為糖基化修飾的不同，并且畢赤酵母表達的高糖基化rhklk1具有高甘露糖型結構，這種糖鏈結構不僅能改變重組糖蛋白的功能和特點，而且高甘露糖型糖鏈在人體內可以與甘露糖受體結合，導致藥動學性質不良和產生免疫反應，而低糖基化rhklk1具有低甘露糖型結構，可以很好的克服上述畢赤酵母表達rhklk1的缺點。而且，若能將所表達的rhklk1較集中于低糖基化部分，不僅對后續(xù)的純化工藝，同時對工業(yè)化生產時的質量控制都無疑有較大的幫助。

技術實現(xiàn)要素：

為克服上述技術問題，發(fā)明人在沒有現(xiàn)有技術能給出成功預期的情況下，經過長期的實驗摸索，在組合多樣的發(fā)酵控制參數(shù)和純化工藝中，摸索出了最佳的發(fā)酵工藝，不僅是采用優(yōu)化過的無機培養(yǎng)基，在提高產量和活性的同時使得生產成本大大降低，而且可以使獲得的產物均以低糖基化條帶為主，為工業(yè)化生產時的質量控制提供了有效支持。

同時，本發(fā)明提供的一種重組畢赤酵母高效發(fā)酵制備激肽原酶的生產工藝，也克服了現(xiàn)有激肽原酶發(fā)酵制備技術中存在的甲醇加入量過大，激肽釋放原酶活性較低，糖基化修飾較高的不足。

本發(fā)明的第一個目的，是提供一種rhklk1的畢赤酵母發(fā)酵方法，其發(fā)酵過程中：誘導階段的甲醇流加速度為：5～11ml/h^-1l^-1，誘導溫度為：25～28℃，所用bsm發(fā)酵培養(yǎng)基各組成成分及其配比分別為：k2so43.64～14.56g/l，mgso45.96～11.92g/l，koh0.372～0.744g/l，caso41.652～3.304g/l，h3po410.68～21.36ml/l，甘油16～32g/l。

優(yōu)選的，所述畢赤酵母表達方法，其中菌體增殖階段、限速生長階段以及rhklk1誘導表達階段中的培養(yǎng)基均采用上述所述bsm發(fā)酵培養(yǎng)基。

作為優(yōu)選的，所述方法包含下述步驟：

步驟1)將rhklk1畢赤酵母工程菌株劃線ypd平板，30℃培養(yǎng)3-5天。

步驟2)將此復蘇后的rhklk1工程菌株單克隆接種于ypd液體培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)至od600＝6～8，即得到上罐種子液。

步驟3)將此種子液接種于發(fā)酵罐的bsm發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵40～72h即得到rhklk1發(fā)酵液，其中誘導階段的甲醇流加速度：5～11ml/h^-1l^-1，誘導溫度為：25～28℃，所述bsm發(fā)酵培養(yǎng)基各組成成分及其配比分別為：k2so43.64～14.56g/l，mgso45.96～11.92g/l，koh0.372～0.744g/l，caso41.652～3.304g/l，h3po410.68～21.36ml/l，甘油16～32g/l。

更優(yōu)選的，上述步驟3)中增殖階段發(fā)酵溫度為30℃，ph＝6.0±0.2，轉速＝300rpm培養(yǎng)，do值100％，添加ptm1(2ml/l)，發(fā)酵20h；限速生長階段，先以30ml/h^-1l^-1的速率補加50％甘油，2h，然后以60ml/h^-1l^-1的速率補加50％甘油，4h；誘導階段，調節(jié)ph＝6.0±0.2，誘導溫度：25～28℃，甲醇流加速度：5～11ml/h^-1l^-1，并維持do不高于30％，繼續(xù)發(fā)酵40～72h。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種rhklk1發(fā)酵液的純化方法，所述純化方法包含以下步驟：

步驟1)rhklk1發(fā)酵液預處理：收集rhklk1發(fā)酵液低溫高速離心收集上清，加入硫酸銨，終濃度為1.5m，0.22μm濾膜過濾；

步驟2)疏水層析法純化：平衡緩沖液平衡層析柱，預處理的發(fā)酵液上清上樣，洗脫液梯度洗脫，收集低糖基化rhklk1洗脫峰；

步驟3)陰離子交換層析法純化：平衡緩沖液平衡層析柱，預處理后上樣，洗脫液梯度洗脫，收集低糖基化rhklk1洗脫峰。

優(yōu)選的，上述重組rhklk1純化方法步驟2)中，填料優(yōu)選為phenylsepharose6ff(hs)，平衡緩沖液buffera為：20mmnah2po4，1.5m(nh4)2so4，ph＝7.5；洗脫緩沖液bufferb為：20mmnah2po4，ph＝7.5，按照洗脫緩沖液bufferb50％，70％，100％等度洗脫，主要收集70％洗脫峰。

上述rhklk1純化方法步驟3)中，填料優(yōu)選為qsepharoseff，平衡緩沖液bufferb為：20mmnah2po4，ph＝7.5，洗脫緩沖液bufferc為：20mmnah2po4，1.5mnacl，按照洗脫緩沖液bufferc17％，35％，100％等度洗脫，主要收集35％洗脫峰。

本發(fā)明還提供一種優(yōu)化的bsm發(fā)酵培養(yǎng)基，其各組成成分及其配比分別為：k2so43.64～14.56g/l，mgso45.96～11.92g/l，koh0.372～0.744g/l，caso41.652～3.304g/l，h3po410.68～21.36ml/l，甘油16～32g/l。所述優(yōu)化的bsm發(fā)酵培養(yǎng)基，更適于rhklk1在畢赤酵母中表達。

根據多次試驗可以確定，本發(fā)明在rhklk1不同規(guī)模的高密度發(fā)酵中，rhklk1比活均大于1000iu/mg，藥用級別低糖基化rhklk1蛋白純品產量達到300mg/l以上。

本發(fā)明采用以上技術方案后，與現(xiàn)有技術相比，具有以下優(yōu)點：通過菌株活化、種子培養(yǎng)和關鍵發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化，制備的發(fā)酵液活性更高、產量更高、純化步驟更簡單，所采用的發(fā)酵培養(yǎng)基成分簡單、成本低廉，降低了發(fā)酵工藝的成本；發(fā)酵工藝中采用特定的培養(yǎng)和發(fā)酵控制條件，與未經優(yōu)化的發(fā)酵工藝條件相比，發(fā)酵時間明顯縮短，有效降低了生產成本，活性、產量均有50％以上的提高。

附圖說明

圖1-a為傳代第40代后，pcr擴增ypd平板中挑取的不同的rhklk1畢赤酵母單菌落中基因組中目的基因瓊脂糖凝膠電泳圖

其中，圖1-a為傳代第40代后，pcr擴增ypd平板中挑取的第1-14個rhklk1畢赤酵母單菌落中基因組中目的基因瓊脂糖凝膠電泳圖，其中泳道1為500bpdnaladder，泳道2-15為ypd平板中挑取的第1-14個rhklk1畢赤酵母單菌落。

圖1-b為傳代第40代后，pcr擴增ypd平板中挑取的第15-28個rhklk1畢赤酵母單菌落中基因組中目的基因瓊脂糖凝膠電泳圖，其中泳道1為500bpdnaladder，泳道2-15為ypd平板中挑取的第15-28個rhklk1畢赤酵母單菌落。

圖1-c為傳代第40代后，pcr擴增ypd平板中挑取的第29-42個rhklk1畢赤酵母單菌落中基因組中目的基因瓊脂糖凝膠電泳圖，其中泳道1為500bpdnaladder，泳道2-15為ypd平板中挑取的第29-42個rhklk1畢赤酵母單菌落。

圖1-d為傳代第40代后，pcr擴增ypd平板中挑取的第43-50個rhklk1畢赤酵母單菌落中基因組中目的基因瓊脂糖凝膠電泳圖，其中泳道1為500bpdnaladder，泳道2-9為ypd平板中挑取的第43-50個rhklk1畢赤酵母單菌落，泳道10為pcr擴增rhklk1表達載體中目的基因。

圖2傳代第40代后rhklk1畢赤酵母單菌落的表達鑒定圖。其中箭頭所指即為rhklk1條帶。

其中，泳道1為第一代rhklk1畢赤酵母單菌落中rhklk1的表達條帶，泳道2為傳代第5代rhklk1畢赤酵母單菌落中rhklk1的表達條帶，泳道3為傳代第10代rhklk1畢赤酵母單菌落中rhklk1的表達條帶，泳道4為傳代第15代rhklk1畢赤酵母單菌落中rhklk1的表達條帶，泳道5為傳代第20代rhklk1畢赤酵母單菌落中rhklk1的表達條帶，泳道6為傳代第25代rhklk1畢赤酵母單菌落中rhklk1的表達條帶，泳道7為傳代第30代rhklk1畢赤酵母單菌落中rhklk1的表達條帶，泳道8為傳代第35代rhklk1畢赤酵母單菌落中rhklk1的表達條帶，泳道9為傳代第40代rhklk1畢赤酵母單菌落中rhklk1的表達條帶。

圖3rhklk1畢赤酵母菌株不同批次小規(guī)模高密度發(fā)酵液od600和菌體濕重變化趨勢圖

其中，圖3-a為rhklk1畢赤酵母菌株第一批次小規(guī)模高密度發(fā)酵液od600和菌體濕重變化趨勢圖，圖3-b為rhklk1畢赤酵母菌株第二批次小規(guī)模高密度發(fā)酵液od600和菌體濕重變化趨勢圖，圖3-c為rhklk1畢赤酵母菌株第三批次小規(guī)模高密度發(fā)酵液od600和菌體濕重變化趨勢圖。

圖4rhklk1畢赤酵母菌株不同批次小規(guī)模高密度發(fā)酵液sds-page電泳圖

其中，圖4-a為rhklk1畢赤酵母菌株第一批次小規(guī)模高密度發(fā)酵液sds-page電泳圖，泳道1為(10-230kda)寬范圍的蛋白上樣marker；泳道2為流加甲醇0h發(fā)酵上清液，泳道3為流加甲醇4h發(fā)酵上清液，泳道4為流加甲醇8h發(fā)酵上清液，泳道5為流加甲醇16h發(fā)酵上清液，泳道6為流加甲醇24h發(fā)酵上清液，泳道7為流加甲醇32h發(fā)酵上清液，泳道8為流加甲醇40h發(fā)酵上清液，其中箭頭所指即為低分子量rhklk1條帶。

圖4-b為rhklk1畢赤酵母菌株第二批次小規(guī)模高密度發(fā)酵液sds-page電泳圖，泳道1為(10-230kda)寬范圍的蛋白上樣marker；泳道2為流加甲醇0h發(fā)酵上清液，泳道3為流加甲醇4h發(fā)酵上清液，泳道4為流加甲醇8h發(fā)酵上清液，泳道5為流加甲醇16h發(fā)酵上清液，泳道6為流加甲醇24h發(fā)酵上清液，泳道7為流加甲醇32h發(fā)酵上清液，泳道8為流加甲醇40h發(fā)酵上清液，其中箭頭所指即為低分子量rhklk1條帶。

圖4-c為rhklk1畢赤酵母菌株第三批次小規(guī)模高密度發(fā)酵液sds-page電泳圖，泳道1為(10-230kda)寬范圍的蛋白上樣marker；泳道2為流加甲醇0h發(fā)酵上清液，泳道3為流加甲醇4h發(fā)酵上清液，泳道4為流加甲醇8h發(fā)酵上清液，泳道5為流加甲醇16h發(fā)酵上清液，泳道6為流加甲醇24h發(fā)酵上清液，泳道7為流加甲醇32h發(fā)酵上清液，泳道8為流加甲醇40h發(fā)酵上清液，中箭頭所指即為低分子量rhklk1條帶。

圖5為rhklk1發(fā)酵液疏水層析色譜圖，圖中三個峰依次為50％，70％，100％bufferb洗脫樣品。其中前兩個分別為高分子量rhklk1、低分子量rhklk1的峰。

圖6為rhklk1發(fā)酵液疏水層析收集樣品sds-page凝膠電泳分析圖

其中，圖6-a為rhklk1發(fā)酵液疏水層析收集樣品sds-page凝膠電泳分析圖，泳道1為(10-230kda)寬范圍的蛋白上樣marker；泳道2-12為50％bufferb洗脫時不同的收集管樣品，泳道13-15為70％bufferb洗脫時不同的收集管樣品，箭頭所指即為低糖基化rhklk1條帶。

圖6-b為rhklk1發(fā)酵液疏水層析收集樣品sds-page凝膠電泳分析圖，

泳道1為(10-230kda)寬范圍的蛋白上樣marker；泳道1-12為70％bufferb洗脫洗脫時不同的收集管樣品，泳道13-15為100％bufferb洗脫時不同的收集管樣品，箭頭所指即為低糖基化rhklk1條帶。

圖7為rhklk1疏水收集樣品經過陰離子交換層析色譜圖。

圖8為rhklk1疏水收集樣品經過陰離子交換層析收集樣品sds-page凝膠電泳分析圖，其中，泳道1為(10-230kda)寬范圍的蛋白上樣marker；泳道2-8為bufferc洗脫時不同的收集管樣品。箭頭所指即為低糖基化rhklk1條帶。

圖9為rhklk1畢赤酵母菌株不同批次小規(guī)模高密度發(fā)酵液經兩步純化后，sec柱分析rhklk1聚集體hplc色譜圖，其中圖a，b，c分別為rhklk1畢赤酵母菌株第一、二、三批次小規(guī)模高密度發(fā)酵液低糖基化rhklk1精純樣品，d為空白對照。

圖10為rhklk1畢赤酵母菌株不同批次小規(guī)模高密度發(fā)酵液經兩步純化后，iec柱分析rhklk1純度hplc色譜圖，其中圖a，b，c分別為rhklk1畢赤酵母菌株第一、二、三批次小規(guī)模高密度發(fā)酵液低糖基化rhklk1精純樣品，d為空白對照。

圖11為rhklk1畢赤酵母菌株工藝參數(shù)范圍內外不同批次小規(guī)模高密度發(fā)酵液od600和菌體濕重變化趨勢圖

其中，圖11-a為rhklk1畢赤酵母菌株工藝范圍內驗證第一批次小規(guī)模高密度發(fā)酵液od600和菌體濕重變化趨勢圖，圖11-b為rhklk1畢赤酵母菌株工藝范圍內驗證第二批次小規(guī)模高密度發(fā)酵液od600和菌體濕重變化趨勢圖，圖11-c為rhklk1畢赤酵母菌株工藝范圍外驗證對照一批次小規(guī)模高密度發(fā)酵液od600和菌體濕重變化趨勢圖，圖11-d為rhklk1畢赤酵母菌株工藝范圍外驗證對照二批次小規(guī)模高密度發(fā)酵液od600和菌體濕重變化趨勢圖。

圖12rhklk1畢赤酵母菌株工藝參數(shù)范圍內外不同批次小規(guī)模高密度發(fā)酵液sds-page電泳圖

其中，圖12-a為rhklk1畢赤酵母菌株工藝范圍內驗證第一批次小規(guī)模高密度發(fā)酵液sds-page電泳圖，泳道1為(10-230kda)寬范圍的蛋白上樣marker；泳道2為流加甲醇0h發(fā)酵上清液，泳道3為流加甲醇4h發(fā)酵上清液，泳道4為流加甲醇8h發(fā)酵上清液，泳道5為流加甲醇16h發(fā)酵上清液，泳道6為流加甲醇24h發(fā)酵上清液，泳道7為流加甲醇32h發(fā)酵上清液，泳道8為流加甲醇40h發(fā)酵上清液，其中箭頭所指即為rhklk1條帶。

圖12-b為rhklk1畢赤酵母菌株工藝范圍內驗證第二批次小規(guī)模高密度發(fā)酵液sds-page電泳圖，泳道1為(10-230kda)寬范圍的蛋白上樣marker；泳道2為流加甲醇0h發(fā)酵上清液，泳道3為流加甲醇4h發(fā)酵上清液，泳道4為流加甲醇8h發(fā)酵上清液，泳道5為流加甲醇16h發(fā)酵上清液，泳道6為流加甲醇24h發(fā)酵上清液，泳道7為流加甲醇32h發(fā)酵上清液，泳道8為流加甲醇40h發(fā)酵上清液，其中箭頭所指即為rhklk1條帶。

圖12-c為rhklk1畢赤酵母菌株工藝范圍外驗證對照一批次小規(guī)模高密度發(fā)酵液sds-page電泳圖，泳道1為(10-230kda)寬范圍的蛋白上樣marker；泳道2為流加甲醇0h發(fā)酵上清液，泳道3為流加甲醇4h發(fā)酵上清液，泳道4為流加甲醇8h發(fā)酵上清液，泳道5為流加甲醇16h發(fā)酵上清液，泳道6為流加甲醇24h發(fā)酵上清液，泳道7為流加甲醇32h發(fā)酵上清液，泳道8為流加甲醇40h發(fā)酵上清液，其中箭頭所指即為rhklk1條帶。

圖12-d為rhklk1畢赤酵母菌株工藝范圍外驗證對照二批次小規(guī)模高密度發(fā)酵液sds-page電泳圖，泳道1為(10-230kda)寬范圍的蛋白上樣marker；泳道2為流加甲醇0h發(fā)酵上清液，泳道3為流加甲醇4h發(fā)酵上清液，泳道4為流加甲醇8h發(fā)酵上清液，泳道5為流加甲醇16h發(fā)酵上清液，泳道6為流加甲醇24h發(fā)酵上清液，泳道7為流加甲醇32h發(fā)酵上清液，泳道8為流加甲醇40h發(fā)酵上清液，其中箭頭所指即為rhklk1條帶。

圖13為rhklk1畢赤酵母菌株大規(guī)模生產高密度發(fā)酵液od600和菌體濕重變化趨勢圖

圖14為rhklk1畢赤酵母菌株大規(guī)模生產高密度發(fā)酵液sds-page電泳圖

其中，泳道1為(10-230kda)寬范圍的蛋白上樣marker；泳道2為流加甲醇0h發(fā)酵上清液，泳道3為流加甲醇4h發(fā)酵上清液，泳道4為流加甲醇8h發(fā)酵上清液，泳道5為流加甲醇16h發(fā)酵上清液，泳道6為流加甲醇24h發(fā)酵上清液，泳道7為流加甲醇32h發(fā)酵上清液，泳道8為流加甲醇40h發(fā)酵上清液，其中箭頭所指即為rhklk1條帶。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明，應理解，引用實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。本申請重組菌株種子根據先申請201310737079.1的方法制備獲得。

實施例1rhklk1種子庫建立及基因遺傳穩(wěn)定性

方案1：rhklk1種子庫建立

根據“生物制品生產檢定用菌毒種管理規(guī)程”的規(guī)定，對專利中201310737079.1rhklk1畢赤酵母菌株x33建立原始種子庫、主種子庫和工作種子庫。

方案2：rhklk1遺傳穩(wěn)定性

步驟1：重組菌株活化

取凍存于-80℃的工作種子庫中rhklk1甘油菌種子于ypd固體培養(yǎng)基(酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l，瓊脂糖15g/l)劃線，30℃恒溫恒濕箱培養(yǎng)3-5天。

步驟2：pcr鑒定基因穩(wěn)定性

挑ypd平板上50個單克隆菌落接種于5mlypd培養(yǎng)基(酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l)中，30℃，220rpm培養(yǎng)過夜。

離心收集上述不同克隆的菌體，分別在液氮和沸水中進行反復凍融破碎菌體。并以上述凍融液為模板，5-aox和3-aox為引物進行pcr擴增rhklk1畢赤酵母菌株基因組中目的基因，1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆率。

步驟3：傳代穩(wěn)定性

挑取步驟2中任一管pcr鑒定為陽性rhklk1畢赤酵母克隆菌液，連續(xù)在ypd液體培養(yǎng)基中傳代40次，并每傳代5次重復步驟2進行pcr擴增rhklk1畢赤酵母菌株基因組中目的基因，1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆率。圖1所示為傳代第40代后，pcr擴增rhklk1畢赤酵母菌株基因組中目的基因，瓊脂糖凝膠電泳顯示陽性克隆率為100％，說明該重組菌株能夠在大規(guī)模生產中，穩(wěn)定遺傳rhklk1基因。

步驟4：表達穩(wěn)定性

將步驟1中任一單克隆菌落穩(wěn)定傳代，第1-40代單克隆菌落均按1％接種量轉接于bsm培養(yǎng)液，濃氨水調節(jié)培養(yǎng)液至不同的ph，30℃，220rpm培養(yǎng)，每24h補加甲醇至終濃度為1.0％，一周后，對誘導培養(yǎng)液進行sds-page分析，各代單克隆菌落中rhklk1的表達情況如圖2所示。根據鑒定結果可知rhklk1畢赤酵母菌株經40代傳代后仍可穩(wěn)定表達目的蛋白rhklk1。

實施例2rhklk1小規(guī)模高密度發(fā)酵工藝

步驟1：重組菌株活化

取凍存于-80℃的工作種子庫中rhklk1甘油菌種子于ypd固體培養(yǎng)基劃線，30℃恒溫恒濕箱培養(yǎng)3-5天。

步驟2：種子液培養(yǎng)

挑取平板上單克隆菌落于ypd液體培養(yǎng)基，30℃，220rpm培養(yǎng)至od600≈6.0，并在顯微鏡下觀察無雜菌污染，即得到發(fā)酵用種子液。

步驟3：發(fā)酵過程

洗凈賽多利斯b-plus生物反應器，用ph＝7.0和ph＝4.0的標準液分別校正發(fā)酵罐的ph計探頭，然后按照表1中rhklk1小規(guī)模高密度發(fā)酵工藝條件優(yōu)化表中不同批次的發(fā)酵培養(yǎng)基配方配置3l發(fā)酵培養(yǎng)基，并倒入發(fā)酵罐中，121℃高壓滅菌20min，待溫度降到50℃后，用濃氨水調ph＝6.0±0.2。

將步驟2中得到的種子液按照1:15(v/v，種子液/發(fā)酵培養(yǎng)基)比例接入生物反應器中。初期重組畢赤酵母菌體增殖階段發(fā)酵溫度為30℃，ph＝6.0±0.2，轉速＝300rpm培養(yǎng)，do值100％，添加ptm1(2ml/l)。此階段大約20h，期間do值持續(xù)下降，通過增加攪拌轉速、通氣量以及通氧氣將do值維持在20％，當碳源消耗完畢后，溶氧值迅速上升，菌體濕重達到100g/l，此時進入限速生長階段，此階段的開始的2h以30ml/h^-1l^-1的速率補加50％甘油，2h后補料速度上調為60ml/h^-1l^-1。補加4h，菌體濕重約200g/l，停止補料，do值上升，表明碳源耗盡，進入誘導階段。調節(jié)ph＝6.0±0.2，按照表1中設計的方案，不同批次不同的甲醇流加速度進行誘導表達，并維持do值不高于30％，進行發(fā)酵表達。誘導開始后，每隔一段時間開始取樣，同時在誘導初期中，短暫停止甲醇補料觀察do值變化判斷罐內甲醇濃度是否過高，保證罐內甲醇無積累，并測發(fā)酵液od600吸收值以及菌體濕重，圖3-a，圖3-b，圖3-c為第一批次-第三批次發(fā)酵液od600吸收值以及菌體濕重發(fā)酵期間變化趨勢圖，由圖可知，在rhklk1小規(guī)模發(fā)酵期間，發(fā)酵液od600均能達到250以上，且菌體濕重均能達到400g/l，確保每批次發(fā)酵的穩(wěn)定性。誘導40h發(fā)酵結束后，離心收集上清，sds-page凝膠電泳鑒定甲醇誘導表達不同時間的rhklk1產量和高低糖基化修飾程度(圖4-a，4-b，4-c)。附圖4中也能明顯可以看出，整體而言rhklk1產量是較高的，而所表達的低糖基化修飾的rhklk1要明顯高于高糖基化修飾的rhklk1。詳細發(fā)酵工藝條件如下表1所示：

表1重組hklk1小規(guī)模高密度發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

其中，不同百分比的bsm發(fā)酵培養(yǎng)基是指在invitrogen公司的發(fā)酵說明書(pichiafermentationprocessguidelines)上確定的bsm(basalsaltsmedium)培養(yǎng)基中各成分標準濃度的基礎上對各成分濃度進行的優(yōu)化，100％的bsm發(fā)酵培養(yǎng)基即是指invitrogen公司的發(fā)酵說明書上確定的bsm培養(yǎng)基中各成分標準濃度，即指k2so418.2g/l，mgso414.9g/l，koh0.93g/l，caso44.13g/l，h3po426.7ml/l，甘油40g/l，40％的bsm發(fā)酵培養(yǎng)基即是指invitrogen公司的發(fā)酵說明書上確定的bsm培養(yǎng)基中各成分標準濃度基礎上各成分濃度都降為40％，即k2so43.64g/l，mgso45.96g/l，koh0.372g/l，caso41.652g/l，h3po410.68ml/l，甘油16g/l。

實施例3重組hklk1蛋白的純化

本專利主要采用兩步法對rhklk1進行純化，第一步采用疏水層析對rhklk1進行富集和分離糖基化修飾程度不同的rhklk1蛋白，第二步采用陰離子交換層析分離低糖基化的rhklk1和雜蛋白。具體步驟如下：

步驟1：發(fā)酵液的預處理

將上述實施例1得到的三個不同批次的發(fā)酵液離心獲得上清液，并通過臺式超濾系統(tǒng)濃縮至500ml，加入高濃度磷酸二氫鈉和硫酸銨，使其終濃度分別為20mm和1.5m，用naoh調ph＝7.5，0.22μm濾膜過濾即得處理后發(fā)酵液上清，可進行層析純化。

步驟2：疏水層析純化

將上述處理后的發(fā)酵液上清上phenylsepharose6ff(hs)層析填料，平衡緩沖液buffera為：20mmnah2po4，1.5m(nh4)2so4，ph＝7.5，洗脫緩沖液bufferb為：20mmnah2po4，ph＝7.5，按照洗脫緩沖液bufferb50％，70％，100％等度洗脫，高糖基化rhklk1主要集中在50％洗脫峰，低糖基化rhklk1主要集中在70％洗脫峰，圖5為重組hklk1疏水層析純化色譜圖，圖6為重組hklk1疏水層析后sds-page分析圖。從圖5、圖6的結果中均可以明顯看出低糖基化rhklk1的量要遠高于高糖基化rhklk1。

步驟3：陰離子交換層析

將疏水層析洗脫收集的rhklk1樣品稀釋電導≤8.0ms/cm，上qsepharoseff陰離子交換層析柱，平衡緩沖液bufferb為：20mmnah2po4，ph＝7.5，洗脫緩沖液bufferc為：20mmnah2po4，1.5mnacl，按照洗脫緩沖液bufferc17％，35％，100％等度洗脫，樣品峰主要集中在35％洗脫峰，過濾除菌即得到rhklk1原液。圖7為rhklk1離子交換純化色譜圖，說明該色譜峰蛋白均為低糖基化rhklk1，沒有其他蛋白色譜峰產生，圖8為rhklk1離子交換層析后sds-page分析圖，說明通過兩步純化，目的條帶均為低糖基化rhklk1，沒有高糖基化rhklk1產生。

實施例4rhklk1hplc純度分析

方案1：rhklk1聚集體分析

將實施例2得到的樣品，并將其余兩個批次也實施例2純化得到的樣品稀釋至1mg/ml，0.22μm濾膜過濾，即得到樣品。流動相bufferb為20mmnah2po4，ph＝7.5，流速1ml/min，進樣體積為10μl，sec柱分析聚體(beh200，sec1.7μm)，hplc儀器型號(waters，e2695)，圖9為sec檢測結果，其中圖9中a圖為第一批次、b圖為第二批次、c圖為第三批次，d圖為溶劑峰，說明發(fā)酵液經兩步純化的獲得的rhklk1成分單一，符合藥用級別質量標準。

方案2：rhklk1純度分析

將實施例2步驟3中純化得到的rhklk1樣品稀釋至1mg/ml，0.22μm濾膜過濾，即得到用于hplc分析樣品。流動相bufferd為20mmnah2po4，ph＝9.0，流速1ml/min，進樣體積為10μl，iec柱分析純度(proteinpakhiresq柱)，儀器型號(waters，e2695)，圖10為純度檢測結果，圖10中a圖為第一批次、b圖為第二批次、c圖為第三批次、d圖為溶劑峰，說明發(fā)酵液經兩步純化的rhklk1純度均大于95％，符合藥用級別純度要求，該純化樣品可用于下述實施例中的比活評價。

實施例5rhklk1比活測定

反應緩沖液為(50mmtris-hcl，100mmnacl，ph8.0)，將標準品“怡開”原料液(購于千紅制藥，生產批號：no.3712030700)，稀釋5個濃度梯度10iu/ml，5iu/ml，2.5iu/ml，1.25iu/ml，0.625iu/ml，底物為s2266(d-val-leu-argp-nitroanilide，購自sigma-aldrich公司)，使用時用反應緩沖液稀釋至0.2mm，對照品尤瑞克林(購自廣州天普，生產批號：311506061)。樣品用反應緩沖液稀釋適當倍數(shù)，于96孔板中先每孔加稀釋好的底物80μl，然后立即加入稀釋好的標準品80μl及各樣品，synergyh1gen酶標儀(購自biotek公司)37℃，405nm處進行吸光度檢測，1min檢測一次，連續(xù)檢測15min。

根據實施例1中表1順序進行的多批次小規(guī)模高密度發(fā)酵實驗，將每批次得出的關鍵質量屬性rhklk1比活值依次填入到表2中的rhklk1比活一列，同時并以市售藥品或半成品尤瑞克林和怡開作對照，由表2可知，rhklk1畢赤酵母菌株在以優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基、誘導溫度和甲醇流加速度進行生產重組激肽原酶，其關鍵質量屬性hklk1比活和市售藥品或半成品尤瑞克林或怡開具有相同比活，完全可以替代類似的產品。

表2不同批次rhklk1小規(guī)模高密度發(fā)酵比活測定表

實施例6rhklk1小規(guī)模高密度發(fā)酵工藝驗證

rhklk1小規(guī)模高密度發(fā)酵工藝參數(shù)范圍內外驗證不同批次發(fā)酵培養(yǎng)基、誘導溫度以及甲醇流加速度詳見表3，其中驗證第一批次、第二批次中關鍵工藝參數(shù)同時滿足發(fā)酵培養(yǎng)基在40～80％、誘導溫度25～28℃以及甲醇流加速度5～11ml/h^-1l^-1范圍內，而對照一、對照二批次均不能同時滿足發(fā)酵培養(yǎng)基在40～80％、誘導溫度25～28℃以及甲醇流加速度5～11ml/h^-1l^-1范圍內，發(fā)酵過程詳見實施例1。誘導開始后，每隔一段時間取樣，測發(fā)酵液od600吸收值以及菌體濕重，以及對發(fā)酵樣品進行sds-page凝膠分析。圖11-a，圖11-b，圖11-c，圖11-d分別為rhklk1小規(guī)模工藝驗證第一批次、第二批次、對照一、對照二發(fā)酵液od600吸收值以及菌體濕重發(fā)酵期間變化趨勢圖，圖11-a和圖11-b發(fā)酵液od600均達到250以上，菌體濕重均達到400g/l，且兩組od600和菌體濕重完全保持一致，圖12-a，圖12-b的sds-page電泳結果表明發(fā)酵產物產量和糖基化修飾程度完全一致，說明關鍵工藝參數(shù)甲醇流加速度、發(fā)酵培養(yǎng)基以及誘導溫度工藝參數(shù)同時滿足設計區(qū)間的參數(shù)時，每批次之間是高度穩(wěn)定一致的，也說明rhklk1藥用蛋白的發(fā)酵工藝高度穩(wěn)健的；而圖11-c在發(fā)酵30h后，發(fā)酵液od600達到最高值350后就開始下降至150，菌體濕重也一直保持在200g/l，圖11-d在發(fā)酵30h后，發(fā)酵液od600達到最高值300就保持穩(wěn)定不變，菌體濕重一直保持在200g/l，圖12-c為對照一發(fā)酵產物sds-page電泳結果，圖12-d為對照二發(fā)酵產物sds-page電泳結果，結果表明這兩批次發(fā)酵產物產量很低，或者高糖基化重組hklk1占比例相對較高，充分說明這二者的工藝不適合重組hklk1進行高密度發(fā)酵的。

表3重組hklk1小規(guī)模高密度發(fā)酵工藝參數(shù)范圍內外驗證表

最終將這四批次發(fā)酵液分別通過兩步純化，獲得低糖基化rhklk1純品，并通過s2266底物測定，由表3可知，該兩批次工藝驗證獲得的rhklk1比活均在1000iu/mg以上，而對照一和對照二均低于300iu/mg以下。

實施例7rhklk1放大規(guī)模發(fā)酵工藝驗證

步驟1：重組菌株活化

取凍存于-80℃的工作種子庫中甘油菌種子于ypd固體培養(yǎng)基(酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l，瓊脂糖15g/l)劃線，30℃恒溫恒濕箱培養(yǎng)3-5天。

步驟2：一級種子液培養(yǎng)

挑取步驟1中平板上單克隆菌落于ypd液體培養(yǎng)基(酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l)，30℃，220rpm培養(yǎng)至od600≈6.0，并在顯微鏡下觀察無雜菌，即得到發(fā)酵用一級種子液。

步驟3：二級種子液培養(yǎng)

將步驟2中獲得的一級種子液接種至賽多利斯b-plus發(fā)酵罐中，并以50％bsm，ph＝6.0±0.2，30℃，300rpm值培養(yǎng)，通過通氣和轉速條件是溶氧保持在25％，最終至od600≈40，濕重達到約80g/l，并在顯微鏡下觀察無雜菌，即得到發(fā)酵用二級種子液。

步驟4：發(fā)酵過程

洗凈賽多利斯cplus生物反應器，用ph＝7.0和ph＝4.0的標準液分別校正發(fā)酵罐的ph計探頭，然后按照實施例6中關鍵工藝參數(shù)的設計區(qū)間，確定發(fā)酵培養(yǎng)基為50％bsm進行配置發(fā)酵培養(yǎng)基20l，并倒入發(fā)酵罐中，121℃在線滅菌20min，待溫度降到50℃后，用濃氨水調ph＝6.0±0.2。

將方案3中得到的種子液按照1:15(v/v，種子液/發(fā)酵培養(yǎng)基)比例接入發(fā)酵罐中。初期重組畢赤酵母菌體增殖階段發(fā)酵溫度為30℃，ph＝6.0±0.2，轉速＝300rpm培養(yǎng)，do值100％，添加ptm1(2ml/l)。此階段大約20h，當碳源消耗完畢后，溶氧值迅速上升，菌體濕重達到100g/l，此時進入限速生長階段，此階段的開始的2h以30ml/h^-1l^-1的速率補加50％甘油，2h后補料速度上調為60ml/h^-1l^-。補加4h，菌體濕重約200g/l，停止補料，do上升，表明碳源耗盡，進入誘導階段。調節(jié)ph＝6.0±0.2，以甲醇流加速度為10ml/h^-1l^-1進行誘導表達rhklk1；維持do不高于50％，誘導溫度為27℃，ph＝6.0±0.2，進行發(fā)酵表達，發(fā)酵開始后每隔一段時間取樣一次，測發(fā)酵液od600吸收值以及菌體濕重，圖13為rhklk1放大規(guī)模發(fā)酵液od600吸收值以及菌體濕重發(fā)酵期間變化趨勢圖，由圖可知，在重組畢赤酵母發(fā)酵期間，發(fā)酵液od600均能達到300以上，且菌體濕重均能達到400g/l。誘導40h發(fā)酵結束后，離心收集上清，sds-page電泳鑒定甲醇誘導不同時間的rhklk1產量和糖基化修飾程度(圖14)，說明發(fā)酵液od600吸收值、菌體濕重變化趨勢以及發(fā)酵產物均與3l小規(guī)模高密度發(fā)酵保持一致。最終將低糖基化rhklk1純品通過s2266底物測定，該放大發(fā)酵得到的rhklk1激肽原酶的比活保持在1000iu/mg以上，產品質量也符合藥用級別標準。申請人因此確定，本發(fā)明的發(fā)酵工藝，完全能夠進行產業(yè)化放大生產。

以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出的是，上述優(yōu)選實施方式不應視為對本發(fā)明的限制，本發(fā)明的保護范圍應當以權利要求所限定的范圍為準。對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。