本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種特異性核酸適配體及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腸出血性大腸桿菌o157∶h7(enterohemorrhagicescherichiacoli，ehec是一種有鞭毛、無芽孢、可運動的革蘭氏陰性菌，它是腸出血性大腸桿菌的一個主要菌型。自1982年首次在美國被確認并分離以來，在世界范圍內(nèi)引起廣泛傳播。大腸桿菌o157:h7主要可引起人類腹瀉、出血性結(jié)腸炎、溶血性尿毒綜合征以及血栓形成性血小板減少性紫癜等，死亡率高達30％。大腸桿菌o157:h7在自然界中分別較廣，感染后致病力較強，僅數(shù)十個活菌就可引發(fā)胃腸道感染。在我國，大腸桿菌o157:h7是現(xiàn)有的對國民健康造成重大威脅的致病原之一。因此、高效、快速、靈敏地檢測大腸桿菌o157:h7的方法是亟待需要的。

傳統(tǒng)的大腸桿菌o157∶h7檢測方法主要包括選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)法，生化方法等，這些方法大多操作步驟繁瑣，且耗時較長。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了一些新興檢測方法,如以pcr為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)法,免疫學(xué)方法，流式細胞儀法及基因芯片法等，這些方法同樣也存在著儀器昂貴，操作復(fù)雜，費時等缺點。

核酸適配體是通過指數(shù)級富集配體的系統(tǒng)進化技術(shù)(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，selex)，從體外人工合成的核酸文庫中篩選得到的高親和力、高特異性結(jié)合靶分子的單鏈寡核苷酸，包括ssdna、rna和修飾rna。適配體因其單鏈結(jié)構(gòu)，可以形成豐富的自適應(yīng)的三維空間結(jié)構(gòu)與靶分子結(jié)合，擴大了靶分子的范圍。此外，核酸適配體還具有穩(wěn)定性好、易于修飾和保存、無免疫原性的特點。結(jié)合適配體的優(yōu)點，在眾多的檢測領(lǐng)域中，適配體作為一種新型的識別元件已經(jīng)成為高效、快速檢測技術(shù)研究的焦點。因此，篩選大腸桿菌o157:h7的特異性核酸適配體并且建立基于適配體的大腸桿菌o157:h7的快速檢測技術(shù)具有重要的應(yīng)用價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種特異性核酸適配體，能夠特異性結(jié)合大腸桿菌o157:h7。

本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題在于提供上述特異性核酸適配體的應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種特異性核酸適配體，能夠與腸出血性大腸桿菌o157:h7特異性結(jié)合，所述核酸適配體(a46)的核苷酸序列為序列表<400>1所示序列。

優(yōu)選的，上述核酸適配體a46，所述的核酸適配體為人工合成或pcr擴增或切膠回收單鏈dna純化后獲得，該核酸適配體為單鏈dna，由88個核苷酸組成，其一級結(jié)構(gòu)為直鏈狀；二級結(jié)構(gòu)為莖環(huán)，最小自由能為11.96kcal/mol。

優(yōu)選的，上述核酸適配體(a46)，可用修飾材料對所述核酸適配體a46進行修飾，所述修飾材料為功能基團、納米材料和/或蛋白類材料。

上述核酸適配體(a46)在制備對腸出血性大腸桿菌o157:h7定性和定量檢測試劑中的應(yīng)用，例如，可廣泛應(yīng)用于熒光檢測方法、酶聯(lián)免疫方法以及生物傳感器中。

優(yōu)選的，上述核酸適配體(a46)的應(yīng)用，所述腸出血性大腸桿菌o157:h7為純標(biāo)本或食物中腸出血性大腸桿菌。

本發(fā)明的有益效果是：

所述核酸適配體利用全菌消減selex技術(shù)篩選而得，分子量較小，易于合成與修飾，能夠高特異性識別并且高親和力結(jié)合腸出血性大腸桿菌o157:h7，與其他細菌并不發(fā)生特性結(jié)合，可用于檢測腸出血性大腸桿菌o157:h7，對于有效地預(yù)防及控制大腸桿菌o157:h7感染具有重要意義。

附圖說明

圖1為熒光結(jié)合率實驗監(jiān)測適配體篩選過程中每一輪文庫與腸出血性大腸桿菌o157:h7結(jié)合效率圖。

圖2為腸出血性大腸桿菌o157:h7核酸適配體的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖。

圖3為腸出血性大腸桿菌o157:h7與其核酸適配體的解離常數(shù)擬合曲線圖。

圖4為熒光化學(xué)分析法檢測腸出血性大腸桿菌o157:h7適配體的特異性圖。

圖5為流式細胞術(shù)檢測腸出血性大腸桿菌o157:h7適配體的特異性圖。

圖6為激光共聚焦顯微鏡方法檢測檢測腸出血性大腸桿菌o157:h7適配體的特異性圖，對于激光共聚焦顯微鏡下觀察適配體a46特異性結(jié)果分析(a～e)中，l-代表白光激發(fā)；f-代表熒光激發(fā)；m-代表白光與熒光激發(fā)重疊結(jié)果。

圖7為基于適配體構(gòu)建的納米磁珠-適配體熒光檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

具體實施方式

為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好的理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明所述技術(shù)方案作進一步的詳細說明。實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明均為常規(guī)方法，使用的試劑、耗材如無特殊說明均未常規(guī)市售試劑或按常規(guī)方法配制的試劑。

實施例1

全菌消減selex技術(shù)篩選與腸出血性大腸桿菌o157:h7特異結(jié)合的核酸適配體

(1)隨機單鏈dna(ssdna)文庫以及引物的合成

隨機ssdna文庫參考相關(guān)文獻如下：

5’-gcaatggtacggtacttcc-n45-caaaagtgcacgctactttgctaa-3’，中間隨機區(qū)域為45個核苷酸，兩端為固定區(qū)域，序列總長為88個核苷酸，庫容量為4⁴⁵。篩選所用的引物序列分別為：

primer?。?’-gcaatggtacggtacttcc-3’

primerⅱ：5’-ttagcaaagtagcgtgcacttttg-3’

primerⅲ：5’-gctaagcgggtgggacttcctagtcccacccgcttagcaaagtagcgtgcacttttg-3’

其中primerⅰ在次級文庫的制備過程中需要fitc熒光基團進行修飾。在構(gòu)建的熒光檢測方法中適配體a46需要進行生物素修飾。

上述的核酸序列均由上海生工生物有限公司完成。

(2)篩選所用菌株及其培養(yǎng)與收集

上述全部菌株均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所提供。

實驗選取的靶細菌為e.colio157:h7(cicc21530)；選取的消減細菌為大腸桿菌(atcc25922)，志賀氏菌(cicc21534)，沙門氏菌(cmcc50115)。具體操作方法如下：首先將超凈工作臺紫外照射滅菌30min，接種過程進行無菌操作，分別將4株保存的菌種各取50μl接種到四支高溫高壓滅菌的lb肉湯培養(yǎng)基中，于37℃恒溫搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至菌液濃度10⁷cfu/ml。分別取4個高溫高壓滅菌的1.5ml離心管，做相應(yīng)的標(biāo)記；在無菌環(huán)境下，用移液器各取出1ml菌液加入到相應(yīng)的離心管中，5000r/min離心5min，棄掉上清培養(yǎng)基，用1×pbs緩沖液將菌體沉淀重懸，再次5000r/min離心5min。使用pbs緩沖液洗滌3次，最后將菌體沉淀使用100μlpbs緩沖液重懸，保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

(3)消減selex篩選過程

首輪篩選的方法是：

1)將體外人工合成的1.5nmol的ssdna文庫溶解于100μl結(jié)合緩沖液

中，于95℃熱變性10min后迅速置于冰上至充分冷卻；

2)然后與制備好的1×10⁷的e.colio157:h7和在合適體積的結(jié)合緩沖

溶液中混勻，37℃搖床180r/min孵育1h，使ssdna文庫與細菌充分作用；

3)8000r/min離心10min，棄上清，使用洗滌緩沖液洗滌(為了增加結(jié)

合強度，隨著輪數(shù)的增加洗滌次數(shù)相應(yīng)增加)；

4)將洗滌后結(jié)合ssdna的細菌沉淀溶于100μl雙蒸水中，作為模板，使用引物primerⅰ和primerⅲ進行不對稱pcr擴增；

5)擴增體系與條件分別為上游引物primerⅰ(10μm)和下游引物primerⅲ(10μm)各1.5μl，premixtaq酶25μl，模板靶細菌-ssdna復(fù)合物5μl，滅菌去離子水(ddh2o)17μl。pcr擴增程序：總循環(huán)數(shù)為35，預(yù)變性溫度為95℃，時間持續(xù)5min；變性溫度為95℃，持續(xù)時間為1min，退火溫度為37℃，持續(xù)時間為30s，延伸溫度為58℃，持續(xù)時間為40s。循環(huán)結(jié)束后，最后的延伸溫度為58℃，持續(xù)時間為2min。

次級文庫制備：

1)pcr擴增產(chǎn)物利用7m尿素10％的聚丙烯酰胺凝膠(page)進行電泳；

2)將膠塊放入凝膠成像儀，打開紫外燈，使用手術(shù)刀將目的片段小心的切下；

3)將切取的帶有目的dna的膠塊置于1.5ml離心管中，離心管提前稱取重量并標(biāo)記，每一輪切取2塊9ml凝膠塊中的目的片段進行dna回收，以保證回收的dna量；

4)使用生工page膠dna回收試劑盒提取回收dna；

5)將回收純化得到的ssdna進行濃度和純度測定，以保證下一輪篩選文庫的純度和使用量達到要求。

為了縮短篩選時間，增加篩選效率，提高篩選適配體的特異性，在第2至7輪加入消減細菌進行消減篩選。將上輪制備獲得的ssdna文庫經(jīng)核酸蛋白測定儀測定濃度，計算出下一輪篩選使用ssdna溶液的體積。在消減篩選過程中，將ssdna文庫首先與消減細菌混合孵育1h，然后將結(jié)合到消減細菌上的ssdna經(jīng)離心去除掉，將未結(jié)合消減細菌的ssdna作為消減文庫再與靶細菌孵育、篩選，之后的篩選步驟同第一輪。以此往復(fù)，本實驗一共進行了7輪篩選。其中每一輪涉及孵育結(jié)合、洗滌的操作，都將菌體重懸液轉(zhuǎn)移至一個新的離心管中，以消除管壁對ssdna的非特異性吸附干擾。每一輪篩選均設(shè)置陰性對照，即除了將實驗組加入的ssdna替換成等體積的1×pbs篩選緩沖液以外，其他操作全部與實驗組相同。每一輪的篩選條件見表1。

表1各輪篩選條件

實施例2

熒光化學(xué)分析法監(jiān)測篩選過程

(1)熒光初始文庫以及次級文庫的制備

1)fitc熒光標(biāo)記的初始隨機ssdna文庫直接由上海生工生物有限公司合成；

2)fitc熒光標(biāo)記的次級ssdna文庫通過切膠回收純化實驗獲得，具體步驟如下：

①以每輪篩選得到的ssdan-靶細菌為模板，生工公司合成fitc標(biāo)記的primerⅰ為上游引物，其他引物和pcr條件不變，均參照實施例1中首輪篩選的pcr擴增體系和條件；

②將擴增產(chǎn)物避光保存，fitc標(biāo)記的ssdna文庫制備參照實施例1中的次級文庫制備的步驟；

③將每一輪制備的fitc熒光標(biāo)記的ssdna文庫避光于-20℃保存。

(2)熒光強度檢測

1)每一輪熒光標(biāo)記的ssdna各取出25pmol，使用熒光化學(xué)分析儀測定其熒光值f0，然后分別與10⁷cfu/ml的靶細菌混合孵育1h；

2)將結(jié)合有ssdna的細菌離心、洗滌后用300μl1×pbs溶液重懸；

3)然后95℃加熱使ssdna-靶細菌復(fù)合物解離，得到fitc熒光標(biāo)記的ssdna溶液，熒光化學(xué)分析儀測定其熒光值f1；

4)計算各輪結(jié)合率r＝f1/f0×100％，以此監(jiān)測各輪篩選的效果以及與靶細菌結(jié)合的ssdna的富集情況。

每一輪ssdna文庫與靶細菌大腸桿菌o157:h7的結(jié)合效率見附圖1，隨著篩選輪次的逐漸增加，ssdna文庫與靶細菌的結(jié)合率逐漸增加，第七輪雖然較第六輪有所下降，但整體趨勢趨于穩(wěn)定，因此篩選共進行七輪。

實施例3

克隆與測序

(1)經(jīng)過7輪篩選，選取與靶細菌結(jié)合效率最高的第六輪篩選產(chǎn)物作為模板，利用引物上游引物primerⅰ和下游引物primerⅱ進行pcr擴增，擴增體系與條件參照實施例1中pcr程序；

(2)將pcr產(chǎn)物連接到克隆載體pmd19-t，進行藍白斑挑選，菌體培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒送往上海生工生物有限公司測序；

(3)使用chromas和dnaman軟件對測序結(jié)果進行同源性以及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，最終得到與大腸桿菌o157:h7特異結(jié)合的核酸適配體(命名為a46)的序列(為序列表<400>1所示序列)及預(yù)測二級結(jié)構(gòu)圖(見圖2)。與大腸桿菌o157:h7特異結(jié)合的適配體a46序列長度：88個堿基；序列類型：核酸，單鏈；序列種類：ssdna。其二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖表明，適配體含有突出的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其最小自由能為11.96kcal/mol，該結(jié)構(gòu)具有較高的穩(wěn)定性。

實施例4

熒光化學(xué)分析法測定核酸適配體的親和性

(1)將適配體a46進行fitc熒光標(biāo)記，使用封閉液配制成不同濃度梯度的適配體溶液，濃度分別為10、20、50、100、200、400、600、800、1000nm；

(2)分別與10⁷cfu/ml的大腸桿菌o157:h7在300μl封閉液中37℃搖床孵育1h，離心、洗滌棄上清；

(3)將結(jié)合了適配體的菌體沉淀使用300μlddh2o重懸，95℃加熱5min，立即置于冰上冷卻至室溫，10000r/min離心10min，保留上清液于新的離心管中避光保存；

(4)使用熒光化學(xué)分析儀測定其熒光值，使用originpro8.0軟件繪制非線性擬合結(jié)合曲線，并且計算適配體a46的解離常數(shù)kd值，計算公式為y＝bmax/x+kd。(其中y為測定熒光值，bmax為體系中最大熒光值，x為適配體濃度)。

如圖3所示，得到了核酸適配體a46的飽和結(jié)合曲線，并且計算得到適配體a46的解離常數(shù)kd值為82.45±18.46nm，說明核酸適配體a46與大腸桿菌o157:h7的親和力較好。

實施例4

核酸適配體a46的特異性分析

將親和力較好適配體a46標(biāo)記fitc熒光基團，各取25pmol的適配體a46然后分別與10⁶cfu/ml的大腸桿菌o157:h7、大腸桿菌atcc25922、福氏志賀氏菌cicc21534、鼠傷寒沙門氏菌cmcc50115、糞腸球菌atcc29212在封閉液中混勻，37℃避光孵育1h，每個樣品設(shè)置3組實驗組和對照組(即不加fitc熒光適配體，加入等體積的1×pbs緩沖液，其他均與實驗組相同)，經(jīng)過洗脫、離心等步驟獲得菌體-適配體復(fù)合物，加入1×pbs緩沖液將菌體-適配體沉淀重懸。將重懸液分別應(yīng)用熒光化學(xué)分析儀、流式細胞儀以及激光共聚焦顯微鏡三種方法，檢測適配體a46對靶細菌的特異性。

(1)熒光化學(xué)分析法檢測適配體的特異性

1)首先將熒光化學(xué)分析儀與電腦相連接，打開儀器后，設(shè)置檢測參數(shù)，選取激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為485nm和535nm；

2)將空白的黑色酶標(biāo)板進行掃描檢測，以確定空白值；

3)分別取各組的樣品懸浮液個200μl加入到黑色酶標(biāo)板中上機檢測，

測得體系熒光值。

熒光化學(xué)分析儀檢測細菌與適配體結(jié)合后的熒光強度，結(jié)果如圖4所示。分別以未加入熒光適配體a46的組作為對照組，在圖4中用綠色表示；以加入熒光適配體的組作為實驗組，在圖4中用紅色代表。根據(jù)結(jié)果圖可以看出，五種細菌的基底熒光值很低，均小于0.7，可以認為基底值不會對結(jié)果有顯著的影響。大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、福式志賀氏菌、糞腸球菌和沙門氏菌的實驗組及其對應(yīng)的對照組熒光強度基本沒有差異或差異較小，而大腸桿菌o157:h7與適配體孵育結(jié)合后，熒光強度達到14以上。與大腸桿菌o157:h7對照組相比，實驗組體系的熒光值大幅度提高，說明標(biāo)記熒光的適配體a46與大腸桿菌o157:h7結(jié)合率較高，而與其他4種細菌結(jié)合率很低或沒有結(jié)合。由此可以判斷適配體a46具有一定的特異性識別以及結(jié)合大腸桿菌o157:h7的能力。

(2)流式細胞術(shù)檢測適配體特的異性

1)將菌體300μl懸浮液使用細胞篩過濾后加入到流式檢測管中；

2)設(shè)置激發(fā)光和發(fā)射光參數(shù)分別為485nm和535nm，選擇fl1通道；

3)連接上機檢測細胞熒光強度。

圖5是適配體a46分別與5種細菌孵育結(jié)合后流式分析比對結(jié)果。圖5中每一種顏色的曲線分別對應(yīng)一種細菌的流式分析結(jié)果，從圖中可以看出適配體與細菌的結(jié)合情況，志賀氏菌、大腸桿菌、沙門氏菌和糞腸球菌與適配體a46孵育結(jié)合后整體的熒光強度集中在10⁰左右；大腸桿菌o157:h7與適配體a46孵育結(jié)合后，細胞整體熒光強度峰值向右發(fā)生了明顯的偏移，峰值接近10¹，表明適配體a46對大腸桿菌o157:h7具有較高的特異性結(jié)合能力。

(3)激光共聚焦顯微鏡檢測適配體的特異性

1)將20μl菌體懸浮液涂載到干凈的載玻片上；

2)晾干后載玻片置于熒光共聚焦顯微鏡下觀察；

3)激光共聚焦顯微鏡觀察倍數(shù)選擇80×，選擇fitc熒光參數(shù)；

4)在目鏡下觀察到熒光后，采用白光和熒光共同重疊掃描，拍照記錄。

激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果如圖6所示。使用激光共聚焦顯微鏡80×放大倍數(shù)，選取同一視野進行白光和熒光雙波長同時激發(fā)，觀察細菌與適配體a46的結(jié)合情況。圖6中5種細菌都可以在白光(l)下觀察到，說明細菌成功固定在載玻片上。在熒光激發(fā)下，大腸桿菌o157:h7出現(xiàn)大量綠色熒光(a-m)，說明適配體與靶細菌大量結(jié)合；綠色熒光標(biāo)記的細菌全部與白光下的細菌成功重疊(a-f)，說明顯示熒光的都是靶細菌，而不是雜質(zhì)非特異性吸附適配體而產(chǎn)生的假陽性結(jié)果；由重疊圖像可以看出絕大部分細菌都顯示綠色熒光，這表示適配體a46與大腸桿菌o157:h7的結(jié)合率很高。而大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、志賀氏菌和鼠傷寒沙門氏菌在熒光激發(fā)下只發(fā)現(xiàn)個別綠色熒光(b-f、c-f、e-f)，糞腸球菌在熒光下沒有發(fā)現(xiàn)熒光(d-f)，由此可以看出，適配體a46幾乎不與除大腸桿菌o157:h7以外的細菌結(jié)合。以上結(jié)果表明親和力相對較高的適配體a46對靶細菌識別和結(jié)合的特異性也較強。

通過親和力和特異性分析，發(fā)現(xiàn)篩選得到的適配體a46對靶細菌大腸桿菌o157:h7可以高特異、高親和力結(jié)合。因此，在此基礎(chǔ)之上，結(jié)合納米磁珠構(gòu)建檢測大腸桿菌o157:h7的熒光檢測方法。

實施例5

基于適配體構(gòu)建的納米磁珠-適配體熒光檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

(1)參照m-280磁珠使用說明書步驟，首先將磁珠表面的防腐劑清洗掉；(2)根據(jù)已驗證的磁珠與dna寡核苷酸結(jié)合的量(1mg鏈霉親和素磁珠可以結(jié)合200pmol的寡核苷酸分子)，向均勻分布的1mg/ml的磁珠中加入過量5’端生物素化修飾的適配體，在37℃溫度下使用旋轉(zhuǎn)混合儀進行緩慢的振動孵育30min；

(3)反應(yīng)結(jié)束后通過磁分離器回收磁珠，1×pbs緩沖液洗滌3次，去除未與磁珠結(jié)合的適配體，最初加入適配體的量減去未結(jié)合的適配體，得到的就是與磁珠結(jié)合的適配體的總量；

(4)取200μl磁珠-適配體作為捕獲探針，捕獲反應(yīng)體系中存在10⁷cfu/ml的靶細菌，總得孵育體積為300μl，使用旋轉(zhuǎn)混合儀孵育時間30min；

(5)通過磁分離器回收磁珠適配體-靶細菌，每次磁分離時間為3min，使磁顆粒復(fù)合物完全被回收，使用1×pbs緩沖液洗滌三次，以去除未與捕獲探針結(jié)合的細菌；

(6)向其中加入fitc熒光標(biāo)記的適配體，與37℃孵育結(jié)合1h，在磁場作用下富集磁珠，使用1×pbs緩沖液洗滌三次以去除未與靶細菌結(jié)合的熒光適配體；

(7)將沉淀重懸于300μl1×pbs緩沖液中使用熒光化學(xué)分析儀測定熒光強度(激發(fā)波長485nm，發(fā)射波長535nm)。

(8)分別取100μl不同濃度梯度的大腸桿菌o157:h7菌液進行平板培養(yǎng)計數(shù)；

(9)參照(1)至(7)的方法分別將不同濃度的菌液加入到反應(yīng)體系中，使用熒光化學(xué)分析儀測得相應(yīng)熒光強度值。

(10)使用軟件origin8.0分析熒光值與平皿培養(yǎng)菌落數(shù)的關(guān)系，并且繪制相關(guān)曲線，確定最低檢測限。

在最佳的實驗條件下，探索大腸桿菌o157:h7菌落數(shù)與熒光強度之間的關(guān)系。結(jié)果如圖7所示，實驗測得的熒光值與相對應(yīng)的細菌平皿培養(yǎng)計數(shù)呈線性關(guān)系，并且相關(guān)性良好。大腸桿菌o157:h7熒光檢測與平皿計數(shù)線性相關(guān)方程為if＝0.006x+4.992(r²＝0.982)，線性檢測范圍是90～5×10⁴cfu/ml，檢出限為90cfu/ml。

上述參照具體實施方式對該腸出血性大腸桿菌o157:h7特異結(jié)合的核酸適配體及應(yīng)用進行的詳細描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個實施例，因此在不脫離本發(fā)明總體構(gòu)思下的變化和修改，應(yīng)屬本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所

<120>一種特異性核酸適配體及應(yīng)用

<130>2017

<141>2017-03-08

<150>2016112034807

<151>2016-12-23

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>88

<212>dna

<213>細菌

<220>

<221>特異性核酸適配體a46

<222>(1)..(88)

<400>1

gcaatggtacggtacttcccgcagtttgggaagggtgatcgcactatcagaggattccgt60

tcggcaaaagtgcacgctactttgctaa88

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>引物

<220>

<221>primerⅰ

<222>(1)..(19)

<400>2

gcaatggtacggtacttcc19

<210>3

<211>24

<212>dna

<213>引物

<220>

<221>primerⅱ

<222>(1)..(24)

<400>3

ttagcaaagtagcgtgcacttttg24

<210>4

<211>57

<212>dna

<213>引物

<220>

<221>primerⅲ

<222>(1)..(57)

<400>4

gctaagcgggtgggacttcctagtcccacccgcttagcaaagtagcgtgcacttttg57