本申請是申請?zhí)枮?01180037906.5的分案申請。相關(guān)申請的交叉參考本申請要求2010年6月21日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?1/357,031在35u.s.c.119(e)下的優(yōu)先權(quán)的利益，將所述臨時(shí)申請通過引用整體并入本文。背景本公開內(nèi)容涉及用于核酸的合成和/或檢測的組合物、試劑盒及方法。對于許多醫(yī)學(xué)、診斷和法醫(yī)應(yīng)用，特定dna序列的擴(kuò)增是使其能夠在其以極低量存在于其中的樣品中被檢測或使其能夠從所述樣品分離所必需的。最近，特定基因的體外擴(kuò)增已提供了強(qiáng)大的成本較低的方法以促進(jìn)利用子生物學(xué)技術(shù)的治療性蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，并且同樣可用于基因療法。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)技術(shù)公開于美國專利號4,683,202；4,683,195；4,800,159和4,965,188中。pcr法也描述于saiki等人,1985,science230:1350中。以其最簡單形式，pcr是用于使用兩個(gè)寡核苷酸引物酶促合成特定dna序列的體外方法，所述兩個(gè)引物與相反鏈雜交并且側(cè)翼連接靶dna的目標(biāo)區(qū)域。重復(fù)系列的反應(yīng)步驟(包括模板變性、引物退火和通過dna聚合酶進(jìn)行的退火引物的延伸)導(dǎo)致其末端由引物的5'末端界定的特定片段的指數(shù)積累。pcr能夠選擇性富集特定dna序列至109倍。商購可得的pcr預(yù)混合物(mastermix)提高了效率并且減小了與高通量分析所需的大量pcr反應(yīng)的裝配相關(guān)的錯(cuò)誤。此類預(yù)混合物包含對于所有pcr反應(yīng)是共同的試劑的組合。例如，預(yù)混合物可包含緩沖劑、鹽例如mgcl2、脫氧核苷三磷酸(dntp)和熱穩(wěn)定性dna聚合酶。每一個(gè)孔可包含共同的預(yù)混合物以及特定靶核酸和引物對。通常，以濃縮液或凍干粉(當(dāng)裝配終反應(yīng)時(shí)，所述濃縮液或凍干粉隨后被稀釋或溶解)的形式制備和分配預(yù)混合物。為了進(jìn)行準(zhǔn)確分析，pcr預(yù)混合物應(yīng)當(dāng)提供可靠的、堅(jiān)實(shí)的和可重現(xiàn)的pcr結(jié)果。此外，pcr預(yù)混合物應(yīng)當(dāng)允許檢測低拷貝靶核酸。pcr預(yù)混合物還應(yīng)當(dāng)允許進(jìn)行快速pcr反應(yīng)循環(huán)以允許快速篩選核酸(例如，dna和cdna)。此外，pcr預(yù)混合物還應(yīng)當(dāng)能夠在環(huán)境溫度或室溫下在實(shí)驗(yàn)臺上是穩(wěn)定的，以便pcr反應(yīng)不必在裝配后立即擴(kuò)增。核酸樣品的來源包括但不限于例如衣服、土壤、紙、金屬表面、空氣、水、植物部分以及人和/或動(dòng)物皮膚、頭發(fā)、血液、血清、糞便、奶、唾液、尿和/或其它分泌液體。此類來源還可包含抑制pcr擴(kuò)增的化合物。因此，需要鑒定阻斷或減弱在核酸樣品的來源中發(fā)現(xiàn)的組分對pcr擴(kuò)增的抑制的試劑。概述本文中公開了用于通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)合成和/或檢測核酸的組合物、試劑盒和方法，所述組合物、試劑盒和方法包括dna聚合酶和pcr抑制劑阻斷劑。pcr抑制劑阻斷劑減緩由多種通常在包含通過pcr分析的核酸的樣品中發(fā)現(xiàn)的化合物引起的pcr的抑制。本文中公開的組合物、試劑盒和方法確保在大范圍靶核酸濃度上的靈敏可靠的pcr結(jié)果。組合物還允許在快速pcr熱循環(huán)中獲得快速結(jié)果。組合物還提供了可在室溫下穩(wěn)定長達(dá)72小時(shí)或更長時(shí)間的裝配的pcr反應(yīng)。本文中公開了包含熱穩(wěn)定性dna聚合酶和pcr抑制劑阻斷劑的組合物，其中pcr抑制劑阻斷劑以有效地增強(qiáng)裝配的pcr對pcr抑制劑的耐受性的量存在。本文中還提供了包括含有熱穩(wěn)定性dna聚合酶和pcr抑制劑阻斷劑的組合物的試劑盒，其中pcr抑制劑阻斷劑以有效地增強(qiáng)裝配的pcr對pcr抑制劑的耐受性的量存在。本文中還公開了包括含有熱穩(wěn)定性dna聚合酶和pcr抑制劑阻斷劑、引物和標(biāo)記的探針的組合物的試劑盒，其中pcr抑制劑阻斷劑以有效地增強(qiáng)裝配的pcr對pcr抑制劑的耐受性的量存在。本文中還公開了用于核酸合成的方法，包括將含有熱穩(wěn)定性dna聚合酶和pcr抑制劑阻斷劑探針的組合物與核酸樣品和引物混合，和使用核酸樣品作為模板合成核酸，其中pcr抑制劑阻斷劑以有效地增強(qiáng)裝配的pcr對pcr抑制劑的耐受性的量存在；和使用核酸樣品作為模板合成核酸。在一些實(shí)施方案中，合成可在將組合物與核酸樣品和引物混合長達(dá)72小時(shí)后發(fā)生。本文還公開了用于裝配聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)的方法，包括向反應(yīng)容器中添加含有熱穩(wěn)定性dna聚合酶和pcr抑制劑阻斷劑的組合物，其中pcr抑制劑阻斷劑以有效地增強(qiáng)裝配的pcr對pcr抑制劑的耐受性的量存在；和向反應(yīng)容器中添加核酸樣品和引物。本文還公開了用于通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)擴(kuò)增核酸的方法，包括向反應(yīng)容器中添加含有熱穩(wěn)定性dna聚合酶和pcr抑制劑阻斷劑的組合物，其中pcr抑制劑阻斷劑以有效地增強(qiáng)裝配的pcr對pcr抑制劑的耐受性的量存在；向反應(yīng)容器中添加核酸樣品和引物；和對核酸樣品進(jìn)行pcr。本文還公開了用于通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)檢測核酸的方法，包括將含有熱穩(wěn)定性dna聚合酶和pcr抑制劑阻斷劑的組合物添加至反應(yīng)容器中，其中pcr抑制劑阻斷劑以有效地增強(qiáng)裝配的pcr對pcr抑制劑的耐受性的量存在；向反應(yīng)容器中添加核酸樣品和引物；對核酸樣品進(jìn)行pcr；和檢測擴(kuò)增的靶。本文還公開了用于阻斷pcr抑制劑對聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)的抑制的方法，包括向反應(yīng)容器中添加含有熱穩(wěn)定性dna聚合酶和pcr抑制劑阻斷劑的組合物，其中pcr抑制劑阻斷劑以有效地增強(qiáng)裝配的pcr對pcr抑制劑的耐受性的量存在，其中組合物阻斷pcr抑制劑對pcr的抑制；向反應(yīng)容器中添加核酸樣品和引物；和對核酸樣品進(jìn)行pcr。本文還公開了用于減少pcr抑制劑對聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)的運(yùn)行時(shí)間的方法，包括向反應(yīng)容器中添加含有熱穩(wěn)定性dna聚合酶和pcr抑制劑阻斷劑的組合物，其中pcr抑制劑阻斷劑以有效地增強(qiáng)裝配的pcr對pcr抑制劑的耐受性的量存在，其中組合物減少pcr的運(yùn)行時(shí)間；向反應(yīng)容器中添加核酸樣品和引物；和對核酸樣品進(jìn)行pcr。上述和其它特征通過下列附圖和詳細(xì)描述來舉例說明。附圖描述圖1顯示了比較使用2x濃度的本文中公開的組合物的實(shí)施方案和商業(yè)組合物通用pcr預(yù)混合物進(jìn)行的一組13個(gè)基因表達(dá)測定的循環(huán)閾值(ct)的曲線。圖2顯示來自在appliedbiosystems7500快速實(shí)時(shí)pcr系統(tǒng)上于fn1基因表達(dá)測定中使用2x濃度的本文中公開的組合物的實(shí)施方案在4個(gè)重復(fù)反應(yīng)中擴(kuò)增的人cdna的系列稀釋物的實(shí)時(shí)pcr的代表性擴(kuò)增曲線。圖3顯示作為在終反應(yīng)物的裝配后(a)和在30℃將裝配的終反應(yīng)物溫育72小時(shí)后(b)，使用2x濃度的本文中公開的組合物的實(shí)施方案在b2m基因表達(dá)測定的4個(gè)重復(fù)反應(yīng)中擴(kuò)增的人cdna的系列稀釋物的pcr循環(huán)的函數(shù)的δrn的曲線。圖4，圖框a顯示了cdna的終濃度(ng/μl)的函數(shù)的ct的曲線，該曲線將使用2x濃度的公開的組合物的實(shí)施方案進(jìn)行的系列稀釋物的單靶(β-肌動(dòng)蛋白基因(actb)或外源內(nèi)部陽性對照(ipc)靶)pcr反應(yīng)基因表達(dá)測定與使用2x濃度的公開的組合物的實(shí)施方案進(jìn)行的系列稀釋物的雙重靶(actb和ipc)pcr反應(yīng)基因表達(dá)測定相比較。圖4，圖框b顯示了作為cdna的終濃度(ng/μl)的函數(shù)的ct的曲線，該曲線將使用2x濃度的公開的組合物的實(shí)施方案進(jìn)行的系列稀釋物的單靶(β-肌動(dòng)蛋白基因(actb)或內(nèi)源內(nèi)部陽性對照(ipc)靶)pcr反應(yīng)基因表達(dá)測定與使用要求保護(hù)的組合物的實(shí)施方案進(jìn)行的系列稀釋物的雙重靶(actb和ipc)pcr反應(yīng)基因表達(dá)測定相比較。圖5顯示了作為使用2x濃度的公開的組合物的實(shí)施方案在appliedbiosystems7900h快速實(shí)時(shí)pcr系統(tǒng)上進(jìn)行的let7-cmicrorna測定的4個(gè)重復(fù)反應(yīng)的系列稀釋物的實(shí)時(shí)pcr的終核酸濃度的函數(shù)的δrn對pcr循環(huán)的擴(kuò)增曲線(上圖框)和ct的標(biāo)準(zhǔn)曲線(下圖框)。圖6顯示了使用2x濃度的公開的組合物的實(shí)施方案在appliedbiosystems7300實(shí)時(shí)pcr系統(tǒng)上進(jìn)行的fn1基因表達(dá)測定的4個(gè)重復(fù)實(shí)時(shí)pcr反應(yīng)中擴(kuò)增的人cdna的系列稀釋物的δrn對pcr循環(huán)的曲線圖。圖7a顯示了柱形圖，該圖顯示對于8個(gè)存在10-50μm的血色素的單重(上圖框)或雙重(下圖框)基因表達(dá)測定測量的ct。圖7b顯示了柱形圖，該圖顯示了對于8個(gè)存在10-50μm的血色素的單重和雙重(上圖框)基因表達(dá)測定測量的dct和對于8個(gè)存在10-50μm的血色素的雙重vic對照基因表達(dá)測定測量的ct。圖8顯示了柱形圖，該圖顯示在添加劑bsa和魚膠存在或不存在的情況下，在不存在腐殖酸或存在15ng/20μl反應(yīng)物的腐殖酸的情況下對于2個(gè)基因表達(dá)測定測量的平均ct。圖9顯示了柱形圖，該圖顯示在添加劑bsa和魚膠存在或不存在的情況下，在肝素不存在和存在0.01u/μl的肝素的情況下對于3個(gè)基因表達(dá)測定測量的平均ct。圖10顯示了單重和雙重?cái)U(kuò)增反應(yīng)在快速熱循環(huán)條件下的結(jié)果。詳述本公開內(nèi)容總地說來涉及用于檢測和/或定量核酸的即可使用的試劑混合物、試劑盒和方法。已開發(fā)了具有預(yù)料之外的優(yōu)良性質(zhì)的改進(jìn)的組合物。本發(fā)明組合物提供了裝配的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)預(yù)混合物，當(dāng)所述預(yù)混合物在標(biāo)準(zhǔn)pcr儀上運(yùn)行時(shí)與利用標(biāo)準(zhǔn)試劑混合物裝配的pcr相比較顯示優(yōu)良的靈敏性、準(zhǔn)確性、動(dòng)態(tài)范圍和特異性。在一些實(shí)施方案中，利用本文中公開的組合物裝配的pcr的優(yōu)良靈敏性允許減少在fast或標(biāo)準(zhǔn)pcr儀上的pcr運(yùn)行時(shí)間。此外，在一些實(shí)施方案中，本文中公開的組合物提供了在室溫(例如，23-30℃)下具有長達(dá)72小時(shí)的極長的穩(wěn)定性的裝配的pcr，該特征有益于高通量液體處理系統(tǒng)的用戶獲得的結(jié)果的準(zhǔn)確性。在一些實(shí)施方案中，本文中公開的組合物對于許多檢測核酸的測定是有用的。例如，組合物可用于用于檢測基因表達(dá)、microrna(mirna)表達(dá)或基因分型的基于pcr的測定。還公開了包括組合物的試劑盒，同樣地包括了使用所述組合物和試劑盒的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含熱穩(wěn)定性dna聚合酶和pcr抑制劑阻斷劑,其中pcr抑制劑阻斷劑以有效地增強(qiáng)裝配的pcr對pcr抑制劑的耐受性的量存在。在實(shí)施方案中，pcr抑制劑阻斷劑為蛋白質(zhì)。適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)包括白蛋白和明膠。在一些實(shí)施方案中，pcr抑制劑阻斷劑選自血清白蛋白、魚膠或上述物質(zhì)的組合，其中組分以有效地增強(qiáng)裝配的pcr對pcr抑制劑的耐受性的量存在。血清白蛋白可來自任何動(dòng)物，例如牛血清白蛋白(bsa)、人血清白蛋白(hsa)。在實(shí)施方案中，組合物以這樣的濃度包含白蛋白，以便其在裝配的pcr(例如，工作溶液)中的濃度為約0.05mg/ml至約0.8mg/ml、約0.1mg/ml至約0.6mg/ml，更特別地約0.2mg/ml至約0.4mg/ml，以這樣的濃度包含明膠以便其在裝配的pcr中的濃度為約0.05％(w/v)至約0.8％(w/v)，更特別地約0.2％(w/v)至約0.4％(w/v)或上述濃度的組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，pcr抑制劑阻斷劑可以是濃度約0.3mg/ml的白蛋白和濃度約0.3％(w/v)的明膠。在一個(gè)實(shí)施方案中，白蛋白為bsa，明膠為魚膠。在一些實(shí)施方案中，本文中使用的熱穩(wěn)定性dna聚合酶當(dāng)經(jīng)歷升高的溫度，進(jìn)行實(shí)現(xiàn)單鏈核酸的去穩(wěn)定作用或在pcr擴(kuò)增過程中實(shí)現(xiàn)雙鏈核酸的變性所必需的時(shí)間時(shí)，不被不可逆地滅活。酶的不可逆變性是指大體上失去了酶活性。優(yōu)選地?zé)岱€(wěn)定性dna聚合酶在例如進(jìn)行pcr擴(kuò)增通常所需要的條件下在約90°-100℃下將不會發(fā)生不可逆變性。在一些實(shí)施方案中，組合物還可包含另外的組分例如甘油、牛明膠、nan3、緩沖劑、鹽、dntp、表面活性劑和/或一般地任何陽離子、陰離子、兩性離子和/或非離子型去垢劑、用于熱啟動(dòng)pcr的試劑、使定量實(shí)時(shí)dna檢測測定的樣品間和/或孔間變化最小的被動(dòng)參考對照和/或尿嘧啶-dna糖基化酶。組合物還可包含擁擠試劑(crowdingagent)例如ficoll70、糖原和聚乙二醇(peg)。在一些實(shí)施方案中，甘油可以以這樣的濃度存在于組合物中，以便其在裝配的pcr中的濃度為約6至約11％(w/v)，特別地約8.5％(w/v)。牛明膠可以以這樣的濃度存在于組合物中，以便其在裝配的pcr中的濃度為約0.3至約0.7％(w/v)，特別地約0.5％(w/v)。nan3可以以這樣的濃度存在于組合物中，以便其在裝配的pcr中的濃度為約0.007至約0.013％(w/v)，特別地約0.01％(w/v)。組合物可包含緩沖劑和/或鹽溶液來提供適當(dāng)?shù)膒h和離子條件以維持dna聚合酶的穩(wěn)定性。術(shù)語"穩(wěn)定"和"穩(wěn)定性"，如本文中所用，通常意指在將酶或包含酶的組合物在約室溫(例如，約20℃至約25℃)的溫度下貯存約3天后，在約4℃的溫度下貯存約1周后，在約-20℃的溫度下貯存約2至6個(gè)月后，以及在約-80℃的溫度下貯存約6個(gè)月或更長時(shí)間后，使組合物例如酶組合物保留至少70％，優(yōu)選至少80％，最優(yōu)選至少90％的原始酶活性(以單位表示)。此類緩沖劑的實(shí)例可包括例如tris、tricine、bis-tricine、hepes、mops、tes、taps、pipes和caps。此類鹽溶液的實(shí)例可包括例如氯化鉀、醋酸鉀、硫酸鉀、硫酸銨、氯化銨、醋酸銨、氯化鎂、醋酸鎂、硫酸鎂、氯化錳、醋酸錳、硫酸錳、氯化鈉、醋酸鈉、氯化鋰和醋酸鋰。應(yīng)理解，許多緩沖劑和鹽溶液在本領(lǐng)域是已知的，包括例如未在本文中明確公開的那些。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以以濃縮原液的形式提供通組合物。如本文中所用，術(shù)語"濃縮原液"意指在需要進(jìn)一步稀釋以達(dá)到用于進(jìn)行特定功能(例如核酸的擴(kuò)增)的溶液的最佳濃度的濃度。如本文中所用，“工作溶液”可用于指具有進(jìn)行特定功能的最佳濃度的溶液。例如，組合物可以是約2x、約3x、約4x、約5x、約6x、約10x等的原液。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，組合物可需要高于2x、高于3x、高于4x、高于5x、高于6x、高于10x等的稀釋度以成為用于核酸合成法的工作濃度或最佳濃度?？稍诮M合物中提供dntp。組合物中包含的每一種dntp的濃度應(yīng)當(dāng)為這樣的濃度以便在裝配的pcr中獲得約0.15mm至約0.65mm的dntp的濃度。包含的dntp可以是datp、dctp、dgtp、dttp或dutp。各個(gè)dntp的濃度不必相同。在實(shí)施方案中，datp、dctp、dgtp以這樣的濃度存在于組合物中以便每一種dntp在裝配的pcr中的濃度為約0.15至約0.35mm，特別地約0.25mm，并且dutp以這樣的濃度存在于組合物中，以便其在裝配的pcr中的濃度為約0.35至約0.65mm，特別地為0.5mm。非離子型去垢劑可以為例如tritonnonidetp-40(np-40)、tween20或brij35。非離子型去垢劑可以以這樣的濃度存在于組合物中以便其在裝配的pcr中的濃度為約0.007至約0.013％(w/v)，特別地約0.01％(w/v)。在一些實(shí)施方案中，tween-20以這樣的濃度存在于組合物中以便其在裝配的pcr中的濃度為約0.007％(w/v)。用于熱啟動(dòng)pcr的試劑可以是抗體、適體、發(fā)夾型引物或隔離石蠟珠。用于熱啟動(dòng)pcr的石蠟珠是商購可得的，例如pcrgem100和pcrgem50(appliedbiosystems)。適當(dāng)?shù)倪m體的選擇可通過本領(lǐng)域已知的方法來進(jìn)行或可使用商購可得的適體。類似地，適當(dāng)?shù)陌l(fā)夾型引物的選擇可通過本領(lǐng)域已知的方法來進(jìn)行或可使用商購得的引物?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生或選擇用于熱啟動(dòng)pcr的抗體。或者，可使用商購可得的抗體，例如對于任何taq-衍生的dna聚合酶是有效的taqstart抗體(clontech)，包括天然、重組和n末端缺失突變體?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法，或?qū)τ谏虡I(yè)產(chǎn)品按照制造商所推薦的方法確定裝配的pcr中用于熱啟動(dòng)pcr的試劑的適當(dāng)濃度。以允許其用作可檢測對照的濃度包含使定量實(shí)時(shí)核酸檢測測定的樣品間和/或孔間變化減小至最小的被動(dòng)參考對照。在實(shí)施方案中，將參照發(fā)色團(tuán)，特別地?zé)晒饣鶊F(tuán)用作被動(dòng)參考對照。在實(shí)施方案中，參照發(fā)色團(tuán)為染料rox(invitrogen)?？梢砸赃@樣的濃度將rox包含在組合物中，以便其在終裝配的pcr中的濃度為約40至約80nm，特別地約60nm。可將尿嘧啶dna糖基化酶(ung)包含在組合物中。該酶可從許多商業(yè)來源例如invitrogen、enzymatics、newenglandbiolabs、genscript或usb商購獲得?？蓪ng以這樣的量包含在組合物中，以便其在終裝配的pcr中的濃度為約0.005至約0.015u/μl，特別地約0.01u/μl。在實(shí)施方案中，組合物包含熱穩(wěn)定性dna聚合酶、pcr抑制劑阻斷劑的組合、緩沖鹽溶液、熱啟動(dòng)組分、dntp、甘油、非離子型去垢劑和被動(dòng)參照染料?？商鎿Q或修飾組分。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)在約-20℃貯存至少5.5個(gè)月時(shí)，公開的組合物是穩(wěn)定的。可將組合物包裝在能夠保持組合物并且不會與組合物的組分明顯相互作用的適當(dāng)?shù)娜萜髦?。容器可以是被設(shè)計(jì)來允許由個(gè)人或由液體操作儀容易地分配劑型的容器。還可將組合物容器包裝至多包(multi-pack)單元中。本文中還公開了包括組合物的試劑盒。試劑盒可進(jìn)一步包含用于一個(gè)或多個(gè)測定中以合成、檢測或定量核酸的試劑。在實(shí)施方案中，除所述組合物外，試劑盒還可包括特異于dna靶的pcr擴(kuò)增的引物對以及特異于dna靶的探針。例如，探針可以是探針、hydroleasytm探針、小溝結(jié)合(mgb)探針、鎖核酸(lna)探針或循環(huán)探針技術(shù)(cpt)探針。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒還可包括對照核酸樣品，以及特異于對照核酸樣品上的dna靶的pcr擴(kuò)增的引物對。還可在試劑盒中包括用于檢測擴(kuò)增的探針。視情況而定，可在各個(gè)容器中或單個(gè)容器中提供除組合物外的試劑盒的組分。可有利地提供使用試劑盒的說明書和方案?？蓪⒐_的組合物和試劑盒用于多種檢測或定量核酸的基于pcr的測定。例如，可將組合物用于基因表達(dá)測定(例如，基因表達(dá)測定)、mirna測定(例如，microrna測定)、基因分型測定(例如，藥物代謝基因分型測定或snp基因分型測定)或rna定量測定(例如，兩步逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測定)和低密度陣列測定。本文中還公開了使用試劑濃度和試劑盒的方法。在實(shí)施方案中，用于裝配聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)的方法包括將包含熱穩(wěn)定性dna聚合酶和pcr抑制劑阻斷劑的組合物添加至反應(yīng)容器，其中pcr抑制劑阻斷劑以有效地增強(qiáng)裝配的pcr對pcr抑制劑的耐受性的量存在；和將核酸樣品和引物添加至反應(yīng)容器中。反應(yīng)容器的實(shí)例包括微量離心管、孔板(wellplate)中的孔、毛細(xì)管或微流控芯片。在實(shí)施方案中，用于利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)擴(kuò)增核酸的方法包括將包含熱穩(wěn)定性dna聚合酶和pcr抑制劑阻斷劑的組合物添加至反應(yīng)容器，其中pcr抑制劑阻斷劑以有效地增強(qiáng)裝配的pcr對pcr抑制劑的耐受性的量存在；將核酸樣品和引物添加至反應(yīng)容器中；和對核酸樣品進(jìn)行pcr，其中在將組合物、核酸樣品和引物添加至反應(yīng)容器后長達(dá)72小時(shí)才進(jìn)行pcr。在一些實(shí)施方案中，用于擴(kuò)增靶核酸的方法可以是其中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)靶的多重pcr擴(kuò)增。擴(kuò)增的靶的數(shù)目可達(dá)到10個(gè)靶，特別地達(dá)到6個(gè)靶，更特別地達(dá)到3個(gè)靶，更特別地2個(gè)靶。在實(shí)施方案中，多重化的靶之一是用于擴(kuò)增的內(nèi)源或外源內(nèi)部陽性對照。一般而言，pcr熱循環(huán)包括在高溫下的初始變性步驟，隨后是被設(shè)計(jì)來允許模板變性、引物退火和通過聚合酶進(jìn)行的退火引物的延伸的重復(fù)的系列的溫度循環(huán)。通常，開始時(shí)將樣品在約95℃的溫度下加熱約2至10分鐘以使雙鏈dna樣品變性。隨后，在每一個(gè)循環(huán)開始時(shí)，取決于樣品和使用的儀器類型，將樣品變性約10至60秒。變性后，使引物在更低的溫度(從約40℃至約60℃)下與靶dna退火，進(jìn)行約20至60秒。通常在約60℃至約72℃范圍內(nèi)的溫度下進(jìn)行聚合酶對引物的延伸。用于延伸的時(shí)間量將取決于擴(kuò)增子的大小和用于擴(kuò)增的酶的類型，并且可通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)容易地確定。此外，可將退火步驟與延伸步驟組合，從而導(dǎo)致兩步驟循環(huán)。熱循環(huán)在pcr測定中還可包括另外的溫度變動(dòng)。用于測定的循環(huán)次數(shù)取決于許多因素，包括使用的引物、存在的樣品dna的量及熱循環(huán)條件。用于任何測定的循環(huán)次數(shù)可由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)容易地確定。任選地，可在完成熱循環(huán)后加上終延伸步驟以確保所有擴(kuò)增產(chǎn)物的合成。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用本文中公開的組合物進(jìn)行pcr擴(kuò)增的示例性熱循環(huán)條件如下:ung步驟(任選的):50℃,2分鐘活化:95℃,20秒(變性:95-97℃/1-3秒)(延伸:60-62℃/20-30秒)x40個(gè)循環(huán)在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)本文中公開的組合物用于低密度陣列(tlda)平臺時(shí)，推薦在92℃下活化10分鐘?？稍凇皹?biāo)準(zhǔn)”pcr儀例如appliedbiosystems7900ht、7500和7300標(biāo)準(zhǔn)pcr系統(tǒng)上，或“快速”pcr儀例如appliedbiosystemsstepone、steponeplus、7500和7900ht快速實(shí)時(shí)pcr系統(tǒng)上進(jìn)行利用公開的組合物的pcr。核苷酸。如本文中所用，“核苷酸”是指堿基-糖-磷酸組合。“核苷”是指堿基-糖組合。核苷酸是核酸序列(例如dna和rna)的單體單位。術(shù)語核苷酸包括脫氧核糖核苷和核糖核苷的單、二和三磷酸形式及其衍生物。術(shù)語核苷酸具體地包括脫氧核糖核苷三磷酸例如datp,dctp,ditp,dutp,dgtp,dttp或其衍生物。此類衍生物包括例如[αs]datp,7-脫氮-dgtp和7-脫氮-datp。術(shù)語核苷酸，如本文中所用，還指二脫氧核糖核苷三磷酸(ddntp)及其衍生物。適用于本發(fā)明組合物的核苷酸的實(shí)例包括但不限于dutp,datp,dttp,dctp,dgtp,ditp,7-脫氮-dgtp,a-硫代-datp,a-硫代-dttp,a-硫代-dgtp,a-硫代-dctp或其衍生物，其全都可從來源包括lifetechnologies(carlsbad,ca)、newenglandbiolabs(beverly,mass.)和sigmachemicalcompany(saintlouis,mo.)商購獲得。此類dntp可不被標(biāo)記，或它們可通過利用本領(lǐng)域已知的方法將其與放射性同位素(例如,3h、14c、32p或35s)、維生素(例如，生物素)、熒光部分(例如,熒光素、羅丹明、德克薩期紅或藻紅蛋白)、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物地高辛(dig)等偶聯(lián)來進(jìn)行可檢測地標(biāo)記。標(biāo)記dntp也可例如從lifetechnologies(carlsbad,ca)或sigmachemicalcompany(saintlouis,mo)商購獲得。在本發(fā)明組合物的一些實(shí)施方案中，可添加dntp以在工作溶液中產(chǎn)生約0.001至約100毫摩爾、約0.01至約10毫摩爾、約0.1至約1毫摩爾或優(yōu)選約0.2至約0.6毫摩爾的每一種dntp的終濃度。多核苷酸和寡核苷酸。如本文中所用，“多核苷酸”和“寡核苷酸”是指合成或生物產(chǎn)生的分子，其包含可通過一個(gè)核苷酸的戊糖的3′位與相鄰核苷酸的戊糖的5′位之間的磷酸二酯鍵連接的核苷酸的共價(jià)連接的序列。此外，多核苷酸或寡核苷酸可包含修飾的或非天然存在的糖殘基(例如，阿拉伯糖)和/或修飾堿基殘基。多核苷酸或寡核苷酸還可包括阻止分子與特定蛋白質(zhì)、酶或底物的相互作用的封閉基團(tuán)。核酸。如本文中所用，“核酸”包括具有多個(gè)天然核苷酸和/或非天然(或“衍生的”)核苷酸單元的化合物?！昂怂帷边€可包括非核苷酸單元，例如肽?！昂怂帷币蚨ɑ衔锢鏳na、rna、肽核酸、含硫代磷酸酯的核酸、含膦酸酯的核酸等。關(guān)于核酸中的單元的數(shù)目不存在特別限制，只要核酸包含2個(gè)以上的核苷酸、核苷酸衍生物或其組合，特別地5、10、15、25、50、100個(gè)或更多個(gè)。核酸可包括單鏈和雙鏈形式，以及完全或部分雙鏈體嵌合體(例如，rna-dna、rna-pna或dna-pna)。引物。術(shù)語“引物”可指超過一個(gè)引物，以及可指寡核苷酸，無論是天然存在(如在純化的限制酶切降解物中)還是合成產(chǎn)生，所述寡核苷酸當(dāng)置于其中催化與核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的合成的條件下時(shí)能夠作為沿著互補(bǔ)鏈的合成的起始點(diǎn)。此類條件包括4種不同的脫氧核糖核苷三磷酸和聚合誘導(dǎo)劑例如dna聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶在適當(dāng)?shù)木彌_液(“緩沖液”包括作為輔因子或影響ph、離子強(qiáng)度等的取代物)中的存在和在適當(dāng)?shù)臏囟认?。引物?yōu)選為單鏈以在擴(kuò)增中具有最大效率。引物通常為11個(gè)堿基或更長，更特別地，引物為17個(gè)堿基或更長，雖然取決于需要可使用更短或更長的引物。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，寡核苷酸可用作各種延伸、合成或擴(kuò)增反應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)引物。如本文中所用，核酸序列的互補(bǔ)序列是指當(dāng)與核酸序列對齊以便一個(gè)序列的5'末端與另一個(gè)序列的3'末端配對時(shí)處于“反向平行締合”中的寡核苷酸或多核苷酸。通常不在天然核酸中發(fā)現(xiàn)的某些堿基可被包含在本發(fā)明的核酸中，包括例如肌苷和7-脫氮鳥嘌呤。互補(bǔ)性不必完美；穩(wěn)定的雙鏈體可包含錯(cuò)配堿基對或未匹配的堿基對。核酸
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員通過考慮許多變量包括例如寡核苷酸的長度、堿基組成和寡核苷酸的序列、離子強(qiáng)度以及錯(cuò)配堿基對的發(fā)生率來經(jīng)驗(yàn)地確定雙鏈體穩(wěn)定性。核酸雙鏈體的穩(wěn)定性通過解鏈溫度(“tm”)來測量。在指定的條件下特定核酸雙鏈體的tm為一半堿基對已分離時(shí)所處的溫度。如本文中所用,“核酸樣品”是指用于測試核酸的存在或不存在的樣品。可從任意來源獲得核酸樣品。核酸樣品的來源包括但不限于衣服、土壤、皮膚、頭發(fā)、血液、血清、糞便、奶、唾液、尿和/或其它分泌液體。當(dāng)提及熱穩(wěn)定性dna聚合酶時(shí)，一個(gè)活性單位為在標(biāo)準(zhǔn)引發(fā)的dna合成條件下在30分鐘內(nèi)將10納摩爾的dntp摻入酸不溶性物質(zhì)(即，dna或rna)的酶的量?！肮ぷ鳚舛取痹诒疚闹杏糜谥笧榛蚪咏芤褐惺褂玫倪M(jìn)行特定功能(例如核酸的擴(kuò)增、測序或降解)的最佳濃度的試劑的濃度。如本文中所用，術(shù)語“穩(wěn)定”和"穩(wěn)定性"，通常意指在將酶或包含酶的組合物在約20℃至約25℃的溫度下貯存至少4周，在約4℃的溫度下貯存1年或在約-20℃的溫度下貯存至少2年后，使酶仍然保留至少70％，優(yōu)選至少80％，最優(yōu)選至少90％的原始酶促活性(以單位表示)。如本文中所用，術(shù)語“靶”、“靶序列”或“靶核酸序列”是指待被擴(kuò)增、檢測或擴(kuò)增和檢測的核酸的區(qū)域。靶序列位于用于擴(kuò)增的兩個(gè)引物序列之間。組合物還可包括用于檢測靶核酸的探針。各種探針在本領(lǐng)域是已知的，例如(探針(參見，例如，美國專利號5,538,848)、各種莖-環(huán)分子信標(biāo)(參見，例如，美國專利號6,103,476和5,925,517以及tyagiandkramer,1996,naturebiotechnology14:303-308)、無莖或線性信標(biāo)(參見，例如，wo99/21881)、pna分子信標(biāo)tm(參見，例如，美國專利號6,355,421和6,593,091)、線性pna信標(biāo)(參見，例如，kubista等人,2001,spie4264:53-58)、非-fret探針(參見，例如，美國專利號6,150,097)、探針(美國專利號6,548,250)、莖-環(huán)雙鏈體scorpiontm探針(參見，例如，solinas等人,2001,nucleicacidsresearch29:e96和美國專利號6,589,743)、凸環(huán)探針(參見，例如，美國專利號6,590,091)、假結(jié)探針(參見，例如，美國專利號6,589,250)、cyclicons(參見，例如，美國專利號6,383,752)、mgbeclipsetm探針(epochbiosciences)、發(fā)夾型探針(參見，例如，美國專利號6,596,490)、在例如美國專利號6,485,901；mhlanga等人,2001,methods25:463-471；whitcombe等人,1999,naturebiotechnology.17:804-807；isacsson等人,2000,molecularcellprobes.14:321-328；svanvik等人,2000,analbiochem.281:26-35；wolffs等人,2001,biotechniques766:769-771；tsourkas等人,2002,nucleicacidsresearch.30:4208-4215；riccelli等人,2002,nucleicacidsresearch30:4088-4093；zhang等人,2002shanghai.34:329-332；maxwell等人,2002,j.am.chem.soc.124:9606-9612；broude等人,2002,trendsbiotechnol.20:249-56；huang等人,2002,chemres.toxicol.15:118-126；和yu等人,2001,j.am.chem.soc14:11155-11161中描述的肽核酸(pna)照亮(light-up)探針、自我裝配納米顆粒探針和二茂絡(luò)鐵修飾探針。探針可包含報(bào)道染料例如6-羧基熒光素(6-fam)或四氯熒光素(tet)等。檢測探針還可包含猝滅劑部分例如四甲基羅丹明(tamra)、blackhole猝滅劑(biosearch)、iowablack(idt)、qsy猝滅劑(molecularprobe)以及dabsyl和dabcel磺酸鹽/羧酸鹽猝滅劑(epoch)等。探針還可包含兩個(gè)探針，其中例如熒光基團(tuán)在一個(gè)探針上，猝滅劑在另一個(gè)探針上，其中兩個(gè)探針一起對靶的雜交猝滅信號，或其對靶的雜交通過熒光的改變來改變信號特征。在一些實(shí)施方案中，按照例如美國專利號6,727,356中描述的方法和原理來設(shè)計(jì)探針。一些探針可以是基于序列的，例如5'核酸酶探針，一些探針例如綠可以是非序列特異性dna結(jié)合染料。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，檢測探針為探針(appliedbiosystems,fostercity,ca)。應(yīng)理解，許多種可用于本發(fā)明的探針在本領(lǐng)域是已知的，包括本文中未明確公開的那些探針。在公開的組合物的一些實(shí)施方案中，工作溶液中的終探針濃度可以為約5nm至約750nm例如約10nm至約600nm、約25nm至約500nm、約50nm至約400nm、約75nm至約300nm或其間任意數(shù)字。在一些示例性實(shí)施方案中，探針濃度為約100nm至約250nm。本發(fā)明的反應(yīng)混合物可包含能夠促進(jìn)或增強(qiáng)擴(kuò)增、逆轉(zhuǎn)錄和/或兩種反應(yīng)的組合的添加劑(例如，用于促進(jìn)/增強(qiáng)pcr的試劑)。添加劑可以是有機(jī)或無機(jī)化合物。適當(dāng)?shù)奶砑觿┌ǘ嚯囊约胺嵌嚯奶砑觿?。此類添加劑可包括例如尿嘧啶dna糖基化酶(udg)、外源凝集素、大腸桿菌(e.coli)單鏈結(jié)合(ssb)蛋白、trna、rrna、7-脫氮-2'-脫氧鳥苷(dc7gtp)、含硫化合物、含乙酸酯化合物、二甲基亞砜(dmso)、甘油、甲酰胺、甜菜堿、氯化四甲胺(tmac)、聚乙二醇(peg)、各種表面活性劑和/或去垢劑，包括陰離子、陽離子、兩性離子或非離子型去垢劑(例如,tween20、np-40、tritonx-100)、四氫嘧啶(ectoine)、疊氮化鈉、凱松(kathon)和多元醇等等。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠鑒定按照本發(fā)明組合物、方法和試劑盒使用的其它添加劑。示例性核酸包括dna和rna。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸為分離和/或純化的核酸。分離或純化的核酸大體上不含其它組分例如蛋白質(zhì)、多糖或其它細(xì)胞、細(xì)菌或病毒組分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸未被分離或純化。例如，核酸可存在于復(fù)雜混合物例如粗制裂解物或完整細(xì)胞提取物中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸可原位存在和存在于其正常細(xì)胞、細(xì)菌或病毒環(huán)境內(nèi)。核酸可獲自天然來源，例如多種細(xì)胞、組織、器官或生物體(包括病毒)。核酸可獲自處于不同發(fā)育階段的細(xì)胞、組織、器官或生物體。核酸可獲自病毒、原核生物或真核生物。適當(dāng)?shù)牟《景ò捳畈《?、hiv、流感病毒、epstein-barrvirus、肝炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒和類病毒。適當(dāng)?shù)脑松锇òＯＪ暇鷮?escherichia)、芽孢桿菌屬(bacillus)、沙雷菌屬(serratia)、沙門菌屬(salmonella)、葡萄球菌屬(staphylococcus)、鏈球菌屬(streptococcus)、梭菌屬(clostridium)、衣原體屬(chlamydia)、奈瑟球菌屬(neisseria)、密螺旋體屬(treponema)、支原體屬(mycoplasma)、疏螺旋體屬(borrelia)、軍團(tuán)病桿菌屬(legionella)、假單胞菌屬(pseudomonas)、分枝桿菌屬(mycobacterium)、螺桿菌屬(helicobacter)、歐文氏菌屬(erwinia)、土壤桿菌屬(agrobacterium)、根瘤菌屬(rhizobium)和鏈霉菌屬(streptomyces)的種類。適當(dāng)?shù)恼婧松锇ㄕ婢?特別地酵母)、植物、原生動(dòng)物和其它寄生蟲，以及動(dòng)物，包括無脊椎動(dòng)物例如昆蟲(特別地果蠅)、線蟲(特別地秀麗隱桿線蟲)和脊椎動(dòng)物例如爬行動(dòng)物、兩棲動(dòng)物(特別地光滑爪蟾(xenopuslaevis))、禽類(特別地雞)、魚(特別地鮐(daniorerio))和哺乳動(dòng)物(特別地小鼠和人)。核酸還可獲自癌細(xì)胞和癌前細(xì)胞(獲自動(dòng)物包括人)。核酸還可獲自細(xì)胞培養(yǎng)系，包括轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培養(yǎng)系?？蓮亩喾N來源提取核酸樣品。此類來源包括但不限于例如衣服、土壤、紙、金屬表面、空氣、水、植物部分以及人和/或動(dòng)物皮膚、頭發(fā)、血液、血清、糞便、奶、唾液、尿和/或其它分泌液體。在擴(kuò)增或合成后，可分離擴(kuò)增的或合成的核酸以進(jìn)一步使用或表征。該步驟通常通過按照大小分離擴(kuò)增的或合成的核酸片段或利用任何物理或生物化學(xué)方法包括凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、層析(包括分篩、親和力和免疫層析)、密度梯度離心及免疫吸附來實(shí)現(xiàn)。示例性方法是利用凝膠電泳分離核酸片段，其提供了大量核酸片段的靈敏性分離的快速高度重現(xiàn)性方法，并且允許直接同時(shí)比較幾個(gè)核酸樣品中的片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如化學(xué)萃取、電洗脫或物理切割從用于鑒定(參見上文)的凝膠取出一個(gè)或多個(gè)擴(kuò)增的或合成的核酸片段。隨后可將分離的獨(dú)特的核酸片段插入適用于多種原核(細(xì)菌)或真核(酵母、植物或動(dòng)物包括人和其它哺乳動(dòng)物)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的標(biāo)準(zhǔn)載體，包括表達(dá)載體。或者，可進(jìn)一步表征由所述方法產(chǎn)生的核酸，例如通過測序(即，測定核酸片段的核苷酸序列)，通過下文中描述的方法和在本領(lǐng)域中是標(biāo)準(zhǔn)的其它方法(參見，例如，美國專利號4,962,022和5,498,523，其涉及dna測序的方法)。還可使用經(jīng)典測序法例如sanger鏈終止法(sanger,f.,等人proc.natl.acad.sci.usa74:5463-5467(1977))以及maxam和gilbert化學(xué)切斷法(maxam,a.m.andgilbert,w.proc.natl.acad.sci.usa74:560-564(1977))。在一些實(shí)施方案中，組合物可包含dna依賴性dna聚合酶、用于逆轉(zhuǎn)錄的酶(rna-依賴性dna聚合酶)和/或兩種類型的酶的組合。在一些實(shí)施方案中，dna依賴性dna聚合酶的組合和/或rna依賴性dna聚合酶的組合可存在于本文中公開的組合物中。用于擴(kuò)增和/或測序的適當(dāng)?shù)膁na聚合酶包括但不限于嗜熱棲熱菌(thermusthermophilus)(tth)dna聚合酶、菌嗜熱水生菌(thermusaquaticus)(taq)dna聚合酶、新阿波羅棲熱袍菌(thermotoganeopolitana)(tne)dna聚合酶、海棲熱袍菌(thermotogamaritima)(tma)dna聚合酶、嗜熱高溫球菌(thermococcuslitoralis)(tli或venttm)dna聚合酶、強(qiáng)烈火球菌(pyrococcusfuriosus)(pfu)dna聚合酶、deepventtmdna聚合酶、pyrococcuswoosii(pwo)dna聚合酶、pyrococcusspkod2(kod)dna聚合酶、嗜熟脂肪芽孢桿菌(bacillussterothermophilus)(bst)dna聚合酶、bacilluscaldophilus(bca)dna聚合酶、嗜熱硫化葉菌(sulfolobusacidocaldarius)(sac)dna聚合酶、嗜酸熱原體(thermoplasmaacidophilum)(tac)dna聚合酶、黃棲熱菌(thermusflavus)(tfl/tub)dna聚合酶、紅棲熱菌(thermusruber)(tru)dna聚合酶、布氏棲熱菌(thermusbrockianus)(dynazymetm)dna聚合酶、熱自參甲烷桿菌(methanobacteriumthermoautotrophicum)(mth)dna聚合酶、分枝桿菌屬(mycobacterium)dna聚合酶(mtb,mlep)、大腸桿菌(e.coli)polidna聚合酶、klenow片段、t5dna聚合酶、t7dna聚合酶和通常poli型dna聚合酶；其突變體、變體和衍生物以及上述聚合酶的組合。適當(dāng)?shù)暮怂峋酆厦缚梢允鞘葴匦曰蚴葻嵝缘?，?yōu)選為嗜熱性的并且具有熱穩(wěn)定性。如本文中所用，術(shù)語“熱穩(wěn)定性核酸聚合酶”是指當(dāng)與例如來自大腸桿菌的核苷酸聚合酶相比較時(shí)對熱相對穩(wěn)定并且催化核苷三磷酸的聚合的酶。通常，酶在與靶序列退火的引物的3'末端起始合成，并且將沿著模板以5'方向前進(jìn)，如果具有5'至3'核酸酶活性，水解間插的退火的探針以釋放標(biāo)記和未標(biāo)記探針片段，直至合成終止。從嗜熱水生菌(thermusaquaticus)(taq)分離的代表性熱穩(wěn)定性酶描述于美國專利號4,889,818，在常規(guī)pcr中使用其的方法描述于saiki等人,1988,science239:487中。適當(dāng)?shù)氖葴匦詃na聚合酶包括dna聚合酶的poli家族(以及其各自的klenow片段)，其任一種酶可從生物例如大腸桿菌、流感嗜血桿菌(h.influenzae)、耐輻射奇球菌(d.radiodurans)、幽門螺旋菌(h.pylori)、嗜熱光合綠曲菌(c.aurantiacus)、普氏立克次體(r.prowazekii、tpallidum)、集胞藻(synechocystissp.)、枯草芽孢桿菌(b.subtilis)、乳酸乳球菌(l.lactis)、肺炎鏈球菌(s.pneumoniae)、結(jié)核分枝桿菌(m.tuberculosis)、麻風(fēng)分枝桿菌(m.leprae)、恥垢分枝桿菌(m.smegmatis)、細(xì)菌噬菌體(bacteriophage)l5、phi-c31、t7、t3、t5、sp01、sp02、來自釀酒酵母(s.cerevisiae)mip-1的線粒體以及真核生物秀麗隱桿線蟲和黑腹果蠅分離而來(astatke,m.等人,1998,jmol.biol.278,147-165)、從任何來源分離的poliii型dna聚合酶及其突變體、衍生物或變體等?？捎糜诒景l(fā)明方法和組合物的優(yōu)選熱穩(wěn)定性dna聚合酶包括taq、tne、tma、pfu、kod、tfl、tth、stoffel片段、venttm和deepventtmdna聚合酶及其突變體、變體和衍生物(美國專利號5,436,149；4,889,818；4,965,188；5,079,352；5,614,365；5,374,553；5,270,179；5,047,342；5,512,462；wo92/06188；wo92/06200；wo96/10640；wo97/09451；barnes,w.m.,gene112:29-35(1992)；lawyer,f.c.,等人,pcrmeth.appl.2:275-287(1993)；flaman,j.-m.,等人,nucl.acidsres.22(15):3259-3260(1994))。示例性熱穩(wěn)定性聚合酶包括來自rochemoleculardiagnostics(pleasanton,ca)的amplitaq聚合酶。在某些實(shí)施方案中，核酸聚合酶具有5’→3’外切核酸酶活性。如本文中所定義，“5'→3'核酸酶活性”或“5'至3'核酸酶活性”是指模板特異性核酸聚合酶的活性，包括常規(guī)地與一些dna聚合酶(通過所述聚合酶以順序方式從寡核苷酸的5'除去核苷酸)相關(guān)的5'→3'外切核酸酶活性(即，大腸桿菌dna聚合酶i具有該活性而klenow片段不具有該活性)，或其中切割發(fā)生在離5'末端超過1個(gè)磷酸二酯鍵(核苷酸)上的5'→3'內(nèi)切核酸酶活性，或兩者。taqdna聚合酶具有dna合成依賴性鏈置換5'-3'外切核酸酶活性(參見gelfand,“taqdnapolymerase”inpcrtechnology:principlesandapplicationsfordnaamplification,erlich,ed.,stocktonpress,n.y.(1989),第2章)。在溶液中，存在極少(如果有的話)的標(biāo)記的寡核苷酸的降解。具有dna聚合酶活性的酶可以例如從rochemoleculardiagnostics(pleasanton,ca)、lifetechnologiescorp.(carlsbad,ca)、perkin-elmer(branchburg,nj)、newenglandbiolabs(beverly,ma)或boehringermannheimbiochemicals(indianapolis,in)商購獲得?；蛘?，可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的分離和純化天然蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)方法(參見，例如，houts,g.e.,等人,j.virol.29:517(1979))從其天然來源分離聚合酶。此外，此類聚合酶可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的重組dna技術(shù)(參見，例如，kotewicz,m.l.,等人,nucl.acidsres.16:265(1988)；美國專利號5,244,797；wo98/47912；soltis,d.a和skalka,a.m.,proc.natl.acad.sci.usa85:3372-3376(1988))來進(jìn)行制備。允許進(jìn)行rt-pcr的實(shí)施方案還包括具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的酶。具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的適當(dāng)?shù)拿缚梢允抢缒孓D(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶，例如莫洛尼鼠白血病病毒(m-mlv)逆轉(zhuǎn)錄酶、勞斯肉瘤病毒(rsv)逆轉(zhuǎn)錄酶、人免疫缺陷病毒(hiv)逆轉(zhuǎn)錄酶、amv逆轉(zhuǎn)錄酶、rav逆轉(zhuǎn)錄酶、mav逆轉(zhuǎn)錄酶、aslv逆轉(zhuǎn)錄酶以及慢病毒逆轉(zhuǎn)錄酶，或其具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的相應(yīng)的突變體、變體或衍生物。如本文中所用，“突變體、變體或衍生物”是指可存在或產(chǎn)生的化學(xué)種類的所有變換，其仍然保留該化學(xué)種類的確定的化學(xué)活性。用于本發(fā)明的一些優(yōu)選酶為rna酶h+酶的酶，例如rna酶h+m-mlv或rna酶h+amv逆轉(zhuǎn)錄酶?；蛘?，本發(fā)明組合物中使用的逆轉(zhuǎn)錄酶可具有減小的，顯著減小的或消除的rna酶h活性(參見，例如，美國專利號7,078,208，將其公開內(nèi)容通過引用整體并入本文)。rna酶h為特異于rna-dna嵌合體的rna鏈的前進(jìn)性5’和3’核糖核酸酶(perbal,apracticalguidetomolecularcloning,newyork:wiley&sons(1984))。rna酶h活性可通過許多測定例如在例如美國專利號5,244,797中，kotewicz,m.l.,等人,nucl.acidsres.16:265(1988)中和gerard,g.f.,等人,focus14(5):91(1992)中描述的那些測定來進(jìn)行測定。所述逆轉(zhuǎn)錄酶與天然存在的逆轉(zhuǎn)錄酶相比較可包含許多突變。例如，可修飾逆轉(zhuǎn)錄酶以包含提供增強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)錄酶穩(wěn)定性和/或功能性的突變。適當(dāng)?shù)拿高€可包括其中末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(tdt)活性已被減小，顯著減小或消除的酶。顯示此類增強(qiáng)的或減弱的功能性的逆轉(zhuǎn)錄酶描述于例如美國專利號7,056,716和7,078,208(將所專利的公開內(nèi)容通過引用整體并入本文)中。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物還包含至少一種pcr抑制劑阻斷劑，其幫助克服多種通常在用于核酸制備和/或分離的樣品中發(fā)現(xiàn)的抑制劑化合物對pcr反應(yīng)的抑制。此類抑制劑包括例如肝素(血液)；血色素(血液)；edta(血液)；檸檬酸鹽(血液)；免疫球蛋白g(血液,血清)；腐殖酸(土壤,糞便)；乳鐵蛋白(牛奶、唾液、其它分泌液體)；尿素(尿)；植物多糖(植物)；黑色素(皮膚、頭發(fā))；肌紅蛋白(組織)；和靛青染料(紡織品)。適當(dāng)?shù)膒cr抑制劑阻斷劑包括蛋白質(zhì)例如但不限白蛋白(例如，牛血清白蛋白(bsa)和重組bsa))、明膠(例如，牛明膠和魚膠)和/或其肽或多肽變體、片段或衍生物。用作pcr抑制劑阻斷劑的示例性蛋白質(zhì)包括牛血清白蛋白(bsa)和魚膠。pcr抑制劑阻斷劑可包括pcr抑制劑阻斷劑的組合。pcr抑制劑阻斷劑的示例性組合是bsa和魚膠.我們已發(fā)現(xiàn)bsa和魚膠單獨(dú)地和組合地在減弱由至少腐殖酸、血色素和/或肝素引起的pcr抑制中是有效的。在一些實(shí)施方案中，pcr抑制的該減弱由更低的ct值顯示。如本文中所用，術(shù)語“ct”或“ct值”是指循環(huán)閾值并且表示其中來自報(bào)道分子的表示擴(kuò)增子產(chǎn)生的信號(例如,熒光)最早變得高于本底水平而可被檢測的pcr擴(kuò)增測定的循環(huán)。在一些實(shí)施方案中，循環(huán)閾值或“ct”為pcr擴(kuò)增變成指數(shù)擴(kuò)增時(shí)的循環(huán)數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，來自報(bào)道分子的信號例如熒光被描述為δrn。如本文中所用，術(shù)語“drn”或“δrn”是指標(biāo)準(zhǔn)化報(bào)道分子信號(rn)與本底信號(基線)之差(然后其通過被動(dòng)參考信號被標(biāo)準(zhǔn)化)。δrn可利用式[rn+-rn-來測定,其中rn+是包括所有組分(包括模板)的反應(yīng)的rn值，rn-是未反應(yīng)的樣品的值。根據(jù)不同的實(shí)施方案，可使用pcr曲線的導(dǎo)數(shù)來測定ct值。例如，可對pcr曲線進(jìn)行一階、二階或n階導(dǎo)數(shù)法以測定ct值。在不同的實(shí)施方案中，導(dǎo)數(shù)的特征可用于測定ct值。此類特征可包括但不限于二階導(dǎo)數(shù)的正拐點(diǎn)(positiveinflection)、二階導(dǎo)數(shù)的負(fù)拐點(diǎn)(negativeinflection)、二階導(dǎo)數(shù)的零交叉或一階導(dǎo)數(shù)的正拐點(diǎn)。在不同的實(shí)施方案中，可使用閾值和基線法(thresholdingandbaseliningmethod)來測定ct值。例如，可使用導(dǎo)數(shù)法來確定pcr曲線的指數(shù)期的上限，可測定pcr曲線的基線來確定pcr曲線的指數(shù)期的下限。根據(jù)pcr曲線的上限和下限，可確定閾值以從其測定ct值。用于測定ct值的其它方法在本領(lǐng)域是已知的，例如但不限于擬合點(diǎn)法(fitpointmethod)的各種實(shí)施方案以及反曲法(sigmoidalmethod)的各種實(shí)施方案(參見，例如，美國專利號6,303,305；6,503,720；6,783,934；7,228,237和美國申請公布no.2004/0096819；將所述專利和申請公布的公開內(nèi)容通過引用整體并入本文)。此外，我們已發(fā)現(xiàn)使用的bsa的濃度越高，反應(yīng)對血色素和腐殖酸抑制越耐受。然而，隨著bsa的量不斷增加，我們還確定drn減小并且基線值(或本底信號)增加。如本文中所用，術(shù)語“drn”或“δrn”是指標(biāo)準(zhǔn)化的報(bào)道分子信號(rn)與本底信號(基線)之差(然后其通過被動(dòng)參考信號被標(biāo)準(zhǔn)化)。δrn可利用式[rn+-rn-來測定,其中rn+是包括所有組分(包括模板)的反應(yīng)的rn值，rn-是未反應(yīng)的樣品的值。令人驚訝地，通過使用此類組合的pcr抑制劑阻斷劑，例如魚膠和bsa，我們觀察到抑制劑耐受性的水平得到大大增強(qiáng)。因此，pcr抑制劑阻斷劑(包括但不限于魚膠和bsa或其組合)的添加在減輕通常在用于核酸分析的樣品中發(fā)現(xiàn)的多種pcr抑制劑的抑制中是有效的?？蓪cr抑制劑阻斷化合物或試劑添加至本發(fā)明組合物以在工作溶液中產(chǎn)生0.05mg/ml至約0.8mg/ml、約0.1mg/ml至約0.6mg/ml，更特別約0.2mg/ml至約0.4mg/ml的濃度。還可以以例如約0.05％(w/v)至約0.8％(w/v)、約0.2％(w/v)至約0.4％(w/v)，更特別地約0.2％(w/v)至約0.4％(w/v)的百分比終濃度添加pcr抑制劑阻斷劑。在一些方面，pcr抑制劑阻斷劑可使此類pcr抑制劑導(dǎo)致的pcr抑制的量與在不存在此類pcr抑制劑阻斷劑的情況下觀察到的抑制水平相比較減少至少1至100％。例如，抑制可被減小至少約1％、約2％、約5％、約10％、約20％、約50％、約75％、約100％或其間的任意百分?jǐn)?shù)。此外我們已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明組合物減少pcr的總運(yùn)行時(shí)間。例如，總pcr運(yùn)行時(shí)間與利用商購可得的預(yù)混合物的等同pcr相比較，可被減少至少約5％、約10％、約20％、約50％、約75％、約100％或其間任意百分比?？稍趐cr過程中發(fā)生的不期望的擴(kuò)增反應(yīng)通常在反應(yīng)混合物的裝配過程中開始，或當(dāng)熱循環(huán)儀正被加熱至初始變性溫度時(shí)發(fā)生。這些假反應(yīng)可通過進(jìn)行“熱啟動(dòng)子”擴(kuò)增來減小至最低程度。一般地，熱啟動(dòng)技術(shù)限制必需反應(yīng)組分的可用性直至升高的溫度(通常高于60℃)。存在用于進(jìn)行熱啟動(dòng)的幾種方法，包括手工技術(shù)、屏障、可逆的聚合酶失活和專門設(shè)計(jì)的發(fā)夾型引物。手工熱啟動(dòng)法需要研究人員扣留關(guān)鍵組分，通常鎂或聚合酶，直至反應(yīng)物已被加熱。隨后添加被扣留的組分以起始反應(yīng)。第二方法使用物理屏障(例如，石蠟)來將關(guān)鍵組分與模板和引物分隔。美國專利號5,565,339描述了使用石蠟屏障以在試管中將各種pcr試劑彼此隔開。美國專利號5,413,924描述了使用石蠟珠粒來隔離dna聚合酶。熱啟動(dòng)擴(kuò)增的第三方法是可逆的聚合酶失活。將聚合酶與結(jié)合聚合酶的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體或寡核苷酸適體反應(yīng)，從而使得聚合酶失活。例如，將針對taq聚合酶的單克隆抗體例如可從sigma獲得的抗-taqdna聚合酶抗體引入反應(yīng)混合物。在加熱后，化合物與聚合酶解離，從而恢復(fù)酶活性。在另一個(gè)實(shí)例中，美國專利號5,677,152描述了其中化學(xué)修飾dna聚合酶以確保其僅在升高的溫度下變得具有活性的方法。實(shí)現(xiàn)熱啟動(dòng)擴(kuò)增的另一個(gè)方法是設(shè)計(jì)將自我退火以形成特殊發(fā)夾結(jié)構(gòu)的引物。發(fā)夾型引物在以發(fā)夾構(gòu)象存在時(shí)不能與靶核酸退火。發(fā)夾型引物將在被加熱至變性溫度之前保持發(fā)夾構(gòu)象。然而，如果發(fā)夾結(jié)構(gòu)包括單鏈延伸，則發(fā)夾結(jié)構(gòu)本身類似對模板退火的引物，并且可導(dǎo)致鏈延伸。如本文中所用，術(shù)語“退火”和“雜交”可互換使用并且意指導(dǎo)致雙鏈體、三鏈體或其它高級結(jié)構(gòu)的形成的一個(gè)核酸與另一個(gè)核酸的互補(bǔ)堿基配對相互作用。在一些實(shí)施方案中，一級相互作用是通過沃爾森/克里克和hoogsteen型氫鍵合產(chǎn)生的堿基特異性，例如a/t和g/c。在一些實(shí)施方案中，堿基堆積和疏水性相互作用也促成了雙鏈體的穩(wěn)定性。用于將核酸探針和引物與互補(bǔ)及大體上互補(bǔ)的靶序列雜交的條件也是公知的，例如如nucleicacidhybridization,apracticalapproach,b.hames和s.higgins,eds.,irlpress,washington,d.c.(1985)andj.wetmurandn.davidson,mol.biol.31:349etseq.(1968)中描述的。一般而言，此類退火是否發(fā)生受到除其它以外，探針和互補(bǔ)靶序列的長度、ph、溫度、單價(jià)和二價(jià)陽離子的存在、雜交區(qū)域中g(shù)與c核苷酸的比例、介質(zhì)的粘度以及變性劑的存在的影響。此類變量影響雜交所需的時(shí)間。因此，優(yōu)選退火條件將取決于具體應(yīng)用。然而，此類條件可由本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)地確定而無需過度實(shí)驗(yàn)。此外，一般而言，本發(fā)明的探針和引物被設(shè)計(jì)來與靶序列互補(bǔ)，以便靶與探針或引物的雜交發(fā)生。然而，應(yīng)理解，該互補(bǔ)性不必是完全的；可存在任何數(shù)目的堿基對錯(cuò)配，其將干擾靶序列與本教導(dǎo)的單鏈核酸之間的雜交。然而，如果堿基對錯(cuò)配的數(shù)目是如此之大以致于在甚至最低的雜交嚴(yán)格度條件下雜交都不能發(fā)生，則序列與靶序列不互補(bǔ)。因此，本文中提及的“大體上互補(bǔ)”意指探針或引物與靶序列充分互補(bǔ)以在選擇的反應(yīng)條件下雜交。術(shù)語“標(biāo)記”，如本文中所用，是指可用于提供可檢測的信號并且可被連接至核酸或蛋白質(zhì)的任意原子或分子。標(biāo)記可提供可通過熒光、放射性、比色法、重力分析法、x射線衍射或吸收、磁性、酶促活性等檢測的信號。在一些實(shí)施方案中，可檢測信號為可定量的信號。例如，標(biāo)記可以是任何部分，其：(i)提供可檢測的信號；(ii)與第二標(biāo)記相互作用以修飾由第一或第二標(biāo)記提供的可檢測信號；或(iii)賦予捕獲功能，例如，疏水性親和力、抗體/抗原、離子型絡(luò)合(ioniccomplexation)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可將許多不同種類的報(bào)道標(biāo)記單獨(dú)地或與一種或多種不同的標(biāo)記組合地用于本教導(dǎo)。示例性標(biāo)記包括但不限于熒光基團(tuán)、放射性同位素、量子點(diǎn)、發(fā)色團(tuán)、酶、抗原包括但不限于附加表位、重金屬、染料、磷光基團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、電化學(xué)檢測部分、親和標(biāo)記物、結(jié)合蛋白、磷光體(phosphors)、稀土螯合劑、近紅外線染料包括但不限于“cy.7.sph.ncs”、“cy.7.ophet.ncs”、“cy7.ophet.co2su”和ird800(參見，例如，j.flanagan等人,bioconjug.chem.8:751-56(1997)；和dnasynthesiswithird800phosphoramidite,li-corbulletin#111,li-cor,inc.,lincoln,ne)、電化學(xué)熒光標(biāo)記，包括但不限于三(聯(lián)吡啶)釕(ii)，也稱為ru(bpy)32+、os(1,10-菲咯啉)2雙(二苯基膦基)乙烷2+，也稱為os(phen)2(dppene)2+、魯米諾/過氧化氫、al(羥基喹啉-5-磺酸)、9,10-二苯基蒽-2-磺酸酯和三(4-乙烯基-4′-甲基-2,2′-聯(lián)吡啶)釕(ii)，也稱為ru(v-bpy32+)等。熒光報(bào)道分子—猝滅劑分子對已被摻入寡核苷酸探針中以監(jiān)測基于熒光報(bào)道分子與猝滅劑分子被分離或拉近至彼此的最小猝滅距離內(nèi)的生物學(xué)事件。例如，已開發(fā)了其中報(bào)道分子熒光的強(qiáng)度因報(bào)道分子與猝滅分子的分離而增加的探針。還已開發(fā)了其中其熒光的喪失是因?yàn)殁绶肿颖焕僚c報(bào)道分子靠近的探針。此類報(bào)道分子-猝滅劑分子對探針已被用于通過監(jiān)測由報(bào)道分子產(chǎn)生的熒光的出現(xiàn)或消失來監(jiān)測雜交測定和核酸擴(kuò)增反應(yīng)，特別地聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)。(例如，參見美國專利號6,030,787)。示例性報(bào)道分子-猝滅劑對可選自噸染料包括熒光素和羅丹明染料。此類化合物的許多適當(dāng)形式可廣泛地商購獲得，所述形式在其苯基部分上具有可用作結(jié)合的位點(diǎn)或用作至寡核苷酸的連接的鍵合功能性的位點(diǎn)的取代基。另一組熒光化合物為在α和β位具有氨基的萘胺。包括在此類萘胺化合物中的是包括1-二甲基氨基萘基-5-磺酸鹽、1-苯胺基-8-萘磺酸鹽和2-對甲苯胺基-6-萘磺酸鹽。其它類型包括3-苯基-7-香豆素異氰酸酯、吖啶例如9-異硫氰酸吖啶和吖啶橙；n-(p-(2-苯丙噁唑基)苯基)馬來酰亞胺；苯并氧二唑、芪類、芘類等。優(yōu)選地，報(bào)道分子與猝滅劑分子選自熒光素和羅丹明染料。此類染料和用于至寡核苷酸的連接的適當(dāng)連接方法描述于許多參考資料中，例如khanna等人(citedabove)；marshall,histochemicalj.,7:299-303(1975)；menchen等人,美國專利號5,188,934；menchen等人,歐洲專利申請87310256.0；和bergot等人,國際申請pct/us90/05565。在另一個(gè)實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物可存在于用于擴(kuò)增核酸分子的試劑盒中。根據(jù)該實(shí)施方案的試劑盒包括將容器例如小瓶、管、安瓿、板、瓶子等封裝在其中的運(yùn)載工具例如箱載體例如箱、硬紙盒、管等。當(dāng)在試劑盒(例如，dna聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶)中包括超過一種dna聚合酶時(shí)，可將聚合酶作為兩種或更多種(例如，2、3、4、5種等)逆轉(zhuǎn)錄酶的混合物裝在單個(gè)容器中或裝在單獨(dú)的容器中。本發(fā)明的試劑盒還可包括(在相同或單獨(dú)的容器中)適當(dāng)?shù)木彌_液、核苷酸、pcr抑制劑阻斷劑、探針和/或引物。在一些實(shí)施方案中，將dna聚合酶、pcr抑制劑阻斷劑、核苷酸和緩沖液組合在單個(gè)管或容器中。在另一個(gè)方面，試劑盒可包括用于核酸合成的組合物?？蓪⒋祟惤M合物配制為濃縮原液(例如，2x、3x、4x、5x、6x等)。在一些實(shí)施方案中，可將組合物在單個(gè)管或容器中配制為濃縮原液，包含dna聚合酶。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，此類濃縮原液還可在緩沖液中包含pcr抑制劑阻斷劑、核苷酸、熱啟動(dòng)組分和/或被動(dòng)參考染料。在一些其它實(shí)施方案中，此類緩沖液可包含甘油、dmso、mg2+和/或去垢劑(例如tween20或np-40)。下列非限定性實(shí)施例進(jìn)一步舉例說明本文中描述的各種實(shí)施方案。實(shí)施例實(shí)施例1.示例性組合物.將示例性組合物配制為2倍濃縮原液，其包含熱穩(wěn)定性dna聚合酶、包含bsa和魚膠的pcr抑制劑阻斷劑的組合、緩沖鹽溶液、熱啟動(dòng)組分、dntp、甘油、非離子型去垢劑和被動(dòng)參考染料。在如下文實(shí)施例中描述的許多測定中測試示例性pcr組合物。實(shí)施例2.利用示例性組合物的pcr的優(yōu)良靈敏性、準(zhǔn)確性、動(dòng)力學(xué)范圍和特異性將實(shí)施例1的pcr組合物在一組13個(gè)基因表達(dá)pcr測定中的性能與商購可得的組合物通用pcr預(yù)混合物(mm；lifetechnologies,inc.)的性能相比較。按照制造商的關(guān)于測定法和mm的說明書進(jìn)行測定，但在一組測定中用示例性組合物替換mm。單個(gè)裝配的20μlpcr包含下列組分:正向pcr引物(18μm)反向pcr引物(18μm)探針(5μm)核酸樣品(10至100ng)通用pcr預(yù)混合物或?qū)嵤├?的組合物(10μl),不含rna酶的水至20μl的總pcr體積對于測試13個(gè)基因表達(dá)pcr測定的每一個(gè)，正向pcr引物、反向pcr引物和探針為基因表達(dá)測定混合物(20x)的組分。按照下列方面選擇用于進(jìn)行測定組的pcr擴(kuò)增的熱循環(huán)條件:ung步驟(任選的):50℃,2分鐘活化:95℃,20秒(變性:95-97℃/1-3秒；延伸:60-62℃/20-30秒)x40個(gè)循環(huán)使用實(shí)施例1的組合物或商業(yè)mm在標(biāo)準(zhǔn)pcr儀上對每一個(gè)測定確定的閾值循環(huán)數(shù)(ct)示于圖1。對于大多數(shù)測定，使用示例性組合物測定到比利用商業(yè)濃縮物測定到的ct值更小的ct值，這表明所述組合物比商購可得的濃縮物更靈敏。使用示例性組合物進(jìn)行的pcr測定的大動(dòng)態(tài)范圍示于圖2中，其顯示了來自在appliedbiosystems7500快速實(shí)時(shí)pcr系統(tǒng)上，于fn1基因表達(dá)測定中使用所述試劑的2倍濃縮物的實(shí)施方案在4個(gè)重復(fù)反應(yīng)中擴(kuò)增的人cdna的系列稀釋物的實(shí)時(shí)pcr的代表性擴(kuò)增曲線。使用各自推薦的方案和核酸樣品，將示例性組合物在一組基因表達(dá)測定中的動(dòng)態(tài)范圍與幾種商購可得的試劑混合物的動(dòng)態(tài)范圍相比較。該比較的結(jié)果示于下面表2中。在表2中，顯示了每一個(gè)試劑混合物的檢測限值(lod)的對數(shù)。檢測到的對數(shù)具有85-115％的pcr效率和大于0.98的r2值。對于每一種試劑混合物在appliedbiosystems7900ht快速實(shí)時(shí)pcr系統(tǒng)上運(yùn)行6個(gè)重復(fù)反應(yīng)。表2.示例性組合物與商購可得的試劑混合物之間比較的測定動(dòng)態(tài)范圍表2中的結(jié)果顯示示例性組合物在多種類型的基因表達(dá)測定中具有比商購可得的試劑混合物的動(dòng)態(tài)范圍更大的動(dòng)態(tài)范圍。實(shí)施例3.利用公開的組合物進(jìn)行的pcr對pcr抑制劑的更大耐受性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以測定在裝配反應(yīng)中示例性組合物對pcr抑制劑的存在的魯棒性(robustness)。血色素和肝素是兩種通常污染來自血液的核酸樣品的pcr抑制劑，而腐殖酸是污染來自土壤、植物或糞便的核酸樣品的常見pcr抑制劑。顯示了根據(jù)制造商對于通用預(yù)混合物ii(mmii)的方案(但用示例性組合物替換mmii)，在濃度為10-50μm的血色素存在的情況下，對于下列fam測定的作為單重fam反應(yīng)或fam與18s(vic)內(nèi)源對照的雙重反應(yīng)運(yùn)行的cdna的單個(gè)稀釋度(10ng/反應(yīng))的代表性數(shù)據(jù)示于下面:測定id類型hs00157812_m1amp>70chs00159092_m1基因家族hs00162613_m1基因家族hs00192202_m1引物<16nths00197394_m1探針<30％gchs00259126_m1良好的快速hs00261096_m1amp<30％gchs00298216_m1amp<30％gc測定的結(jié)果示于圖7a和7b中。在整個(gè)測試范圍(10μm-50μm)內(nèi)，多數(shù)測定在對照的1ct內(nèi)，顯示了利用所述組合物裝配的pcr反應(yīng)耐受在該范圍內(nèi)的血色素濃度。還測試了對利用所述組合物裝配的pcr樣品中的腐殖酸的耐受性。低至15ng的污染pcr樣品的腐殖酸完全抑制pcr。在添加劑bsa和魚膠存在或不存在于示例性組合物中的情況下，在腐殖酸不存在或在15ng/20μl反應(yīng)的腐殖酸存在的情況下進(jìn)行使用兩個(gè)基因表達(dá)測定的pcr實(shí)驗(yàn)。結(jié)果概述于圖8的柱形圖中。在樣品中包含魚膠和bsa的組合導(dǎo)致在對照pcr的范圍內(nèi)的pcr擴(kuò)增。因此，示例性組合物耐受pcr樣品中達(dá)15ng的腐殖酸。此外，測試對利用組合物裝配的pcr樣品中的肝素的耐受性。低至0.01u/μl的pcr樣品中的肝素完全抑制反應(yīng)。在添加劑bsa和魚膠在示例性組合物中存在或不存在的情況下，在肝素不存在或存在0.01u/μl肝素的情況下，進(jìn)行使用3個(gè)基因表達(dá)測定的pcr實(shí)驗(yàn)。結(jié)果概述于圖9的柱形圖中。在樣品中包含魚膠和bsa的組合導(dǎo)致在可檢測的范圍內(nèi)的pcr擴(kuò)增。因此，示例性組合物耐受pcr樣品中達(dá)0.01u/ul的肝素。實(shí)施例4.利用公開的組合物裝配的pcr反應(yīng)的增強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)臺穩(wěn)定性已顯示實(shí)施例1的組合物在室溫下產(chǎn)生具有增強(qiáng)的穩(wěn)定性的裝配反應(yīng)。在反應(yīng)物裝配后立即進(jìn)行的擴(kuò)增相對于在于30℃下將裝配的反應(yīng)物溫育72小時(shí)后的擴(kuò)增的代表性結(jié)果示于圖3中。圖3中顯示的擴(kuò)增結(jié)果定量地概述于表3和4中。表3顯示在于30℃溫育72小時(shí)后pcr效率仍然保持較高，同時(shí)對r2幾乎無影響。表4顯示對于每一個(gè)稀釋度水平，在72小時(shí)時(shí)測定的ct相對于立即測定的ct顯示略微的增加。表3.在0或72小時(shí)的pcr效率和r2表4.在第0小時(shí)或72小時(shí)對每一種稀釋度測定的ct實(shí)施例5.單靶和雙重靶的利用公開的組合物進(jìn)行的pcr的比較比較單靶pcr與包括所靶和內(nèi)部陽性對照的雙重pcr的使用實(shí)施例1的組合物進(jìn)行的擴(kuò)增。內(nèi)部陽性對照(ipc)是外源ipc(此處試劑盒的信息)或內(nèi)源iipc測定(gapdh)。靶存在于β-肌動(dòng)蛋白基因(actb)中，在利用恒定量的外源(圖4a)或內(nèi)源(圖4b)ipc測定擴(kuò)增前將其進(jìn)行系列稀釋。結(jié)果示于圖4中。實(shí)施例6.標(biāo)準(zhǔn)或快速儀器上減少的pcr運(yùn)行時(shí)間圖6顯示對當(dāng)在appliedbiosystems7300實(shí)時(shí)pcr系統(tǒng)(用于標(biāo)準(zhǔn)而非快速實(shí)時(shí)pcr的儀器)上于快速熱循環(huán)條件下使用實(shí)施例1的組合物時(shí)，在fn1基因表達(dá)測定中擴(kuò)增的人cdna的系列稀釋度獲得的擴(kuò)增結(jié)果。熱循環(huán)時(shí)間顯著減少。實(shí)施例7.用于mirna測定的應(yīng)用已顯示實(shí)施例1的組合物在microrna的商業(yè)測定中表現(xiàn)良好。來自代表性測定的結(jié)果示于圖5中。圖5的上圖框顯示了顯示δrn對pcr循環(huán)的擴(kuò)增曲線，而下圖框顯示了作為使用實(shí)施例1的組合物在appliedbiosystems7900h快速實(shí)時(shí)pcr系統(tǒng)上進(jìn)行的let7-cmicrorna測定的一系列稀釋物的4個(gè)重復(fù)反應(yīng)的實(shí)時(shí)pcr的終核酸濃度的函數(shù)的ct的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖5中標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示在輸入模板濃度的6-log范圍內(nèi)pcr擴(kuò)增的優(yōu)良線性。如圖10中所示，實(shí)施例1的組合物在快速熱循環(huán)條件下在單重和雙重反應(yīng)中顯示相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。此外，單重和雙重反應(yīng)中的結(jié)果與利用fn1基因表達(dá)測定獲得的結(jié)果相似。除非上下文中明確地指出，否則單數(shù)“一個(gè)/一種(a)”、“一個(gè)/一種(an)”和“所指物(the)”包括復(fù)數(shù)所指物。除非另外明確指出，否則數(shù)量之前的術(shù)語“約”表示與量可接受的可能變化為該量的-+10％。引述相同特征或量的所有范圍的的終點(diǎn)可獨(dú)立地組合并且包括引述的終點(diǎn)。術(shù)語“第一”、“第二”等不表示任何順序、量或重要性，而是用于區(qū)分一個(gè)元素與另個(gè)元素。本文中引用的所有參考資料通過引用整體并入本文。除非另外定義，否則本文中使用的所有術(shù)語(包括技術(shù)和科學(xué)術(shù)語)具有與由本發(fā)明所屬的領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。還應(yīng)理解，術(shù)語例如在常用詞典中定義的術(shù)語，應(yīng)當(dāng)解釋為具有與它們在相關(guān)領(lǐng)域和本公開內(nèi)容的上下文中含義一致的含義，并且除非明確地在本文中這樣定義，否則將不以理想化的或過度正式的意義進(jìn)行解釋。雖然已在本文中顯示和描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但對于本領(lǐng)域技術(shù)人員很明顯的是，此類實(shí)施方案僅以舉例方式提供。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說現(xiàn)可在不背離本發(fā)明的情況下進(jìn)行許多變化、改變和替換。應(yīng)理解，可在實(shí)施本發(fā)明中應(yīng)用對本文中描述的本發(fā)明的實(shí)施方案的各種改變。下列權(quán)利要求意欲定義本發(fā)明的范圍，從而意欲包括在這些權(quán)利要求的范圍內(nèi)的結(jié)果及其等同物。本說明書中提及的所有公開案、專利和專利申請通過引用并入本文，其引用程度就如同將每一個(gè)別公開案、專利或?qū)＠暾執(zhí)囟ㄇ覀€(gè)別地通過引用并入本文。當(dāng)前第1頁12