本發(fā)明生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種橡膠樹hbag基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

巴西橡膠樹俗稱橡膠樹，是中國熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟作物，其生產(chǎn)的天然橡膠是關(guān)系到國計民生的戰(zhàn)略資源。隨著國內(nèi)天然橡膠消費量的逐年增加，受種植條件和宜膠地的限制，提高橡膠樹單位面積產(chǎn)量迫在眉睫。橡膠樹屬多年生喬木，有性世代周期長，在橡膠樹新品種選育中存在花多果少，座果率偏低等問題，導(dǎo)致許多雜交組合不能成功組配，使得橡膠樹選育種效率受到很大限制，成為橡膠樹育種中亟待解決的問題之一。因此，深入研究橡膠樹花發(fā)育及生殖發(fā)育機理，旨在改變橡膠樹“繁花少實”的現(xiàn)象，提高其坐果率，可為橡膠樹優(yōu)良雜交組合的配置提供理論基礎(chǔ)與技術(shù)手段。

在植物花器官及生殖發(fā)育中，agamous基因作為一類重要的轉(zhuǎn)錄因子基因家族，它們在植物的生長發(fā)育和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著關(guān)鍵性的調(diào)控作用，可以激活或抑制目的基因的轉(zhuǎn)錄表達，在植物生長發(fā)育和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要的、不可或缺的作用。如前人研究表明agamous基因主要參與調(diào)控開花時間、決定花器官的發(fā)育、影響果實的成熟、調(diào)節(jié)營養(yǎng)器官的發(fā)育、以及對外界信號的響應(yīng)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明通過對不同發(fā)育時期的橡膠樹花器官進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，結(jié)合race試驗和pcr分析，鑒定出一個橡膠樹花器官特征因子agamous(ag)基因，進一步對這個花器官特征因子hbag基因進行生物信息學分析、進化樹分析、時空表達模式分析、亞細胞定位、以及轉(zhuǎn)基因功能驗證，顯示hbag的過表達可導(dǎo)致植株矮小，使得營養(yǎng)生長期縮短，從而促進植株提前開花。

本發(fā)明的第一個方面是提供一種橡膠樹hbag基因，其核苷酸序列如seqidno:1所示。

本發(fā)明的第二個方面是提供一種蛋白質(zhì)，其為本發(fā)明第一個方面所述的橡膠樹hbag基因編碼的蛋白質(zhì)，其核苷酸序列如seqidno:2所示。

本發(fā)明的第三個方面是提供一種本發(fā)明第一個方面所述的橡膠樹hbag基因的克隆方法，包括以下步驟：(1)從橡膠樹根、莖、莖尖、葉片、木質(zhì)部、乳膠、果實、花序、雄花和/或雌花組織中提取總rna；(2)以總rna為模板進行反轉(zhuǎn)錄獲得cdna；(3)設(shè)計hbag基因全長序列擴增引物對，進行pcr擴增，回收pcr產(chǎn)物，其中，hbag基因全長序列擴增引物對的核苷酸序列如seqidno:3和seqidno:4所示；(4)pcr產(chǎn)物連接載體，轉(zhuǎn)化，測序，獲得hbag基因基因片段。

本發(fā)明的第四個方面是提供如本發(fā)明第一個方面所述的橡膠樹hbag基因在促進植株提前開花中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第五個方面是提供如本發(fā)明第一個方面所述的橡膠樹hbag基因在培育提前開花植株中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第六個方面是提供一種表達載體，其含有本發(fā)明第一個方面所述的橡膠樹hbag基因。

本發(fā)明的第七個方面是提供一種引物對，其核苷酸序列如seqidno:3和seqidno:4所示。該引物對可用于hbag基因全長序列擴增。

本發(fā)明首次從橡膠樹中克隆得到hbag基因，該基因?qū)儆赼g亞家族，參與花的發(fā)育、胚珠的形成和種子的成熟，執(zhí)行d類基因功能。通過亞細胞定位分析表明該基因定位于細胞核，符合轉(zhuǎn)錄因子的特征。進一步將該基因轉(zhuǎn)到擬南芥中，獲得轉(zhuǎn)基因植株，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)開花時間明顯提前，營養(yǎng)生長時間短，以及植株矮化等表型，表明該基因在橡膠樹的花器官發(fā)育、以及生殖發(fā)育中起著重要的調(diào)控作用。將來利用hbag基因?qū)ο鹉z樹進行遺傳改良，可為縮短橡膠樹育種年限、提高育種效率提供有效的基因資源。

附圖說明

圖1為橡膠樹hbag基因的orf擴增電泳圖。

圖2為橡膠樹mads-box基因外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，其中，cdsf片段是第一個外顯子，cdsi片段是中間的外顯子，cdsl片段是最后一個外顯子，刻度尺表示基因的長度，單位bp。

圖3為橡膠樹mads-box基因的相對熒光定量表達分析結(jié)果，其中，ro代表根、st代表莖、stt代表莖尖、le代表葉片、ba代表樹皮、xy代表木質(zhì)部、la代表膠乳、fr代表果實、hx3代表3cm花序、hx6代表6cm花序、hx9代表9cm花序、hx12代表12cm花序、xr代表雄蕊、cr代表雌蕊。

圖4為植物過表達載體的構(gòu)建和鑒定結(jié)果，其中，a：m:dl5000dnamarker，1:19t-hbag質(zhì)粒經(jīng)xhoi和psti雙酶切，2:pxcs-hastrep質(zhì)粒經(jīng)xhoi和psti雙酶切，3:pxcs-hastrep質(zhì)粒無酶切對照；b:m:dl5000dnamarker，1:pxcs-hbag-hastrep質(zhì)粒經(jīng)xhoi和psti雙酶切。

圖5為轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性植株的pcr鑒定結(jié)果，其中，a:hbag基因；b：bar基因；ck：陰性對照。

圖6為hbag的轉(zhuǎn)基因植株的表型。

具體實施方式

下面參照附圖，結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明作進一步的說明，以更好地理解本發(fā)明。下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，分子克隆(molecularcloning:alaboratorymanual,3rded.)或酵母遺傳法實驗指南(methodsinyeastgenetics:acoldspringharborlaboratorycoursemanual，adamsaetal編，coldspringharborlaboratory,1998出版)中所述條件，或按照制造廠商所建議的條件。

1、橡膠樹hbag基因的克隆

(1)取橡膠樹的根、莖、莖尖、葉片、木質(zhì)部、乳膠、果實、花序、雄花和雌花等組織參照invitrogenreagent提取rna的方法步驟進行，得到符合后續(xù)試驗要求的總rna。反轉(zhuǎn)錄，得到cdna。設(shè)計orf引物，以獲得的cdna作為模板，進行pcr擴增，擴增條件如下：

a.設(shè)計引物如下：

forwardprimer(5’-3’)：atggcataccagagcgag；

reverseprimer(5’-3’)：ttaaactaactgaagggacatctg

b.pcr擴增體系如下：

c.反應(yīng)程序為：94℃變性5分鐘；94℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分，34個循環(huán)；72℃延伸10分鐘。pcr產(chǎn)物低溫保藏備用。

(2)將pcr擴增產(chǎn)物加入5μl6×loadingbuffer混勻后，進行1％瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果如圖1所示，得到的目的條帶大小與預(yù)期一致。

用普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒，回收pcr產(chǎn)物，將回收的pcr產(chǎn)物與t載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞dh5α，挑取轉(zhuǎn)化陽性的克隆提取質(zhì)粒送測序，經(jīng)過測序確定正確的克隆用于后續(xù)克隆及酶切。測序結(jié)果與之前的轉(zhuǎn)錄組里的序列大部分相同。

2、橡膠樹hbag基因生物信息學分析

將得到的橡膠樹hbag基因編碼序列與橡膠樹基因組序列比對，用以篩選相應(yīng)的基因組序列信息，用fgenesh網(wǎng)站做hbag基因結(jié)構(gòu)分析(http://linux1.softberry.com/berry.phtml？topic＝fgenesh&group＝programs&subgroup＝gfind)，進而得到hbag基因的內(nèi)含子與外顯子的數(shù)目及位置，基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示橡膠樹hbag基因包含7個外顯子，6個內(nèi)含子(圖2)。

3、橡膠樹不同組織中hbag基因表達分析

選取橡膠樹的根、莖、莖尖、葉片、木質(zhì)部、乳膠、果實、花序、雄花和雌花10個組織，花序又分成幾個時期(以花序長度區(qū)分)，以橡膠樹18s為內(nèi)參基因，探究hbag基因在橡膠樹各個組織器官中的表達情況。熒光定量分析結(jié)果表明hbag基因主要在橡膠樹的莖尖、果實、花序、以及雄花和雌花中特異性高調(diào)表達(圖3)，表明hbag基因參與了橡膠樹花器官與生殖發(fā)育進程。

4、hbag基因過表達載體構(gòu)建

用xhoi和psti兩個限制性內(nèi)切酶將含有酶切位點的19t-hbag基因載體和pxcs-hastrep載體切開(圖4-a)，并回收載體大片段和目的基因片段，連接，然后轉(zhuǎn)化dh5α感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，提質(zhì)粒，進行雙酶切(圖4-b)，得到兩條酶切片段大約750bp和大于5000bp，片段大小符合預(yù)期，說明載體構(gòu)建成功，正確載體命名為pxcs-hbag-hastrep。

5、轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的篩選

將構(gòu)建好的表達載體pxcs-hbag-hastrep轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。用沾花浸染(floraldipping)的方法轉(zhuǎn)化擬南芥野生型。將轉(zhuǎn)化后得到的t0代擬南芥種子放在含有20mg/lbasta的ms固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)兩周后，轉(zhuǎn)基因苗仍為綠色，不含目的載體的植株逐漸白化死去。待植株長到六片真葉時，移出存活的植株(如圖5)。洗去根上的培養(yǎng)基，種植到營養(yǎng)土中。共轉(zhuǎn)移出8株，標記為l1-8。取每株的一兩片葉粗提dna，進行pcr驗證。之后保留陽性植株，待種子成熟后，分株收種，得到t1代種子。然后再進行篩選，將t1代擬南芥種子放在含有30mg/lbasta的ms固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，將后代分離比為3:1的存活的植株隨機選取8株，移栽到營養(yǎng)土中，待種子成熟后，分株收種，得到t2代種子。再次進行篩選，選用不發(fā)生性狀分離的株系做后續(xù)實驗。

以t0代8個株系的dna為模板，分別用bra基因引物和hbag基因引物進行pcr擴增。結(jié)果如圖5所示，l1-l6株系都能擴增從400bp左右(bar)和750bp左右(hbag)的目的片段，說明這幾個株系都是陽性植株。

6、轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的表型

選取后代存活分離比為3:1的兩個株系l1和l5得到的純合轉(zhuǎn)基因種子和野生型的擬南芥種子，同時播種，在同樣的培養(yǎng)條件，統(tǒng)計它們的形態(tài)學指標。分別統(tǒng)計植株的蓮座葉數(shù)目、蓮座上的最長葉片的長度、抽薹兩周后的株高、以及從種子萌發(fā)到開花的時間和果莢成熟時的長度。結(jié)果如表1和圖6所示。

表1hbag的轉(zhuǎn)基因植株表型的統(tǒng)計分析

由表1可知：野生型植株的這些形態(tài)學指標都顯著性的高于轉(zhuǎn)基因株系的，說明野生型植株營養(yǎng)生長時間長，植株高大粗壯，而轉(zhuǎn)基因植株開花時間明顯提前，營養(yǎng)生長時間短，故植株矮小。

從圖6可以直觀看出它們的差異，轉(zhuǎn)基因植株已經(jīng)長出果莢了，野生型的才開始開花；轉(zhuǎn)基因植株葉片整體偏小。通過局部的觀察(圖6)，可以看出野生型的蓮座不僅葉片數(shù)目多，而且還長出了多個分枝，轉(zhuǎn)基因植株沒有明顯的分枝或有分枝但是不長大，受到抑制作用；野生型的花序比較密集，開花比較多，莖上的分枝較多，轉(zhuǎn)基因植株的每個小花比較分散，而且數(shù)目少，分枝也少。

進一步對轉(zhuǎn)基因擬南芥中花發(fā)育相關(guān)內(nèi)源基因的表達情況進行檢測，結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中hbag的過表達可以促進atft、atap1、atlfy和atful基因的表達，抑制atsvp基因的表達，推測hbag可能通過與這些基因的互作來影響橡膠樹的生殖發(fā)育進程。

以上對本發(fā)明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所

<120>一種橡膠樹hbag基因及其應(yīng)用

<130>123456

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>726

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>hbag基因

<400>1

atggcataccagagcgagtccagggagacttcaccccagaggaaaatgggtaggggtaag60

atcgagatcaagcggatcgaaaacaccacaaatcgtcaagttactttctgcaaaaggcgc120

aacggtctgctcaagaaagcttatgaattatctgttctttgtgatgctgaggttgctctt180

atcgtcttctctagccgtggccgcctctatgagtatgccaacaatagtgttaaatctaca240

attgagaggtacaagaaggcatgtgcagattcatccaatactggatctgtttctgaagct300

aatgctcagtactatcagcaagaagctgccaagctgcgtgggcaaataagcaatttgcag360

aagtcaaacaggcatatgctgggtgagtcgctaggagccttaacagtgaaagaacttaag420

agcttggagatacgactagaaaaaggaatcagtagaattcggtccaaaaagaatgagctg480

ctgtttgcagaaatcgagtatatgcagaaaagggaaattgatttgcacaacaataaccag540

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ggtggaggtagttatgagatcatgcaatctcaaccattcgataacaggaactattttcaa660

gtgaatgcattacaacccgctaatcattatccacaccaagaccagatgtcccttcagtta720

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<210>2

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<213>artificial

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<223>hbag蛋白質(zhì)

<400>2

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151015

glyargglylysilegluilelysargilegluasnthrthrasnarg

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65707580

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asnasnasnglnileleuargalalysilealagluasngluarglys

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glnserglnpropheaspasnargasntyrpheglnvalasnalaleu

210215220

glnproalaasnhistyrprohisglnaspglnmetserleuglnleu

225230235240

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<213>artificial

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<213>artificial

<220>

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<400>4

ttaaactaactgaagggacatctg24