高效的小體積核酸合成的制作方法
本申請是申請日為2012年9月26日、申請?zhí)枮?01280057089.4、發(fā)明名稱為“高效的小體積核酸合成”的發(fā)明專利申請的分案申請。
發(fā)明領域
總體而言，本公開內容涉及用于產生核酸分子的組合物和方法。在一些方面，本發(fā)明允許核酸分子的微量產生，任選地隨后為這些核酸分子裝配成更大的分子。在一些方面，本發(fā)明允許核酸分子(例如，大核酸分子例如基因組)的有效產生。
發(fā)明背景
核酸分子的產生可以是相當簡單或復雜的，這取決于諸如待產生的核酸分子的類型等的因素。例如，歷史上，短的單鏈核酸分子例如引物典型地通過化學合成來產生(參見例如，u.s.專利號5,837,858，其公開內容通過提及而并入本文)。進一步地，更長的核酸分子典型地通過聚合酶鏈式反應(pcr)來產生。pcr的一個缺點是通常需要模板核酸。
許多核酸合成方法對于從頭產生大的核酸分子具有有限的能力。本公開內容的一個方面是解決該限制。
發(fā)明概述
本發(fā)明部分地涉及用于合成核酸分子的組合物和方法。本發(fā)明還涉及用于裝配核酸分子從而形成諸如質粒、染色體和基因組之類的分子的組合物和方法。
在一些方面，本發(fā)明涉及用于核酸分子的非模板指導的合成的多孔平板。在一些實施方案中，所述平板包含位于所述平板的眾多孔的每個孔中的珠粒(例如，磁性珠粒)和存在于所述眾多孔的一個或多個孔中的以電化學方式產生的酸(ega)。代替在一個或多個孔中具有ega或者除了在一個或多個孔中具有ega，所述平板的孔可以包含有在別處陳述的與核酸分子的合成相關的其他試劑。
在本發(fā)明的實踐中使用的珠粒大小可以廣泛地變化，但是包括具有下列直徑的珠粒：0.01μm至100μm、0.005μm至100μm、0.005μm至10μm、0.01μm至100μm、0.01μm至1,000μm、1.0μm至2.0μm、1.0μm至100μm、2.0μm至100μm、3.0μm至100μm、0.5μm至50μm、0.5μm至20μm、1.0μm至10μm、1.0μm至20μm、1.0μm至30μm、10μm至40μm、10μm至60μm、10μm至80μm或0.5μm至10μm。正如本領域技術人員將會認識到的，當固體顆粒降到一個特定的大小水平之下時，它們開始看上去獲得了流體的屬性(例如，形成膠體懸浮液的等價物)。因此，在一些情況下(例如，在使用直徑低于大約500nm的珠粒時)，可以期望將所述珠粒作為流體對待。這可以意味著從磁性尖端上移除珠粒，例如，通過攪拌、洗滌，或通過使用表面活性劑。
在本發(fā)明的特別的實施方案中，可以依賴于孔的大小來選擇珠粒大小，以允許僅一個單珠粒占據(jù)孔。在其他實施方案中，多于一個的珠粒(或其他形狀的核酸合成基質)可以在所述孔的一些或所有中。在一些情況下，珠粒數(shù)目/孔可以為二至二十，二至三十，二至十，四至二十，四至十，四至五十，等等。
孔的數(shù)目也可以廣泛地變化，并且受到諸如待產生的核酸的量之類的因素以及諸如可制造性和與使用有關的機械因素(例如，磁性珠粒提取器的大小下限)之類的技術因素限制。在任何情況下，孔的數(shù)目可以總計為例如為10至10,000,000、10至5,000,000、10至2,000,000、10至1,000,000、10至800,000、10至650,000、10至500,000、500至500,000、10至50,000、1,000至500,000、10,000至500,000、20,000至500,000或1,000至50,000。進一步地，制備了多孔表面，其具有數(shù)目在1千萬范圍內的孔。因此，在一些情況下，孔的數(shù)目可以少于5百萬、1千萬、2千萬等。
每個孔的總體積是可以變化的另一個項目，并且可以例如為1.0×10-9μl至50μl、1.0×10-9μl至10μl、1.0×10-9μl至1.0μl、1.0×10-9μl至0.1μl、1.0×10-9μl至1.0×10-2μl、1.0×10-9μl至1.0×10-3μl、1.0×10-9μl至1.0×10-4μl、1.0×10-9μl至50μl、1.0×10-5μl至1.0×10-6μl、1.0×10-9μl至1.0×10-7μl、2.5×10-9μl至1.0×10-2μl、2.5×10-9μl至1.0×10-3μl、2.5×10-9μl至1.0×10-4μl、2.5×10-9μl至1.0×10-5μl、2.5×10-9μl至1.0×10-6μl、1.0×10-8μl至1.0×10-6μl、1.0×10-8μl至1.0×10-5μl、1.0×10-7μl至1.0×10-5μl、1.0×10-7μl至1.0×10-4μl、1.0×10-7μl至1.0×10-3μl、1.0×10-7μl至1.0×10-2μl、0.1μl至50μl、0.01μl至50μl、0.01μl至25μl、0.01μl至15μl、0.01μl至10μl、0.001μl至50μl、0.001μl至5μl、0.001μl至1μl、0.001μl至0.01μl或0.001μl至1μl。
在許多情況下，將會將本發(fā)明的多孔平板或適合用于本發(fā)明的多孔平板可操作地與一個電極或一套(例如，一對或數(shù)對)電極相連接。如在本文別處所討論的，這些電極可以用于產生與一個或多個化學反應的催化相關的微環(huán)境(例如，用于核苷酸去保護的ega)。
在一些實施方案中，將會將本發(fā)明的多孔平板或適合用于本發(fā)明的多孔平板與用于引入和移除試劑的微觀流體通道相連接。這允許試劑的有效和自動化的控制。
本發(fā)明還提供了用于產生從更小的化學合成的核酸分子形成的經(jīng)裝配的核酸分子的方法。在一些實施方案中，這樣的方法可以包括一個或多個下列步驟：
(a)合成眾多核酸分子，其中在平板的孔中以微量制備每個核酸分子；
(b)將在(a)中產生的核酸分子或其一部分進行合并，從而產生匯集物；
(c)將一些或所有存在于在(b)中形成的匯集物中的核酸分子進行連接，從而形成眾多更大的核酸分子；
(d)從在(c)中形成的所述眾多更大的核酸分子中去除包含序列錯誤的核酸分子，從而產生校正了錯誤的核酸分子匯集物；和
(e)將在所述校正了錯誤的核酸分子匯集物中的核酸分子進行裝配，從而形成經(jīng)裝配的核酸分子。
在一些實施方案中，存在于匯集物中的核酸分子的連接將由聚合酶鏈式反應(pcr)來介導。
在一些實施方案中，步驟(b)可以進一步包括將在(a)中產生的核酸分子與通過其他方式獲得的核酸分子進行合并，從而形成匯集物，其中所述其他方式包括pcr、限制酶消化或核酸外切酶處理。在一些情況下，可以將在(c)和/或(e)中產生的經(jīng)裝配的核酸分子進行裝配并引入到載體(例如，克隆載體、目的載體，等等)中。
通過本發(fā)明的方法進行裝配的核酸分子的數(shù)目可以變化，并且在合適時將會與經(jīng)匯集的核酸分子的數(shù)目相關聯(lián)。在任何情況下，在本發(fā)明的方法中裝配的核酸分子可以由至少五個其他(例如，更小的)核酸分子(例如，大約五個至大約五千個，大約五個至大約兩萬個，大約五個至大約十萬個，大約五十個至大約五千個，大約五十個至大約兩萬個，大約五十個至大約十萬個，大約一百個至大約五千個，大約一百個至大約十萬個，大約五百個至大約五千個，大約五百個至大約十萬個等的核酸分子)組成。
通過本發(fā)明的方法進行裝配的核酸分子可以很大地變化，并且包括至少20千堿基(例如，大約0.5千堿基至大約10兆堿基、大約0.5千堿基至大約5兆堿基、大約0.5千堿基至大約1兆堿基、大約0.5千堿基至大約500千堿基、大約0.5千堿基至大約100千堿基、大約0.5千堿基至大約10兆堿基、大約0.5千堿基至大約1千堿基、大約1千堿基至大約10兆堿基、大約10千堿基至大約5兆堿基、大約1千堿基至大約5兆堿基、大約1千堿基至大約2兆堿基、大約1千堿基至大約1兆堿基、大約1千堿基至大約500千堿基、大約10千堿基至大約1兆堿基、大約10千堿基至大約500千堿基、大約10千堿基至大約100千堿基，等等)的分子。
通過本發(fā)明的方法進行裝配的核酸分子可以例如是單鏈的、部分單鏈的或雙鏈的，閉合的，環(huán)狀的(例如，質粒)；帶切口的，環(huán)狀的；或線性的(例如，質粒、染色體等)。進一步地，可以如此地施行本發(fā)明的方法，從而在相同的反應混合物中同時形成兩個或更多個(例如，兩個、三個、四個、五個、六個、十個、二十個等)經(jīng)裝配的核酸分子。
本發(fā)明還提供了用于產生產物核酸分子的方法。在一些情況下，這樣的方法包括：
(a)設計大小為10千堿基至500千堿基(例如，500堿基至500千堿基、500堿基至100千堿基、500堿基至1千堿基、500堿基至800堿基，2千堿基至100千堿基、2千堿基至50千堿基、2千堿基至5千堿基、10千堿基至500千堿基、10千堿基至300千堿基、10千堿基至200千堿基、10千堿基至100千堿基、10千堿基至50千堿基，等等)的產物核酸分子，其中所述產物核酸分子通過核苷酸序列來進行定義；
(b)合成眾多在核苷酸序列方面不同的獨個核酸分子，其中合成每個獨個核酸分子以制備1,000至1.0×109個拷貝的數(shù)量，并且其中所述獨個核酸分子能夠與一個或多個其他獨個核酸分子雜交；
(c)在一定的條件下將在(b)中合成的獨個核酸分子進行合并，所述條件允許所述獨個核酸分子在允許形成至少一個更大的核酸分子的條件下進行雜交；和
(d)將在(c)中形成的所述至少一個更大的核酸分子與一個或多個另外的核酸分子進行合并，從而形成產物核酸分子，其中所述產物核酸分子包含少于一個的序列錯誤/千堿基。
在許多情況下，在產生產物核酸分子過程中采用錯誤校正程序。在上面的工作流程中可以施行錯誤校正程序的一個地方是在步驟(b)之后。錯誤校正程序在本文別處進行描述，并且將會經(jīng)常包括使用一種或多種錯配修復核酸內切酶。
作為產物核酸分子的制備的一部分而合成的獨個核酸分子的數(shù)目可以很大地變化，但是包括1,000至1.0×109個拷貝、1,000至1.0×108個拷貝、1,000至1.0×107個拷貝、1,000至1.0×106個拷貝、1,000至1.0×105個拷貝、2.0×107至1.0×109個拷貝、5.0×107至1.0×109個拷貝、7.0×107至1.0×109個拷貝、2.0×107至8.0×108個拷貝、2.0×107至5.0×108個拷貝、5.0×104至1.0×109個拷貝、1.0×106至1.0×109個拷貝、1.0×107至1.0×108個拷貝，等等。
在許多情況下，可以使用聚合酶鏈式反應來擴增在上面的產物核酸分子制備方法中在步驟(c)中形成的所述至少一個更大的核酸分子。
用于合成核酸分子的平板形式在本文別處進行描述，并且它們可以用在上面的產物核酸分子制備方法中。進一步地，當在珠粒上合成獨個核酸分子時，其中每個珠?？梢园诳字?。進一步地，在本發(fā)明的該方面以及本發(fā)明的其他方面中使用的珠?？梢岳缇哂兄T如下列的大?。?μm至100μm的直徑、5μm至50μm的直徑、3μm至100μm的直徑、5μm至100μm的直徑、20μm至100μm的直徑、5μm至60μm的直徑、10μm至100μm的直徑，等等。在一些實施方案中，珠粒可以具有大約30μm的直徑(例如，28至32μm)的大小。
本發(fā)明還包括用于以小的量和以高的序列保真度產生核酸分子的方法。在一些方面，本發(fā)明包括用于產生核酸分子的方法，所述方法包括以3.0×106至4.0×108個分子的總量合成核酸分子，其中序列錯誤的數(shù)目為1/100至1/500。
因此，本發(fā)明包括用于產生核酸分子集合的方法，囊括了包括下列步驟的方法：
(a)合成眾多核酸分子，其中以微量制備每個核酸分子；
(b)將一些或所有存在于在(a)中形成的匯集物中的核酸分子進行連接，從而形成眾多更大的的核酸分子；和
(c)將所述眾多更大的核酸分子進行裝配，從而形成核酸分子集合，其中從生物信息學信息方面，所述核酸分子集合選自下列：
(1)互補dna(cdna)文庫，其僅包含與信使rna(mrna)分子相對應的dna；
(2)部分cdna文庫，其包含與小于在所述生物信息學信息所來自的細胞類型中發(fā)現(xiàn)的mrna分子的完全互補物相對應的dna分子；和
(3)核酸分子集合，其中一些或所有的所述核酸分子為在所述生物信息學信息所來自的細胞類型中發(fā)現(xiàn)的核酸分子的密碼子經(jīng)改變的變體。
本發(fā)明還提供了用于產生從更小的化學合成的核酸分子形成的自我復制性核酸分子的方法。在一些實施方案中，這樣的方法可以包括一個或多個下列步驟：
(a)合成眾多核酸分子，其中在平板中以微量制備每個核酸分子；
(b)將一些或所有存在于在(a)中形成的匯集物中的核酸分子進行連接，從而形成眾多更大的核酸分子；和
(c)將所述眾多更大的核酸分子進行裝配，從而形成自我復制性核酸分子。
通過本發(fā)明的方法制備的自我復制性核酸分子包括染色體、人工染色體(例如，bac或yac)、質粒和基因組(例如，諸如下列的基因組：病毒基因組、核基因組、原核生物(例如，細菌、藻類等)基因組、葉綠體基因組或線粒體基因組)。
本發(fā)明還包括用于合成和裝配編碼多于一種的表達產物的核酸分子的方法，所述方法包括：
(a)合成眾多核酸分子，其中以微量制備每個核酸分子；
(b)將一些或所有存在于在(a)中形成的匯集物中的核酸分子進行連接，從而形成眾多更大的核酸分子；和
(c)將所述眾多更大的核酸分子進行裝配，從而形成編碼多于一種的表達產物的核酸分子。
在本發(fā)明的各種不同的方面，所述多于一種的表達產物可以為在相同的生物學途徑中所牽涉的蛋白質。在更特別的方面，所述多于一種的表達產物可以為在相同的生物學途徑中所牽涉的蛋白質，所述在相同的生物學途徑中所牽涉的蛋白質為催化在該生物學途徑中的一系列化學反應的酶。進一步地，此類在相同的生物學途徑中的化學反應可以為順次反應，其意義為：一個化學反應跟隨另一個化學反應，直接地(直接順次的)或者在一個或多個插入反應發(fā)生之后。
本文所指的生物學途徑包括導致產生選自下列的終產物的那些：(a)生物燃料前體；(b)抗生素或抗生素前體；(c)食物組分；(d)化學中間體(例如，1,4-丁二醇、2,3-丁二醇、苯、丁二烯、2-丁醇、3-羥基丙酸、丙烯酸、己二酸、氨基己酸、己內酰胺、乙炔、正丁醇、環(huán)己酮、富馬酸、4-羥基丁酸、gbl/bdo、六亞甲基二胺、異丁醇、異丙醇、正丙醇、長鏈醇、甲基丙烯酸/甲基丙烯酸甲酯、甲基·乙基酮、丙烯、腐胺、粘康酸、對甲苯甲酸、對苯二酸、乙酸、葡糖二酸)；(d)工業(yè)酶；和(e)天然產物。生物燃料前體包括選自下列的醇：(a)丁醇；(b)戊醇；(c)己醇；(d)庚醇；和(e)辛醇。食物組分包括牲畜飼料組分，其包括選自下列的氨基酸：(a)l-賴氨酸；(b)l-蘇氨酸；(c)l-甲硫氨酸；(d)l-亮氨酸；(e)l-異亮氨酸；(f)l-纈氨酸；和(g)高絲氨酸。
可以將經(jīng)裝配的核酸分子引入到許多細胞(包括原核細胞和真核細胞)中。此類細胞的例子包括下列成員：棒桿菌屬(corynebacterium)(例如，谷氨酸棒桿菌(corynebacteriumglutamicum))、假單胞菌屬物種(pseudomonassp.)(銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa))、釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)、芽孢桿菌屬物種(bacillussp.)(遲緩芽孢桿菌(bacilluslentus)、凝結芽孢桿菌(bacilluscoagulans)、枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis))、曲霉屬物種(aspergillussp.)(土曲霉(aspergillusterreus)、黑曲霉(a.niger)、雜色曲霉(aspergillusversicolor))、鏈霉菌屬物種(streptomycetesspp.)(灰色鏈霉菌(streptomycesgriseus)、紫色鏈霉菌(streptomycesviolaceans)、吸水鏈霉菌(streptomyceshygroscopicus)、八孢鏈霉菌(streptomycesoctosporus))、梭菌屬(clostridium)(梭菌)、熱纖維梭菌(clostridiumthermocellum)、丙酮丁醇梭菌(clostridiumacetobutylicum)、拜氏梭菌(clostridiumbeijerinckii)、丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)、揚氏梭菌(clostridiumljungdahlii)、醋酸梭菌(clostridiumaceticum)、糖丁醇梭菌(clostridiumsaccharobutylicum)、糖多丁基丙酮梭菌(clostridiumsaccharoperbutylacetonicum)、里氏木霉(trichodermareesei)(紅褐肉座菌(hypocreajecorina))、(乳酸)克魯維酵母(kluyveromyces(lactis))、粗糙脈孢菌(neurosporacrassa)、解脂耶氏酵母(yarrowialipolitica)、腐質霉屬(humicola)(灰腐質霉(humicolagrisea))、多形漢遜酵母(hansenulapolymorpha)(狹小畢赤酵母(pichiaangusta))、醋桿菌屬(acetobacters)、發(fā)酵單胞菌屬(zymomonas)、金孢屬(chrysosporium)、熱厭氧桿菌屬(thermoanaerobacter)、樹干畢赤酵母(pichiastipitis)、粘細菌屬(myxobacteria)、深黃被孢霉(mortierellaisabellina)、產琥珀酸放線桿菌(actinobacillussuccinogenes)、產琥珀酸厭氧螺菌(anaerobiospirillumsucciniciproducens)、庫德畢赤酵母(pichiakudriavzevii)/東方伊薩酵母(issatchenkiaorientalis)(酵母)(克魯斯假絲酵母(candidakrusei))、雙歧桿菌屬(bifidobacterium)、凝結芽孢桿菌gbi-30、動物雙歧桿菌乳酸亞種(bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)bb-12、長雙歧桿菌嬰兒亞種(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)35624、嗜酸乳桿菌(lactobacillusacidophilus)ncfm、類干酪乳桿菌(lactobacillusparacasei)、約氏乳桿菌(lactobacillusjohnsonii)la1、植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)、路氏乳桿菌(lactobacillusreuteri)、布拉氏糖酵母(saccharomycesboulardii)、鼠李糖乳桿菌(lactobacillusrhamnosus)、嗜酸乳桿菌ncfm、雙歧雙歧桿菌(bifidobacteriumbifidum)bb-12、干酪乳桿菌(lactobacilluscasei)、植物乳桿菌、黃單胞菌屬(xanthomonas)(野油菜黃單胞菌(x.campestris))、古細菌(archea)(鹽桿菌屬物種(halobacteriumsp.)nrc-1、東大硫化葉菌(sulfolobustokodaii)、東大硫化葉菌(sulfolobustokodaii)、詹氏甲烷熱球菌(methanocaldococcusjannaschii)、嗜酸熱原體(thermoplasmaacidophilum)和火山熱原體(thermoplasmavolcanium))、類球紅細菌(rhodobactersphaeroides)、富養(yǎng)羅爾斯通氏菌(ralstoniaeutropha)、鼠孢菌屬物種(sporomusaspecies)、揚氏梭菌、醋酸梭菌、熱醋穆爾氏菌(moorellathermoacetica)、地桿菌屬物種(geobacterspecies)、希瓦氏菌屬物種(shewanellasp.)、光滑假絲酵母(candidaglabrata)、索諾拉假絲酵母(candidasonorensis)、熱帶假絲酵母(candidatropicalis)、多形漢遜酵母、東方伊薩酵母、乳酸克魯維酵母(kluyveromyceslactis)、馬克斯克魯維酵母(kluyveromycesmarxianus)、耐熱克魯維酵母(kluyveromycesthermotolerans)、樹干畢赤酵母、貝糖酵母(saccharomycesbayanus)、博伊丁糖酵母(saccharomycesbulderi)、葡萄汁糖酵母(saccharomycesuvarum)、釀酒酵母、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)、解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)、拜耳接合酵母(zygosaccharomycesbailii)、生物降解(aromatoleumaromaticum、芳香脫氯單胞菌(dechloromonasaromatica)、哈夫尼脫亞硫酸菌(desulfitobacteriumhafniense)、金屬還原地桿菌(geobactermetallireducens)、博爾庫姆島食烷菌(alcanivoraxborkumensis)、結核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis))、耐放射異常球菌(deinococcusradiodurans)、規(guī)則游動放線菌(actinoplanesregularis)、東方諾卡氏菌(nocardiaorientalis)、actinocorruliaregularis、膨大彎頸霉(tolypocladiuminflatum)、紅色紅曲(monascusruber)、淤泥兩面神菌(janibacterlimonus)、馬杜拉放線菌屬物種(actinomadurasp.)、疣孢菌屬物種(verucosisporasp.)、muscodaralbus和粗糙脈孢菌。
正如本領域技術人員將會理解的，本發(fā)明的許多方面很好地適合于自動化。自動化系統(tǒng)常常由可以實施重復任務的軟件來進行驅動，尤其是當與為組分和試劑流的微量操作而設計的硬件相整合時。因此，根據(jù)本文所描述的各種不同的實施方案，裝配和合成核酸的方法可以在計算機系統(tǒng)上施行。進一步地，根據(jù)本文所描述的各種不同的實施方案，用于裝配和合成核酸的處理器可執(zhí)行的指令。因此，在一些方面，本發(fā)明包括用通過處理器可執(zhí)行的指令進行編碼的、非暫時性的、計算機可讀的存儲介質，其用于產生經(jīng)裝配的核酸分子，所述指令包括用于下列步驟的指令：
(a)合成眾多核酸分子，其中在平板的孔中以微量制備每個核酸分子；
(b)將在(a)中產生的核酸分子進行合并，從而產生匯集物；
(c)將一些或所有存在于在(b)中形成的匯集物中的核酸分子進行連接，從而形成眾多更大的核酸分子；
(d)從在(c)中形成的所述眾多更大的核酸分子中去除包含序列錯誤的核酸分子，從而產生校正了錯誤的核酸分子匯集物；和
(e)將在所述校正了錯誤的核酸分子匯集物中的核酸分子進行裝配，從而形成經(jīng)裝配的核酸分子。
本發(fā)明還包括用于產生經(jīng)裝配的核酸分子的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：
-處理器；和
-用由處理器可執(zhí)行的指令進行編碼的存儲器，所述指令用于下列步驟：
(a)合成眾多核酸分子，其中在平板的孔中以微量制備每個核酸分子；
(b)將在(a)中產生的核酸分子進行合并，從而產生匯集物；
(c)將一些或所有存在于在(b)中形成的匯集物中的核酸分子進行連接，從而形成眾多更大的核酸分子；
(d)從在(c)中形成的所述眾多更大的核酸分子中去除包含序列錯誤的核酸分子，從而產生校正了錯誤的核酸分子匯集物；和
(e)將在所述校正了錯誤的核酸分子匯集物中的核酸分子進行裝配，從而形成經(jīng)裝配的核酸分子。
附圖簡述
圖1是本發(fā)明的工作流程的方面的總體描述。該工作流程被切分為四個部分，為了描述的容易而將這些部分稱作“模塊”。該工作流程在該圖的右側顯示出在本發(fā)明的方法的一些方面中包括的一些特殊步驟。
圖2a-2b是根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的一行孔的示意性圖示?？?中的較暗區(qū)域指明了存在有在給定的時間處在其他孔中不存在的試劑(例如，ega)。
圖3顯示了核酸裝配流程方案。在該圖的底部顯示的經(jīng)裝配的核酸分子上的粗末端表示通過外部引物(也稱為末端引物)而添加的區(qū)域。
圖4顯示了第二種核酸裝配流程方案。具有箭頭的點線顯示了基于pcr的合成方向和區(qū)域。
圖5顯示了通過使用縫合性核酸分子來將兩個不共享有任何同源性的dna片段裝配到載體中。在該圖的下面部分中以粗體顯示的69堿基對雙鏈縫合性核酸分子與每個相鄰片段(片段1和2)共享有30-bp同源性。這些縫合性核酸分子用于在所述相鄰片段的接合點處插入9bp。插入堿基顯示為具有下劃線。
圖6是用于合成最小化了錯誤的核酸分子的示例性過程的流程圖。
圖7是用于合成最小化了錯誤的核酸分子的示例性過程的工作流程圖。雙鏈核酸分子的不同鏈通過較粗和較細的線條來表示?！癿me”是指錯配核酸內切酶。小的圓形物表示序列錯誤。
圖8總體性地圖解說明了用于在酵母中裝配和克隆核酸區(qū)段的方法。在本發(fā)明的一些實施方案中，將許多核酸區(qū)段(其中之一為載體)與片段共轉化到酵母宿主細胞中，在那里它們通過同源重組而裝配形成例如閉合的環(huán)狀核酸分子。
圖9是可以在本發(fā)明的實踐中使用的電線圈的圖畫。
圖10是適合用于本發(fā)明的流體試劑遞送系統(tǒng)的一個實施方案的橫截面視圖。
圖11顯示了通過本發(fā)明的方法產生的線性核酸分子的文庫(上部)和被設計用于接受文庫成員的載體(下部)。該圖的上面部分顯示了代表所述文庫的四個成員的一系列線條。下面的開放環(huán)線表示載體。在所述核酸分子的每個末端處的塊狀物表示促進連接的核酸區(qū)段(例如，
圖12顯示了可以通過本發(fā)明的方法制備的一系列變體核酸分子以及其所編碼的氨基酸序列。圖12a顯示了編碼不同的氨基酸序列的變體核酸分子。圖12b顯示了使用不同的密碼子但編碼相同的氨基酸序列的變體核酸分子。
圖13顯示了用于合成平臺的微孔平板實施方案的兩種不同的流體移除選項。
圖14顯示了被設計用于在每行(1401)中產生相同的核酸分子的核酸分子合成平臺的兩個不同的視圖。圖14a是頂視圖，和圖14b是側視圖。在該圖中顯示了流體通道(1401)，與每個通道相關聯(lián)的兩個電極/行孔(1402)，和一系列包含位于孔中的核酸合成基質(例如，獨個珠粒)的孔(1400)。在一些實施方案中，所述孔將會相隔300μm，并且將會在形狀上是圓柱形的(具有40μm的直徑和35μm的深度)。
圖15是圖解說明計算機系統(tǒng)的方框圖，本教導的實施方案可在所述計算機系統(tǒng)上實施。
圖16是用于施行本發(fā)明的方法的自動化系統(tǒng)的示意圖。
圖17是通道“芯片”的頂視示意圖。
發(fā)明詳述
定義：
固體支持物：如本文中所使用的，術語“固體支持物”是指可以在其上可以合成和/或固定聚合物例如核酸分子的多孔或無孔材料。如本文中所使用的，“多孔(的)”意味著所述材料包含可以具有不均一或均一的直徑(例如在nm范圍內)的孔。多孔材料包括紙張、合成濾紙，等等。在這樣的多孔材料中，反應可以在孔內發(fā)生。固體支持物可以具有許多形狀中的任一種，例如針狀、條狀、片狀、盤狀、棒狀、纖維狀、彎曲狀、圓柱體結構、平面表面、凹或凸表面或者毛細管或柱子。固體支持物可以是顆粒，包括珠粒、微顆粒、納米顆粒等。固體支持物可以是具有類似大小的非珠粒類型的顆粒(例如，纖絲)。支持物可以具有可變的寬度和大小。例如，可以在本發(fā)明的實施中使用的珠粒(例如，磁性珠粒)的大小描述在本文別處。支持物可以是親水的或可能被變成親水的，并且包括無機粉末例如二氧化硅、硫酸鎂和氧化鋁；天然的聚合材料，特別是纖維素材料；和源自纖維素的材料，例如包含纖維的紙張，例如濾紙、色譜紙等。
在一些實施方案中，固體支持物可以是可碎片化的。固體材料可以是合成的或經(jīng)修飾的天然出現(xiàn)的聚合物，例如硝化纖維素、碳、乙酸纖維素、聚氯乙烯、聚丙烯酰胺、交聯(lián)葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚(對苯二甲酸乙二酯)、尼龍、聚(丁酸乙烯酯)、聚偏二氟乙烯(pvdf)膜、玻璃、受控孔徑玻璃、磁性受控孔徑玻璃、磁性珠粒、陶瓷、金屬等；其要么單獨地進行使用，要么與其他材料一同進行使用
在一些實施方案中，支持物可以是芯片、陣列、微陣列或微孔平板形式。在許多情況下，通過本發(fā)明的方法產生的支持物將會是這樣的支持物，在所述支持物中，獨個核酸分子在分開的或不連續(xù)的區(qū)域上合成從而在所述支持物上產生特征部位(features)(即，包含獨個核酸分子的位置)。
在一些實施方案中，選擇所定義的特征部位的大小以允許在所述特征部位上形成微體積小滴或反應體積，其中每個小滴或反應體積互相保持分開。如本文所描述的，特征部位，通常地，但并不需要，被特征部位間(interfeature)空間分開，從而確保小滴或反應體積或者兩個相鄰特征部位之間不融合。通常地，特征部位間空間在其表面上將不攜帶任何核酸分子，并且將會相應于惰性空間。在一些實施方案中，特征部位和特征部位間空間可以因其親水性或疏水性特性而不同。在一些實施方案中，特征部位和特征部位間空間可以包含改性劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述特征部位是孔或微孔或凹槽。
可以將核酸分子共價或非共價地附著至表面或者沉積在表面上。
在本發(fā)明的一個實施方案中，模塊1可以涉及使用多于一個的固體支持物。在一些實施方案中，可以在平板上布置兩個或更多個固體支持物?？梢圆捎霉腆w支持物的任何布置，例如行或列或其組合。例如，行可以是對齊的和/或列可以是對齊的。在其他實施方案中，行和/或列是相等地間隔和交錯的。在行之間和/或在列之間的間距可以是可變的。包含在例如平板中的固體支持物的數(shù)目可以是可變的。在一些實施方案中，平板可以包含多達1536個(或更多個)固體支持物。
核酸分子：如本文中所使用的，術語“核酸分子”是指核苷酸或堿基(例如，核糖核苷酸，對于rna；和脫氧核糖核苷酸，對于dna；但還包括dna/rna雜合體，其中dna在分開的鏈中或在相同的鏈中)的共價連接的序列，其中一個核苷酸的戊糖的3’位置通過磷酸二酯鍵而連接至下一個核苷酸的戊糖的5’位置。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的或者部分雙鏈的。核酸分子可以以線性或環(huán)化形式(在用平頭或粘性末端進行的超螺旋的或松弛的形成中)出現(xiàn)，并且可以包含“切口”。核酸分子可以由完全互補的單鏈或者形成至少一個堿基錯配的部分互補的單鏈組成。核酸分子可以進一步包含兩個自我互補的序列，其可以形成雙鏈莖區(qū)，所述雙鏈莖區(qū)任選地在一個末端處通過環(huán)序列而分開。包含雙鏈莖區(qū)的核酸分子的兩個區(qū)域基本上是相互互補的，這導致自我雜交。然而，莖可以包括一個或多個錯配、插入或缺失。
核酸分子可以包含經(jīng)以化學、酶促或代謝方式進行修飾的形式的核酸分子或其組合。化學合成的核酸分子可以是指長度通常少于或等于150個核苷酸(例如，長度為5至150，10至100，15至50個核苷酸)的核酸，而酶促合成的核酸分子可以包括更小的以及更大的核酸分子(如在本申請中別處所描述的)。核酸分子的酶促合成可以包括使用酶(例如，聚合酶、連接酶、核酸外切酶、核酸內切酶等，或其組合)的分步過程。因此，本發(fā)明部分地提供了涉及化學合成的核酸分子的酶促裝配的組合物和聯(lián)合方法。
核酸分子也指短的核酸分子，其常常被稱為例如引物或探針。引物常常被稱為用于酶促裝配反應的單鏈起動核酸分子，而探針通?？梢杂糜跈z測至少部分互補的核酸分子。核酸分子具有“5’-末端”和“3’-末端”，因為核酸分子磷酸二酯鍵出現(xiàn)在取代的單核苷酸的戊糖環(huán)的5’碳和3’碳之間。在其處新的鍵將會至5’碳的核酸分子的末端為其5’末端核苷酸。在其處新的鍵將會至3’碳的核酸分子的末端為其3’末端核苷酸。如本文中所使用的，末端核苷酸或堿基是在3’-或5’-末端的末端位置處的核苷酸。核酸分子序列，即使在更大的核酸分子的內部(例如，在核酸分子內的序列區(qū)域)，也可以說是具有5’-和3’-末端。
概覽：
本發(fā)明部分地涉及用于制備核酸分子的組合物和方法。盡管本發(fā)明具有許多方面和與之相關的變化形式，但這些方面和變化形式中的一些以概要形式呈現(xiàn)在圖1中。
本發(fā)明的一個優(yōu)點是，對于許多應用，小量的合成的核酸適合于達到所想要的目的(例如，制備微陣列，構建包含選擇標記的質粒，等等)。在一些情況下，小量的核酸適合于用來進行工作，由于諸如酶促的(例如，pcr)和細胞內的擴增之類的因素。
圖1的左側顯示了四個總的“模塊”，其代表了本發(fā)明的一些實施方案的不同部分。這樣，在一些方面，本發(fā)明涉及下列中的一個或多個：(1)核酸分子合成，(2)核酸分子的匯集，(3)眾多核酸分子的裝配，和/或(4)經(jīng)裝配的核酸的轉移(例如，轉移至細胞)。
關于本發(fā)明的更特別的實施方案，圖1的右側顯示了與在該圖的左側中所顯示的模塊相關的額外細節(jié)。在許多文本塊上方是以粗體表示的術語，例如“酶促的”和“細胞的”。這些術語指明了示例性的一般性手段，通過所述手段可以施行所提及的過程。正如本領域技術人員將會理解的，一些過程可以例如以化學方式、以酶促方式或在細胞中來施行。
如在圖1中所顯示的，模塊1是指被稱為“微量平行核酸分子合成”的單個過程。如在本文別處所陳述的，該過程通常將會涉及幾個步驟，這些步驟將會隨如何實施該過程而變化。在許多實施方案中，模塊1的總體功能將會是產生眾多核酸分子?？梢詫⑦@些核酸分子作為組進行設計，該組待進行連接從而形成一個或多個更大的核酸分子或當與另外的核酸分子(例如，“縫合性核酸分子”)相接觸時形成一個或多個更大的核酸分子。
如在圖1中所顯示的，模塊2是指被稱為“固體支持物的匯集”、“核酸分子切割”和“去保護”的過程。模塊2的總體功能將會是制備用于參與一個或多個在模塊3中所指出的過程的核酸分子。這常常將會意味將在序列上不同的核酸分子進行合并，并且去除對于實施一個或多個在模塊3中所指出的過程來說非必需的或不希望的任何化學基團。
使用模塊2作為例子，正如本領域技術人員將會認識到的，圖1顯示了本發(fā)明的一般性實施方案。更特別地，模塊2是指固體支持物的匯集。這些支持物通常將會包含核酸分子。在一些實施方案中，可以以沒有固體支持物的形式獲得核酸分子，然后進行匯集。
如在圖1中所顯示的，模塊3是指被稱為“片段擴增和裝配”、“錯誤校正”和“最終的裝配”的過程。模塊3的過程的總體功能是產生與所尋求產生的核酸分子的序列相比較而言具有高的序列保真度的經(jīng)裝配的核酸分子。
如在圖1中所顯示的，模塊4是指被稱為“受者細胞插入”的過程。正如本領域技術人員將會理解的，將通過本發(fā)明的方法產生的核酸分子引入到細胞中僅是一種應用。在大多數(shù)情況下，根據(jù)本發(fā)明的方法進行裝配的核酸分子將會被設計用于特殊的應用。應用廣泛地變化，并且包括生物燃料生產、生物除污和化學前體生產。
在一些實施方案中，可以使用具有聚乙烯基骨架的包含氨基基團的支持基體作為固體支持物。例如，可以在本發(fā)明的實踐中使用通過在u.s.專利號6,335,438(其公開內容通過提及而并入本文)中所描述的方法而獲得的單分散顆粒。
模塊1
在本發(fā)明中，可以將核酸分子附著至固體支持物，例如顆?；蛑榱?例如，受控孔徑玻璃珠)。在一個實施方案中，使用磁性微珠粒作為固體支持物。在許多情況下，可以在本發(fā)明中使用具有大的“表面/體積”比的單活化的多孔的1μm大小微珠粒。這樣的單分散顆粒的均一性質通常提供了均一的反應速率，這特別適合于在自動化學合成儀(例如，核酸分子合成儀)中的合成。最初，可以給珠粒提供反應性基團。例如，在本發(fā)明的一些實施方案中，可以使用
磁性珠粒技術描述在u.s.專利號5,512,439(其在此通過提及而并入本文)中。
除了由cpg或磁性材料組成的那些之外的其他合成基質也可以用于本發(fā)明，并且包括由聚苯乙烯(例如，聚苯乙烯-1％二乙烯基苯、大孔聚苯乙烯和聚(乙二醇)-聚苯乙烯(peg-ps))、聚酰胺(例如，聚酰胺粘合的硅膠)、硅膠和纖維素組成的那些。這些基質中的一些可以樹脂形式得到。在許多情況下，可以將為樹脂的基質置于孔中(代替珠粒或與珠粒一同)，并且可以用于核酸合成。
本領域已知其他的核酸連接方法，以及采用它們的陣列。例如，已知使用經(jīng)氨或過氧化物(其朝向醚橋)活化的表面的方法。如本文別處所指明的，對于本領域中的ega方法，已描述了羥基基團并將其用于將核酸連接至二氧化硅磁性珠粒表面。本發(fā)明包括這樣的連接方法和包含它們的組合物。
在一些情況下，也可能希望使用具有凝膠樣或粘性稠度或基體的半固體支持物以代替固體支持物。本發(fā)明考慮了這點，并且在合適的情況下，在此當提及固體支持物時，可以使用非固體支持物。
決定可以合成的核酸的量的因素包括，在其上發(fā)生合成的顆粒的表面面積和大小。因此，在某種程度上，可以調整支持物(例如，珠粒)參數(shù)以改變所合成的核酸的量?？稍诒景l(fā)明的實踐中使用的珠粒可以在大小方面廣泛地變化，包括下列大小范圍：平均直徑為大約0.01μm至大約1,000μm、大約0.1μm至大約1,000μm、大約1.0μm至大約1,000μm、大約0.01μm至大約400μm、大約0.01μm至大約200μm、大約0.01μm至大約100μm、大約0.1μm至大約100μm、大約0.1μm至大約50μm、大約1.0μm至大約600μm、大約1.0μm至大約400μm、大約1.0μm至大約200μm、大約1.0μm至大約100μm、大約2.0μm至大約400μm、大約2.0μm至大約200μm、大約5.0μm至大約500μm，等等。
進一步地，可以使用這樣的珠粒，其允許以下列量的待產生的核酸的平均量：大約0.001納摩爾至大約1,000納摩爾、大約0.1納摩爾至大約1,000納摩爾、大約1.0納摩爾至大約1,000納摩爾、大約5.0納摩爾至大約1,000納摩爾、大約10納摩爾至大約1,000納摩爾、大約30納摩爾至大約1,000納摩爾、大約50納摩爾至大約1,000納摩爾、大約200納摩爾至大約1,000納摩爾、大約1.0納摩爾至大約500納摩爾、大約1.0納摩爾至大約250納摩爾、大約10納摩爾至大約500納摩爾，等等。
在許多情況下，一旦已達到某個大小，化學合成的核酸分子的產量就下降。在本發(fā)明的許多實施方案中，化學合成的核酸分子將會處于下列范圍內：大約8至大約100個核苷酸、大約8至大約35個核苷酸、大約8至大約40個核苷酸、大約8至大約50個核苷酸、大約8至大約100個核苷酸、大約15至大約100個核苷酸、大約15至大約75個核苷酸、大約15至大約50個核苷酸、大約20至大約60個核苷酸、大約40至大約400個核苷酸、大約40至大約300個核苷酸、大約40至大約200個核苷酸、大約40至大約100個核苷酸、大約40至大約90個核苷酸、大約50至大約400個核苷酸、大約50至大約300個核苷酸、大約50至大約200個核苷酸、大約50至大約100個核苷酸、大約50至大約90個核苷酸、大約50至大約80個核苷酸、大約75至大約400個核苷酸、大約75至大約300個核苷酸或大約75至大約200個核苷酸。
正如本領域技術人員將會認識到的，需要產生的核酸的量將會隨例如應用和所使用的裝配方法的效率而變化。當產生可復制的分子(例如，通過pcr，插入到細胞中，等等)時，需要產生理論上僅一個經(jīng)裝配的核酸分子。如果所產生的核酸分子的數(shù)目降低到其中產生理論上僅一個完全經(jīng)裝配的核酸分子這樣的點，那么一半時間將會沒有完全經(jīng)裝配的核酸分子產生。因此，對于待使用本發(fā)明的方法來產生的核酸的量來說的一個下限基于可以產生的完全經(jīng)裝配的核酸分子的數(shù)目。該數(shù)目常常將會隨必須進行合并以形成最終構建體的合成的核酸分子的數(shù)目而變化。典型地，本發(fā)明的方法將會被設計成產生下列數(shù)目的經(jīng)裝配的核酸分子：大約1至大約500,000、大約10至大約500,000、大約100至大約500,000、大約500至大約500,000、大約1至大約1,000、大約1至大約500、大約10至大約1,000、大約10至大約500、大約100至大約1,000、大約100至大約500、大約100至大約5,000、大約100至大約50,000、大約100至大約250,000、大約1,000至大約50,000，等等。
正如本領域技術人員將會理解的，核酸合成基質面積直接反映了可以在那基質上合成的核酸分子的數(shù)目。下面的表2顯示了珠粒大小、表面面積計算值和估計的可以在指定的珠粒上產生的核酸分子的數(shù)目。
在一些實施方案中，將會在平板中使用2.8μm珠粒來進行寡核苷酸合成，其中每個孔一個珠粒。進一步地，可以將孔設計為4μm和3μm深的圓柱形的洞或小室。當使用100μm的孔間距時，10mm2芯片可以容納10,000個孔。在許多情況下，當通過蝕刻來制備平板時，孔將會具有非圓柱狀的形狀，并且可能是棱錐狀、圓錐狀或四方形狀的。在一些情況下，孔可以是以顛倒的、截短的圓錐狀的形狀。
所產生的獨個核酸分子的數(shù)目還將會隨應用而變化。盡管可以通過試劑使用減少來達到節(jié)約成本，但是通常將會希望產生對于例如有效裝配來說所需的足夠的核酸分子。進一步地，所產生的具有特定核苷酸序列的核酸分子的數(shù)目通常將會反映出合成基質的“攜帶能力”。例如，典型地，30微米的珠?？梢杂糜诋a生大約1,000,000個核酸分子。例如，在許多情況下，當珠粒大小降低時，那么在每個珠粒上可以產生的核酸分子的數(shù)目將會降低。
本發(fā)明的方法可以用于產生下列數(shù)目的被設計成具有相同核苷酸序列的核酸分子：大約100至大約20,000,000、大約1,000至大約20,000,000、大約10,000至大約20,000,000、大約100至大約5,000,000、大約1,000至大約5,000,000、大約10,000至大約5,000,000、大約100至大約1,000,000、大約1,000至大約1,000,000、大約10,000至大約10,000,000、大約100至大約500,000、大約1,000至大約500,000、大約10,000至大約500,000，等等。
核酸分子合成位點(例如，孔)的數(shù)目可以很大地變化，并且將會由許多因素決定，所述因素包括：(1)工程和核酸分子合成硬件的限制；和(2)所希望的核酸的量(參見本文別處對于該因素的討論)。例如，在本發(fā)明的實施中所使用的合成平臺中核酸分子合成位點(例如，孔)的數(shù)目可以在下列總數(shù)范圍內變化：9至200,000、9至100,000、9至20,000、9至1,000、9至500、1,000至200,000、1,000至400,000、1,000至500,000、1,000至1,00,000、1,000至10,000,000、20,000至1,000,000、50,000至10,000,000、10,000至5,000,000、1,000至100,000、2,000至100,000、5,000至100,000、10,000至100,000、20,000至100,000、30,000至100,000、1,000至80,000、1,000至70,000、1,000至50,000、1,000至40,000、1,000至30,000、1,000至20,000、1,000至10,000、1,000至8,000、1,000至5,000、5,000至50,000、10,000至50,000、5,000至35,000，等等。另外，每mm2的核酸分子合成位點(例如，孔)的數(shù)目可以在下列范圍內變化：1,000至5,000、1,000至10,000、1,000至20,000、1,000至30,000、2,000至5,000、2,000至10,000、4,000至15,000、100至1,000、100至3,000、100至5,000、250至5,000，等等。
每個核酸分子合成位點(例如，孔)的試劑空間的量將會隨孔的大小和形狀，特別是能夠接受試劑的空間的面積而變化。這將會隨諸如下列的因素而變化：核酸分子合成位點是否是平坦的表面(例如，依賴于保持試劑位于合成位點或空穴(例如，孔)之上的表面張力)。此外，所應用的試劑的量可以由對于覆蓋合成位點，遞送必需量的反應物，和/或稀釋、移除或洗去在合成位點處存在的試劑來說所需的試劑的量來決定。所應用的試劑的量(當所述試劑為液體時)和在合成位點處的試劑空間的量可以很大地變化，包括0.001×10-15l(飛升)至100μl、0.01×10-15l(飛升)至100μl、0.1×10-15l(飛升)至100μl、1.0×10-15l(飛升)至100μl、0.1×10-15l(飛升)至1μl、0.1×10-15l(飛升)至500nl、0.1×10-15l(飛升)至100nl、0.1×10-15l(飛升)至1nl、0.1×10-15l(飛升)至500pl(皮升)、0.1×10-15l(飛升)至100pl、0.1×10-15l(飛升)至10pl、0.1×10-15l(飛升)至1pl、0.001×10-15l(飛升)至1pl、0.001×10-15l(飛升)至1.0×10-15l(飛升)、0.001×10-15l(飛升)至100×10-15l(飛升)、1.0×10-15l(飛升)至500×10-15l(飛升)，等等。
為了制備適合于核酸分子合成的固體支持物材料，可以將非核苷連接體或核苷琥珀酸酯共價附著至反應性氨基基團。然而，如果需要，可以使用其他表面官能團(例如，羧基)來附著攜帶羥基基團或備選地3’-附著的核苷酸的連接體。
連接體，當存在時，可以是將核酸分子的3’-o附著至固體支持物的化學實體(例如，固體支持物上的官能團)。在大多數(shù)情況下，連接體對于在核酸分子合成過程中所使用的所有試劑將會是穩(wěn)定的，但在合成過程結束時在特定的條件下是可切割的。在核酸分子合成中通常使用的一個連接體是琥珀?；B接體。具有不同特性的不同的連接體是本領域技術人員已知的，并且可以由技術人員依據(jù)下游過程要求來進行選擇。
在核酸分子合成中廣泛地使用核苷固體支持物(例如，用堿基預衍生化的支持物)。這樣的支持物的一個例子是其中3’-末端核苷殘基的3’-羥基基團通過3’-o-琥珀?；鄱街凉腆w支持物的支持物。核苷固體支持物的使用需要使用不同類型的珠粒(對于每個堿基一個)。然而，核苷固體支持物必須以序列特異性方式進行選擇(按照對于每個核酸分子所需的第一個堿基)的事實降低了整個合成過程的通量，這歸因于附著至特定起動堿基的珠粒的費力的預選擇和至獨個微孔的分配。
更方便的用于合成的方法用其中將非核苷連接體附著至固體支持物材料的通用支持物來開始。該方法的優(yōu)點是，可以使用相同的固體支持物，而不論待合成的核酸分子的序列為何?？梢栽诒景l(fā)明中使用的通用支持物的一個例子描述在u.s.專利號7,202,264(其公開內容通過提及而并入本文)中。然而，本領域技術人員已知的其他通用連接體可以同樣適合于實施本發(fā)明。為了從經(jīng)裝配的核酸分子上完全去除連接體和3’-末端磷酸，本領域中已知的通用固體支持物中的一些需要氣態(tài)氨、含水氫氧化銨、含水甲胺或其混合物。
已知許多用于合成核酸的方法。這些方法中的許多遵循一系列基本步驟，例如下列的那些，具有使用例如乙腈、乙酸乙酯或其他適合于實踐本發(fā)明的洗滌試劑來進行的合適的洗滌步驟：
a)將第一個核苷酸(其已在5’位置處進行了保護)衍生化至固體支持物(通常是受控孔徑玻璃(cpg))上，或者以預衍生化的形式獲得；
b)使用例如在二氯甲烷中的三氯乙酸來使第一個核苷酸的糖基團去保護(例如，通過脫三苯甲基作用)(常常被稱為“去保護”的過程)，其導致可以就反應進程而進行監(jiān)測的有色產物；
c)將第二個核苷酸(其具有經(jīng)保護的磷、糖和堿基基團)添加至正在生長的鏈，通常在催化劑例如四唑或4,5-二氰基咪唑存在下(常常被稱為“偶聯(lián)”的過程)；
d)使用例如乙酸酐和n-甲基咪唑來給未反應的第一個核苷酸加帽以避免缺失積累(常常被稱為“加帽”的過程)；
e)通常使用例如碘試劑來將亞磷酸三酯氧化以形成更穩(wěn)定的磷酸三酯(常常被稱為“氧化”的過程)；
f)取決于所希望的核酸分子長度，在需要時，重復該過程；和
g)通常在升高的溫度下使用氨水或氣態(tài)氨來進行從固體支持物上的切割。本領域技術人員將會認識到，在本發(fā)明的某些實施方案中，步驟的順序可以變化，或者一些步驟(包括洗滌步驟)可以根據(jù)所使用的實驗方案在適當時進行重復。
在本發(fā)明中，亞磷酰胺合成化學這一技術的狀態(tài)通過修飾上面實驗方案的特定步驟而進一步得到改進。在一個實施方案中，可以使用有機催化劑來改善例如偶聯(lián)步驟的效率。有機催化劑和此類催化劑的一些用途陳述在avenier和hollfelder,combiningmediumeffectsandcofactorcatalysis:metal-coordinatedsynzymesacceleratephosphatetransferby108chem.eur.j.15:12371-12380(2009)，和jordan等人,asymmetricphosphorylationthroughcatalyticp(iii)phosphoramiditetransfer:enantioselectivesynthesisofd-myo-inositol-6-phosphate,proc.nat.acad.sci.usa,107:20620-20624(2010)中。
在一些實施方案中，本發(fā)明利用了通過產生以電化學方式產生的酸(ega)的局部化學反應。作為例子，可尋址的電信號可用于以允許二甲氧基三苯甲基(dmt)保護基團從表面上去保護的足夠濃度產生酸(maurer等人,“electrochemicallygeneratedacidanditscontainmentto100micronreactionareasfortheproductionofdnamicroarrays”plos,第1期,e34(2006年12月))。
關于作為在表面(例如，微表面)上的核酸分子合成實驗方案的一部分的ega產生的一個問題是“濺出”至相鄰區(qū)域?！盀R出”(其包括擴散)可以導致在非計劃中的位置處出現(xiàn)的反應(例如，由于ega擴散而引起的)。盡管當一個反應發(fā)生時此類效應可能是相當?shù)匦〉?，但是當多個反應相繼地發(fā)生時，多個反應循環(huán)的“濺出”效應可以導致許多錯摻入的堿基。該問題可以以幾種方式來解決。一種方式是用足夠中和所述酸的緩沖液(例如，包含有機堿的緩沖液)覆蓋反應區(qū)域，如果它移動自局部環(huán)境。另一種方式是通過物理封閉或區(qū)室化。例如，如果ega在孔中產生并在那個孔中催化反應，那么所述孔可以具有足夠的大小以防止酸出來。因此，封閉在孔內是孔的大小和所產生的酸的量的一個因素。在一些反應形式中，一些酸將會總是跑出到孔外。這應當不是問題，除非足夠催化反應的數(shù)量到達了其中未設想發(fā)生反應的另一個孔中。如上面所指明的，可以采用使用覆蓋緩沖液來使此類反應最小化。
在本發(fā)明的實踐中可以使用的平板包括在u.s.專利公開號2010/0137143a1(其公開內容通過提及而并入本文，并且顯示了這樣的代表性平板形式)中所描述的平板的改進形式。
圖2a-2b是根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的一行孔(200)的示意性圖示。圖2a-2b的實施方案圖解說明了五個孔，每個孔在底部包含磁性珠粒(201)。在每個孔之下是電極(202)，其可以遞送電流至與其相關聯(lián)的孔。每個電極與調節(jié)至該電極的電流的電流控制器(203)相連通。磁性珠?？梢园c初始構件塊相關聯(lián)的連接體。作為例子，珠粒可以包含第一個核苷酸(具有a、t、c、g或u堿基，或者經(jīng)修飾的堿基，取決于在待合成的核酸分子中所希望的第一個堿基)。第一個堿基可以作為合成過程的一部分進行添加(例如，用具有經(jīng)保護的羥基基團的珠粒)或者可以在插入孔中之前進行預衍生化。在任一個事件中，在大多數(shù)情況下，保護基團將會存在(例如，在5’位置處)，其必須在可以作為核酸分子鏈的一部分共價地連接另一個堿基之前去除。
可以包括微觀流體通道(未在圖2a中顯示)用于從孔中有效地添加和移除試劑。因此，部分地，本發(fā)明包括微觀流體平板，其被設計成與用于從平板的孔中添加和移除流體的微觀流體系統(tǒng)相交接。在相似的平板中使用的微觀流體通道描述在u.s.專利公開號2010/0137143a1(其公開內容通過提及而并入本文作為背景信息)中。
在圖2a中所顯示的平板的蓋子(204)包含對準的電極，其連接至電流控制器。在該蓋子中可以包括更大的的電極(例如，延伸出所有孔的頂部的電極)以“閉合該電路”。因此，所述蓋子可以包含一個與每個對于其尋求進行電化學反應的孔對準的電極，一個與平板的所有孔可操作地連接的電極，或多個其中的一些或所有與兩個或更多個孔可操作地連接的電極。在一個備選的實施方案中，將關于每個孔的蓋子電極用一個或多個沿著每個孔的一個或多個側壁嵌入或放置的電極替代。因此，將電極放置在蓋子中不是關鍵的。事實上，在許多情況下，將會希望的是(例如，易于制造)，將電極置于除了蓋子之外的其他地方。
還可以包括參考電極(re)(205)以提供穩(wěn)定的且預先確定的電位。為了在工作電極(we)上施加特定的電位，可以測量針對re的電位而言的we的電位。下一步，可以調節(jié)在反電極(ce)和we之間的電位直至在re和ce之間的電位具有正確的值。
一種用于去保護的方法可以采用在we上將氫醌氧化成苯醌(氧化還原系統(tǒng))以便產生質子。為了在孔中設置特定的ph，可以在指定的時間段內施加恒定的電流。在不太活潑的we的情況下，將會出現(xiàn)we電位的強烈增加。這可以導致非計劃中的反應(例如，在高電位下，溶劑的氧化或we材料的損壞)。為了避免該效應，可以控制we的電位。
電流控制器(可互換地，控制器)可以是微處理器或處理器，例如在圖15中所顯示的。控制器(未顯示)可以包含常規(guī)的電流控制系統(tǒng)，包括例如與存儲電路相連通的微處理器電路。存儲電路可以包括用于指導微處理器電路給一個或多個所述電極供能(例如，給與孔1或眾多孔相關聯(lián)的電極供能)的指令。任選地，存儲電路可以包括用于激活一對電極之一(例如，激活與孔1相關聯(lián)的底部電極)的指令。在另外一個實施方案中，存儲電路可以包括用于逐步地增加/降低對于電極的偏壓以便減少在孔中的突然電涌的可能性的指令。
在另一個實施方案中，電流控制器與外部處理器電路例如恒電位器電路、輸入/輸出(“i/o”)設備和顯示器相連通。所述電路或電路板使裝置的控制成為可能，并且還可以用于與其他設備(例如，pc、ipad等)相連通。
在圖2a的實施方案的變化形式中，可以將兩個電極(正極和負極)放置在孔的底部。這允許電流在孔的底部附近產生，由此在緊鄰珠粒的區(qū)域中產生局部化的ega。取決于通過其將試劑添加至孔和/或從孔中移除的方法和其他因素，可以使用這樣的構造來限制孔之間的串擾、干擾或非計劃中的ega污染。
在圖2b中顯示了一個相關的實施方案。在此，蓋子包含對準的電極(205)，其延伸入孔的試劑部分中。將排液管(206)置于每個孔的底部。這些排液管提供數(shù)種功能。一種功能是在化學反應步驟(例如，堿基添加、洗滌、去保護等)完成時移除試劑。另一種功能是降低用于去保護步驟的流體水平。換言之，可以將流體添加至所有孔，然后可以在給孔加偏壓之前通過排液管降低流體水平。降低孔的流體水平減少了孔之間的交叉溢出并增加了合成保真度。降低的流體水平還降低了電位串擾和相鄰孔之間的污染。這也適用于通過孔的瓶形體的一般性流體移除。這是如此的，因為ega的孔間交叉污染可以導致不正確的堿基摻入。甚至由ega所產生的堿基錯摻入以在相鄰的孔中正被合成的核酸分子的0.5％出現(xiàn)，凈結果粗略地可以是堿基錯摻入的加倍。因此，拉低孔中的流體水平和孔底部排液導致增加的合成保真度。
用于從孔中移除流體的一種手段是從孔的頂部。這可以通過許多手段來進行，包括使用移液管尖端或引入吸收材料。在任一種情況下，目標將會是從每個孔中移除足夠的流體以使“濺出”最小化。在一些情況下，唯一的其中流體水平將會被降低的孔將會是經(jīng)歷反應(例如，ega的產生，導致去保護)的那些。換言之，流體水平降低可以僅在其中產生一種或多種反應物的孔中施行。
孔的建造可以通過常規(guī)的制造方法來完成，包括例如cmos和vlsi技術?？梢栽诎雽w或聚合物基質中形成孔。在一個示例性的實施方案中，通過使用常規(guī)的蝕刻和鉆孔技術在半導體基質中使孔成形?？椎膬缺砻婵梢杂媒^緣材料進行包被以減少相鄰孔之間的串擾。在隨之而推論出的實施方案中，可以包被孔表面以增加傳導性，由此更均一地產生ega?？妆砻婵梢杂貌煌膶舆M行包被以減少串擾，而同時增加孔內的導電性和導熱性。因此，壁可以包含不同材料的復合物，其在減少孔之間的串擾同時，將會增加每個孔內的傳導性以用于快速的ega產生。
還可以包被孔的頂部表面(相鄰孔之間的跨距)以提供試劑排斥表面。作為例子，可以用疏水性組合物包被頂部表面以抵制交叉污染。用于減少孔至孔的交叉污染的方法陳述在u.s.專利號6,444,111(其公開內容通過提及而并入本文)中。
最后，可以將孔的形狀塑造成用于減少交叉污染，而同時增加反應速度。例如，可以可以將孔塑造成具有圓柱狀、桶狀或圓錐狀的形狀。
在使用例如圖2a-2b的平板構造的許多方法中，第一個核苷酸的糖基團通過激活(激發(fā))由電信號(或脈沖)起動的化學反應來去保護。如在本文別處所指明的，用于做此事的一種方法是通過產生以電化學方式產生的酸(ega)。在許多情況下，將會希望的是控制所制備的化學反應物(例如，ega)的量，以便有效地催化去保護反應，而同時限制反應物交叉污染的可能性。
圖17顯示了具有三個電極的通道芯片設計的頂視圖。反電極元件(1700)和(1702)位于兩個側通道的頂部并且越過流動通道(1701)的底部。還存在有圍繞具有工作電極(1704)的兩個孔的參考電極(1703)。
為了限制質子流，可以采取一系列步驟，包括：(1)使用在少量質子存在下防止顯著的ph移動的緩沖液，(2)使用醌氧化還原系統(tǒng)，和(3)設計孔和通道的尺寸以保持它們之間的實質的距離(例如，使用為通道體積的1/150的孔體積)。
例如，為了舉例說明的目的使用圖17中所顯示的示意圖，工作電極(1704)與反電極元件(1700)和(1702)之間的距離可以是大約200μm。進一步地，可以使用通過堿基分子攔截質子來降低到達其他孔的質子的數(shù)目。此外，還可以使用在具有與反電極元件(1700)和(1702)相同的電位的孔之間的參考電極條(1703)來產生堿基分子，和進一步可以防止質子“串擾”。除了本文所陳述的其他方法之外，諸如這些的方法和組分提供了高保真度核酸分子合成。
為了舉例說明的目的，可以將經(jīng)預衍生化的珠粒(例如，磁性珠粒)置于圖2a-2b的孔1至5中，其中在孔1和5中為“a”珠粒，在孔2中為“c’珠粒，在孔3中為“u”珠粒，和在孔4中為“g”珠粒。然后，可以給所有五個孔填充以ega試劑(例如，包含甲醇、乙腈、氫醌、蒽醌、對甲苯磺酸四乙銨和2,6-盧剔啶的試劑)。待添加至鏈上的的下一個堿基是g，并且在位置2處包含g的待產生的分子的唯一的核酸分子在孔1中。因此，僅對孔1施加電流。該電流產生了酸性微環(huán)境，其導致僅在孔1中核苷酸的5’位置的去保護。在固定的(或可變的)反應時間后，洗滌所有五個孔。在催化劑(例如，四唑催化劑)存在下，向所有的所述孔添加具有磷、糖和堿基(在該情況下，t)的核苷酸。在預先確定的反應時間后，洗滌所有五個孔，并且可以通過使用例如乙酸酐和n-甲基咪唑來給未反應的第一個核苷酸加帽以避免缺失的積累。再次，在預定的反應時間后，洗滌所有五個孔，并且可以通過使用例如含碘的試劑來氧化經(jīng)化學反應而形成的亞磷酸三酯以形成更穩(wěn)定的磷酸三酯。然后，重復該過程直至已添加上了該核酸分子的最終的堿基。之后，可以從固體支持物上切割下合成的核酸分子。這可以例如通過使用氨水或氣態(tài)氨在加熱下來進行。但是，切割方法可以隨著諸如所使用的連接體之類的因素而變化。
給每個孔施加的電流的量和其持續(xù)時間將會隨諸如待產生的試劑的量和孔的大小之類的參數(shù)而變化。所施加的電流可以是具有變化的形狀和/或幅度的脈沖。所述脈沖可以限定一系列具有變化的振幅或逐漸增加/減小的振幅的脈沖(頻率)?？梢哉{整所述脈沖的振幅和持續(xù)時間以為了試劑的最佳產生。作為例子，可以調整施加至孔的電流一個特定的時間段，以產生特定的ega量。意欲產生的ega的量將會通常地至少足以完全催化所存在的核酸分子的去保護。
在本發(fā)明的一些方面，可以采用“電潤濕(electrowetting)”。其中電潤濕可以是特別有用的本發(fā)明的兩個方面是為了混合用于(1)核酸合成和匯集(模塊1和2)以及(2)裝配(模塊3)的試劑。
簡而言之，電潤濕涉及使用電壓來改變在固體表面上的液體的表面張力?？梢愿淖冸妶?例如，交流的或直流的)的施加，流體和表面之間的接觸角。例如，通過施加電壓，疏水表面的潤濕特性可以變成漸增地親水的并因此是可潤濕的。電潤濕原理基于在包含電極陣列的表面上操縱小滴和使用電壓來改變界面張力。在一些實施方案中，電極陣列不與流體直接接觸。在另外的實施方案中，可以如此布置電極陣列，從而所述支持物具有親水側和疏水側。受電壓影響的小滴將會移向親水側。在一些實施方案中，電極的陣列或圖式可以是高密度圖式。當與亞磷酰胺化學(以及其他試劑)一同使用時，電極陣列應當能夠移動1pl(和更小)至10pl的小滴體積。因此，本發(fā)明的方面涉及高電壓互補半導體微觀流體控制器。在一些實施方案中，高電壓互補半導體設備(hv-cmos)具有有著高密度電極圖式和高電壓電子器件的集成電路。在一些實施方案中，所施加的電壓為15v至30v。電潤濕方法陳述在u.s.專利公開號2012/0220497a1(其公開內容通過提及而并入本文)中。
通過使用電壓，電潤濕進行工作從而改變液滴的形狀。在一些情況下，電潤濕涉及被置于包被有電介質的電極上的固著的液滴。當施加電流時，所述液滴變平并流出至旁側，因此使另外的表面潤濕。當移除電流時，所述液滴復原至其原始形狀并且從在電流施加時所覆蓋的區(qū)域縮回。電潤濕陳述在處于下面的url處的論文中：http://www.ll.mit.edu/publications/journal/pdf/vol17_no2/17_2_4berry.pdf。
在本發(fā)明的一些實施方案中，核酸合成位點可以具有鄰近其的一系列試劑，所述一系列試劑在當向正確的試劑位置施加電流時流入和退出合成位點。因此，本發(fā)明包括用于合成核酸分子的方法，該方法通過經(jīng)從鄰近的試劑加上和移除電流而誘導的從合成位點處的試劑的添加和移除。在一些情況下，鄰近核酸合成位點的試劑的數(shù)目可以為大約2至大約10、大約3至大約10、大約4至大約10、大約5至大約10、大約6至大約10，等等。
電潤濕方法也可以用于片段裝配和錯誤校正(模塊3)。因此，本發(fā)明包括用于通過使用電潤濕來混合試劑以為了核酸分子的裝配和錯誤校正的方法。在本發(fā)明的這些方面可以與核酸分子相接觸的試劑包括核酸外切酶、錯配修復核酸內切酶(mme)、連接酶、緩沖液、edta溶液等。
關于電潤濕方法的一個問題是“濺出”，其可以在混合區(qū)域之間發(fā)生，并且還因為，在許多情況下，使用了平面的或半平面的表面。因此，除非采用微觀流體排液通道等，否則在試劑變換過程中存在混合區(qū)域的“濺出”污染的可能性。
用于使該混合最小化的兩種手段是通過使用微觀流體通道和屏障?？梢苑胖闷琳?例如，物理屏障，例如高起的區(qū)域)以防止試劑從一個混合區(qū)域移動至另一個混合區(qū)域。在所希望的反應結束后，移除屏障。不同的反應可以在混合區(qū)域的不同的和/或重疊的亞組處順次地進行。
如上面所提及的，核酸合成的方法可以在根據(jù)本文所描述的各種不同實施方案的系統(tǒng)中通過處理器或計算機系統(tǒng)(例如，圖15中所描繪的示例性計算機系統(tǒng))來實施和進行控制。例如，根據(jù)本教導的各種不同的實施方案，向所選擇的孔施加電流(脈沖或連續(xù)波)從而產生特定數(shù)量的ega以完全催化去保護可以通過執(zhí)行處理器可執(zhí)行的指令的計算機系統(tǒng)來控制。
通過使用氧化還原系統(tǒng)還可以發(fā)生解封閉(deblocking)。此類系統(tǒng)的例子包括氫醌/蒽醌；ph緩沖液例如2,6-盧剔啶，用于減少在活動的孔和不活動的鄰近孔之間的質子串擾。
核酸分子的有效產生可能要求，使核酸合成步驟適應于正在構建的分子?？紤]了被設計用于構建具有60/40的cg/at比的病毒基因組的核酸分子的構建的例子。這樣的基因組的核酸分子構件塊將會不變地具有比a和t更多的c和g。在這樣的情況下，可以希望具有比a和t更多的添加c和g的反應。作為例子，堿基添加的順序可以是atcgcatgcg的重復。因此，本發(fā)明進一步地包括適應于指定的核酸分子的有效產生的化學合成方法。在一個方面，這需要在化學合成過程中以反映或緊密地接近在那些核酸分子中的堿基流行率的方式將堿基添加至核酸分子。
本發(fā)明包括例如，導致核酸分子的高保真度的微量產生的方法。因此，本發(fā)明包括這樣的方法，通過所述方法以下列參數(shù)產生核酸分子：以1個堿基/100至1個堿基/500的平均的堿基錯摻入數(shù)目，產生1×105至1.5×109個拷貝的核酸分子。本發(fā)明包括具有在表3中所展示的參數(shù)的類似方法。
根據(jù)本發(fā)明制備和使用的核酸分子可以包含經(jīng)修飾的核酸分子，包括鎖定核酸(lna)、肽核酸(pna)等。pna是聚酰胺類型的dna類似物，并且關于a、g、t、u和c的單體單元是商購可得的。此外，本發(fā)明的核酸分子可以包含一個或多個經(jīng)修飾的堿基，所述經(jīng)修飾的堿基選自但不限于下列：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-d-半乳糖基辮苷、肌苷、n6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、n6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、8-氮鳥嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-d-甘露糖基辮苷、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-n6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸、wybutoxosine、假尿嘧啶、辮苷、肌苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲基酯、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-n-2-羧丙基)尿嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。后面的那種經(jīng)修飾的堿基在當與dt進行堿基配對時可以形成三個氫鍵，并且可以增加短核酸分子的tm差不多1-2℃/插入。但是，該效應是復雜的并且取決于序列背景。
在核酸分子中，2-氨基嘌呤可以替代da。它是天然地發(fā)熒光的堿基，其對于局部環(huán)境敏感，這使得它對于監(jiān)測dna發(fā)夾的結構和動力學和對于檢測雙鏈體的堿基堆疊狀態(tài)是有用的。2-氨基嘌呤可以是致去穩(wěn)定化的并且稍微降低tm。5-溴-脫氧尿苷是光反應性鹵代堿基，其可以摻入到核酸分子中以在暴露于uv光的情況下將所述核酸分子交聯(lián)至dna、rna或蛋白質。在核酸分子的3’-末端處可以摻入其他經(jīng)修飾的堿基例如反向的dt，這導致3’-3’連接，其抑制通過3’核酸外切酶進行的降解和通過dna聚合酶進行的延伸。在本發(fā)明的另一個實施方案中，可以在核酸分子的5’末端處放置反向的雙脫氧-t以防止不希望的5’連接?？梢允褂秒p脫氧-c(ddc)3’鏈終止劑來防止通過dna聚合酶進行的3’延伸。當5-甲基-脫氧-c替代dc時，將會增加tm差不多0.5℃/插入。在一個實施方案中，可以使用天然出現(xiàn)的堿基脫氧肌苷，其致去穩(wěn)定化效應比牽涉四種標準堿基的錯配更小。因此，本發(fā)明部分地提供了涉及合成具有新特性和/或功能的經(jīng)修飾的核酸分子的組合物和方法。
圖2中所顯示的平板形式的一種修飾是給孔使用“液體蓋子”?？梢詫嵤┐说囊环N方式是，對于孔來說包含雙層。例如，包含固體支持物的孔的底部部分可以包含ega。在此上面可以是密度更低的、任選地不相混合的流體。該密度更低的流體層將會阻止或延遲酸擴散出所希望的孔和擴散至不希望的孔。進一步地，可以放置該密度更低的流體以實現(xiàn)與上面的電極的傳導性接觸。商購可得的“液體蓋片”的一個例子由ventanamedicalsystems,inc(目錄編號650-010)進行銷售。該產品是作為在含水試劑和空氣之間的屏障進行使用的溶液，其防止蒸發(fā)，并且被設計用于為諸如免疫組織化學和原位雜交反應之類的應用提供穩(wěn)定的水性環(huán)境。
用于實踐本發(fā)明的方法的一個示例性實驗方案如下。通過受控的或脈沖的流而向芯片表面添加具有1微米的均一直徑的多孔的經(jīng)硅烷包被的磁性珠粒(myonebeads,dynal)，以確保珠粒在芯片上的所有微孔(大約1.3μm直徑)范圍內的均勻分布和確保最大數(shù)目的孔加載有一個珠粒。通過能夠描繪在空的孔和包含導電性磁性珠粒的孔之間的電阻差異的合成前電流檢查來鑒別未包含珠粒的孔。
在珠粒表面的準備中，各種各樣的化學都是可能的。例如，可以產生許多硅烷層以給予珠粒以更大的功能性表面面積。如此地制備硅烷涂層，從而使得存在羥基官能團的穩(wěn)定附著；通常，通過三甲氧基或三乙氧基硅烷連接體將硅烷核心偶聯(lián)至裸露的二氧化硅珠粒表面，以在最初的亞酰胺(amidite)合成步驟結束時暴露伯羥基基團。用于在dna合成中的起始和偶聯(lián)的、為平面陣列表面電極而開發(fā)的基礎化學可以在maurer等人,electrochemicallygeneratedacidanditscontainmentto100micronreactionareasfortheproductionofdnamicroarrays,plosone1(1):e34.doi:10.1371/journal.pone.0000034(2006)中找到。
芯片的制造：在就高導電率以及在合成、試劑添加和解封閉條件下的化學穩(wěn)定性而選擇出的經(jīng)氧化的高電阻率硅上產生電極材料，例如至多50nm厚的銥金屬。通過超聲粘合將電極連接至印刷電路板，以提供數(shù)字控制的模擬集成開關電路，其激活被選擇用于解封閉給定的孔的電極。將印刷電路板仔細地對準并且粘合至規(guī)則的微孔結構，從而產生合成芯片。將提供和密封用于試劑的內部體積的蓋板以及普通的互補電路電極粘合在周邊處和在微孔結構的上表面上，從而完成閉合的合成芯片。
可以使用常規(guī)的半導體或聚合物材料來形成孔(200)。例如，可以使用cmos技術來形成半導體材料(例如，sio或sio2)的具有所希望的形狀或大小的孔。取決于所希望的應用，電極(202)可以與孔(200)一起進行制造或分開進行制造。
向芯片施加核酸合成(例如，dna合成)試劑可以通過許多手段來進行。例如，一旦珠粒被加載到芯片中，計算機系統(tǒng)就控制一系列的試劑添加，并且可以進行洗滌，以影響在位于芯片的微孔中的珠粒的表面上的亞磷酰胺dna合成?？梢圆捎锰幚砥骺蓤?zhí)行的指令，其決定，對于任何給定的dna序列群體，相關于試劑的體積/成本和合成運行的時間來說最佳的dna合成試劑添加的次序以及試劑添加和洗滌步驟的順序。此外，如上面所提及的，給予在芯片上的特定孔的由控制器或處理器控制的電流決定了在哪些孔中可以產生以電化學方式產生的酸，并且可以以化學方式準備用于激活在孔中的珠粒上的正在生長的核酸分子的去保護，以偶聯(lián)下一個被添加到反應容器中的亞酰胺堿基。通過經(jīng)優(yōu)化的開發(fā)過程，用于施加合成試劑和用于確保精確且受控的流體施加的許多特定的儀器和組件構造是可能的。使用ega來影響去保護的亞磷酰胺dna合成步驟、條件和試劑可以在例如maurer等人,electrochemicallygeneratedacidanditscontainmentto100micronreactionareasfortheproductionofdnamicroarrays,plosone1(1):e34.doi:10.1371/journal.pone.0000034(2006)以及egeland和southern,electrochemicallydirectedsynthesisofoligonucleotidesfordnamicroarrayfabrication,nucleicacidsresearch,33(14):e125(2005)中找到。
ega組分的組成和濃度：ega試劑的確切組成和濃度受到電極和微孔的精確的傳導、結構和幾何特性以及與施加電流以將ega轉化為其酸形式相關的參數(shù)(電流、電壓和時間)的影響。一般地，用于影響去保護的ega產生的體積越小，所需要的電流強度和/或電流施加時間越小。由于在這樣的微量系統(tǒng)中產生的核酸分子的量低于可以直接且準確地測量的閾值，因而對于核酸分子合成和偶聯(lián)效率，通常需要作為替代品的測定法，例如雜交或在靶擴增后的產物富集。將ega試劑(包括氫醌和苯醌)與六氟磷酸四丁基銨(在無水乙腈中)一起用于通過陽極氧化來產生電化學酸以影響去保護。以至多25mm的濃度制備上述ega試劑，并且在施加電流之前將其施加至芯片以影響去保護。在最佳參數(shù)的確定中，通常將會希望避免由于因dna過度暴露于酸造成的脫嘌呤作用而引起的堿基損傷。
施加電流以影響基于ega的dmt去保護：可以恒定地施加至多2μa的電流，并且將至多2v的電壓施加至在受控電路中的電極，至多30秒的時間段。還可以在1至60秒的時間期間以10至2000ms的脈沖持續(xù)時間施加電流。還可以以各種不同的脈沖(例如，大約2至大約10,000個、大約10至大約10,000個、大約50至大約10,000個、大約100至大約10,000個、大約1,000至大約10,000個、大約10至大約500個等的脈沖)施加至多2μa(例如，大約0.02na至大約20,000na、大約0.2na至大約20,000na、大約0.2na至大約5,000na、大約0.2na至大約2,000na、大約0.2na至大約1,000na、大約0.2na至大約5000na、大約2.0na至大約20,000na、大約2.0na至大約10,000na、大約2.0na至大約5,000na、大約2.0na至大約2,000na、大約5.0na至大約20,000na、大約5.0na至大約8,000na、大約10na至大約20,000na、大約10na至大約8,000na、大約10na至大約5,000na、大約20na至大約20,000na、大約20na至大約8,000na、大約50na至大約20,000na、大約50na至大約10,000na、大約50na至大約5,000na、大約100na至大約10,000na、大約500na至大約20,000na、大約500na至大約10,000na、大約500na至大約5,000na、大約1,000na至大約20,000na、大約1,000na至大約10,000na等)的電流。在一些情況下，將會大致使電流脈沖大約1秒至大約30秒、大約2秒至大約30秒、大約4秒至大約30秒、大約5秒至大約30秒、大約5秒至大約20秒、大約5秒至大約15秒、大約5秒至大約10秒等。當然，必須確定有效的去保護和核酸分子合成，因為ega試劑的確切組成和濃度受到電極和微孔的精確的傳導、結構和幾何特性以及與施加電流相關的參數(shù)(電流、電壓和時間)的影響。
在本發(fā)明的某些實施方案中，可以使核酸分子或其部分在合成之前經(jīng)歷序列優(yōu)化過程。各種不同的用于序列修飾的計算方法是本領域中已知的，并且可以用于在下列方面優(yōu)化給定的核苷酸序列：1)有效的裝配，和/或2)經(jīng)改善的在給定宿主中的性能。為了設計用于最佳裝配的核苷酸序列，可以借助于考慮了參數(shù)(例如，解鏈溫度、重疊區(qū)域、自我雜交、不存在或存在克隆位點，等等)的算法來將全長序列拆散成確定數(shù)目的具有最佳雜交特性的更小的片段。在本發(fā)明的某些方面，所希望的核酸序列的至少一部分可以編碼多肽或蛋白質。在這樣的情況下，可以希望的是優(yōu)化開放閱讀框以為了經(jīng)改善的在給定的同源或異源宿主中的性能，例如表達產量或可溶性?？梢岳缤ㄟ^下列方式來取得基因表達的增加：用偏愛的密碼子代替非偏愛的或較不偏愛的密碼子，或者增加開放閱讀框中的cpg二核苷酸的數(shù)目，其例如描述在u.s.專利號5,786,464和6,114,148以及u.s.專利公開號2009/0324546aa(其公開內容通過提及而并入本文)中。
在一個特別的實施方案中，可以將經(jīng)優(yōu)化的開放閱讀框與算法相組合以將秘密信息加密編碼到開放閱讀框中，如在u.s.專利公開號2011/0119778aa中所描述的。這樣的信息可以允許某些合成的核酸分子的鑒定或追蹤。在本發(fā)明的某些方面，可以希望使用同時考慮了多個不同參數(shù)(包括與裝配相關的以及與表達相關的序列特性)的優(yōu)化策略。可以為經(jīng)優(yōu)化的序列設計而在本發(fā)明中使用的綜合的多參數(shù)方法的一個例子是在u.s.專利公開號2007/0141557aa(其公開內容通過提及而并入本文)中所描述的
模塊2
在模塊1上的合成運行完成后，可以使與支持物相關聯(lián)的(例如，與珠粒相關聯(lián)的)核酸分子經(jīng)歷在模塊2中的后加工。在模塊2中進行的過程可以手工地或者通過由計算機指導的自動化控制步驟(例如，從合成微孔陣列中揀取和匯集珠粒(例如，磁性珠粒)，以及氣相切割和去保護)來實施，以制備用于后續(xù)裝配步驟(在適當時)的核酸分子。
為了暴露與珠粒相附著的核酸分子的微孔陣列，可以移除合成孔的蓋子，當存在時。在一個實施方案中，以由計算機控制的方式通過自動手段來移除蓋子。
可以給珠粒揀取器具(包括，例如精密控制的電微磁體)進行編程并對其進行控制，以提取和匯集含有合成的核酸分子的獨個珠粒。取決于應用和待裝配的核酸分子的數(shù)目，可以匯集微孔陣列的所有的珠?；騼H所述珠粒的亞組。當僅匯集珠粒的亞組時或當珠粒的總數(shù)受到限制時，所匯集的珠粒的數(shù)目可以廣泛地變化，并且包括大約10至大約50個、大約50至大約100個、大約100至大約1000個、大約50至大約10,000個、大約100至大約10,000個或大約500至大約10,000個獨個珠粒。可以將這些珠粒存放在任何合適的容器中。容器的一個例子是微孔平板的孔(例如，1536微孔平板的孔)。
適合用于本發(fā)明的自動化包括：精密控制的電微磁體揀起第一個珠粒并將它存放到匯集孔(即，包含用于收集尋求組合地進行使用的核酸分子的多個珠粒的孔)中。備選地，可以使用這樣的精密控制的電微磁體，其揀起第一個珠粒并然后在x-y方向上移動至下一個位置，在z方向上降低以揀起第二個珠粒，在z方向上回升以離開磁場范圍，在x-y方向上移動至第三個孔，等等。因此，讓磁體處于“開”的狀態(tài)，并且作為珠粒串來揀起和搬運珠粒組(例如，大約2至大約50個、大約10至大約50個、大約2至大約100個、大約10至大約100個、大約20至大約80個等)。當收集到一組珠粒時，那么就將該組同時存放到匯集孔中。當然，可以收集多個珠粒組并存放在單個匯集孔中。
在一些情況下，可以使用例如在u.s.專利公開號2008/0281466aa或2008/0113361aa中或者在u.s.專利號6,887,431、7,347,975或7,384,606(其公開內容通過提及而并入本文)中所描述的系統(tǒng)來提取和匯集珠粒。在本發(fā)明的其他實施方案中，可以使用具有至少一個集成的精密控制的電微磁體的珠粒揀取器具。這樣的揀取器具可以通過控制單元來進行控制，可以給所述控制單元進行編程以控制微磁體移動至與特定的微孔對準。在進一步的實施方案中，所述控制單元可以提供用于控制微磁體和微孔之間的距離的調整的手段。在一個特別的實施方案中，可以通過電手段來控制和激活微磁體以允許提取攜帶特定核酸序列的單個磁性珠粒。
在本發(fā)明中所使用的電微磁體可以是中空的磁體或是針狀的，并且常常將會具有使磁場聚焦在其尖端從而允許特異地靶向獨個珠粒的大小和尺寸。在一個特別的實施方案中，所述微磁體可以由電磁體和永磁體組成，其中永磁體的活性可以受電磁體控制。用于本發(fā)明的電微磁體可以以任何數(shù)目或形式，并且可以例如包含單個磁體或與其他微磁體一起排列成行。
在本發(fā)明的某些實施方案中，可以使用電微磁體來提取和匯集在在單個陣列的微孔中所包含的所有磁性珠粒。為了該目的，可以將電微磁體分配至每個微孔以便以預先確定的或隨機的次序逐步地提取與珠粒相附著的核酸分子。在一個實施方案中，可以在單個陣列上合成對于全長構建體的裝配來說所需要的所有核酸分子。根據(jù)對于構筑全長構建體來說所需要的核酸分子的量，可以使用具有不同大小和尺寸的陣列。
在另一個實施方案中，可以給電微磁體進行編程以便僅靶向特定陣列的一部分微孔以提取和匯集與珠粒相附著的核酸分子的預先確定的選擇。可以給電微磁體進行編程以從兩個或更多個不同的平板的微孔中提取和匯集珠粒。所述揀取可以將第一個平板的所有珠粒的完全提取與從第二個平板獲得的部分珠粒的選擇性提取相組合。第一個平板和第二個平板可以在大小和尺寸方面變化。
然后，可以將由微磁體提取的每個磁性珠粒通過揀取器具的可移動機構轉移至匯集站。在一個實施方案中，所述匯集站可以包含具有微孔平板的小室。在一個實施方案中，所述微孔平板可以為1536微孔平板。然而，具有其他大小和尺寸的微孔平板(例如，標準的96-孔平板)是本領域中已知的，并且可以在本發(fā)明中使用?？梢詫⒋_定級分的核酸分子匯集在微孔平板的獨個孔中，其中一個經(jīng)匯集的級分包含對于裝配全長構建體的至少一個確定的片段來說所需要的所有核酸分子。在一個實施方案中，獨個核酸分子匯集物可以包含對于裝配全長構建體來說所需要的所有核酸分子。可以通過使用布置在微孔平板上的機器可讀的鑒別器來進一步鑒別出分配至每個孔的不同核酸分子匯集物。
還可以使用靜電力來從合成平臺中移除珠粒和其他基質。使用圖2a-2b為了舉例說明的目的，寡核苷酸合成基質(在該情況下為珠粒)可以是帶靜電電荷的，并且可以通過使用相反的電荷而從與表面或孔的聯(lián)系中分開。例如，如果圖2a-2b中所顯示的一個或多個珠粒具有正電荷，那么可以將下面的電極用于產生正電荷以排斥珠粒并迫使它離開孔。還可以使用磁荷來達到相同的目的。還可以采用剩磁。本質上，剩磁是在暴露于磁力之后余留在材料中的磁性。在許多情況下，磁性基質將會具有小的大小。因此，此類基質的吸引通常將會不需要強的磁場。剩磁可以存在于基質、用于結合至基質的選擇探針或兩者之中。進一步地，可以使用電荷來從合成平臺中選擇性地移除合成基質的亞組。
可以容易地計算出對于從合成平臺中移除珠粒和其他基質來說所需要的靜電力。下面的表4假定，存在相對均勻的電場并且每個珠粒作為單個電荷點起作用。核酸分子在其上攜帶有當使用電荷來從孔中逐出珠粒時應當考慮的電荷。進一步地，僅需要向包含具有所希望的核酸分子(例如，用于裝配成更大的核酸分子的核酸分子)的基質的孔施加電荷。
表4
在另一個實施方案中，合成平臺可以包含一系列與合成平臺的其他區(qū)域分開的區(qū)域。例如，合成平臺可以以正方形的10×10排列包含100行的合成區(qū)域。進一步地，可以如此地設計合成平臺，從而使得它可分開成十行的十個合成區(qū)域。為了舉例說明的目的，假定尋求產生八個不同的經(jīng)裝配的核酸分子，并且這些經(jīng)裝配的核酸分子被設計成從下列數(shù)目的寡核苷酸的裝配中形成：
表5
表5指明了各種不同的經(jīng)裝配的核酸分子的數(shù)字標號，將會用于裝配所述經(jīng)裝配的核酸分子的寡核苷酸的數(shù)目，和其中合成寡核苷酸的行。在該實施方案中，第1-5行中的每個將會具有至少一個其中將不會產生寡核苷酸的合成區(qū)域。
在合成完成后，可以分開可分開的行，并且收集/加工和裝配所合成的核酸分子，例如，如本文別處所描述的那樣。
還可以使用其他方法來收集核酸合成基質，包括：(1)“抓取”，例如通過使用鑷子樣裝置，其基于機械的(例如，真實的抓取)、光學的、聲音的、磁性的原理進行運轉；(2)“破壞”在核酸合成基質周圍的結構，通過諸如化學溶解的方法或通過使用激光；(3)移動核酸合成基質，通過例如使用熱能、靜電能、磁能、流體能；(4)混合型鉗子，其組合了例如(a)磁性和流體沖洗，(b)磁性和壓電方法，和(c)靜電提升和流體沖洗；(5)磁性固定/收集，通過使用例如受調節(jié)的永磁體、外部線圈、在合成基質上的平面線圈等；(6)靜電提升和收集；和(7)溢流指導(例如，將流體添加至孔的底部以提升基質)。
在本發(fā)明的實踐中所使用的匯集站可以進一步包含微孔處理裝置，其包含可控制的可移動機構用于在x和/或y和/或z方向上將微孔平板從第一個位置移動至至少第二個位置，并且可以進行編程以實施液體處理步驟。這樣的匯集站可以進一步配備有移液裝置和允許試劑的受控添加和移除的抽吸儀器。備選地，可以通過真空機構來實施液體的移除?？梢赃M一步將移液裝置連接至試劑儲器和混合機構以混合和添加確定量的對于純化以及隨后的加工和裝配步驟來說所需要的試劑。組合了各自功能的集成的液體處理裝置是本領域技術人員已知的。
在一個特別的實施方案中，匯集站集成了允許進一步地將來自第一個和第二個孔的一個或多個核酸分子匯集物合并到第三個孔中以產生更大的的核酸分子匯集物的機構。在從相同的和可變的序列元件來裝配全長構建體的變體或文庫的情況下，可能需要這樣的逐步匯集。
在本發(fā)明的實踐中所使用的匯集站可以進一步包含位于微孔平板下面的磁體。在一個特別的實施方案中，這樣的平板磁體可以用作微磁體的對應物，以便觸發(fā)所提取的珠粒釋放到受者微孔中。備選地，電微磁體可以是連接至毛細管的中空磁體，所述毛細管可以用液體進行沖洗以將所結合的珠粒吹出到受者孔中。還可以采用其他的珠粒釋放機構。
關于核酸分子的匯集，這可以以許多方式來進行。例如，可以收集合成基質并置于單個容器中。備選地，可以從合成基質中釋放出核酸分子，然后使它們相互接觸。進一步地，可以通過雜交來裝配核酸分子。這意味著，可以在同一個容器中發(fā)生多于一次的裝配。換言之，本發(fā)明包括這樣的方法，通過所述方法從更小的、經(jīng)化學合成的核酸分子發(fā)生多于一個(例如，兩個、三個、四個、五個、六個等)的核酸分子的裝配。其中多于一個的更大的核酸分子(例如，可復制的核酸分子)的裝配可以是有用的一個應用是，其中意欲將經(jīng)裝配的核酸分子插入到相同細胞中的應用。因此，經(jīng)裝配的核酸分子之一可以是染色體，并且另一個可以是質粒。
一旦產生了所希望的核酸分子匯集物，常常將會進一步加工與珠粒相附著的核酸分子，例如以獲得用于下游反應的功能性核酸分子。在鏈合成后，通常保護5’-末端5’-羥基基團，例如用二甲氧基三苯甲基(dmt)基團；還可以保護核苷間的磷酸酯或硫代磷酸酯部分，例如用2-氰基乙基基團；和可以保護在所有核堿基(除了t和u外)中的環(huán)外氨基基團，例如用酰基保護基團。通常，在匯集與珠粒相附著的核酸分子之前，于在支持物上的最后一個合成循環(huán)后，切割5’-末端dmt基團。然而，在可以將核酸分子有效地用于隨后的過程之前，必須在去保護步驟中移除所有的保護基團。
在本發(fā)明的一個實施方案中，實施去保護，而例如不從珠粒上釋放出核酸分子。這可以通過選擇堿穩(wěn)定的、非可切割的連接體來進行。各自的連接體是技術人員已知的。
在一個實施方案中，在下游裝配之前，從珠粒上釋放出核酸分子。如果需要核酸分子的切割，可以在單個步驟中進行切割和去保護。核酸分子的釋放可以通過用合適的試劑切割將核酸分子的3’-末端附著至珠粒(例如，磁性珠粒)的連接體來達到。用于切割的合適的試劑和條件取決于連接的性質，如本文別處所描述的，并且是本領域技術人員已知的。
在本發(fā)明的一個實施方案中，通過琥珀酰基基團將核酸分子附著至磁性珠粒。琥珀?；B接體可以通過使用例如濃縮的含水氫氧化銨來進行切割。該反應通常在50℃至80℃的溫度下進行至少一個至大約八個小時。當然，取決于實驗方案和所使用的保護基團，切割條件可以變化。然后，可以通過蒸發(fā)來去除氨溶液，從而留下核酸分子備用于進行純化。
在一個實施方案中，切割可以通過氣相加工來進行。在氣相加工中，可以在封閉的小室中，在包含氣態(tài)切割/去保護試劑(例如，氣態(tài)氨或氫氧化銨蒸氣)的氣體環(huán)境中切割核酸分子。各自的方法例如陳述在u.s.專利號5,514,789或5,738,829(其公開內容通過提及而并入本文)中。
通常，上面的反應將會還觸發(fā)其他保護基團(包括氰乙基基團，保護雜環(huán)伯胺的基團，和在最后一個堿基上的dmt基團)的切割。因此，在合適時，可以使用單個切割反應，以去除所有存在的保護基團。
可以使用至少兩種方法來切割在本發(fā)明的實踐中所使用的連接體：(a)在與去保護步驟相同的條件下同時地，或(b)在去保護步驟完成后，隨后使用用于連接體切割的不同的條件或試劑。用于從核酸分子上去除通用連接體的各種不同的方法描述在本領域中，例如描述在u.s.專利公開號2002/0143166a1(其公開內容通過提及而并入本文)中。
對于下游應用，可能需要純化經(jīng)匯集和經(jīng)去保護的核酸分子以去除切割下來的基團，例如，通過沉淀?？赡苓M一步需要將核酸分子混合物與磁性顆?；蚱渌С治锓珠_。在一個實施方案中，可以使用位于微孔平板下面的平板磁體來將珠粒固定在孔中，而同時可以洗脫核酸分子，例如通過抽吸。備選地，在平板磁體不存在下，可以通過磁性手段從孔中自動地移除珠粒，而同時核酸分子將會被保留在孔中以獲得準備好用于進一步加工或使用的以皮摩爾濃度的高質量核酸分子的飛摩爾的獨個匯集物。
在一些情況下，可以將核酸分子與固體支持物分開，而同時固體支持物仍然位于與其中核酸分子進行合成的地方相同或相似的位置。在此類情況下，通常在合成完成后，可以使寡核苷酸合成試劑從與合成支持物的接觸中移除，隨后添加一種或多種用于釋放所構建的寡核苷酸的試劑(也稱為切割試劑)。這些釋放試劑可以以諸如液體或氣體之類的形式。氣體試劑如上面所提到的。
在許多情況下，切割試劑將會是揮發(fā)性的(例如，它可以通過冷凍干燥被去除)和非離子型的。那么，可以通過從孔(當存在時)中移除，或通過漂洗合成基質，來回收切割下來的寡核苷酸。當采用微孔來進行合成時，可以使用以液體形式的切割試劑?？梢杂眠@樣的液體試劑包被合成基質，隨后為合成的寡核苷酸的集體移除或獨個寡核苷酸的移除(少于全部存在的寡核苷酸)。獨個寡核苷酸的移除可以例如通過在發(fā)生了切割后限制基質的攪動和位點特異性地移除(例如，用移液管尖端)包含獨個寡核苷酸的流體來實現(xiàn)。當基質包含孔或空穴時，此類方法將會是特別有用的。
任選地，在匯集、切割和/或去保護步驟后可以濃縮所合成的核酸分子，而不是進入模塊3過程。這樣的濃縮的一個濃縮方法將會通過額外的第二次結合、洗滌和洗脫設置系列以減少最終的體積。該增加的濃度將會增加所合成的核酸分子的濃度，導致在亞片段產生中重疊區(qū)段的加速的雜交，如可能希望的那樣。還可以采用濃縮至增加的濃度來使多個匯集物的濃度“標準化”至更恒定的范圍，從而在模塊3過程(例如，所有模塊3過程)中只需要采用有限的一套例如裝配條件。
圖13顯示了兩種方法，通過所述方法可以將合成的寡核苷酸與支持物分開。在該圖中，寡核苷酸已經(jīng)在珠粒(1300)上合成并且被釋放到微孔滴定平板(1301)的周圍的孔中。在每種情況下，用流體(1302)覆蓋用于進行收集的包含寡核苷酸的孔，并使用移液管尖端(1303)來收集該流體。在該圖的左側是兩個孔，其中流體被包含在孔中。進一步地，在圖13的右側，屏障(1304)在孔的上方延伸以允許流體以更高的水平集中。在這兩種情況下，在將移液管尖端帶至緊密接近之前流體可以就在那里，或者可以通過移液管尖端來遞送流體。此外，在珠粒(1300)周圍的流體可以進行循環(huán)以通過由移液管尖端(1303)遞送的液流來分配所釋放的寡核苷酸。
模塊3
一旦完成了化學合成階段，就可以將所得的核酸分子裝配成更大的核酸分子，如果希望。取決于最后的核酸分子進行使用的最終目的，化學合成的核酸分子的“質量”(例如，從序列保真度的角度看)對于所想要的應用來說可能太低了。作為例子，如果化學合成的核酸分子待被用作長的探針，那么它們對于該目的來說可能具有足夠的質量，而無需進一步的加工。然而，要考慮這樣的情形，其中待裝配一百個核酸區(qū)段，每個核酸區(qū)段的長度為一百個堿基對，并且每五十個堿基對存在一個錯誤。最終結果將會是，平均地，在每個10,000堿基對的經(jīng)裝配的核酸分子中存在200個序列錯誤。如果意欲例如從經(jīng)裝配的核酸分子表達一種或多種蛋白質，那么該序列錯誤數(shù)目將會可能被認為是太高了。此外，盡管可以進行獨個核酸分子的測序，但這是耗費時間的并且涉及額外的成本。因此，在許多情況下，可以實施錯誤去除步驟。通常地，這將會在第一輪裝配后進行。因此，在一個方面，本發(fā)明的方法包括下列(以該次序或不同的次序)：
1.片段擴增和裝配(例如，pcr/體外裝配)；
2.錯誤校正；
3.最終的裝配(例如，體內裝配)。
在本公開內容的各種不同的實施方案中，錯誤去除步驟也可以通過執(zhí)行處理器可執(zhí)行的指令來實施。因此，本發(fā)明包括用于施行與錯誤去除過程以及本發(fā)明的其他方面相關的機械功能的基于軟件的指令。
可以使用許多方法來進行片段擴增和裝配。一個示例性的方法描述在yang等人,nucleicacidsresearch,21:1889-1893(1993)和u.s.專利號5,580,759(其公開內容通過提及而并入本文)中。
在yang等人的文章中所描述的方法之中，將線性載體與在末端共享序列同源性的雙鏈核酸分子相混合。添加具有核酸外切酶活性的酶(即，t4dna聚合酶、t5核酸外切酶、t7核酸外切酶等)，其使存在于混合物中的所有末端的一條鏈向后剝離。然后，通過與dna聚合酶和脫氧核苷三磷酸一起在允許單鏈缺口填充的條件下進行溫育，使“被向后剝離的”核酸分子退火。在所得的核酸分子中的切口可以通過將分子引入到細胞中或者通過添加連接酶來進行修補。當然，取決于應用和工作流程，可以省略載體。進一步地，可以通過聚合酶鏈式反應來擴增所得的核酸分子或其亞部分。
核酸裝配的其他方法包括在u.s.專利公開號2010/0062495a1、2007/0292954a1、2003/0152984aa和2006/0115850aa中，以及在u.s.專利號6,083726、6,110,668、5,624,827、6,521,427、5,869,644和6,495,318(其公開內容通過提及而并入本文)中所描述的那些。
在u.s.專利公開號2012/0053087(其公開內容通過提及而并入本文)中陳述了用于核酸分子的等溫裝配的方法。在該方法的一個方面，將用于裝配的核酸分子與具有核酸外切酶活性的不耐熱的蛋白質(例如，t5聚合酶)、熱穩(wěn)定的聚合酶和熱穩(wěn)定的連接酶在核酸外切酶活性隨時間而降低的條件(例如，50℃)下進行接觸。所述核酸外切酶“向后咬嚼”核酸分子的一條鏈，并且，如果存在序列互補性，核酸分子將會互相退火。所述熱穩(wěn)定的聚合酶填充缺口，并且所述熱穩(wěn)定的連接酶封閉切口?？梢詫⑾襁@樣的方法與圖16的設備一起進行使用。進一步地，可以將多于一個的核酸分子與其他合適的試劑一起儲存在1609的獨個儲存單元內，并且可以將這些儲存單元設定至例如50℃的溫度以為了裝配所儲存的分子。
一種商購可得的可用于裝配本發(fā)明的核酸分子以及用于將這樣的核酸分子插入到載體中的試劑盒為
可以包括單鏈結合蛋白例如t4基因32蛋白和reca，以及本領域中已知的其他核酸結合或重組蛋白，例如以便促進核酸分子退火。
在一些情況下，可以在固體支持物上擴增核酸分子。因此，本發(fā)明包括其中合成核酸分子但不將它們從它們在其上進行合成的固體支持物上切割下來的方法。在這樣的情況下，可以直接地(例如，作為探針)或經(jīng)裝配地使用擴增出的核酸分子，如本文別處所描述的那樣。
一種用于裝配核酸分子的方法(圖3)涉及以通過使用pcr而“縫合”在一起的重疊核酸分子開始。在許多情況下，經(jīng)縫合的核酸分子將會是經(jīng)化學合成的，并且其長度將會少于100個核苷酸(例如，大約40至100個、大約50至100個、大約60至100個、大約40至90個、大約40至80個、大約40至75個、大約50至85個等核苷酸)。在u.s.專利號6,472,184(其公開內容通過提及而并入本文)中陳述了一種與在圖3中所顯示的那種相似的方法。還可以使用引物，所述引物包含用于其中希望插入到克隆載體中的情況的限制位點。一種合適的克隆系統(tǒng)被稱為goldengate，其以各種不同的形式陳述在u.s專利公開號2010/0291633a1和pct公開wo2010/040531(其公開內容通過提及而并入本文)中。因此，在希望時，可以將經(jīng)裝配的核酸分子直接插入到載體和宿主細胞中。當所希望的構建體相當小(例如，小于5千堿基)時，這可能是合適的。當希望更大的構建體(例如，5至100千堿基)時，可以使用由iis型限制位點介導的裝配來裝配多個片段(例如，二個、三個、五個、八個、十個等)。
用于核酸分子(例如，化學合成的核酸分子)的基于pcr的裝配的一種備選的方法基于5’-磷酸化的核酸分子的重疊對的直接連接(“基于連接的裝配”)。在該方法中，合成單鏈核酸分子，使其磷酸化，并進行退火以形成具有互補突出端(例如，四個核苷酸的突出端)的雙鏈分子。然后，將獨個雙鏈分子相互連接以形成更大的構建體。在某些實施方案中，可希望該方法超過pcr方法，特別是當待裝配高度重復的序列，例如gc序列段時?？梢允褂迷摲椒▉硌b配大約2至大約40個核酸分子(例如，大約2至大約40個、大約3至大約40個、大約5至大約40個、大約8至大約40個、大約2至大約30個、大約2至大約20個、大約2至大約10個等核酸分子)。相關的方法描述在u.s.專利號4,652,639(其公開內容通過提及而并入本文)中。
在許多情況下，當在使用化學合成的核酸分子的情形下采用基于連接的裝配時，這些分子的長度將會少于100個堿基對。此外，互補重疊可以用于連接長度通常在2和10之間(例如，長度為大約2至大約10個、大約4至大約10個、大約5至大約10個、大約2至大約8個、大約3至大約7個等核苷酸)的核酸分子(圖4)。
一種可以用于裝配核酸分子的方法是red/et重組。該方法采用基于大腸桿菌(e.coli)的同源重組，其由噬菌體蛋白質對，例如rece/rect或redα/redβ來介導。該方法不受核酸大小限制，并且不依賴于限制位點?；旧?，通過使用red/et重組，可以在任何位點處改造幾乎任何大小的在大腸桿菌中的任何dna分子。大體上，red/et重組涉及三個步驟/條件。第一個步驟或條件是在線性dna中同源性臂(例如，長度為50堿基對的臂)的存在。第二個步驟或條件是在大腸桿菌細胞中線性dna的插入或存在。第三個步驟或條件是在大腸桿菌細胞中任何合適的噬菌體對(例如，rece/rect或redα/redβ)的表達或存在。red/et重組陳述在us專利號6,355,412和6,509,156(其公開內容通過提及而并入本文)中。
進一步地，如在圖4中所顯示的，可以使用多輪聚合酶鏈式反應來連續(xù)地產生更大的核酸分子。
在大多數(shù)情況下，不管通過其而從化學合成的核酸分子產生更大的核酸分子的方法是什么，來自化學合成過程的錯誤將會存在。因此，在許多情況下，錯誤校正將會是希望的。錯誤校正可以通過許多手段來實現(xiàn)。一種方法是通過對化學合成的核酸分子獨個地進行測序。
在圖6中呈現(xiàn)了另一種錯誤校正方法。圖6是用于合成最小化了錯誤的核酸分子的示例性過程的流程圖。在第一個步驟中，獲得長度小于全長的所希望的核苷酸序列的長度的核酸分子(即，全長的所希望的核苷酸序列的“核酸分子片段”)。每個核酸分子意欲具有這樣的所希望的核苷酸序列，其包含全長的所希望的核苷酸序列的一部分。每個核酸分子還可能意欲具有這樣的所希望的核苷酸序列，其包含用于核酸分子的pcr擴增的適體引物、用于將核酸分子附著至dna微芯片的拴系序列或者由任何實驗目的或其他意圖決定的任何其他核苷酸序列?？梢砸砸环N或多種方式中的任一種，例如通過合成、購買等來獲得核酸分子。
在任選的第二個步驟中，擴增核酸分子以獲得更多的每個核酸分子。所述擴增可以通過任何方法(例如，通過pcr)來實現(xiàn)。在擴增期間，可能發(fā)生額外的錯誤被引入到任何所述核酸分子的核苷酸序列中。
在第三個步驟中，將擴增出的核酸分子裝配成意欲具有所希望的長度(其可以是所希望的核苷酸序列的所想要的全長)的第一組分子。擴增出的核酸分子裝配成全長分子可以以任何方式來實現(xiàn)，例如通過使用基于pcr的方法。
在第四個步驟中，使第一組全長分子變性。變性致使雙鏈分子變成單鏈分子。變性可以通過任何方式來實現(xiàn)。在一些實施方案中，變性通過加熱所述分子來實現(xiàn)。
在第五個步驟中，使經(jīng)變性的分子退火。退火致使單鏈分子變成第二組全長的雙鏈分子。退火可以通過任何方式來實現(xiàn)。在一些實施方案中，退火通過冷卻所述分子來實現(xiàn)。
在第六個步驟中，使第二組全長分子與一種或多種核酸內切酶反應從而產生第三組分子，其意欲具有小于完整的所希望的基因序列的長度的長度。核酸內切酶將第二組中的分子中的一個或多個分子切割成更短的分子。所述切割可以通過任何方式來實現(xiàn)。在任何核苷酸序列錯誤的位點處的切割是特別希望的，因為一個或多個已在錯誤位點處進行了切割的分子的斷片的裝配提供了在該過程的最后步驟中去除切割錯誤的可能性。在一個示例性的實施方案中，所述分子用t7核酸內切酶i、大腸桿菌核酸內切酶v和綠豆核酸內切酶在錳存在下進行切割。在該實施方案中，核酸內切酶意欲在任何序列錯誤的位點處以及在其中沒有序列錯誤的隨機位點處將平頭切割引入到分子中。
在最后的步驟中，將第三組分子裝配成第四組分子，其長度意欲為所希望的核苷酸序列的全長。由于通過所提供的方法而使得能夠實現(xiàn)的后期錯誤校正，因而期望該組分子具有比由現(xiàn)有技術的方法所可以提供的錯誤少得多的核苷酸序列錯誤。
在上面和在圖6中所呈現(xiàn)的過程也陳述在u.s.專利號7,704,690(其公開內容通過提及而并入本文)中。此外，可以將上面所描述的過程作為處理器可執(zhí)行的指令編碼在計算機可讀的介質上。
另一種用于實行在化學合成的核酸分子中的錯誤校正的過程是通過稱作errasetm(novicibiotech)的商業(yè)程序。適合于在錯誤校正過程中使用的錯誤校正方法和試劑陳述在u.s.專利號7,838,210和7,833,759、u.s.專利公開號2008/0145913a1(錯配核酸內切酶)和pct公開wo2011/102802a1(其公開內容通過提及而并入本文)中。
示例性的錯配核酸內切酶包括核酸內切酶vii(由t4基因49編碼)、resi核酸內切酶、celi核酸內切酶和sp核酸內切酶，或甲基定向的核酸內切酶例如muth、muts或mutl。技術人員將會認識到，在本發(fā)明的某些實施方案中可以實踐其他錯誤校正方法，例如在u.s.專利公開號2006/0127920aa、2007/0231805aa、2010/0216648a1、2011/0124049a1或u.s.專利號7,820,412(其公開內容通過提及而并入本文)中所描述的那些。
在圖7中顯示了錯誤校正方法的另一個示意圖。
合成地產生的核酸分子通常具有大約1個堿基/300-500個堿基的錯誤率。進一步地，在許多情況下，多于80％的錯誤是單堿基移碼缺失和插入。此外，當采用高保真度pcr擴增時，少于2％的錯誤由于聚合酶的作用而產生。在許多情況下，將會通過使用固定的“蛋白質:dna”比例來進行錯配核酸內切酶(mme)校正。
一種錯誤校正方法涉及下列步驟。第一步是使包含在反應緩沖液(例如，200mmtris-hcl(ph8.3)、250mmkcl、100mmmgcl2、5mmnad和0.1％
另一種用于從化學合成的核酸分子中去除錯誤的方法是通過選擇具有正確的核苷酸序列的核酸分子。這可以通過下述方式來做：選擇用于擴增的單個核酸分子，然后對擴增產物進行測序以決定是否存在任何錯誤。因此，本發(fā)明還包括用于減少序列錯誤的選擇方法。用于擴增和測序驗證核酸分子的方法陳述在u.s.專利號8,173,368(其公開內容通過提及而并入本文)中。在matzas等人,naturebiotechnology,28:1291-1294(2010)中陳述了類似的方法。
根據(jù)本發(fā)明的該方面的方法可以包括下列步驟：(a)提供進行合成以具有相同的核苷酸序列的核酸分子的混合物，(b)將該混合物中的核酸分子分開，從而擴增導致源自單個起始核酸分子的子代核酸分子，(c)對多于一個的在步驟(b)中產生的擴增出的核酸分子進行測序，和(d)從在步驟(c)中進行測序的核酸分子中鑒定出至少一個具有所希望的序列的獨個核酸。然后，可以將在步驟(d)中鑒定出的核酸分子用作在裝配過程中的一個核酸分子，如本文別處所描述的。
根據(jù)本文所描述的各種不同的實施方案，可以用處理器可執(zhí)行的指令對計算機可讀的介質進行編碼，所述指令用于下列步驟：(a)提供進行合成以具有相同的核苷酸序列的核酸分子的混合物，(b)將該混合物中的核酸分子分開，從而擴增導致源自單個起始核酸分子的子代核酸分子，(c)對多于一個的在步驟(b)中產生的擴增出的核酸分子進行測序，和(d)從在步驟(c)中進行測序的核酸分子中鑒定出至少一個具有所希望的序列的獨個核酸。然后，可以將在步驟(d)中鑒定出的核酸分子用作在裝配過程中的一個核酸分子，如本文別處所描述的。在各種不同的實施方案中，可以將計算機可讀的介質包括在這樣的系統(tǒng)中，所述系統(tǒng)被配置成通過選擇具有正確的核苷酸序列的核酸分子來減少來自化學合成的核酸分子的錯誤。
大的核酸分子是相對易碎的，并因此容易剪切。一種用于穩(wěn)定這樣的分子的方法是通過在細胞內維持它們。因此，在一些方面，本發(fā)明涉及在宿主細胞中大的核酸分子的裝配和/或維持。
已知相當有效地施行同源重組的一組生物是酵母。因此，在本發(fā)明的實踐中所使用的宿主細胞可以為酵母細胞(例如，釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)等)。
酵母宿主由于其獨特的一套遺傳操作工具而特別適合于供者基因組材料的操作。酵母細胞的天然能力以及幾十年的研究已創(chuàng)建了豐富的一套用于在酵母中操作dna的工具。這些優(yōu)點是本領域熟知的。例如，具有其豐富的遺傳系統(tǒng)的酵母可以通過同源重組(一種不被許多容易得到的生物所共享的能力)來裝配和再裝配核苷酸序列?？梢詫⒔湍讣毎糜诳寺〔荒茉谄渌镏羞M行克隆的較大的dna斷片，例如，完整的細胞的、細胞器的和病毒的基因組。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明利用酵母遺傳學的巨大能力，通過使用酵母作為用于裝配和維持的宿主細胞來產生大的核酸分子(例如，合成的基因組)。
酵母宿主細胞的例子為，為了高的轉化效率而開發(fā)的酵母菌株vl6-48n(親本菌株：vl6-48(atcc編號mya-3666tm))，w303a菌株，mav203菌株(lifetechnologiesinc.,目錄編號11281-011)，和重組缺陷型酵母菌株例如rad54基因缺陷型菌株vl6-48-δ54g(matαhis3-δ200trp1-δ1ura3-52lys2ade2-101met14rad54-δ1::kanmx)，其可以減少酵母人工染色體(yac)中各種各樣的重組事件的發(fā)生。
存在有很大的一套用于選擇和反選擇酵母突變體的選擇標記(例如，ura3、his3等)，其使得能夠在酵母宿主細胞內進行多輪無縫的核酸改變。因此，可以使用酵母來引入許多不同的遺傳修飾，包括單個核苷酸改變(例如，插入、缺失、突變)、靶核酸部分和區(qū)域的修飾以及完全新的染色體的構建。可以在酵母中快速連續(xù)地進行對于以另外方式難處理的基因組或其他大的核酸的經(jīng)克隆的拷貝來施行的系列修飾。酵母的交配能力對于修飾基因組和其他大的核酸來說是有利的。可以使用酵母重組機構系統(tǒng)(當在酵母交配期間被激活時)來產生文庫，例如包含經(jīng)克隆的基因組或核酸的變體的組合文庫。
例如，已為數(shù)種不同的細菌構建了酵母人工染色(yac)(azevedo等人,pnasusa90,6047(1993)；heuer等人,electrophoresis19,486(1998)；kuspa等人,pnasusa86,8917(1989))。可以通過使用通用遺傳密碼來將大的原核dna區(qū)段克隆到酵母中。通常，毒性基因表達對于在酵母中克隆核酸來說不是障礙。關于例如細菌和古細菌的基因組的研究表明，由于真核生物使用與這些細菌不同的蛋白質表達機構系統(tǒng)，因此存在很小的由從經(jīng)克隆的基因組表達出的蛋白質對酵母宿主造成傷害的風險。因此，本發(fā)明進一步包括用于產生當被引入到非酵母細胞(例如，細菌細胞)中時賦予毒性表型的核酸分子(例如，合成的基因組)的方法。
在酵母中的轉錄(kozak,gene234,187(1999))和翻譯(kornberg,trends.cell.biol.9,m46(1999))信號不同于在細菌中的那些。事實上，大多數(shù)原核基因可能在酵母中不表達。在酵母中不存在限制障礙(belfort和roberts,nucleicacidsres25,3379(1997))。如果存在障礙，它可能是復制障礙，而不是基因表達障礙(stinchcomb等人,pnasusa77,4559(1980))?；蚨拘员蛔钚』?，因為在真核生物例如酵母中的基因表達的調節(jié)不同于在原核生物中的那種。此外，支原體例如使用密碼子uga用于色氨酸，而不是作為翻譯終止信號。因此，大多數(shù)支原體基因，如果被表達，將會在酵母中產生截短的蛋白質。這大大地避免了毒性基因產物的可能性。
可以在轉化到酵母細胞中之前從天然或合成的片段連同酵母載體一起來裝配核酸分子，或者可以同時共轉化到酵母細胞中?？梢酝ㄟ^將這些基因組或其他核酸分子(其已經(jīng)任選地如所希望的那樣進行了操作)轉移到相容的受者細胞中來創(chuàng)造新的生物。因此，一個實施方案提供了合適的技術用于將基因組和其他核酸分子轉移至酵母宿主細胞，修飾宿主細胞內的基因組而同時保持其穩(wěn)定性和完整性，和將經(jīng)克隆和操作的來自酵母宿主細胞的基因組移植回更近地與原始供者(例如，從其獲得所述核苷酸序列的生物)相似的受者細胞，如此創(chuàng)造出新的生物。
用于在酵母細胞中裝配核酸分子的商購可得的產品是
除了酵母之外的其他生物可以用于體內裝配。例如，已經(jīng)顯示，在非同源末端連接方面缺陷的突變型菌株中，以100％的頻率將外源dna整合到粗糙脈孢菌的基因組中的同源序列中(ninomiya等人,highlyefficientgenereplacementsinneurosporastrainsdeficientfornonhomologousend-joining,pnas,100:12248–12253,2004)。因此，本發(fā)明進一步包括涉及除了酵母之外的其他生物(例如，真菌，例如粗糙脈孢菌)的方法，以及涉及抑制和/或消除非同源末端連接以增加同源重組效率的方法。本質上，可以使用任何經(jīng)歷同源重組的細胞來裝配核酸分子。然而，最適合于本發(fā)明的該方面的細胞將會是這樣的細胞，所述細胞天然地在實施同源重組方面是有效的(例如，酵母)或者可以被改變(例如，通過誘變)以增加它們進行同源重組的頻率。
核酸分子的裝配和維持常常將會涉及核酸分子的產生或將核酸分子插入到細胞中，所述核酸分子包含諸如下列的元件：一個或多個復制起點(例如，兩個復制起點，其在不同的細胞類型中具有功能)和一個或多個選擇標記(例如，一個或多個正選擇標記和/或一個或多個負選擇標記)。
被引入到細胞中用于進行裝配的核酸分子通常將會具有允許它們以特定的次序進行裝配的某些特征。一種特征是待進行裝配的核酸分子之間的末端序列同源性。
可以將經(jīng)裝配的核酸分子引入到位于細胞內的其他核酸分子(例如，病毒基因組、核基因組、細胞器基因組、細菌染色體等)中。在此類情況下，功能元件例如復制起點、著絲粒等，通常將會存在于位于細胞內的其他核酸分子中。因此，本發(fā)明部分地提供了涉及核酸分子的裝配和所得的裝配體插入到其他核酸分子中的組合物和方法。
在一些情況下，可以采用部分地和完全地經(jīng)裝配的核酸分子的基于標準連接酶的連接。例如，可以用接近其末端的限制酶位點來產生完全地經(jīng)裝配的核酸分子。然后，可以用一種或多種合適的限制酶處理這些核酸分子以產生例如一個或兩個“粘性末端”。然后，可以通過標準的限制酶-連接酶方法將這些粘性末端分子引入到載體中。在惰性的核酸分子具有僅一個粘性末端的情況下，可以將連接酶用于“非粘性”末端的平頭末端連接。
經(jīng)裝配的核酸分子還可以包含賦予所希望的特性的功能元件(例如，復制起點、選擇標記等)。在許多情況下，經(jīng)裝配的核酸分子將會從多個獨個核酸區(qū)段來進行裝配，其中所述區(qū)段之一為載體(例如，線性載體)。
使用圖8的示意圖為了舉例說明的目的，該方法可以通過將眾多(例如，兩個、三個、五個、八個、十個、十五個、二十個、三十個等)希望進行裝配的“重疊”核酸片段連同宿主載體一起共轉化到宿主細胞中來進行。在該情況下，所述片段中的每一個包含兩個與被引入到宿主細胞中的其他核酸區(qū)段的區(qū)域具有同源性的區(qū)域。所述核酸區(qū)段在轉化到宿主細胞中后例如通過經(jīng)由同源性區(qū)域的同源重組來進行裝配。在圖8中所顯示的情況下，結果為經(jīng)裝配的、閉合的、環(huán)狀的核酸分子。
在圖8中所顯示的舉例說明性的例子的一個變化形式中，將環(huán)狀細菌基因組的重疊片段連同線性酵母載體一起共轉化到酵母宿主細胞中。再次地，酵母載體在其朝向細菌基因組的部分的末端處包含同源性區(qū)域。在將基因組片段和酵母宿主載體引入到宿主細胞中之后，所述片段和載體進行重組，由此連接了所述基因組片段和宿主載體。
在圖8中所顯示的過程部分地依賴于就閉合的、環(huán)狀的、可復制的核酸分子的裝配進行選擇。類似的選擇機制陳述在u.s.專利公開號2004/0219516a1(參見例如，該申請的圖20)(其公開內容通過提及而并入本文)中。當然，通過本發(fā)明的方法進行裝配的核酸分子不需要總是產生閉合的環(huán)狀核酸分子。可以通過本發(fā)明的方法產生的其他核酸分子包括線性質粒(例如，可以以線性形式進行復制的質粒)和染色體。
在圖8中所顯示的類型的體內裝配系統(tǒng)可以由兩個核心組分組成：(1)用于裝配的核酸區(qū)段；和(2)合適的宿主細胞。在其中在用于裝配的核酸區(qū)段中沒有提供所希望的功能元件(例如，復制起點、選擇標記等)的某些實施方案中，可以包括載體作為另外的核酸區(qū)段。
待裝配的片段通常將會包含在其末端重疊的序列。在一個實施方案中，所述重疊為大約10bp；在其他實施方案中，所述重疊可以為15、25、50、60、70、80或100堿基對，等等(例如，大約10至大約120、大約15至大約120、大約20至大約120、大約25至大約120、大約30至大約120、大約40至大約120、大約10至大約40、大約15至大約50、大約20至大約50等堿基對)。為了避免錯裝配，獨個重疊在所述片段之中不應當重復或緊密地配對。由于同源重組不要求在參與的核酸分子或區(qū)域之間的100％的序列同一性，因而每個末端應當足夠不同以防止錯裝配。進一步地，意欲經(jīng)歷相互之間的同源重組的末端應當共享至少90％、93％、95％或98％的序列同一性。
在體內裝配方法中，將所有待裝配的片段的混合物用于通過使用標準轉染技術來轉染宿主重組和裝配細胞。在混合物中的片段分子的數(shù)目與在待轉染的培養(yǎng)物中的細胞的數(shù)目之比應當足夠高以允許至少一些細胞攝取比在混合物中存在的不同片段多的片段分子。因此，在大多數(shù)情況下，轉染效率越高，將會存在越大數(shù)目的包含對于形成最終的所希望的經(jīng)裝配的核酸分子來說所需要的所有核酸區(qū)段的細胞。按照這些路線的技術參數(shù)陳述在u.s.專利出版號2009/0275086a1(其公開內容通過提及而并入本文)中。
用于連接不共享末端序列同源性的雙鏈核酸分子的裝配方法的一個例子顯示在圖5中。在該實施方案中，通過使用單鏈“縫合性核酸分子”，將兩個雙鏈片段引入到線性載體中。在某種意義上，這是五個核酸區(qū)段的裝配，其中所述區(qū)段中的一個為載體，所述區(qū)段中的兩個為兩個縫合性核酸分子，和最后兩個區(qū)段為被標注為片段1和片段2的區(qū)段。除了促進其他核酸分子的連接之外，縫合性核酸分子還將短的插入物(例如，九堿基對)引入到經(jīng)裝配的核酸分子中。包含這些特征的商購可得的產品是
還可以用位點特異性重組位點(例如，
通過其可以裝配核酸分子的一種手段是通過使用重組克隆化。因此，本發(fā)明包括與重組克隆化和重組位點以及重組克隆化組分有關的組合物和方法。
許多重組克隆化系統(tǒng)是已知的。可以在此類系統(tǒng)中使用的重組位點的例子包括但不限于：loxp位點；loxp位點突變體、變體或衍生物例如loxp511(參見u.s.專利號5,851,808)；frt位點；frt位點突變體、變體或衍生物；dif位點；dif位點突變體、變體或衍生物；psi位點；psi位點突變體、變體或衍生物；cer位點；和cer位點突變體、變體或衍生物。
典型地，這些克隆系統(tǒng)基于這樣的原則，即特定的重組位點將會與其關連對應物進行重組?？梢詫Ρ景l(fā)明的核酸分子進行設計，只要它們包含不同的重組克隆系統(tǒng)的重組位點(例如，lox位點和att位點)。作為例子，本發(fā)明的核酸分子可以包含單個lox位點和兩個att位點，其中att位點不相互重組。
用于在本發(fā)明中使用的重組位點可以是任何能夠在重組反應中充當?shù)孜锏暮怂帷＿@樣的重組位點可以是野生型的或天然出現(xiàn)的重組位點，或者經(jīng)修飾的、變異的、衍生的或突變的重組位點。用于在本發(fā)明中使用的重組位點的例子包括但不限于，λ噬菌體重組位點(例如attp、attb、attl和attr以及其突變體或衍生物)和來自其他噬菌體例如phi80、p22、p2、186、p4和p1的重組位點(包括lox位點，例如loxp和loxp511)。經(jīng)突變的att位點(例如，attb1-10、attp1-10、attr1-10和attl-110)描述在1999年5月28日提交的u.s.申請?zhí)?0/136,744，和2000年3月2日提交的u.s.申請系列號09/517,466中，這些文獻通過提及而明確地并入本文。其他具有單一特異性的重組位點(即，第一個位點將會與其相應的位點重組，而不會與具有不同特異性的第二個位點重組)是本領域技術人員已知的，并且可以用于實踐本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明，關于所指出的重組位點可以使用用于這些系統(tǒng)的相應的重組蛋白。提供了用于在本發(fā)明中使用的重組位點和重組蛋白的其他系統(tǒng)包括來自釀酒酵母的flp/frt系統(tǒng)、解離酶家族(例如，tndx、tnpx、tn3解離酶、hin、hjc、gin、spcce1、para和cin)和is231以及其他蘇云金芽孢桿菌(bacillusthuringiensis)轉座元件。用于在本發(fā)明中使用的其他合適的重組系統(tǒng)包括xerc和xerd重組酶以及大腸桿菌中的psi、dif和cer重組位點。其他合適的重組位點可以在elledge和liu的u.s.專利號5,851,808(其通過提及而明確地并入本文)中找到?？梢栽诒景l(fā)明的實踐中使用的重組蛋白和突變的、經(jīng)修飾的、變異的或衍生的重組位點包括：在u.s.專利號5,888,732和6,143,557中以及在基于u.s.臨時申請?zhí)?0/108,324(1998年11月13日提交)的u.s.申請系列號09/438,358(1999年11月12日提交)和基于u.s.臨時申請?zhí)?0/136,744(1999年5月28日提交)的u.s.申請系列號09/517,466(2000年3月2日提交)中所描述的那些，以及與從lifetechnologiescorp.(carlsbad,calif.)可得的
可以在本發(fā)明的實踐中使用的重組位點的代表性例子包括上面所提到的att位點。與其他att位點特異性地重組的att位點可以通過改變在7-堿基對重疊區(qū)域中和附近的核苷酸來進行構建。因此，適合于在本發(fā)明的方法、組合物和載體中使用的重組位點包括但不限于，在15-堿基對核心區(qū)域(gcttttttatactaa)內具有一個、兩個、三個、四個或更多個核苷酸堿基的插入、缺失或置換的那些，該15-堿基對核心區(qū)域在所有四種野生型λatt位點即attb、attp、attl和attr中是相同的(參見1996年6月7日提交的u.s.申請系列號08/663,002(現(xiàn)在的u.s.專利號5,888,732)和1998年10月23日提交的u.s.系列號09/177,387，其進一步詳細地描述了核心區(qū)域，并且其公開內容通過提及而以其整體并入本文)。適合于在本發(fā)明的方法、組合物和載體中使用的重組位點還包括，在15-堿基對核心區(qū)域(gcttttttatactaa)內具有一個、兩個、三個、四個或更多個核苷酸堿基的插入、缺失或置換的那些，其與該15-堿基對核心區(qū)域至少50％同一，至少55％同一，至少60％同一，至少65％同一，至少70％同一，至少75％同一，至少80％同一，至少85％同一，至少90％同一，或至少95％同一。
類似地，在attb1、attp1、attl1和attr1中的核心區(qū)域彼此是相同的，正如在attb2、attp2、attl2和attr2中的核心區(qū)域那樣。適合用于本發(fā)明的核酸分子還包括，在該15-堿基對核心區(qū)域(gcttttttatactaa)內出現(xiàn)的7-堿基對重疊區(qū)域(tttatac，其通過用于整合酶蛋白的切割位點來定義并且是其中發(fā)生鏈交換的區(qū)域)之內包含一個、兩個、三個、四個或更多個核苷酸的插入、缺失或置換的那些。
多位點
本發(fā)明還涉及使用一種或多種拓撲異構酶來產生經(jīng)裝配的核酸分子的方法?？梢詫⑼負洚悩嬅概c本文所描述的重組克隆技術相組合地進行使用。例如，可以使用由拓撲異構酶介導的反應來將一個或多個重組位點附著至一個或多個核酸區(qū)段。然后，所述區(qū)段可以進一步地通過使用例如重組克隆技術來進行操作和組合。
在一個方面，本發(fā)明提供了這樣的方法，其用于通過使用拓撲異構酶(例如，ia型；ib型，例如痘苗病毒拓撲異構酶；和/或ii型拓撲異構酶)來連接第一個和至少第二個核酸區(qū)段，從而經(jīng)連接的區(qū)段的任一條鏈或兩條鏈在所述區(qū)段進行連接的位點處共價地連接在一起。
用于產生在一條鏈中共價地連接的雙鏈重組核酸分子的方法可以通過下述方式來施行：使在5’或3’末端處具有位點特異性拓撲異構酶識別位點(例如，ia型或ii型拓撲異構酶識別位點)或其切割產物的第一個核酸分子與第二個(或另一個)核酸分子和任選地拓撲異構酶(例如，ia型、ib型和/或ii型拓撲異構酶)相接觸，從而可以將第二個核苷酸序列共價地附著至第一個核苷酸序列。如本文所公開的，本發(fā)明的方法可以以下述方式來施行：使用許多核苷酸序列，通常地，其中核苷酸序列中至少一個在5’和/或3’末端之一或兩者處具有位點特異性拓撲異構酶識別位點(例如，ia型、ib型或ii型拓撲異構酶)或其切割產物的核酸分子。
由拓撲異構酶介導的核酸連接方法詳細描述在u.s.專利公開號2004/0265863a1(其全部公開內容通過提及而并入本文)中。
可以進行克隆的經(jīng)裝配的核酸分子可以包含待連接的平頭末端，并且在克隆方法中所牽涉的第二個核酸分子可以在待通過位點特異性拓撲異構酶(例如，ia型或ib型拓撲異構酶)進行連接的末端處包含突出端，其中所述突出端包括與包含平頭末端的序列互補的序列，由此促進鏈侵入以作為用于正確地定位用于連接反應的末端的手段。
在本發(fā)明的實踐中可以使用許多載體。進一步地，用于特定應用的載體的選擇將會隨這些應用的細節(jié)(例如，宿主細胞)而變化。在許多情況下，將會以線性形式將載體引入到宿主細胞中。
用于在本發(fā)明中使用的合適的載體還包括原核載體，例如pcdnaii，psl301，pse280，pse380，pse420，ptrchisa、b和c，prseta、b和c(lifetechnologiescorp.)，pgemex-1，和pgemex-2(promega,inc.)，pet載體(novagen,inc.)，ptrc99a，pkk223-3，pgex載體，pezz18，prit2t，和pmc1871(pharmacia,inc.)，pkk233-2，和pkk388-1(clontech,inc.)，和pproex-ht(lifetechnologiescorp.)，以及其變體和衍生物。其他目的載體包括真核表達載體，例如pfastbac，pfastbacht，pfastbacdual，psfv，和ptet-splice(lifetechnologiescorp.)，peuk-c1，ppur，pmam，pmamneo，pbi101，pbi121，pdr2，pcmvebna，和pyacneo(clontech)，psvk3，psvl，pmsg，pch110，和pkk232-8(pharmacia,inc.)，p3'ss，pxt1，psg5，ppbac，pmbac，pmc1neo，和pog44(stratagene,inc.)，以及pyes2，pac360，pbluebachisa、b和c，pvl1392，pbluebaciii，pcdm8，pcdna1，pzeosv，pcdna3，prep4，pcep4，和pebvhis(lifetechnologiescorp.)，以及其變體或衍生物。
適合于在本發(fā)明中使用的其他載體包括puc18，puc19，pbluescript，psport，粘粒，噬菌粒，yac(酵母人工染色體)，bac(細菌人工染色體)，p1(大腸桿菌噬菌體)，pqe70，pqe60，pqe9(qiagen)，pbs載體，phagescript載體，bluescript載體，pnh8a，pnh16a，pnh18a，pnh46a(stratagene)，pcdna3(lifetechnologiescorp.)，pgex，ptrsfus，ptrc99a，pet-5，pet-9，pkk223-3，pkk233-3，pdr540，prit5(pharmacia)，psport1，psport2，pcmvsport2.0和psv-sport1(lifetechnologiescorp.)，以及其變體或衍生物。
除了本文所描述的其他方法之外，裝配方法也能夠小型化和/或自動化。事實上，在許多情況下，當被裝配和/或引入到載體中的核酸分子以較低的總數(shù)目存在時，小型化將會是所希望的。通過其可以實現(xiàn)微混合以為了裝配和諸如將核酸分子插入到載體中之類的過程的一種手段是通過電潤濕，例如，如在本文別處所描寫的。
圖16是用于加工本發(fā)明的核酸分子的設備的一個實施方案的方框圖。在該圖的左上部是載體油儲器(1600)和用于從該儲器運輸油的管(1601)。載體油被運輸經(jīng)過一系列額外的包含試劑的儲器(1602)。環(huán)狀結構表示獨個試劑儲器。示例性的試劑為核酸分子、pcr酶、引物和載體，以及例如其他與模塊3相關的成分。所述試劑通常將會以水性囊泡的形式在油屏障之間進行運輸。
然后，將通過載體油進行運輸?shù)脑噭┻\輸至混合室(1603)，在那里發(fā)生混合。然后，試劑繼續(xù)前進至數(shù)字pcr站(1604)。管(1601)在其中發(fā)生變性的加熱塊(1605)與其中發(fā)生退火和pcr的冷卻塊(1606)之間游走。在第一次后每當囊泡游走至冷卻塊(1606)時，發(fā)生pcr擴增。
在離開數(shù)字pcr站(1604)后，囊泡移動經(jīng)過額外的試劑儲器(1607)以便任選地添加更多試劑(例如，緩沖液、錯誤校正組分，等等)，然后繼續(xù)前進至另一個任選的混合室(1608)。然后，囊泡繼續(xù)前進至任選的儲存場所(1609)。在多于一個的核酸分子待裝配成更大分子的情況下，用于裝配的獨個核酸分子常常將會在不同的時間抵達儲存場所(1609)，并且將會需要隔離一段時間直至其他組分抵達。
然后，核酸分子繼續(xù)前進至另一個數(shù)字pcr站(1610)，并且再次在冷卻塊與加熱塊之間循環(huán)。錯誤校正反應可以在數(shù)字pcr站(1610)中發(fā)生。最后，將經(jīng)裝配的核酸分子運輸至界面出口(1611)以進行收集，并且將廢棄材料(例如，載體油)收集在廢物儲器(1612)中。
圖16中所呈現(xiàn)的類型的系統(tǒng)可以同時加工多個樣品。這些樣品可以被隔離在載體油之間，并且連續(xù)地通過該系統(tǒng)進行運送。圖16的方框圖未顯示計算機系統(tǒng)、光學部件、閥門和其他與系統(tǒng)自動化有關的部件?？梢允褂霉鈱W元件以及其他元件(例如，電氣元件)來記錄在該流動系統(tǒng)中試劑囊泡和各種點的位置和鑒定。這些試劑囊泡通常將會包含具有預定的序列的核酸分子。因此，本發(fā)明包括用于同時加工(例如，順次加工)多個樣品的方法。
模塊4
在分離和處理之后，可以通過使用本文所描述的或本領域已知的方法來進一步將經(jīng)裝配的核酸分子移植到受者細胞中?？梢允褂玫姆椒òㄔ|體和原生質球融合、接合轉移(例如，細菌接合)、病毒感染、電穿孔和由仙臺病毒介導的細胞融合。因此，本發(fā)明包括用于將合成的和/或經(jīng)裝配的核酸分子轉移至細胞的方法。
用于產生酵母原生質體融合的一種方法陳述在nakazawa和iwano,efficientselectionofhybridsbyprotoplastfusionusingdrugresistancemarkersandreportergenesinsaccharomycescerevisiae,j.biosci.bioeng.98:353-358(2004)中。進一步地，已經(jīng)開發(fā)出了用于原核和真核細胞的融合的方法(參見例如，gyuris和duda,high-efficiencytransformationofsaccharomycescerevisiaecellsbybacterialminicellprotoplastfusion,mol.cell.biol.6:3295-3297(1986)。諸如這些的方法可以在本發(fā)明的實踐中使用，以在細胞之間轉移核酸分子而不將核酸分子暴露于細胞外環(huán)境。可以使用的其他方法包括天然感受態(tài)、生物射彈槍、電穿孔、由桿狀病毒介導的轉導和iii型分泌系統(tǒng)。
示例性的移植實驗方案描述在pct公開wo2011/109031中。一種用于將來自供者的支原體(mycoplasma)基因組移植到支原體受者的方法由lartigue等人,genometransplantationinbacteria:changingonespeciestoanother,science317:632(2007)進行了描述。該工作涉及通過經(jīng)由使用由聚乙二醇介導的轉化而以裸dna施行基因組移植，用來自另一個物種的基因組完全代替細菌細胞的基因組。所得的受者細胞在表型上與供體菌株是相同的。此類方法可以用于將通過本發(fā)明的方法構建出的經(jīng)裝配的核酸分子轉移至受者細胞。
通常地，將會基于其支持從經(jīng)裝配的核酸分子進行的基因表達的能力來選擇受者細胞。例如，在已經(jīng)在具有合適的遺傳操作系統(tǒng)的真核宿主細胞(例如，酵母)中裝配了細菌基因組后，那么可能需要或希望將基因組移植回細菌受者細胞中。除了其他因素外，翻譯和轉錄方面的差異以及不同的密碼子使用尤其可以阻止供者基因產物在宿主細胞中的表達。因此，受者細胞可以是與供者細胞或生物相同的物種或相似的物種。在許多情況下，受者細胞將會是與供者相同的目或界。但是，在需要在不相關的細胞類型中進行表達的情況下，最初的基因設計可以包括密碼子和序列優(yōu)化策略以允許在不同的受者細胞中的表達。
在瓊脂糖塞子中分離供者核酸后，可以任選地去除宿主dna(例如，通過消化和/或電泳)，和任選地用甲基轉移酶和/或蛋白酶進行處理。
可以使瓊脂糖塞子融化，例如通過與β-瓊脂糖酶i(newenglandbiolabs)一起進行溫育，如在pct公開wo2011/109031的實施例3a(ii)(b)中所描述的那樣。
移植可以在聚乙二醇(peg)，例如peg-6000或peg-8000或者其他peg存在下進行，以促進轉化。可以變換peg的來源、數(shù)量和大小以確定最佳的peg。在一個例子中，所述peg為peg-2000、peg-4000、peg-6000、peg-8000、peg-10000、peg-20000，等等。取決于移植的條件，peg的濃度可以變化；濃度包括，例如處于或大約5％或者處于或大約10％的那些。例子描述在pct公開wo2011/109031的實施例3a(ii)(c)中?？梢栽谳p輕搖動以進行混合的情況下，在peg存在下，向受者細胞添加經(jīng)融化的塞子。讓細胞恢復，進行離心，并使其在包含合適的選擇培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中進行生長，以選擇包含經(jīng)移植的供者核酸的受者細胞。在一個方面，將細胞在培養(yǎng)基上進行鋪板，并使其在對于受者細胞類型來說合適的條件下進行生長直至集落出現(xiàn)。可以挑取集落，并使其在選擇培養(yǎng)基中進一步進行生長以產生所希望的數(shù)量的包含經(jīng)移植的基因組或其他供者核酸的受者細胞。
在需要時，可以保持特定的受者細胞與供者核酸的比例。在一個例子中，可以保持處于或大約107個受者細胞/2μg基因組dna至處于或大約108個受者細胞/2μg基因組dna的比例。所提供的移植方法可以用于得到大約30個轉化體/200ng內源基因組dna，或500至1500個移植物/反應，或者其他合適的從宿主或供者細胞獲得的量。在一個非限制性的例子中，用107個受者細胞、20皮升的包含100ng/μl的供者基因組的經(jīng)融化的瓊脂糖塞子來進行移植。將會理解，取決于細胞類型，受者細胞與供者核酸的比例可以變化；并且可以使用經(jīng)驗評估來優(yōu)化該比例。
包含經(jīng)移植的供者核酸的受者細胞的選擇可以通過許多手段來施行。例如，經(jīng)移植的供者核酸可以包含正選擇標記，其將會允許它在受者細胞中進行維持。此外，可以在受者細胞基因組中引入反選擇標記，以允許針對保留這些核酸分子的細胞進行選擇。如果想要包含經(jīng)移植的供者核酸而非原始的受者細胞基因組的經(jīng)改造的受者細胞，那么可以采用正選擇和反選擇的組合。
進一步地，在一些實施方案中，可以將眾多(例如，兩個、三個、四個、五個等)供者核酸分子(例如，來自不同生物的基因組)引入到單個宿主細胞中。例如，可以產生包含兩種不同生物的基因組(例如，來自不同物種的兩個支原體基因組)的二倍體酵母菌株，通過使兩個不同的單倍體菌株(每個攜帶所述基因組之一)進行雜交。使單倍體酵母菌株雜交可以通過使用眾所周知的方法來進行。
可以在各自單倍體菌株中使用多個不同的選擇標記，以允許在雜交后選擇出包含兩個基因組的細胞。例如，可以將his3和trp標記分別引入到攜帶不同基因組的兩個不同的單倍體細胞中，隨后在缺乏組氨酸和色氨酸的培養(yǎng)基上選擇二倍體細胞，如在pct公開wo2011/109031的實施例中所描述的那樣。
可以將經(jīng)裝配的核酸分子用于許多目的。例如，在許多情況下，將會希望將此類分子引入到細胞中以為了特定的應用。經(jīng)裝配的核酸分子的組分和其中引入它們的細胞將會隨特定的應用而變化。
應用的一個舉例說明是原核生產細胞系，對于其而言經(jīng)裝配的核酸分子代表整個基因組。該基因組可以設計為最小功能性，其中表現(xiàn)出/不存在下列特征：
1.缺乏經(jīng)歷接合或交配的能力(安全特征)；
2.缺乏合成關鍵營養(yǎng)物的能力(安全特征)；
3.保持高的能量負荷(生產效率特征)；
4.用于產生所希望的終產物的途徑(生產特征)。
盡管在通過本發(fā)明的方法產生的細胞中包括或從通過本發(fā)明的方法產生的細胞中排除的特征可以很大地變化，但是在許多情況下，將會包括安全特征以防止生物的“逃跑”，并限制所述生物將性狀轉移給其他生物的能力?？梢园ㄉa特征以為了具體應用而對生物進行適應調整。該適應調整可以以用“底盤”生物目前不可能的方式進行精細微調?！暗妆P”生物是具有所希望的應用的許多特征但需要修飾以使它完全適合的生物。通常地，該修飾由于下列原因而產生：(1)一個或多個基因和/或途徑的失活；和/或(2)一個或多個基因的引入。在一些情況下，可以將經(jīng)裝配的核酸分子引入到“底盤”生物中，其中具有或沒有“底盤”生物基因組的最終去除。
受者細胞可以為例如，細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞、植物細胞或藻類細胞。
本發(fā)明包括用于產生被設計用于獲得所希望的終產物的高水平生產的核酸分子(例如，獨個編碼元件、基因組等)的方法，以及所述核酸分子本身和其中引入這些核酸分子的生物。使用氨基酸生物合成用于舉例說明的目的，許多生物可以自己產生賴氨酸，但以有限的量。在許多情況下，l-天冬氨酸是關于l-賴氨酸生產的起始化合物。進一步地，可以作為天冬氨酸至賴氨酸的轉化的一部分而產生的氨基酸包括l-蘇氨酸、l-甲硫氨酸和l-異亮氨酸。進一步地，許多酶參與天冬氨酸至賴氨酸的轉化，經(jīng)常以天冬氨酸激酶開始。正如對于本領域技術人員來說將會是顯然的，還可以改變與l-賴氨酸的合成相關的途徑，以為了l-蘇氨酸、l-甲硫氨酸和/或l-異亮氨酸的高水平生產。參與l-賴氨酸、l-蘇氨酸、l-甲硫氨酸和l-異亮氨酸的產生的酶陳述在u.s.專利號7,323,321(其全部公開內容通過提及而并入本文)中。
可以采用途徑改造來在代謝途徑中的特定點處引入組成型、誘導型和阻抑型啟動子，以驅動生產朝向所設計的終產物(例如，l-賴氨酸)。經(jīng)常將會以這樣的方式采用途徑改造，即允許將細胞的細胞資源(例如，能量負荷、營養(yǎng)物)的方向導向兩個功能：(1)細胞生長/分裂；和(2)終產物產生。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明包括用于設計和構建細胞的方法，以及細胞本身，所述細胞將細胞資源引導到兩個功能上去：(1)細胞生長/分裂；和(2)終產物產生。
本發(fā)明的細胞可以被設計成不參與正常與野生型細胞相關的活動。這些活動之一是交配。交配消耗細胞資源并促進基因傳播。在許多情況下，交配的這些效應中沒有一個將會是希望的。進一步地，在一些情況下，交配導致孢子形成。孢子形式化對于生物的儲存來說可能是希望的，但是，在許多情況下，如果希望孢子形成，那么可以將交配基因置于嚴密的調節(jié)控制之下或者在載體上接受指導。
在一些實施方案中，本發(fā)明包括被設計和構建成具有最小基因組以為了所希望的目的的細胞。作為例子，dna復制、轉錄和翻譯消耗細胞資源。因此，一種用于提供有效的細胞資源引導的方法是設計和/或使用具有最小基因組的細胞。
關于細胞分裂，如果對于細胞功能來說所需要的基本分子降低至低于某些水平，那么細胞生長和分裂通常將會受到影響。再次使用氨基酸生產用于舉例說明的目的，當賴氨酸是所希望的終產物時，存在至少三種選擇來提供用于細胞代謝的合適濃度的蘇氨酸、甲硫氨酸和異亮氨酸：(1)允許通過備選途徑來產生這些氨基酸；(2)使用允許作為賴氨酸生產的副產物而稍許產生這些氨基酸的啟動子；和(3)外源地供應這些氨基酸。
因此，本發(fā)明包括用于細胞的途徑改造的方法，此類方法包括：
(a)合成眾多核酸分子，其中以微量制備每個核酸分子；
(b)將一些或所有存在于在(a)中形成的匯集物中的核酸分子進行連接，從而形成眾多更大的核酸分子；和
(c)將所述眾多更大的核酸分子進行裝配，從而形成編碼至少兩種表達產物的核酸分子，
其中所述至少兩種表達產物中的至少兩種處于相同的將起始化合物(例如，l-天冬氨酸)轉化為所希望的終產物(例如，l-賴氨酸、l-異亮氨酸等)的生物學途徑中。
本發(fā)明的各種不同的實施方案包括用于細胞的途徑改造的由計算機施行的方法。這些方法可以通過執(zhí)行在計算機可讀的介質上所編碼的指令而由處理器來施行。根據(jù)各種不同的實施方案，所述指令可以用于下列步驟：
(a)合成眾多核酸分子，其中以微量制備每個核酸分子；
(b)將一些或所有存在于在(a)中形成的匯集物中的核酸分子進行連接，從而形成眾多更大的核酸分子；和
(c)將所述眾多更大的核酸分子進行裝配，從而形成編碼至少兩種表達產物的核酸分子，
其中所述至少兩種表達產物中的至少兩種處于相同的將起始化合物(例如，l-天冬氨酸)轉化為所希望的終產物(例如，l-賴氨酸、l-異亮氨酸等)的生物學途徑中。
本發(fā)明的技術的一個應用在于生物燃料生產。在許多情況下，這涉及將碳源轉化為生物燃料或生物燃料前體。生物燃料或生物燃料前體可以廣泛地變化，如適合于其生產的細胞所做的那樣。在許多情況下，用于生產生物燃料或生物燃料前體的細胞將會是藻類細胞或植物細胞。可以在本發(fā)明的這個和其他方面中使用的示例性的藻類包括：魚腥藻屬物種(anabaenasp.)、雷氏衣藻(chlamydomonasreinhardtii)、小球藻屬物種(chlorellasp.)、小環(huán)藻屬物種(cyclotellasp.)、紫色粘桿菌(gloeobacterviolaceus)、微擬球藻屬物種(nannochloropsissp.)、節(jié)球藻屬物種(nodulariasp.)、念珠藻屬物種(nostocsp.)、原綠球藻屬物種(prochlorococcussp.)、聚球藻屬物種(synechococcussp.)、顫藻屬物種(oscillatoriasp.)、節(jié)旋藻屬物種(arthrospirasp.)、鞘絲藻屬物種(lyngbyasp.)、杜氏藻屬物種(dunaliellasp.)和集胞藻屬物種(synechocystissp.)。
許多植物物種可以從單個的或小數(shù)目的植物細胞來進行培養(yǎng)。因此，可以產生在大多數(shù)(如果不是全部)其細胞中包含經(jīng)裝配的核酸分子的植物?？梢栽诒景l(fā)明的這個和其他方面中使用的示例性的植物包括：玉米、大豆、油菜、甘蔗、芥菜、柳枝稷和麻風樹。
生產生物燃料、生物燃料前體和相關化合物的應用對于包括下列方面的應用可以是有用的：空間加熱，照明，烹飪，以及汽車發(fā)動機和發(fā)電機的運轉。
示例性的生物燃料和生物燃料前體包括具有大于3個碳原子直至21個碳的正鏈醇(醇基團-oh附著至末端碳)。可以通過本發(fā)明的方法來生產的正鏈醇包括：正丁醇、正戊醇、正己醇、正庚醇、正辛醇(辛醇)、正壬醇(壬醇)、正癸醇(癸醇)、正十二烷醇(月桂醇)、正十五烷醇、正十六烷醇(鯨蠟醇)、正十四烷醇(肉豆蔻醇)、順9-十六碳烯-1-醇(棕櫚醇)、正十八烷醇(硬脂醇)、9e-十八碳烯-1-醇(反式十八烯醇)、順-9-十八碳烯-1-醇(油醇)、9z,12z-十八碳二烯-1-醇(亞油醇)、9e,12e-十八碳二烯-1-醇(反式亞油醇)、9z,12z,15z-十八碳三烯-1-醇(亞麻醇)、9e,12e,15e-十八碳三烯-1-醇(反式亞麻醇)、12-羥基-9-十八碳烯-1-醇(蓖麻油醇)和1-二十烷醇(花生醇)或其組合。正鏈醇可以是飽和的或不飽和的。
正丁醇可以通過微生物發(fā)酵產生，化學合成，或者通過細菌作用(例如，通過本發(fā)明的方法產生的經(jīng)改造的細菌)從植物來源獲得。這包括從包含纖維素的植物，從包含木質素的植物，從污水和動物排泄物，從由植物來源獲得的糖，通過涉及藻類(例如，通過本發(fā)明的方法產生的經(jīng)改造的藻類)的發(fā)酵來獲得丁醇。也可以以相似的方式獲得高級醇。
本發(fā)明還可以用于生產化學中間體。此類中間體的例子為1,4-丁二醇和1,3-丙二醇。1,4-丁二醇是一種雙官能醇，其在化學工業(yè)中具有廣泛的用途。作為例子，丁二醇及其衍生物用于塑料、聚氨酯類、溶劑、電子化學品和彈性纖維的生產。1,4-丁二醇合成途徑陳述在burk,internationalsugarjournal112:30-35(2010)中。因此，本發(fā)明包括為了生產化學中間體(例如，1,4-丁二醇、1,3-丙二醇等)或為了增加化學中間體的生產而進行改造的細胞，以及用于設計和產生此類細胞的方法。
另外的應用
正如本領域技術人員將會理解的，核酸分子以微量(例如，飛摩爾至納摩爾的量，例如大約0.001飛摩爾至大約1.0納摩爾、大約0.01飛摩爾至大約1.0納摩爾、大約0.1飛摩爾至大約1.0納摩爾、大約0.001飛摩爾至大約0.1納摩爾、大約0.001飛摩爾至大約0.01納摩爾、大約0.001飛摩爾至大約0.001納摩爾、大約1.0飛摩爾至大約1.0納摩爾、大約1.0飛摩爾至大約0.1納摩爾、大約1.0飛摩爾至大約0.01納摩爾、大約1.0飛摩爾至大約0.001納摩爾、大約10飛摩爾至大約1.0納摩爾、大約10飛摩爾至大約0.001納摩爾、大約20飛摩爾至大約1.0納摩爾、大約100飛摩爾至大約1.0納摩爾、大約500飛摩爾至大約1.0納摩爾、大約1納摩爾至大約800納摩爾、大約40納摩爾至大約800納摩爾、大約100納摩爾至大約800納摩爾、大約200納摩爾至大約800納摩爾、大約500納摩爾至大約800納摩爾、大約100納摩爾至大約1,000納摩爾等)產生。
本發(fā)明可以用于制備微陣列。此類微陣列可以以多種方式產生，包括通過將核酸分子沉積在支持物(例如，固體支持物，例如平面固體支持物)上或通過直接在支持物上合成核酸。在一個實施方案中，可以修飾圖2a-2b中所顯示的平板，從而將基底/底部設計成用于在其表面上合成核酸。任選地，可以將基底構造成可移動的，以產生例如平面微陣列。在大多數(shù)此類情況下，在核酸合成過程中將會省略圖2a-2b中所顯示的珠粒。因此，本發(fā)明包括用于產生微陣列的方法。
用于打印微陣列的方法陳述在u.s.專利號5,807,522和7,211,148(其公開內容通過提及而并入本文)中。此類方法可以在本發(fā)明的實踐中使用以產生例如微陣列，通過使如本文所描述的那樣產生的核酸分子沉積。
本文所描述的方法的一個優(yōu)點是其模塊性。作為例子，可以在與陣列相同的平板上產生形成不同的更大的核酸分子的亞部分的核酸分子。因此，本發(fā)明的方法允許同時產生核酸分子，隨后為選擇獨個的合成的核酸分子用于以后的過程(例如，匯集、切割、去保護和裝配)。因此，本發(fā)明的方法包括那些方法，其中同時產生(例如，化學合成)核酸分子，隨后裝配成兩個或更多個(例如，二至十個、三至十個、四至十個、五至十個、二至三十個、五至三十個、十至三十個、五至五十個等)更大的核酸分子。
在某些實施方案中，通過本發(fā)明的方法合成的核酸分子或眾多核酸分子可以是引物和/或探針。引物和/或探針可以通過使用例如本文所描述的固體支持物以微量產生。引物引發(fā)可以為擴增反應的一部分的核酸延伸反應。探針用于檢測靶核酸序列。因此，在檢測方法中使用探針來直接或間接地檢測靶核酸序列。引物和探針通常具有與靶核酸序列雜交或者與靶核酸序列結合的預定的核苷酸序列。在舉例說明性的實施方案中，探針包括標記物，例如熒光標記物。例如，可以將控制機構與在本發(fā)明的方法中所使用的固體支持物或固體支持物陣列相連接，其中將靶核苷酸序列輸入到控制機構中。所述控制機構可以用于指導添加用于核酸合成的反應物的順序，從而合成具有靶核苷酸序列的核酸分子。
由于它們與靶核酸序列共享的序列同一性，探針和引物與靶核酸序列雜交或者與靶核酸序列結合。例如，引物或探針可以與靶核酸序列共享80、85、90、95、96、97、98、99、99.5或100％的連續(xù)序列同一性。引物和探針與其靶核酸序列在嚴緊和通常高嚴緊條件下進行雜交，正如本領域所已知的那樣。
可以將標記物附著至本發(fā)明的引物和/或探針的5’末端核苷酸、3’末端核苷酸或任何內部核苷酸。在某些舉例說明性的實施方案中，標記物為熒光團。大批的熒光團是本領域技術人員已知的，并且可以包括在本發(fā)明的方法和組合物中。參見例如cardullo等人,proc.natl.acad.sci.usa85:8790-8794(1988)；dexter,d.l,j.ofchemicalphysics21:836-850(1953)；hochstrasser等人,biophysicalchemistry45:133-141(1992)；selvin,r,methodsinenzymology246:300-334(1995)；steinberg,i.,ann.rev.biochem,40:83-114(1971)；stryer,l.,ann.rev.biochem,47:819-846(1978)；wang等人,tetrahedronletters31:6493-6496(1990)；wang等人,anal.chem.67:1197-1203(1995)。例如，所述熒光團可以為biosearchblue、fam、tet、calfluor染料、joe、vic、hex、quasar染料、cy染料、ned、tamra、rox、德克薩斯紅或pulsar染料。這些染料和包括這些染料的核酸合成反應物是商購可得的，例如，從biosearchtechnologies,inc.、glenresearch或lifetechnologies。
在舉例說明性的實施方案中，通過本文所提供的方法而合成的引物為pcr引物。在某些實施方案中，用標記物在其5’末端或3’末端對引物進行標記。例如，引物可以為lux引物、蝎形引物、amplifluor引物和/或plexor引物。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供了用于合成眾多引物和探針組(例如，對)的方法。所述引物和探針組(例如，對)可以通過使用本文所描述的平板(例如，圖2a-2b中所顯示的一般形式的平板)以微量產生。所述引物和探針組(例如，對)包括一個或多個引發(fā)延伸反應的引物，所述延伸反應產生核酸延伸產物，所述核酸延伸產物為關于所述引物和探針組(例如，對)的一個或多個探針的靶核酸序列。換言之，在引物和探針組(例如，對)中，探針通常與通過所述引物而產生的擴增產物相結合。在舉例說明性的實施方案中，所述引物和探針組(例如，對)包括pcr引物對以及與通過使用所述引物對的擴增反應而產生的擴增產物相結合的探針。例如，所述引物和探針組(例如，對)可以包括兩個pcr引物以及一個5’核酸酶探針或一個分子信標探針，其與當在pcr反應中使用所述pcr引物時所產生的擴增產物相結合。
如上面所指明的，本發(fā)明的方法可以產生核酸分子(例如，引物、探針和/或引物和探針組(例如，對))的陣列。例如，可以在這樣的位置陣列中合成核酸分子，從而每個位置包括一個或眾多核酸分子例如引物、探針和/或引物和探針組(例如，對)。陣列可以以100、200、250、500、1000、10,000、100,000、1,000,000或10,000,000/cm2的密度包括引物、探針以及引物和探針組(例如，對)。在通過使用本發(fā)明的方法而產生的核酸分子陣列中的核酸分子總數(shù)目可以包括，例如100、200、250、500、1000、10,000、100,000、1,000,000、10,000,000、100,000,000、1,000,000,000或10,000,000,000個引物、探針和/或引物和探針組(例如，對)?？梢栽陉嚵形恢弥邪ǘ嘤谝粋€的引物和探針組(例如，對)，從而所述引物和探針組(例如，對)被設計成施行多重反應，例如多重pcr反應。
本發(fā)明的探針可以用單個染料(例如，單個熒光團)進行標記。本發(fā)明的探針可以為fish探針。
本發(fā)明的探針可以是在擴增反應中使用的探針。例如，這些探針可以是經(jīng)雙重標記的探針。在某些舉例說明性的實施方案中，經(jīng)雙重標記的探針包括這樣的標記物，其是給體-受體能量轉移對，例如fret對。當給體(熒光團)是利用給體-受體能量轉移的探針的組分時，優(yōu)選地如此選擇本發(fā)明的給體發(fā)熒光的部分和猝滅劑(受體)，從而所述給體和受體部分在當給體部分被激發(fā)時展現(xiàn)出給體-受體能量轉移。在選擇熒光團-猝滅劑對中要考慮的一個因素是在它們之間給體-受體能量轉移的效率。在許多情況下，在給體和受體部分之間fret的效率為至少10％，至少50％或至少80％。fret的效率可以容易地通過使用本文所描述的和本領域已知的方法根據(jù)經(jīng)驗進行測試。
在一些情況下，給體-受體對可以包括熒光團和猝滅劑。猝滅劑可以是暗猝滅劑。如此，本發(fā)明的探針可以包括bhq染料或dq染料(epoch)作為猝滅劑。在其他實施方案中，猝滅劑可以為dabcyl或tamra。
通過使用本發(fā)明的方法和系統(tǒng)而合成的引物和探針可以包括使核酸的雜交穩(wěn)定化的部分(例如，嵌入劑、小溝結合部分、用穩(wěn)定化部分(例如，炔基部分和氟烷基部分)進行修飾的堿基)，和構象穩(wěn)定化部分，例如在u.s.專利申請公開號2007/0059752(其公開內容通過提及而并入本文)中公開的那些。引物和探針可以包括嵌入試劑，例如吖啶。在其他實施方案中，通過使用本發(fā)明的方法和系統(tǒng)而合成的引物和探針可以為鎖定核酸(lna)探針或肽核酸(pna)探針。
可以將通過使用本發(fā)明的方法和系統(tǒng)而合成的經(jīng)雙重標記的探針用在擴增反應例如實時pcr反應中。在舉例說明性的實施例中，所述經(jīng)雙重標記的探針為水解探針，例如5’核酸酶探針(參見例如，livak等人,pcrmethodsappl.,4:357-562(1995)；和u.s.專利號5,538,848)、分子信標(參見例如，mhlanga,methods,25:463-472(2001))，蝎形探針(參見例如，saha,j.virol.methods,93:33-42(2001))，或雜交探針(參見例如，u.s.專利號7,670,832)。在某些實施方案中，將本發(fā)明的引物和探針用在數(shù)字擴增反應例如數(shù)字pcr反應中。
通過本發(fā)明的方法合成的引物的長度可以為5至50個核苷酸，和典型地為10至30個和更典型地為15至30個核苷酸。本發(fā)明的探針的長度可以為5至100、10至50、10至30或15至30個核苷酸。
本發(fā)明的方法可以利用本領域中已知用于合成包括一個、兩個或更多個標記物(例如，熒光標記物)的核酸分子的一般化學和化學方法。例如，此類方法可以利用亞磷酰胺和/或經(jīng)修飾而包括此類標記物的固體支持物。示例性的固體支持物例如可以包括至少一個通過連接體結合至固體支持物的猝滅劑。另外的示例性實施方案可以利用固體支持物或經(jīng)亞磷酰胺官能化的部分，其使根據(jù)本發(fā)明合成的核酸分子與靶核酸分子的雙鏈體、三鏈體或高等級聚集(例如，雜交)穩(wěn)定化。
在某些實施方案中，將本發(fā)明的引物和/或探針用在實時pcr測定法例如基因表達測定法或基因型分型測定法(例如，snp基因型分型測定法)中。探針可以通過使用本文所提供的方法，以例如1nm至1m、1mm至1m的濃度產生。示例性的濃度可以為100mm?？梢詫⑼ㄟ^本文所提供的方法產生的探針和/或尤其是引物冷凍干燥。例如，可以在反應容器例如試管或孔中冷凍干燥1-1,000,000皮摩爾的引物，或者可以在位置陣列的點上進行干燥。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于核酸合成的方法，其包括將核酸合成反應物組合在微孔內并且在該微孔內產生核酸分子?？梢詫⑽⒖着c控制器例如計算機處理器相連接，其中一個或多個核酸分子的核苷酸序列被輸入到控制器中或者存在于控制器的計算機存儲器中。可以將控制器連接至或與可以在廣域網(wǎng)上提供的核酸分子設計和排序功能性相連通。例如，可以在互聯(lián)網(wǎng)上提供核酸分子設計和排序功能性。
在某些實施方案中，本發(fā)明的方法包括hplc-純化步驟。此外，本發(fā)明的方法可以在經(jīng)iso和/或gmp認證的條件下進行。在一些實施方案中，核酸分子合成通過使用微孔平板來進行。
本發(fā)明的方法和儀器也可以用于制備文庫。這些文庫可以包含一個或多個點突變或者高度分歧的分子(例如，編碼具有不同功能活性的蛋白質的核酸分子)。按照這些路線，本發(fā)明包括用于產生文庫的方法，在所述文庫中所有或一些文庫成員是化學合成的并因此不從細胞核酸產生?？梢酝ㄟ^本發(fā)明的方法產生的文庫類型包括cdna文庫、基因組文庫、組合文庫、點突變文庫和一個或多個此類文庫的組合。
如上面所指明的，在一些實施方案中，本發(fā)明包括用于產生通過使用生物信息學信息而產生的cdna文庫等價物的方法，以及文庫本身。使用圖11中所顯示的示意圖用于舉例說明的目的，可以根據(jù)本文所描述的方法來合成和(如果需要)裝配文庫。然后，可以將文庫成員插入到非文庫核酸分子(例如，載體、細胞染色體等)中。插入可以通過許多方式例如連接(例如，“粘性末端”連接)來促進。
本發(fā)明包括用于產生文庫的方法，以及文庫本身。這些文庫中的一些是難以或不可能通過標準的文庫產生方法來產生的類型。一個這樣的類型是部分cdna文庫。部分cdna文庫(也稱為“cdna等價物”文庫)可以通過以生物信息學方式選擇用于包括在文庫中的特定的cdna來產生。然后，可以合成和(如果需要)裝配核酸分子以形成文庫。
cdna文庫通常包含相應于細胞內的rna轉錄物的dna分子。在許多情況下，此類文庫偏向于包含polya尾的轉錄物。在此類文庫中所呈現(xiàn)的mrna通常包含多個相應于獨個編碼區(qū)的cdna。當通過剪接事件產生基因組編碼區(qū)的剪接變體時，正是這樣的情況。本發(fā)明允許產生具有“排除性”表現(xiàn)的cdna文庫(以及基因組文庫)。例如，由于選擇核酸分子用于包括(相比于排除而言)，因而可以從文庫中排除相應于下列那些的dna分子：核糖體rna、珠蛋白rna、trna和指定的mrna。因此，本發(fā)明包括用于產生成員-偏愛的和排除性成員包括的cdna和基因組文庫的方法，以及文庫本身。
進一步地，本發(fā)明的文庫包括包含指定的核酸分子的那些。例如，本發(fā)明包括用于產生cdna文庫的方法，所述cdna文庫包含有在通過標準方法產生的cdna文庫中所呈現(xiàn)的成員的亞組。為了舉例說明的目的，假定特定的哺乳動物細胞類型具有平均15,000個不同的mrna轉錄物(包括剪接變體)，并且尋求使用這樣的cdna文庫，其包含與相應于35個不同激酶的轉錄物的所有已知的剪接變體相應的125個cdna分子。在另一種情況下，尋求篩選編碼相同的野生型編碼序列的變體的核酸分子集合。使用圖12a用于舉例說明的目的，在該圖的頂部顯示了氨基酸85至95，和野生型cdna的編碼序列。氨基酸88至91代表了被預測為連接兩個功能結構域的柔韌連接體的區(qū)域。在該情況下，產生了編碼在位置88至91(連接體區(qū)域)處具有不同的但指定的氨基酸的蛋白質的核酸分子集合。核酸分子集合(例如，在圖12a中所顯示的那些)可以以許多方式產生。
一種方式通常將會是過度包括性的，因為正常地將會產生另外的核酸分子。該方法采用“臟瓶(dirtybottle)”合成。為了產生變體分子例如在圖12a中所顯示的那些，在特定的位置混合用于添加堿基的試劑。因此，當要添加在密碼子88的第一和第二位置處的堿基時，可以使用用于添加c和g的試劑混合物?？梢哉{整這些試劑的比例以有利于c或g添加，或者可以調整該比例從而引入等量的c和g。在該群體的一部分中，還將會產生密碼子cgt(精氨酸)。
通過其可以產生核酸分子集合例如在圖12a中所顯示的那些的另一種方法是通過作為分開的核酸區(qū)段來合成獨個變體序列。這允許僅產生編碼所希望的變體群體成員的核酸分子(除了合成錯誤外)。
本發(fā)明還包括相比于野生型分子而言具有密碼子改變的獨個核酸分子和核酸分子集合，以及用于產生此類分子的方法。在一些方面，產生密碼子經(jīng)改變的文庫，其中所述集合中的核酸分子的一些或全部(在許多情況下，全部或大多數(shù))相比于天然野生型編碼序列而言是密碼子經(jīng)改變的。這顯示了本發(fā)明的方法相對于標準文庫構建方法而言的一個重大的優(yōu)點。用標準文庫構建方法，從天然出現(xiàn)的核酸分子(例如，基因組dna、mrna等)來構筑文庫。本發(fā)明的方法允許通過使用生物信息學信息來有效地構建文庫。結果是，在所產生的任何集合中的獨個核酸分子可以以“經(jīng)適應調整的”核苷酸序列來產生。
使用圖12b用于舉例說明的目的，可以產生包含不同的關于相同編碼序列的密碼子的核酸分子集合，然后就所希望的特征(例如，增加或降低的表達水平)進行篩選。當?shù)鞍踪|過表達對于其中產生該蛋白質的細胞或宿主生物有害時，降低的表達水平可能是希望的。因此，可以使用密碼子選擇作為表達調節(jié)機制。
本發(fā)明的方法還可以用于產生用于多重擴增(例如，pcr)的大量的引物。典型地，此類引物的長度將會為15至100(例如，15至90、25至90、25至80、25至70、25至60、25至50、30至90、30至60等)個核苷酸。進一步地，引物還可以包含條形碼以便允許給擴增出的核酸分子加標簽，以例如用于以后的鑒定以及在合成運行期間和之后引物和引物對的追蹤。
在一些情況下，將會產生500至50,000個、1,000至50,000個、2,000至50,000個、5,000至50,000個、5,000至40,000個、5,000至30,000個、5,000至100,000個、5,000至300,000個、5,000至500,000個、5,000至1,000,000個、5,000至5,000,000個、10,000至100,000個、10,000至500,000個、10,000至800,000個、20,000至100,000個、20,000至500,000個等的引物對。
本發(fā)明包括制備可以在諸如lifetechnologycorporation的ampliseqtm產品(參見例如，目錄編號4472395)之類的過程中使用的引物。諸如此類的產品采用多重pcr來擴增特定的核酸分子。然后，擴增出的核酸分子可以用于下游過程例如測序中以鑒定存在于起始樣品中的核酸。在一些情況下，將經(jīng)修飾的核酸堿基和/或通常不與dna相關聯(lián)的天然堿基(例如，脫氧尿苷)作為“第五(或更大)個瓶”合成地摻入到引物序列中，從而將特殊的特性賦予獨個引物和/或引物組，以便在測序之前促進擴增出的產物的下游加工，或者進一步地從而以加條形碼的方式賦予獨個引物和/或引物組以編碼，以便促進和解決通常從樣品混合物中的復雜的序列分析。
因此，本發(fā)明提供了用于產生引物匯集物的方法，以及引物匯集物本身。引物匯集物可以用于擴增rna和/或dna群或亞群。作為例子，可以產生這樣的引物匯集物，其允許擴增出代表了細胞的整個核基因組、單個核染色體、一組核基因或區(qū)域(例如，一組染色體座位)、線粒體基因組或葉綠體基因組以及其組合的基因組dna。因此，本發(fā)明包括用于特定應用(例如，上面剛剛陳述的應用)的引物的生物信息學設計。
本發(fā)明還提供了用于產生用于擴增特定rna群的引物工具的方法。在本發(fā)明的一個實施方案中，引物匯集物被設計成擴增所有的mrna分子，或者擴增由細胞所產生的mrna分子的亞群(例如，編碼激酶、磷酸酶等的mrna)，但任選地不擴增其他rna分子(例如，trna、rrna、hnrna等)。然后，這樣的引物工具可以用于表達分析(例如，測量在各種條件下的表達水平)。表達分析可以通過使用例如微陣列或測序平臺來進行。因此，本發(fā)明包括表達分析方法。在一些實施方案中，這樣的方法包括一個或多個下列步驟：(a)以生物信息學方式設計引物匯集物；(b)合成所述引物匯集物的引物對；(c)使所述引物匯集物與源自包含核酸(例如，mrna)的細胞的樣品接觸；(d)擴增所述樣品中的與引物對相應的核酸分子；和(e)分析所得的擴增出的核酸分子。
由于在許多樣品中rrna的豐富性，相應于rdna的核酸分子的減少或去除在許多表達分析應用中是所希望的。其他rrna擴增減少方法陳述在u.s.專利公開號2008/0187969(其公開內容通過提及而并入本文)中。
本發(fā)明還包括用于另外的應用(例如，鑒定基因組核酸中的突變的多重方法)的上述分案的變化形式。因此，本發(fā)明進一步包括用于鑒定突變(包括癌癥篩選)的方法和組合物。
本發(fā)明包括用于產生各種數(shù)目的引物(在許多情況下，以引物對形式)的方法。可以通過本發(fā)明的方法作為分開的實體和/或以混合的群體來制備的引物的數(shù)目在下列范圍內變化：5至500,000、500至500,000、1,000至500,000、5,000至500,000、10,000至500,000、20,000至500,000、30,000至500,000、5,000至250,000、5,000至100,000、5至5,000、5至50,000、5,000至800,000、5,000至1,000,000、5,000至2,000,000、10,000至2,000,000、20,000至1,000,000、30,000至2,000,000等。
因此，本發(fā)明提供了用于確定的引物組的快速設計、構造和合成的方法，所述引物組用于特異地測定用于各種各樣的分析、樣品設置和實驗設計的區(qū)域的遺傳組成和表征。本發(fā)明的該方面部分地是使用生物信息學連同本文所描述的核酸分子合成方法一起的結果。特別地，已經(jīng)對相當大數(shù)目的基因組的完整序列進行了測序。該序列信息，與本文所描述的核酸合成方法(以及其他方法)相組合，允許詳細的基因組和轉錄物組分析。多重方法，例如上面所陳述的那些，為施行此類分析提供了一種手段。
代表性的實施方案
本發(fā)明的許多變化形式是可行的，并且可以用于取得所希望的結果?？梢詫⒃S多這樣的變化形式導向設計特征。在一些情況下，這樣的設計特征可以為了操作者方便和/或成本節(jié)省(例如，減少的試劑使用)而進行使用。
圖9顯示了可以在本發(fā)明的特殊實施方案中使用的電線圈的一個實施方案。此類線圈的許多變化形式(其中的許多在本文別處作了描述)可以用于本發(fā)明。
可以以下列示例性結構和操作參數(shù)來設計電線圈例如圖9中所顯示的那種：最大電流密度3amps/mm2，雙層扁平線圈，線材橫截面5×2μm，10匝，內徑(di)～10μm，外徑(da)～180μm，和線材長度～6mm。
表6
圖9和表6顯示了可以在晶片上建立起來的扁平雙層線圈的示例性規(guī)格?？梢詫€圈例如在圖9中所顯示的那種進行設計，從而使得與在合成平臺中的每個孔相接觸。進一步地，磁場的產生可以用于從合成位點(例如，孔)提升珠粒。示例性的磁場強度/磁通量密度數(shù)字顯示在表6中。可以使用fem-程序例如comsol(www.comsol.com)來計算用于特定系統(tǒng)和型式的參數(shù)。
可以在用于本發(fā)明的各種不同方面的電極中使用的幾種材料以及與這些材料相關的特性陳列在表7中。電極材料的選擇將會由許多因素(包括成本以及各種設計規(guī)格和功率要求)來決定。
表7
將會對在本發(fā)明的實踐中所使用的電極(例如，電線圈)進行設計，以便滿足它們所用于的特定應用。作為例子，當使用電極來產生ega時，通常將會在牢記下列方面的情況下來設計它們：(1)施加(例如，局部施加)足夠的電流以允許在指定的時間段內產生有效量的ega；(2)限制與電流的施加相關的發(fā)熱。因此，通常將會希望限制所使用的電流量以達到1.0的局部ph，其中添加很少的過量電流。表8提供了用于以特定的孔參數(shù)來達到這一點的計算。進一步地，在下面所陳述的孔中ph1的產生將會需要施加727pa的電流大約1秒鐘。這導致在工作電極上115a/m2的電流密度。
電極的形狀可以很大地變化，并且可以是圖9中所顯示的線圈、盤、薄膜等。進一步地，在本發(fā)明的實踐中所使用的電極可以由許多化合物構成，包括鉑、鈀、銅、金、鋁、鈮、氧化鈮、鎢、鈦、鉭、鉬、鎳、鉑、銀、錳、釹、碳和硅，以及合金材料或包含一種或多種上面所描述的元素以及其他元素的復合材料。
圖10顯示了本發(fā)明的示例性的儀器形式。該圖顯示了兩個泵(1000)，所述兩個泵遞送流體以及在合適時遞送氣體通過管(1001)至流體通道(1002)，其在頂部與平板(1007)相鄰。將被遞送至該儀器的流體移動通過排液通道(1003)至通向廢物收集處(1005)的排液管(1004)。將泵(1000)連接至流體儲器(未顯示)或在合適時氣體儲器，和調節(jié)將什么流體或氣體遞送至該儀器的控制裝置(未顯示)。
所述控制裝置還調節(jié)流體或氣體接觸核酸合成“芯片”(1006)的時間長度。在圖10中可見三個核酸合成“芯片”(1006)，其靠置在電極(1008)上。使流體和/或氣體與芯片相接觸，并且電流通過芯片上的特定位置，在那里希望發(fā)生化學反應。正如本文別處所描述的，許多試劑和洗滌材料可以在本發(fā)明的實踐中使用。在許多情況下，所使用的試劑和材料將會是允許產生核酸分子的那些。
下面的電極(1008)，如在圖9中所顯示的，覆蓋該儀器的整個底部。這并不不是必需的情況，并且一個或多個電極可以與每個孔或多于一個的孔的一端相關聯(lián)。在該電極(在圖10中作為下面的電極(1008)所顯示的)對面，通常將會存在一個或多個第二電極(在圖10中未顯示)，其允許電流流過整個芯片或流過芯片的孔。在許多情況下，這些第二電極將會置于芯片的獨個孔之上，以允許指導電流在獨個基礎上通過所述孔(參見圖2a-2b)。
流體通道(1002)可以在表面層中形成。所述表面層可以由聚合材料、無機材料或其組合形成。例如，所述表面層可以由聚合材料形成。示例性的聚合材料包括丙烯酸類聚合物、含氟聚合物、乙烯-乙酸乙烯酯(eva)或其任何組合。在一個例子中，所述聚合材料為含氟聚合物。示例性的含氟聚合物包括聚偏二氟乙烯(pvdf)，聚氟乙烯(pvf)，氟化乙烯-丙烯(fep)共聚物，乙烯-氯三氟乙烯(ectfe)共聚物，四氟乙烯、六氟丙烯和偏二氟乙烯(thv)的共聚物，四氟乙烯和全氟甲基·乙烯基醚(pfa或mfa)的共聚物，在其主鏈中具有氟化氧雜環(huán)戊烷的含氟聚合物，全氟醚，或其任何組合。特別地，所述含氟聚合物可以為在其主鏈中具有氟化氧雜環(huán)戊烷的含氟聚合物，例如cytop。進一步地，所述聚合物涂層可以是無定形的，其展現(xiàn)出很少的結晶性或不展現(xiàn)出結晶性。在另一個例子中，所述表面層由無機絕緣體形成。例如，所述無機絕緣體可以包括硅、鋁、鉿、鉭、鋯的氧化物或者其任何組合，可以包括四原硅酸鹽，可以包括硅的氮化物，或者可以包括其任何組合。在一個例子中，所述無機絕緣體可以包括硅的氧化物。在另一個例子中，所述無機絕緣體包括硅的氮化物。
所述表面層可以具有在0.3微米至10微米的范圍內，例如在0.5微米至6微米的范圍內的厚度。
在本發(fā)明的實踐中所使用的獨個孔可以具有許多形狀和大小?？讌?shù)的一個例子陳列在表9中。當然，孔體積和其他因素將會隨孔尺寸而改變。
表9：示例性的圓柱形孔參數(shù)
表10
表10顯示了一些珠粒參數(shù)，并且估計了關于特定珠粒大小的緩沖液體積和濃度。
在核酸分子產生步驟完成后，可以收集包含核酸分子的基質(例如，珠粒)，將其與合成基質分開，并且進一步進行加工。
示例性的工作流程為諸如下面的那一個：(1)用官能基團(羥基或氨基)來準備珠粒；(2)分批離線地用預先合成的通用引物使珠粒衍生化，從而形成酰胺，所述通用引物具有用于從珠粒上酶促切割下合成的核酸分子的罕見的iis型限制位點；(3)通過使懸浮液流入芯片來對珠粒進行負載，電流的施加將珠粒關牢在孔中；(4)經(jīng)負載的珠粒與正極處于物理接觸或者接近物理接觸，并且在正極處和在珠粒表面上產生ega以用于去保護；(5)施行本文所描述的合成步驟；(6)在合成后，通過反轉電流來實現(xiàn)所希望的珠粒從孔中的數(shù)字電逐出；(7)從流出芯片的液體中收集和匯集被逐出的珠粒；和(8)將其他珠粒保持在孔中直至稍后以最初的正極/負極方向施加弱的電流。
本領域技術人員將會認識到，通過使用硬件、軟件、固件或其組合(在合適時)，可以施行各種不同的實施方案的操作。例如，一些過程可以通過在軟件、固件或硬連線邏輯的控制之下使用處理器或其他數(shù)字電路系統(tǒng)來進行。(本文中的術語“邏輯”是指固定的硬件、可編程的邏輯和/或其合適的組合，正如將會被本領域技術人員認可用于施行所述的功能的)。可以將軟件和固件存儲在計算機可讀的介質上。一些其他過程可以通過使用模擬電路系統(tǒng)來實施，正如本領域普通技術人員所熟知的。另外，在本發(fā)明的實施方案中可以使用存儲器或其他存儲體，以及通信部件。
圖15是圖解說明可以用于根據(jù)各種不同的實施方案來施行處理功能性的計算機系統(tǒng)(1500)的方框圖，在該計算機系統(tǒng)上可以使用圖5的熱循環(huán)儀系統(tǒng)(500)的實施方案。計算機系統(tǒng)(1500)可以包括一個或多個處理器或控制器，例如處理器(1504)。處理器(1504)可以通過使用一般或特殊目的處理引擎例如微處理器、控制器或其他控制邏輯來實施。在該例子中，處理器(1504)與總線(1502)或其他通信介質相連接。例如，處理器(1504)可以是在上面通過參考圖2a-2b而描述的電流控制器。
進一步地，應當意識到，圖12的計算機系統(tǒng)(1500)可以具體化為許多形式，例如機架安裝式計算機、主機(mainframe)、超級計算機、服務器、客戶機、臺式計算機、膝上計算機、平板計算機、手持式計算設備(例如，pda、蜂窩式電話、智能電話、掌上型電腦等)、群集網(wǎng)格(clustergrid)、上網(wǎng)本、嵌入式系統(tǒng)或任何其他類型的特殊或一般目的計算裝置，如對于給定的應用或環(huán)境而可以是希望的或合適的。另外，計算機系統(tǒng)(1500)可以包括常規(guī)網(wǎng)絡系統(tǒng)，包括客戶端/服務器環(huán)境和一個或多個數(shù)據(jù)庫服務器，或者與lis/lims基礎設施的集成。許多常規(guī)網(wǎng)絡系統(tǒng)是本領域中已知的，包括局域網(wǎng)(lan)或廣域網(wǎng)(wan)，和包括無線和/或有線部件。另外，客戶端/服務器環(huán)境、數(shù)據(jù)庫服務器和網(wǎng)絡在本領域中是有充分文獻證明的。
計算機系統(tǒng)(1500)可以包括總線(1502)或其他用于傳遞信息的通信機構，和用于處理信息的與總線(1502)相聯(lián)結的處理器(1504)。
計算機系統(tǒng)(1500)還可以包括存儲器(1506)，其可以是隨機存取存儲器(ram)或其他動態(tài)存儲器，其與總線(1502)相聯(lián)結，用于存儲待由處理器(1504)執(zhí)行的指令。存儲器(1506)還可以用于在執(zhí)行待由處理器(1504)執(zhí)行的指令期間存儲臨時變量或其他中間信息。計算機系統(tǒng)(1500)進一步包括只讀存儲器(rom)(1508)或其他靜態(tài)存儲設備，其與總線(1502)相聯(lián)結，用于存儲關于處理器(1504)的靜態(tài)信息和指令。
計算機系統(tǒng)(1500)還可以包括非暫時性存儲設備(1510)，例如提供了磁盤、光盤或固態(tài)硬盤(ssd)并將其與總線(1502)相聯(lián)結，用于存儲信息和指令。存儲設備(1510)可以包括介質驅動器和可移動存儲接口。介質驅動器可以包括驅動器或其他用于支持固定的或可移動的存儲介質的機構，例如硬盤驅動器、軟盤驅動器、磁帶驅動器、光盤驅動器、cd或dvd驅動器(r或rw)、閃存驅動器或其他可移動的或固定的介質驅動器。正如這些例子所舉例說明的，存儲介質可以包括已經(jīng)在那里存儲了特別是計算機軟件、指令或數(shù)據(jù)的計算機可讀的存儲介質。
在備選的實施方案中，存儲設備(1510)可以包括其他類似的用于允許計算機程序或者其他指令或數(shù)據(jù)加載到計算機系統(tǒng)(1500)中的工具。此類工具可以包括例如，可移動的存儲單元和接口，例如程序盒式存儲器和盒式存儲器接口，可移動的存儲器(例如，閃存或其他可移動的存儲器模塊)和存儲器插槽，以及其他允許軟件和數(shù)據(jù)從存儲設備(1510)轉移至計算機系統(tǒng)(1500)的可移動的存儲單元和接口。
計算機系統(tǒng)(1500)還可以包括通信接口(1518)。通信接口(1518)可以用于允許軟件和數(shù)據(jù)在計算機系統(tǒng)(1500)和外部設備之間轉移。通信接口(1518)的例子可以包括調制解調器、網(wǎng)絡接口(例如，以太網(wǎng)或其他nic卡)、通信端口(例如，usb端口、rs-232c串行端口)、pcmcia插槽和卡、藍牙等。通過通信接口(1518)進行轉移的軟件和數(shù)據(jù)是以信號的形式，所述信號可以是電子信號、電磁信號、光學信號或其他能夠被通信接口(1518)接收的信號。這些信號可以由通信接口(1518)經(jīng)由諸如無線介質、電線或電纜、光纖或其他通信介質之類的通道進行傳送和接收。通道的一些例子包括電話線、蜂窩式電話鏈接線路、rf鏈接線路、網(wǎng)絡接口、局域或廣域網(wǎng)和其他通信通道。
可以將計算機系統(tǒng)(1500)通過總線(1502)聯(lián)結至顯示器(1512)，例如陰極射線管(crt)或液晶顯示器(lcd)，用于將信息顯示給計算機用戶。將輸入設備(1514)(包括字母數(shù)字鍵和其他鍵)與總線(1502)相聯(lián)結，用于將信息和命令選擇傳遞給例如處理器(1504)。輸入設備也可以是顯示器，例如配置有觸摸屏輸入能力的lcd顯示器。用戶輸入設備的另一種類型為光標控制器(1516)，例如鼠標、跟蹤球或光標方向鍵，用于將方向信息和命令選擇傳遞給處理器(1504)和用于控制在顯示器(1512)上的光標移動。該輸入設備通常具有在兩個軸(第一軸(例如，x)和第二軸(例如，y))上的兩個自由度，其允許該設備指定在平面中的位置。計算機系統(tǒng)(1500)提供數(shù)據(jù)處理，并且提供對于此類數(shù)據(jù)的置信水平。與本教導的實施方案的某些實施相一致，響應于執(zhí)行一個或多個序列的一個或多個包含在存儲器(1506)中的指令的處理器(1504)，由計算機系統(tǒng)(1500)來提供數(shù)據(jù)處理和置信值。此類指令可以被從另一個計算機可讀的介質(例如存儲設備(1510))讀入到存儲器(1506)中。包含在存儲器(1506)中的指令序列的執(zhí)行導致處理器(1504)實施本文所描述的過程狀態(tài)。備選地，代替軟件指令或與軟件指令相組合地，可以使用硬連線電路系統(tǒng)來實施本教導的實施方案。因此，本教導的實施方案的實施并不限于硬件電路系統(tǒng)和軟件的任何特定的組合。
本文所使用的術語“計算機可讀的介質”和“計算機程序產品”通常是指任何這樣的介質，其參與向處理器(1504)提供一個或多個序列的一個或多個指令以用于執(zhí)行。此類指令(通常稱為“計算機程序代碼”(其可以以計算機程序或其他分組法的形式進行編組))在當被執(zhí)行時，使得計算機系統(tǒng)(1500)能夠施行本發(fā)明的實施方案的特征或功能。這些和其他形式的計算機可讀的介質可以采取許多形式，包括但不限于非易失性介質、易失性介質和傳送介質。非易失性介質包括，例如固態(tài)硬盤、光盤或磁盤，例如存儲設備(1510)。易失性介質包括動態(tài)存儲器，例如存儲器(1506)。傳送介質包括同軸電纜、銅線和光纖，包括包含總線(1502)的電線。
計算機可讀的介質的一般形式包括，例如軟盤，柔性盤，硬盤，磁帶，或任何其他磁性介質，cd-rom，任何其他光學介質，穿孔卡，紙帶，任何其他具有孔洞模式的物理介質，ram，prom，和eprom，flash-eprom，任何其他存儲器芯片或盒，后面所描述的載波，或任何其他計算機可以從中進行讀取的介質。
各種不同形式的計算機可讀的介質可以參與將一個或多個序列的一個或多個指令攜帶至處理器(1504)以用于執(zhí)行。例如，最初可以將指令攜帶在遠程計算機的磁盤上。該遠程計算機可以將所述指令加載到其動態(tài)存儲器中，并且通過使用調制解調器經(jīng)由電話線發(fā)送所述指令。計算機系統(tǒng)(1500)的本地調制解調器可以接收在電話線上的數(shù)據(jù)，并且使用紅外傳送器來將所述數(shù)據(jù)轉換為紅外信號。與總線(1502)相聯(lián)結的紅外檢測器可以接收在紅外信號中所攜帶的數(shù)據(jù)，并且將所述數(shù)據(jù)放在總線上(1502)上?？偩€(1502)將所述數(shù)據(jù)攜帶至存儲器(1506)，處理器(1504)從存儲器(1506)中取回并執(zhí)行所述指令。任選地，在由處理器(1504)進行執(zhí)行之前或之后，可以將由存儲器(1506)所接收的指令存儲在存儲設備(1510)上。
將會意識到，為了清楚的目的，上面的描述已經(jīng)關于不同的功能單元和處理器描述了本發(fā)明的實施方案。然而，將會明顯的是，可以使用在不同的功能單元、處理器或域之間的任何合適的功能性分布，而不對本發(fā)明有所減損。例如，在舉例說明時由分開的處理器或控制器來實施的功能性可以由相同的處理器或控制器來實施。因此，對于特定功能單元的提及僅被視為提及用于提供所描述的功能性的合適的手段，而不是指明嚴格的邏輯或物理結構或組織。
實施方案可以符合下列的經(jīng)編號的條項：
1.用于核酸分子的非模板定向合成的多孔平板，所述平板包含：
(a)至少一個位于所述平板的眾多孔的每個孔中的磁性珠粒，和
(b)存在于一個或多個孔中的以電化學方式產生的酸，
其中所述珠粒的直徑為0.1μm至100μm。
2.條目1的多孔平板，其中所述平板中的孔的數(shù)目為10至10,000,000。
3.前述條目中任一項的多孔平板，其中每個孔的總體積為0.1μl至50μl。
4.前述條目中任一項的多孔平板，其中每個孔可操作地與一對電極相連接。
5.前述條目中任一項的多孔平板，其中所述平板的孔與用于引入和移除試劑的微觀流體通道相連接。
6.用于產生經(jīng)裝配的核酸分子的方法，所述方法包括：
(a)合成眾多核酸分子，其中以大約0.001納摩爾至大約1,000納摩爾的平均量在平板的孔中制備每個核酸分子；
(b)將在(a)中產生的核酸分子進行合并，從而產生匯集物；
(c)將一些或所有存在于在(b)中形成的匯集物中的核酸分子進行連接，從而形成眾多更大的核酸分子；
(d)從在(c)中形成的所述眾多更大的核酸分子中去除包含序列錯誤的核酸分子，從而產生校正了錯誤的核酸分子匯集物；和
(e)將在所述校正了錯誤的核酸分子匯集物中的核酸分子進行裝配，從而形成經(jīng)裝配的核酸分子。
7.條目6的方法，其中(c)中的連接由聚合酶鏈式反應和/或連接酶來介導。
8.條目6或7中任一項的方法，其中所述經(jīng)裝配的核酸分子由至少五個核酸分子組成。
9.條目6至8中任一項的方法，其中所述經(jīng)裝配的核酸分子由五至五千個核酸分子組成。
10.條目6至9中任一項的方法，其中所述經(jīng)裝配的核酸分子具有至少20千堿基。
11.條目6至10中任一項的方法，其中所述經(jīng)裝配的核酸分子具有10千堿基至1兆堿基。
12.條目6至11中任一項的方法，其中所述經(jīng)裝配的核酸分子是閉合的、環(huán)狀的。
13.條目6至12中任一項的方法，其中所述經(jīng)裝配的核酸分子為質粒。
14.條目6至13中任一項的方法，其中同時形成兩個或更多個經(jīng)裝配的核酸分子。
15.條目6至14中任一項的方法，其中在校正了錯誤的核酸分子匯集物中的核酸分子的裝配在真菌細胞中發(fā)生。
16.條目6至15中任一項的方法，其中步驟(b)進一步包括將在(a)中產生的核酸分子與通過其他手段獲得的核酸分子進行合并從而形成匯集物，其中所述其他手段包括pcr、限制酶消化或核酸外切酶處理。
17.條目6至16中任一項的方法，其中將在(e)中產生的經(jīng)裝配的核酸分子裝配和引入到克隆載體中。
18.用于產生產物核酸分子的方法，所述方法包括：
(a)設計大小為0.1千堿基至500千堿基的產物核酸分子，其中所述產物核酸分子通過核苷酸序列來進行定義；
(b)合成眾多在核苷酸序列方面不同的獨個核酸分子，其中合成每個獨個核酸分子以制備1.0×103至1.0×109個拷貝的數(shù)量，并且其中所述獨個核酸分子能夠與一個或多個其他獨個核酸分子雜交；
(c)在一定的條件下將在(b)中合成的獨個核酸分子進行合并，所述條件允許所述獨個核酸分子在允許形成至少一個更大的核酸分子的條件下進行雜交；和
(d)將在(c)中形成的所述至少一個更大的核酸分子與一個或多個另外的核酸分子進行合并，從而形成產物核酸分子，其中所述產物核酸分子包含少于一個的序列錯誤/千堿基。
19.條目18的方法，其中所述產物核酸分子具有選自下列的大?。?/p>
(a)0.1千堿基至300千堿基；
(b)10千堿基至200千堿基；
(c)10千堿基至100千堿基；和
(d)10千堿基至50千堿基。
20.條目18或19中任一項的方法，其中在步驟(b)之后或在步驟(d)之后采用錯誤校正程序。
21.條目18至20中任一項的方法，其中合成每個獨個核酸分子以制備選自下列的數(shù)量：
(a)5.0×103至1.0×109個拷貝；
(b)1.0×106至1.0×109個拷貝；
(c)1.0×107至1.0×108個拷貝；
(d)2.0×107至1.0×109個拷貝；
(e)5.0×107至1.0×109個拷貝；
(f)7.0×107至1.0×109個拷貝；
(g)2.0×107至8.0×108個拷貝；和
(h)2.0×107至5.0×108個拷貝。
22.條目18至21中任一項的方法，其中使用聚合酶鏈式反應來擴增在步驟(c)中形成的所述至少一個更大的核酸分子。
23.條目18至22中任一項的方法，其中所述產物核酸分子是可自我復制的。
24.條目18至23中任一項的方法，其中所述可自我復制的核酸分子為質粒。
25.條目18至24中任一項的方法，其中在珠粒上合成所述獨個核酸分子，其中每個珠粒包含在孔中。
26.條目18至25中任一項的方法，其中所述珠粒具有選自下列的大?。?/p>
(a)5μm至100μm的直徑；
(b)20μm至100μm的直徑；
(c)28μm至32μm的直徑；
(d)5μm至60μm的直徑；和
(e)10μm至100μm的直徑。
27.用于產生自我復制性核酸分子的方法，所述方法包括：
(a)合成眾多核酸分子，其中在平板的孔中以微量制備每個核酸分子；
(b)將一些或所有存在于在(a)中形成的匯集物中的核酸分子進行連接，從而形成眾多更大的核酸分子；和
(c)將所述眾多更大的核酸分子進行裝配，從而形成自我復制性核酸分子。
28.條目27的方法，其中所述自我復制性核酸分子為染色體或質粒。
29.條目27或28中任一項的方法，其中所述自我復制性核酸分子為基因組。
30.條目27至29中任一項的方法，其中所述基因組為病毒基因組、核基因組、細胞器基因組或原核細胞的基因組。
31.用于合成和裝配編碼多于一種的表達產物的核酸分子的方法，所述方法包括：
(a)合成眾多核酸分子，其中以微量制備每個核酸分子；
(b)將一些或所有存在于在(a)中形成的匯集物中的核酸分子進行連接，從而形成眾多更大的核酸分子；和
(c)將所述眾多更大的核酸分子進行裝配，從而形成編碼多于一種的表達產物的核酸分子。
32.條目31的方法，其中所述多于一種的表達產物為在相同的生物學途徑中所牽涉的蛋白質。
33.條目31或32中任一項的方法，其中所述多于一種的表達產物為在相同的生物學途徑中所牽涉的蛋白質，所述在相同的生物學途徑中所牽涉的蛋白質為催化在生物學途徑中的一系列化學反應的酶。
34.條目31至33中任一項的方法，其中所述在相同的生物學途徑中的化學反應為順次反應。
35.條目31至34中任一項的方法，其中所述生物學途徑導致選自下列的終產物：
(a)生物燃料前體；
(b)抗生素或抗生素前體；
(c)食物組分；和
(d)工業(yè)酶。
36.條目31至35中任一項的方法，其中所述生物燃料前體為選自下列的醇：
(a)丁醇；
(b)戊醇；
(c)己醇；
(d)庚醇；和
(e)辛醇。
37.條目31至36中任一項的方法，其中所述食物組分為選自下列的氨基酸：
(a)l-賴氨酸；
(b)l-蘇氨酸；
(c)l-甲硫氨酸；
(d)l-亮氨酸；
(e)l-異亮氨酸；
(f)l-纈氨酸；和
(g)高絲氨酸。
38.條目31至37中任一項的方法，其中將所述經(jīng)裝配的核酸分子引入到原核細胞中。
39.條目31至38中任一項的方法，其中所述原核細胞為棒桿菌屬(corynebacterium)細菌。
40.條目31至39中任一項的方法，其中所述棒桿菌屬細菌為谷氨酸棒桿菌(corynebacteriumglutamicum)。
41.用通過處理器可執(zhí)行的指令進行編碼的、非暫時性的、計算機可讀的存儲介質，其用于產生經(jīng)裝配的核酸分子，所述指令包括用于下列步驟的指令：
(a)合成眾多核酸分子，其中在平板的孔中以微量制備每個核酸分子；
(b)將在(a)中產生的核酸分子進行合并，從而產生匯集物；
(c)將一些或所有存在于在(b)中形成的匯集物中的核酸分子進行連接，從而形成眾多更大的核酸分子；
(d)從在(c)中形成的所述眾多更大的核酸分子中去除包含序列錯誤的核酸分子，從而產生校正了錯誤的核酸分子匯集物；和
(e)將在所述校正了錯誤的核酸分子匯集物中的核酸分子進行裝配，從而形成經(jīng)裝配的核酸分子。
42.用于產生經(jīng)裝配的核酸分子的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：
-處理器；和
-用由處理器可執(zhí)行的指令進行編碼的存儲器，所述指令用于下列步驟：
(a)合成眾多核酸分子，其中在平板的孔中以微量制備每個核酸分子；
(b)將在(a)中產生的核酸分子進行合并，從而產生匯集物；
(c)將一些或所有存在于在(b)中形成的匯集物中的核酸分子進行連接，從而形成眾多更大的核酸分子；
(d)從在(c)中形成的所述眾多更大的核酸分子中去除包含序列錯誤的核酸分子，從而產生校正了錯誤的核酸分子匯集物；和
(e)將在所述校正了錯誤的核酸分子匯集物中的核酸分子進行裝配，從而形成經(jīng)裝配的核酸分子。
在本說明書中所提到的所有出版物、專利和專利申請表明了本領域普通技術人員的技術水平并且通過提及而并入本文，其程度就如同每一單個出版物、專利或專利申請明確和單獨地被指明通過提及而并入一樣。
通過如此描述了本發(fā)明，本領域技術人員將會認識到，本發(fā)明可以以許多方式進行變化。這樣的變化形式將不被視為背離本發(fā)明的精神和范圍，并且所有對于本領域普通技術人員來說將會是顯而易見的此類修飾意欲被包括在下述權利要求書的范圍之內。
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