本發(fā)明涉及mrna編碼的納米抗體及其應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是納米抗體藥物領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

隨著生物醫(yī)學(xué)研究的進(jìn)步，大量與疾病發(fā)生相關(guān)的蛋白功能失調(diào)被發(fā)現(xiàn)，其中絕大多數(shù)（90%以上）致病性蛋白均位于細(xì)胞內(nèi)部。然而，由于普通的單克隆抗體難以有效進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，目前已有的抗體藥物均通過(guò)結(jié)合位于細(xì)胞表面或細(xì)胞外的靶蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)其治療作用。細(xì)胞外靶蛋白的數(shù)量非常有限，受此限制，市場(chǎng)已有抗體藥物識(shí)別的目標(biāo)蛋白高度集中，這一方面大大限制了抗體藥物的適應(yīng)癥范圍，很多疾病缺乏合適的抗體類(lèi)藥物；另一方面，有限的標(biāo)靶也導(dǎo)致制藥公司的研發(fā)工作高度同質(zhì)化，造成行業(yè)內(nèi)的過(guò)度競(jìng)爭(zhēng)和社會(huì)資源的浪費(fèi)。一種能夠方便、高效、安全、特異性、并雙方向（包括活化和抑制）地調(diào)控細(xì)胞內(nèi)功能蛋白活性的方法，將開(kāi)啟生物制藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的新階段。

用質(zhì)粒為代表的dna或者病毒為媒介，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)功能蛋白是基因治療的常用手段，該方法雖然具有較高的轉(zhuǎn)染和表達(dá)效率，但卻無(wú)法避免dna與靶細(xì)胞的基因組發(fā)生重組，而導(dǎo)致其他疾病的風(fēng)險(xiǎn)。舉例而言，外源dna可能被插入某個(gè)正常的基因內(nèi)部，從而導(dǎo)致突變甚至完全破壞該基因的表達(dá)，如果這個(gè)被插入的基因是比較重要的功能基因，這種改變將對(duì)細(xì)胞功能造成重大破壞，甚至導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)生癌癥。以基于dna的質(zhì)?；虿《緸楣ぞ?，在理論上無(wú)法避免相關(guān)的致癌風(fēng)險(xiǎn)，這也是基因治療方法未能充分推廣的重要原因。相比而言，rna進(jìn)入細(xì)胞后，無(wú)法反轉(zhuǎn)錄成dna,因此在理論上不會(huì)對(duì)細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性造成破壞，可以說(shuō)，rna療法從根本上規(guī)避了基因療法的致癌風(fēng)險(xiǎn)，更適合臨床用藥的安全需求。此外，dna需要進(jìn)入細(xì)胞核才能被轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，轉(zhuǎn)染難度較大，且在一定程度上需要細(xì)胞處于活躍的分裂周期才能進(jìn)入細(xì)胞核；而rna只要進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)就可以表達(dá)，不需進(jìn)細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄，也不依賴(lài)細(xì)胞周期，同樣的轉(zhuǎn)染條件下rna比dna在胞內(nèi)表達(dá)的效率更高，在臨床應(yīng)用的難度更小。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決以上問(wèn)題，本發(fā)明提出用rna編碼納米抗體調(diào)控胞內(nèi)蛋白的新思路和方法系統(tǒng)。

二十世紀(jì)九十年代，人們?cè)趶能浌囚~(yú)和駱駝科動(dòng)物的體內(nèi)發(fā)現(xiàn)天然缺失輕鏈的抗體，并發(fā)現(xiàn)此類(lèi)抗體往往以重鏈二聚體的形式存在，此類(lèi)抗體被稱(chēng)為重鏈抗體。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，駝源重鏈體抗體中，與抗原結(jié)合的重鏈可變區(qū)可以單獨(dú)穩(wěn)定表達(dá)，并具有良好的抗原結(jié)合的特異性和親和力，該重鏈可變區(qū)（variabledomainofheavychainantibody,vhh）被稱(chēng)為單域抗體（single-domainantibody,sdab）或納米抗體（nanobody）。納米抗體是已知最小的能夠穩(wěn)定表達(dá)的抗原結(jié)合蛋白，分子大小僅為常規(guī)igg抗體的十分之一，具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。

基于此，我們首先在本發(fā)明中公開(kāi)了mrna編碼的納米抗體，該mrna攜帶的編碼信息在細(xì)胞內(nèi)被識(shí)別、翻譯、表達(dá)出可以與靶蛋白結(jié)合的單鏈納米抗體。也就是說(shuō)，在本發(fā)明中描述了一種在目的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)編碼特定納米抗體mrna的方法和工具系統(tǒng)。該工具系統(tǒng)包括：至少一種體外轉(zhuǎn)錄的編碼納米抗體的rna分子，協(xié)助該rna分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的轉(zhuǎn)染工具，以及增強(qiáng)該轉(zhuǎn)染復(fù)合物識(shí)別特定細(xì)胞并提高其轉(zhuǎn)染效率的輔助試劑。rna分子被運(yùn)送到目的細(xì)胞內(nèi)部后，可以被細(xì)胞內(nèi)的翻譯機(jī)器識(shí)別，表達(dá)出與特定靶蛋白結(jié)合的單鏈納米抗體。根據(jù)該納米抗體與目的蛋白結(jié)合方式的不同，目的蛋白的構(gòu)象發(fā)生不同形式的改變，從而實(shí)現(xiàn)抑制或者活化目的蛋白生物學(xué)功能的作用。

本發(fā)明公開(kāi)的構(gòu)建rna分子以編碼識(shí)別特定目標(biāo)蛋白的納米抗體，通過(guò)引入一定的化學(xué)修飾和核苷酸序列，增加該rna在體內(nèi)的穩(wěn)定性和翻譯效率，以及將該rna轉(zhuǎn)入特定細(xì)胞并實(shí)現(xiàn)相應(yīng)納米抗體在胞內(nèi)表達(dá)的方法和工具系統(tǒng)。該方法和工具系統(tǒng)特別適用于醫(yī)學(xué)臨床上治療因細(xì)胞內(nèi)特定蛋白功能失調(diào)造成的疾病。用本發(fā)明描述的工具系統(tǒng)處理帶有特定蛋白功能缺陷的細(xì)胞，根據(jù)產(chǎn)生的納米抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合造成結(jié)果的不同，其治療的適用癥包括兩個(gè)方面：一是rna編碼的納米抗體通過(guò)結(jié)合來(lái)抑制目的蛋白的功能，用于治療細(xì)胞內(nèi)致病基因高表達(dá)或過(guò)度活化而導(dǎo)致的疾病，；二是rna編碼的納米抗體將目標(biāo)蛋白的構(gòu)象穩(wěn)定于高活性的狀態(tài)，從而增強(qiáng)該蛋白的功能，用于治療細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)蛋白表達(dá)不足或活力下降而造成的功能缺陷。

本發(fā)明提到的納米抗體是指駝源重鏈抗體的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域，其能夠特異性地與目標(biāo)蛋白上的抗原表位發(fā)生緊密結(jié)合。由于是單鏈蛋白,且結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，通常的納米抗體均采用大腸桿菌或酵母等微生物高表達(dá)獲得。為了得到調(diào)控目標(biāo)蛋白功能的納米抗體，通常將純化得到的抗原蛋白或者蛋白的抗原表位結(jié)構(gòu)域與合適的免疫佐劑混合后，多次注射雙峰駝、羊駝等駝?lì)悇?dòng)物，該動(dòng)物被刺激的免疫系統(tǒng)經(jīng)過(guò)細(xì)胞活化、分化和成熟的過(guò)程，產(chǎn)生能夠分泌抗原蛋白特異性重鏈抗體的b細(xì)胞；收集免疫動(dòng)物外周血中的總b細(xì)胞，抽提總rna并反轉(zhuǎn)錄cdna文庫(kù)，或者通過(guò)流式細(xì)胞儀篩選能夠與靶抗原結(jié)合的b細(xì)胞，抽提其總rna并反轉(zhuǎn)錄cdna文庫(kù)；以cdna文庫(kù)為模板，通過(guò)特定的引物（序列1）經(jīng)套式pcr擴(kuò)增單域重鏈抗體可變區(qū)（vhh）的編碼基因，通過(guò)噬菌體展示技術(shù)篩選獲得能夠識(shí)別目的抗原蛋白的納米抗體庫(kù)；將這些基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，建立能在大腸感覺(jué)中高效表達(dá)的納米抗體株，通過(guò)elisa的方式確定與抗原蛋白有較高親和力的抗體株，并對(duì)這些納米抗體的編碼基因進(jìn)行測(cè)序；根據(jù)序列比對(duì)軟件分析各個(gè)克隆株的基因序列，去除fr1、fr2、fr3、fr4、cdr1、cdr2、cdr3序列相同的冗余克隆，并將cdr3區(qū)域相似（序列相似性>80%）的序列歸為一組，選擇各組中親和力較高的納米抗體克隆，在大腸桿菌中高表達(dá)并純化得到相應(yīng)的納米抗體；用生化手段檢驗(yàn)不同納米抗體對(duì)抗原蛋白功能產(chǎn)生的影響，從而獲得能夠活化或抑制目的蛋白功能的納米抗體。

通過(guò)測(cè)序得到編碼功能性納米抗體的基因序列，該數(shù)據(jù)可以作為本發(fā)明中通過(guò)生物手段合成編碼納米抗體rna的基本序列信息。生物手段通常指通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄獲得rna的方法，該方法指在體外無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中，以dna作為模板，以ntp為原料，依賴(lài)rna聚合酶，模仿體內(nèi)轉(zhuǎn)錄過(guò)程生成rna的過(guò)程。

方法中描述了獲取特異性納米抗體基因序列以及相應(yīng)rna的方法，優(yōu)選方案是利用流式細(xì)胞術(shù)和噬菌體展示技術(shù)，或者利用高通量測(cè)序技術(shù)（或下一代測(cè)序技術(shù)nextgenerationsequencing,ngs)結(jié)合生物信息學(xué)分析方法，從駝源免疫的單域重鏈抗體庫(kù)中篩選能與靶蛋白特異結(jié)合的單域重鏈抗體可變區(qū)的dna克隆，對(duì)獲得的克隆進(jìn)行測(cè)序、表達(dá)、和活力鑒定，獲得能與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合的功能性納米抗體及其基因序列，根據(jù)獲得的基因序列，通過(guò)化學(xué)合成或體外轉(zhuǎn)錄的方法得到編碼該納米抗體的rna。

一般來(lái)講，通過(guò)噬菌體展示技術(shù)獲得的納米抗體基因序列往往位于噬菌體展示質(zhì)粒上，包括phen1，phen4，pmes4或pmesy4等，由于這些質(zhì)粒的拷貝數(shù)不高，優(yōu)化的方法是通過(guò)亞克隆的方法將編碼納米抗體的基因轉(zhuǎn)移到更適合體外轉(zhuǎn)錄的其他質(zhì)粒上，包括puc18，puc19等高拷貝質(zhì)粒，pt7ts,pgem-1系列質(zhì)?；騪sp64質(zhì)粒等等；也可以通過(guò)pcr的方法得到大量的用于體外轉(zhuǎn)錄的dna模板。

進(jìn)一步地，在本發(fā)明中還公開(kāi)了mrna分子帶有至少一種增強(qiáng)其穩(wěn)定性的修飾。優(yōu)選方案是該rna分子上帶有多種修飾用以增強(qiáng)其穩(wěn)定性。在某些情境下，增強(qiáng)穩(wěn)定性的修飾包括：用帶有化學(xué)修飾的核苷酸（nucleotide）代替天然的沒(méi)有修飾的核苷酸，在不影響編碼納米抗體氨基酸組成的情況下增加rna中g(shù)c堿基的含量，以及在rna的兩端引入增加其穩(wěn)定性的非編碼序列（utr）等。這里提到的增加rna中g(shù)c堿基的含量，是指相較于au堿基對(duì)，應(yīng)當(dāng)盡量增加gc堿基的比例。

譬如，為了增加rna轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的穩(wěn)定性，本發(fā)明推薦在不影響編碼蛋白氨基酸序列的前提下，在編碼序列的上游和下游添加特定的非編碼序列，即5’-utr和3’-utr。相關(guān)的情境之一是在rna的3-末端增加較長(zhǎng)的多聚腺嘌呤尾巴（polyatail），從而增加rna的穩(wěn)定性。在一定的情境下，polyatail的長(zhǎng)度不少于100，200，300或者400個(gè)核苷酸。添加長(zhǎng)ployatail的方法即包括通過(guò)polyapolymerase在rna轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物末端直接添加多聚腺嘌呤，也可以通過(guò)在體外轉(zhuǎn)錄的dna模板的3’端直接引入polya來(lái)實(shí)現(xiàn)，還可以通過(guò)rna連接酶將polya與轉(zhuǎn)錄rna產(chǎn)物的3’端直接相連得到。特別地，由于polyatail的長(zhǎng)度可以調(diào)節(jié)rna轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在體內(nèi)的半衰期，在某些情境下，可以通過(guò)調(diào)整rna轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物帶有的polyatail的長(zhǎng)度，控制該rna在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)納米抗體的時(shí)間。除了polyatail，另一種比較常用的情境是在編碼納米抗體的基因上下游引入特定的5’-utr和3’-utr區(qū)，特別是在mrna終止密碼子下游較多的c堿基重復(fù)，被證明可以提高mrna的穩(wěn)定性。本發(fā)明推薦來(lái)源于其他穩(wěn)定性較高的天然蛋白的mrna的非編碼區(qū)，例如collagen、globin、actin、tubulin、gapdh、histone等蛋白mrna的5’-utr和3’-utr區(qū)，在納米抗體編碼序列的上下游引入這些非編碼區(qū)，也可以提高相應(yīng)ran轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的穩(wěn)定性。根據(jù)我們的研究，從多種高穩(wěn)定性蛋白mrna編碼區(qū)上下游的utr區(qū)提取同源性序列，通過(guò)篩選獲得以下兩條新序列（序列如下）可以顯著提高mrna的穩(wěn)定性,在同等條件下，該非編碼序列的加入可將mrna在胞內(nèi)的半衰期提高一倍以上。

5’utr添加序列：5’accgccgagccgtttccgggacccgtgcttctgaccctaccgccttcgccagcatcctcaaaccgccacc3’

3’utr添加序列：

ggtggctcctgccactctgccccttgccctcccctgccccctttcttgctgtccaacttacctgaaaggtttgaaggctccctgagtccctttacttgactgggggatattaggaagggcctttaccatgtggaacctgcttaataaaaaacatttatttttcatagc

需要說(shuō)明的是，以上四種優(yōu)化rna分子編碼序列的方法既可以單獨(dú)使用，也可以多種方法合并使用，其目的都是使產(chǎn)生的rna具有更高的穩(wěn)定性和翻譯效率。

在多數(shù)情境下，該發(fā)明的工具系統(tǒng)中的rna帶有一種或多種增強(qiáng)其穩(wěn)定性的修飾，用于延長(zhǎng)rna分子的半衰期，從而增加該rna分子在靶細(xì)胞內(nèi)被翻譯并表達(dá)產(chǎn)生納米抗體的效率。在這里，對(duì)rna分子的化學(xué)修飾是指對(duì)構(gòu)成rna的元件---核苷酸（nucleotides）的修飾，即用帶有修飾基團(tuán)的核苷酸代替天然情況下沒(méi)有修飾基團(tuán)的核苷酸。具體而言，核苷酸由含氮堿基、核糖與磷酸三個(gè)部分組成，為了不影響體外轉(zhuǎn)錄時(shí)rna的生成，此處的化學(xué)修飾主要位于其堿基部分。常用的修飾堿基包括，但不限于，帶有甲基化、乙?；?、氫化、氟化以及硫化等修飾堿基的嘌呤（腺嘌呤a，鳥(niǎo)嘌呤g）和嘧啶（胞嘧啶c，尿嘧啶u，胸腺嘧啶t）的類(lèi)似物或衍生物。最常用的修飾堿基包括但不限于，例如：假尿嘧啶（pseudouridine，ψ），n6-甲基腺腺嘌呤（n6ma），次黃嘌呤（inosine，i），甲基尿嘧啶（methyluridine,mu），5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mc)，5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,om5c)，二氫尿嘧啶（dihydrouridine，dhu，d），ribothymidine(rt)，以及7-甲基鳥(niǎo)嘌呤（7-methylguanosine，m7g)等等。

特別地，由于u、c堿基數(shù)量與rna穩(wěn)定性成反比，本發(fā)明推薦的情境之一是用盡量多的假尿嘧啶（pseudouridine，ψ）取代尿嘧啶，而用盡量多的甲基胞嘧啶取代胞嘧啶，是rna轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中u、c被假尿嘧啶和甲基胞嘧啶替代的比率超過(guò)20%，30%，40%，甚至理想情況下100%。

本發(fā)明推薦在不影響編碼蛋白氨基酸序列的前提下，通過(guò)分子生物學(xué)的手段在編碼序列中進(jìn)行增強(qiáng)rna穩(wěn)定性的堿基替換。rna分子的穩(wěn)定性隨著其中含有胞嘧啶cytidines（c）和尿嘧啶uridines（u）的數(shù)量升高而下降，不含有c、u堿基的rna穩(wěn)定性相對(duì)較高。這里所說(shuō)的意思是，在au堿基對(duì)中應(yīng)盡量增加a的含量，而在cg堿基對(duì)中，則應(yīng)盡量增加g的含量。也即是說(shuō)，在本專(zhuān)利推薦的情境下，可以在不影響蛋白氨基酸序列的前提下，降低rna序列中c、u堿基的含量。一個(gè)特定的情境是，利用同一個(gè)氨基酸具有多個(gè)密碼子的簡(jiǎn)并性特點(diǎn)，通過(guò)用編碼相同氨基酸但c、u數(shù)量較少的密碼子替代原來(lái)c、u數(shù)量較多的密碼子，可以降低整條rna序列中的c、u含量，從而使rna分子更為穩(wěn)定。例如，甘氨酸（gly）的密碼子ggu或ggc可以調(diào)整為gga或ggg，丙氨酸（ala）的密碼子gcu或gca可以調(diào)整為gca或gcg，纈氨酸（val）的密碼子guu或guc可以調(diào)整為gua或gug，亮氨酸（leu）的密碼子cuu或cuc可以調(diào)整為uug或cug，異亮（iso）氨酸的密碼子auu或auc可以調(diào)整為aua,絲氨酸的密碼子ucu或ucc可以調(diào)整為uca或ucg，脯氨酸（pro）的密碼子ccu或ccc可以調(diào)整為cca或ccg，蘇氨酸（thr）的密碼子acu或acc可以調(diào)整為aca或acg，精氨酸（arg）的密碼子cgu或cgc調(diào)整為cga或cgg，等等，這些替換均可降低編碼區(qū)的c、u含量以增加rna的穩(wěn)定性。

同時(shí)，本發(fā)明還進(jìn)一步優(yōu)選公開(kāi)了mrna分子帶有至少一種增強(qiáng)其翻譯效率的修飾。優(yōu)選方案是該rna分子上帶有多種修飾用以增強(qiáng)其翻譯效率。在某些情境下，增加翻譯效率的修飾包括：在rna的5’端引入招募核糖體的帽子（5’cap）結(jié)構(gòu)，在納米抗體編碼區(qū)上游引入kozak序列和其他增強(qiáng)翻譯效率的序列，以及在不影響編碼納米抗體氨基酸組成的前提下，選擇使用翻譯效率更高的氨基酸密碼子等。

考慮到納米抗體編碼區(qū)所用密碼子對(duì)應(yīng)trna的使用頻率，為了增加rna轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯效率，本發(fā)明的方法推薦用在人類(lèi)細(xì)胞中使用頻率較高的trna密碼子，替代那些使用頻率較低的密碼子。例如，在編碼亮氨酸(leu)的六個(gè)密碼子中選擇使用頻率最高的cug，在編碼纈氨酸（val）的四個(gè)密碼子中選擇使用頻率最高的gug；在編碼谷氨酰胺的兩個(gè)密碼子中選擇使用頻率最高的cag等等。

此外，為了促進(jìn)核糖體對(duì)rna轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的識(shí)別，增加翻譯效率，rna分子的5-末端需要帶有特定的帽子結(jié)構(gòu)（5’-capstructure）。5’端加帽不但可以增加轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的穩(wěn)定性，還可以提高翻譯機(jī)器對(duì)其識(shí)別的效率，從而增加mrna編碼納米抗體在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。常用的帽子結(jié)構(gòu)修飾堿基包括，但不限于，7-甲基鳥(niǎo)嘌呤（m7g(5')ppp(5')g，7-methylguanylate）和thermofisher公司的arca-cap（anti-reversecapanalog）等，后者可以增加rna向正確方向合成的幾率。為rna添加5’端帽子，可以通過(guò)在體外轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系中用此類(lèi)修飾的鳥(niǎo)嘌呤代替部分正常gtp來(lái)實(shí)現(xiàn)，推薦修飾鳥(niǎo)嘌呤的工作濃度為1mm-4mm，該用量為正常gtp濃度的2-8倍。

本發(fā)明中引入堿基修飾的方法，是在轉(zhuǎn)錄體系中額外添加帶有修飾基團(tuán)的核苷酸，或者用帶有修飾基團(tuán)的核苷酸完全替代天然無(wú)修飾的核苷酸，使這些修飾的核苷酸在rna聚合酶的作用下，參與rna轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的合成。需要說(shuō)明的是，以上堿基修飾既可以單獨(dú)使用，也可以多種方法合并使用，其目的都是使產(chǎn)生的rna具有更高的穩(wěn)定性和翻譯效率。

在某些情形下，為了進(jìn)一步提高本發(fā)明中編碼納米抗體的rna轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的穩(wěn)定性，可以向工具系統(tǒng)中加入特殊物質(zhì)，以延長(zhǎng)rna在細(xì)胞內(nèi)的半衰期。此類(lèi)試劑可以是特殊的蛋白或者核酸片段,例如用于保護(hù)rna分子3’端序列的polya結(jié)合蛋白，或者是與rna轉(zhuǎn)錄分子的一定序列互補(bǔ)的dna或rna片段等等。在rna轉(zhuǎn)染細(xì)胞之前，將此類(lèi)物質(zhì)與rna混合，它們可以直接或間接與轉(zhuǎn)錄rna發(fā)生作用，將此混合物轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，結(jié)合了保護(hù)分子的rna被核酸酶降解的機(jī)會(huì)下降，從而能夠在細(xì)胞內(nèi)存留更長(zhǎng)的時(shí)間。需要說(shuō)明的是，不同的保護(hù)分子既可以單獨(dú)使用，也可以多種方法合并使用，其目的都是使產(chǎn)生的rna具有更高的穩(wěn)定性和更長(zhǎng)的胞內(nèi)半衰期。

更進(jìn)一步地，本發(fā)明還優(yōu)選公開(kāi)了mrna分子帶有至少一種降低其免疫原性的修飾。優(yōu)選方案是通過(guò)多種修飾以降低其造成機(jī)體免疫反應(yīng)的可能性。在某些情境下，降低rna免疫原性的修飾包括：用磷酸酶處理去除體外轉(zhuǎn)錄或化學(xué)合成的rna分子5’端造成免疫原性的磷酸化基團(tuán)，特別是三磷酸基團(tuán)；通過(guò)向rna分子中引入n6-methyladenosine,5-methylcytidine,以及其他2-o-位甲基化的核苷酸，阻止該rna分子形成免疫原性較強(qiáng)的雙鏈rna型的二級(jí)結(jié)構(gòu)等。

細(xì)胞存在一套天然免疫系統(tǒng)（innateimmunesystem），在受到病原分子侵染的時(shí)候，能夠通過(guò)激活一系列復(fù)雜的炎癥反應(yīng)將入侵物降解掉。很多哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)了多種模式識(shí)別受體（patternrecognitionreceptor,prrs），可以識(shí)別、結(jié)合并降解進(jìn)入細(xì)胞的外源性rna，這是體外轉(zhuǎn)錄rna在細(xì)胞內(nèi)翻譯效率低下的重要原因。在多數(shù)情境下，該發(fā)明的工具系統(tǒng)中的rna帶有一種或多種降低其免疫原性的修飾，從而增加該rna分子在靶細(xì)胞內(nèi)被翻譯并表達(dá)產(chǎn)生納米抗體的效率。

有報(bào)道指出，外源rna分子5’端的磷酸化修飾可以影響rna對(duì)天然免疫系統(tǒng)的免疫原性，帶有5’-三磷酸化修飾的rna比沒(méi)有磷酸化修飾的rna更容易被降解。據(jù)此特性，本發(fā)明推薦用磷酸酶處理去除體外轉(zhuǎn)錄或化學(xué)合成的rna分子5’端造成免疫原性的磷酸化基團(tuán)，特別是三磷酸基團(tuán)，以降低其免疫原性。此外，真核細(xì)胞中的天然mrna往往帶有一些修飾的核苷酸，例如n6-methyladenosine,5-methylcytidine,以及其他2-o-位甲基化的核苷酸等等，盡管數(shù)量不多，但可以阻止該rna分子激活天然免疫反應(yīng)。據(jù)此，本發(fā)明推薦在體外轉(zhuǎn)錄的rna分子中引入包括n6-methyladenosine,5-methylcytidine,以及2’-o-methylatednucleotides在內(nèi)的修飾核苷酸，這些修飾堿基可以阻止該rna分子形成免疫原性較強(qiáng)的雙鏈rna型的二級(jí)結(jié)構(gòu),從而降低天然免疫反應(yīng)對(duì)rna分子的降解，延長(zhǎng)其在細(xì)胞內(nèi)的半衰期。需要說(shuō)明的是，不同的修飾方法既可以單獨(dú)使用，也可以多種方法合并使用，其目的都是使產(chǎn)生的rna具有更低的免疫原性和更長(zhǎng)的胞內(nèi)半衰期。

同時(shí)，本發(fā)明還進(jìn)一步優(yōu)選公開(kāi)mrna編碼蛋白的上下游修飾有細(xì)胞內(nèi)定位信號(hào)。這也就是說(shuō)，rna分子編碼的納米抗體可以根據(jù)靶蛋白的細(xì)胞分布情況，定位于特殊的細(xì)胞區(qū)域或者細(xì)胞器，譬如在某些情境下，產(chǎn)生的納米抗體可以根據(jù)需要定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、或高爾基體等特定的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中。

本發(fā)明中所用體外轉(zhuǎn)錄rna分子的編碼區(qū)可以包含特定的細(xì)胞定位信號(hào)，根據(jù)結(jié)合目標(biāo)蛋白所處細(xì)胞區(qū)域的不同，該rna分子翻譯產(chǎn)生的納米抗體可以被定為于相應(yīng)特定的細(xì)胞區(qū)域，以增加納米抗體對(duì)于其目標(biāo)蛋白的識(shí)別效果。這里的定位信號(hào)是指有rna編碼翻譯得到的特殊的氨基酸序列，例如信號(hào)肽、前導(dǎo)肽、分類(lèi)信號(hào)、定位信號(hào)等，根據(jù)需求可以位于納米抗體的n-端或c-端，包括但不限于：將納米抗體定位于細(xì)胞核內(nèi)的核定位信號(hào)（nuclearlocalizationsignal,nls，如pkkkrkv,pqkkiks,qpkkp及rkkr等序列）；將納米抗體定位于細(xì)胞質(zhì)中的核輸出信號(hào)（nuclearexportsignal,nes，如lxxxlxxlxl）;將納米抗體定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位（er-retention）信號(hào)（如kdel,ddel,deel,qedl及rdel等序列）；將納米抗體定位于內(nèi)吞體的內(nèi)吞體定位信號(hào)（如序列mddqrdlisnneqlp）；將納米抗體定位于線粒體的線粒體定位信號(hào)（mitochondrialtargetingsignal）；將納米抗體定位于過(guò)氧化物酶體的過(guò)氧化物酶體靶向信號(hào)（peroxisomaltargetingsignals,pts，如skl）等等。

作為另一公開(kāi)，我們?cè)诒景l(fā)明中進(jìn)一步公開(kāi)了前述的mrna編碼的納米抗體在制備用于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)靶蛋白功能制劑中的應(yīng)用。

并且進(jìn)一步地，我們公開(kāi)了所述編碼納米抗體的mrna通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)載體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。

本發(fā)明的工具系統(tǒng)中還包括攜帶rna轉(zhuǎn)錄物進(jìn)入目標(biāo)細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)載體。目標(biāo)細(xì)胞是指帶有靶蛋白功能缺陷的細(xì)胞，rna編碼納米抗體在這些細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)能夠調(diào)控其中靶蛋白的活性，并恢復(fù)細(xì)胞的正常功能。在這里，轉(zhuǎn)運(yùn)載體包括多種形式的幫助核酸類(lèi)物質(zhì)攝入的藥物載體，該載體的組成可以將大小不同的rna分子遞送進(jìn)入目標(biāo)細(xì)胞。在轉(zhuǎn)運(yùn)載體中，rna分子可以與一種或多種化學(xué)試劑結(jié)合，從而被包裝成為能夠進(jìn)入目標(biāo)細(xì)胞的形式。合適的化學(xué)試劑的選擇，不但要考慮其轉(zhuǎn)運(yùn)rna的生物和化學(xué)性質(zhì)，也要結(jié)合治療方案實(shí)施時(shí)的使用情況，以及rna分子施用后所暴露的生物環(huán)境等因素。在施用當(dāng)中，轉(zhuǎn)運(yùn)載體在包裹rna的同時(shí)并不破壞rna的生物活性。在某些情境下，轉(zhuǎn)運(yùn)載體對(duì)目標(biāo)細(xì)胞要具有一定的傾向性，及其結(jié)合目標(biāo)細(xì)胞的能力要強(qiáng)于其他非目標(biāo)細(xì)胞，在理想的情況下，發(fā)明中使用的轉(zhuǎn)染載體可以將rna特異性的轉(zhuǎn)入目標(biāo)細(xì)胞，而不影響其他無(wú)需調(diào)控的正常細(xì)胞。

根據(jù)需要，轉(zhuǎn)運(yùn)載體可以是脂質(zhì)體（liposomal）載體，或者其他有助于核酸進(jìn)入目標(biāo)細(xì)胞的試劑。合適的轉(zhuǎn)運(yùn)載體包括但不限于：脂質(zhì)體；帶有神經(jīng)酰胺的納米脂質(zhì)體；帶有特殊脂蛋白的脂質(zhì)體，例如帶有apolipoprotein-b或者apolipoprotein-e等配體蛋白的脂質(zhì)體,這些配體蛋白能夠與表達(dá)低密度脂蛋白受體的目標(biāo)細(xì)胞結(jié)合，從而提高載有rna的轉(zhuǎn)運(yùn)載體進(jìn)入相應(yīng)的目標(biāo)細(xì)胞；納米脂質(zhì)體(nanoliposomes)；納米顆粒（nanoparticulates），包括磷酸鈣納米顆粒，二氧化硅納米顆粒,納米晶體顆粒（nanocrystallineparticulates）,生物納米顆粒，半導(dǎo)體納米顆粒等；多聚精氨酸；淀粉類(lèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)；微膠束（micelles）；乳狀液（emulsion）；以及某些病毒的衣殼蛋白等等，某些多聚化合物也可以用作rna的轉(zhuǎn)運(yùn)載體。轉(zhuǎn)運(yùn)載體系統(tǒng)可以用于將編碼納米抗體的rna優(yōu)先靶向多種目標(biāo)細(xì)胞，合適的目標(biāo)細(xì)胞包括但不限于：肝細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肺細(xì)胞、骨細(xì)胞、干細(xì)胞、間葉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、免疫細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、睪丸細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等等。

在某些情境中，為了便于觀察，本發(fā)明的轉(zhuǎn)運(yùn)載體中還要包括一個(gè)易于檢測(cè)的生物指標(biāo)，以顯示編碼納米抗體的rna成功進(jìn)入目標(biāo)細(xì)胞。常用的檢測(cè)指標(biāo)包括同位素標(biāo)記、熒光標(biāo)記或者其他體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)常用的材料。該檢測(cè)物質(zhì)即可以與rna分子共價(jià)連接，用于rna分子在細(xì)胞或組織中的示蹤；也可以由rna序列編碼（如熒光蛋白、熒光素酶等），用于顯示rna分子在細(xì)胞內(nèi)的翻譯情況。

并且更進(jìn)一步地，我們優(yōu)選公開(kāi)了轉(zhuǎn)運(yùn)載體添加有與目標(biāo)待調(diào)節(jié)細(xì)胞表面標(biāo)志相結(jié)合的配體。這也即是說(shuō)，可以通過(guò)向轉(zhuǎn)運(yùn)載體中添加與目標(biāo)細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白相結(jié)合的配體，以增加轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物對(duì)目的細(xì)胞的靶向性，可以將rna轉(zhuǎn)入特定組織的特定細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)翻譯表達(dá)出特定功能蛋白的納米抗體。某些情境下，攜帶編碼納米抗體rna的載體可以通過(guò)自然擴(kuò)散的被動(dòng)方式進(jìn)入組織和細(xì)胞，其他的情境下，攜帶rna的載體帶有附加的、可以被特定的靶細(xì)胞識(shí)別的組成成分，使其能夠選擇性地進(jìn)入特定細(xì)胞。優(yōu)選方案是，發(fā)明中攜帶rna的載體可以帶有能夠增加該復(fù)合物與一種或多種目標(biāo)細(xì)胞結(jié)合的配體，某些情境下，該定位用配體是apolipoprotein-b或者apolipoprotein-e,這些配體能夠與表達(dá)低密度脂蛋白受體的目標(biāo)細(xì)胞結(jié)合；在其他的情況下，該定位配體是能夠與目標(biāo)細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白結(jié)合的抗體。這些配體能夠與目標(biāo)細(xì)胞表面的標(biāo)志蛋白結(jié)合，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)載體與目標(biāo)細(xì)胞的結(jié)合，增加將該轉(zhuǎn)運(yùn)載體攜帶的納米抗體rna靶向目標(biāo)細(xì)胞的效率。該組成系統(tǒng)可以用于將納米抗體rna優(yōu)先靶向多種目標(biāo)細(xì)胞，合適的目標(biāo)細(xì)胞包括但不限于：肝細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肺細(xì)胞、骨細(xì)胞、干細(xì)胞、間葉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、免疫細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、睪丸細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等等。

本發(fā)明描述的方法和工具系統(tǒng)可以用于調(diào)控細(xì)胞內(nèi)部多種關(guān)鍵功能蛋白的功能，包括多種與疾病發(fā)生相關(guān)的功能蛋白，優(yōu)選方案是rna編碼的納米抗體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并與目標(biāo)蛋白結(jié)合。某些情境下，目標(biāo)蛋白被納米抗體穩(wěn)定于失活構(gòu)象，其功能被抑制，用于治療目標(biāo)蛋白過(guò)度活化導(dǎo)致的疾?。黄渌榫诚?，目標(biāo)蛋白被納米抗體穩(wěn)定于活化構(gòu)象，其功能被激活，用于治療目標(biāo)蛋白活力不足造成的疾病?？蛇x目標(biāo)蛋白包括但不限于：細(xì)胞信號(hào)通路分子、轉(zhuǎn)錄因子、蛋白修飾酶（甲基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等等）、蛋白去修飾酶（去甲基化、去烷基化、去乙?；?、去磷酸化、去泛素化等等）、核酸修飾酶（甲基化、磷硫酰化）、核酸去修飾酶（去甲基化、去磷硫酰化）、結(jié)構(gòu)蛋白、重要的功能性復(fù)合物、以及其他重要的疾病標(biāo)志蛋白等。該方法可以控制或治療的疾病包括但不限于：發(fā)育異常、代謝相關(guān)疾病、腫瘤和癌癥、自身免疫性疾病、傳染性疾病、自身免疫性疾病、肌肉及運(yùn)動(dòng)功能失調(diào)等等。

用mrna編碼納米抗體靶向潛在的胞內(nèi)目標(biāo)蛋白的列表(target突變蛋白的抗體；盡量挑有害蛋白，功能調(diào)控與疾病的關(guān)系，定位發(fā)展方向)：

多種e3ligases包括：

amfr,apc/cdc20,apc/cdh1,c6orf157,cbl,cbll1,chfr,chip,dtl(cdt2),e6-ap,hace1,hectd1,hectd2,hecdt3,hecw1,hecw2,herc2,hecr3,hecr4,hecr5,huwe1,hyd,itch,lnx1,mathogunin,march-i,march-ii,march-iii,march-iv,march-v,march-vi,march-vii,march-viii,march-x,mdm2,mekk1,mib1,mib2,mycbp2,nedd4,nedd4l,parkin,peli1,pirh2,pja1,pja2,rffl,rfwd2,rictor,rnf5,rnf8,rnf19,rnf190,rnf20,rnf34,rnf40,rnf125,rnf128,rnf38，rnf68，scf/beta-trcp,scf/fbw7,scf/skp2,shprh,siah1,siah2,smurf1,smurf2,topors,traf6,traf7,trim63,ube3b,ube3c,ubr1,ubr2,uhrf2,vhl,wwp1,wwp2,znrf1.etal.

多種hdacs包括：

hdac1-hdac11

sirtuin1–sirtuin7

多種hats包括：

gcn5

pcaf

tip60

morf

moz

hbo1

p300

cbp

src-1

actr(rac3,aib1,tram-1)

tif-2(grip1)

src-3

tfiiic(p220,p110,p90)

clock

多種methyltransferase,包括：

histonemethyltransferase

dna/rnamethyltransferase

n-terminalmethyltransferase

non-samdependentmethyltransferases

多種demethyltransferase包括：

kdm1family

kdm2family

kdm3family

kdm4family

kdm5family

kdm6family

protein-glutamatemethylesterase

多種疾病相關(guān)信號(hào)通路蛋白包括：

p53

kras

braf

bcr/abl

bcl1

bcl2

pml-rara

c-kit

egfr

egfr(fish)

her2/neu(fish)

jak2

alk(fish)

dpd/tyms

tpmt

多種感染性病毒標(biāo)志蛋白或病原體蛋白包括：

rsv的組成（呼吸道合胞體病毒）

在本發(fā)明中特別地公開(kāi)了該mrna編碼的納米抗體對(duì)于hdac6-wt的調(diào)控作用，在這一應(yīng)用中，mrna的核苷酸序列對(duì)應(yīng)于hdac6-cat1的核苷酸序列，其表達(dá)后的納米抗體與hdac6-wt結(jié)合。

具體地，納米抗體具有seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15或seqidno:16所示的氨基酸序列的vhh鏈，其編碼核苷酸序列如seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16所示。

還包括有生成這一mrna的模板dna分子，其核苷酸序列如seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16所示，可以用以編碼針對(duì)hdac6-cat1的納米抗體。

進(jìn)一步地，在這一應(yīng)用中，我們還進(jìn)一步公開(kāi)了一種表達(dá)載體，這一表達(dá)載體包含有前述的dna分子的核苷酸序列。

并且，進(jìn)一步地，還包括有一個(gè)宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞能夠表達(dá)針對(duì)hdac6-cat1的納米抗體。

本發(fā)明公開(kāi)的mrna編碼的納米抗體能夠高效、安全地調(diào)控細(xì)胞內(nèi)部特定蛋白功能的方法。該方法通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄的、帶有修飾堿基以及翻譯原件的rna編碼納米抗體，并通過(guò)物理方法將該rna轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物導(dǎo)入特定的細(xì)胞，使其能在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)翻譯表達(dá)出可以與特定靶蛋白相結(jié)合的納米抗體。

同時(shí)，相較于用rna為載體在細(xì)胞內(nèi)部表達(dá)常規(guī)igg抗體全長(zhǎng)或igg抗體的片段的方法，由于納米抗體為分子量較?。▋H15kd）的單鏈多肽結(jié)構(gòu)，非常適合用體外轉(zhuǎn)錄或化學(xué)合成的一條rna鏈進(jìn)行編碼和表達(dá)，用rna表達(dá)納米抗體的難度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于用rna表達(dá)常規(guī)的多亞基igg抗體。此外，和常規(guī)igg抗體或igg抗體片段相比，納米抗體識(shí)別靶蛋白的特異性和穩(wěn)定性都顯著升高，其在科學(xué)研究和臨床使用中的可靠性很好。更重要的是，根據(jù)與目標(biāo)蛋白的結(jié)合方式的不同，不同的納米抗體可以活化或者抑制目標(biāo)蛋白的功能，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白功能的雙向調(diào)節(jié)。具體而言，由于其體積小，納米抗體可以插入靶蛋白表面凹陷的空隙中，如果這種結(jié)合誘發(fā)的構(gòu)象改變導(dǎo)致目標(biāo)蛋白活性中心更開(kāi)放，則使目標(biāo)蛋白的功能更為活躍；反之，如果這種結(jié)合導(dǎo)致目標(biāo)蛋白的活性中心被屏蔽或扭曲，則使該蛋白的功能被抑制。綜上所述，以rna編碼的納米抗體為工具調(diào)節(jié)胞內(nèi)蛋白的功能，具有易于操作、性能穩(wěn)定、效果可控的特點(diǎn)，臨床應(yīng)用前景良好。

本發(fā)明“用mrna編碼的納米抗體調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)靶蛋白功能”公開(kāi)了一種能夠高效、安全地調(diào)控細(xì)胞內(nèi)部特定蛋白功能的方法。該方法通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄的、帶有修飾堿基以及翻譯原件的rna編碼納米抗體，并通過(guò)物理方法將該rna轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物導(dǎo)入特定的細(xì)胞，使其能在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)翻譯表達(dá)出可以與特定靶蛋白相結(jié)合的納米抗體；根據(jù)納米抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合方式的不同，該方法既能用于抑制目標(biāo)蛋白的活力，也能用于促進(jìn)目標(biāo)蛋白的功能。采用該方法可以高效、特異性地干預(yù)細(xì)胞內(nèi)部疾病相關(guān)蛋白的功能，并以此實(shí)現(xiàn)治療疾病的目的。前人研究的絕大多數(shù)疾病相關(guān)的蛋白都位于細(xì)胞內(nèi)部，該發(fā)明解決了靶向胞內(nèi)蛋白的納米抗體無(wú)法用于臨床疾病治療的難題，從根本上拓寬了納米抗體類(lèi)藥物的可適用范圍。此外，和以dna或病毒為載體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)納米抗體的常用策略不同，該方法摒除了對(duì)宿主細(xì)胞基因組序列造成改變的風(fēng)險(xiǎn)，具有安全和容易清除的特點(diǎn)，非常適合臨床藥物設(shè)計(jì)生產(chǎn)的需要。

附圖說(shuō)明

圖1為重組質(zhì)粒雙酶切鑒定圖，其中：1:dl2000dna標(biāo)準(zhǔn)分子量；2:pet32a-cat1-jd重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物，說(shuō)明hdac6-cat1-jd目的片段成功克隆進(jìn)入pet32a（+）載體。

圖2為重組蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)物sds-page分析，其中：m:蛋白標(biāo)樣；1:bl21/cat1-jd菌體誘導(dǎo)產(chǎn)物包涵體純化產(chǎn)物，大小為48ku，說(shuō)明hdac6-cat1-jd重組蛋白成功表達(dá)且純化效果較好。

圖3為免疫駱駝的elisa抗體水平檢測(cè)圖，其中：免疫后血清抗體效價(jià)達(dá)104，，說(shuō)明hdac6-cat1-jd重組蛋白免疫效果較好。

圖4為cat1-jd重組蛋白特異性納米抗體在宿主菌大腸桿菌中的表達(dá)和純化圖，其中：2株納米抗體seqidno:4和seqidno:6未成功純化，其余14株納米抗體均得到較好的純化，大小為15kda。

圖5為所選各克隆與hdac6-wt的親和效果elisa圖，其中：9株納米抗體與hdac6-wt有較好的反應(yīng)，分別為seqidno:2、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:8、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16。

圖6為針對(duì)cat1-jd重組蛋白的納米抗體在真核宿主中的表達(dá)，其中：16株納米抗體均在真核宿主中表達(dá)。

圖7為hela細(xì)胞表達(dá)后對(duì)底物乙酰化水平的影響western-blot圖，其中：1株納米抗體seqidno:5在真核體內(nèi)表達(dá)后，對(duì)底物乙?；缴撸衕dac6去乙?；敢种苿┑淖饔?。

圖8為cho-k1細(xì)胞表達(dá)后對(duì)底物乙?；降挠绊慽f圖，其中：與沒(méi)有轉(zhuǎn)染進(jìn)重組質(zhì)粒的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染seqidno:5真核重組質(zhì)粒的細(xì)胞紅光更明顯，說(shuō)明1株納米抗體seqidno:5在真核體內(nèi)表達(dá)后，對(duì)底物乙?；缴撸僖淮巫C明hdac6去乙?；敢种苿┑淖饔谩?/p>

圖9為體外轉(zhuǎn)錄方法及各步效果圖，其中：1為pcr產(chǎn)物；2為mrnas加帽孵育0.5h；3為mrnas加帽孵育1.5h；4為dnase1處理后的mrna；5為mrna加尾poly（a），說(shuō)明體外mrna轉(zhuǎn)錄效果較好。

圖10為體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物抗egfp抗體體內(nèi)結(jié)合egfp圖，其中：含有g(shù)fp標(biāo)簽的抗actin抗體發(fā)綠色熒光，含有his標(biāo)簽的抗gfp納米抗體發(fā)紅色熒光，且兩種熒光重合。說(shuō)明體外轉(zhuǎn)錄的抗gfp納米抗體的mrna成功轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞，替代了質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的作用，且能正確識(shí)別gfp蛋白，起到一定的生物學(xué)功能。

圖11-12為體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與dna相比的體內(nèi)表達(dá)圖，其中：mrna結(jié)果如圖11所示，dna結(jié)果如圖12所示，說(shuō)明mrna在轉(zhuǎn)錄后3h便開(kāi)始表達(dá)，而dna在轉(zhuǎn)錄后12h才開(kāi)始表達(dá)，mrna表達(dá)時(shí)間早于dna。

圖13為rna轉(zhuǎn)入細(xì)胞后乙?；淖儓D，其中：seqidno:5的mrna在hela細(xì)胞中成功表達(dá)，且轉(zhuǎn)染有seqidno:5的mrna的細(xì)胞tubulin乙?；缴仙?，說(shuō)明mrna可以替代dna，起到hdac6去乙?；敢种苿┑淖饔谩?/p>

具體實(shí)施方式

為了更好的理解本發(fā)明，下面我們結(jié)合具體的實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述，但值得注意的是本發(fā)明的實(shí)施不僅限于此。

本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得或者可以按照文獻(xiàn)方法制備。本發(fā)明實(shí)施例中未注明的具體條件的試驗(yàn)方法均按照常規(guī)條件，或者按照制造廠商所建議的條件。

以抗胞質(zhì)內(nèi)去乙?；竓dac6的納米抗體為例，介紹本發(fā)明的應(yīng)用方法。

實(shí)施例1：hdac6-cat1截短蛋白的表達(dá)與純化：

（1）根據(jù)hdac6的基因序列，運(yùn)用premierprimer5.0軟件設(shè)計(jì)pcr引物：cat1-jd-5-sal1（cgagtcgacgagcagttaaatgaattccattg）和cat1-jd-3-not1（gcggcggccgcggcggccatctcacccttggggtcc），擴(kuò)增基因片段長(zhǎng)度為801bp；（2）以cat1-jd-5-sal1與cat1-jd-3-not1為引物，以hdac6-wt重組質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增出hdac6-cat1的6-272個(gè)氨基酸。pcr反應(yīng)體系25μl，含2×pcrmix（含酶）12.5μl、上游引物1μl、下游引物1μl、dna模板1μl、雙蒸水9.5μl。pcr的循環(huán)參數(shù)為：預(yù)變性95℃8min；變性95℃40s,退火57℃40s，延伸72℃50s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。1%瓊脂糖凝膠電泳觀察。（3）構(gòu)建pet32a-cat1-jd重組質(zhì)粒，方法如下：用市售dna膠回收試劑盒回收各pcr擴(kuò)增的基因片段，將純化后得到的10μl基因片段及10μlpet-32a（+）載體分別用salⅰ和xhoⅰ限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行雙酶切處理，酶切反應(yīng)可在0.5ml的ep管中進(jìn)行，37℃水浴4-5h。酶切后回收、純化各基因片段和載體。將酶切回收后的7μl各基因片段分別與1μl酶切后載體利用1μlt4連接酶進(jìn)行連接，連接體系置16℃6-8h或過(guò)夜，得連接產(chǎn)物。dh5α感受態(tài)細(xì)胞制備與連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，根據(jù)上述平板上菌落的生長(zhǎng)情況挑取分散的單菌落若干，接種于3ml含50μg/ml氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。在無(wú)菌條件下吸取相應(yīng)的菌液1μl作為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr結(jié)束后，用1.0％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定pcr產(chǎn)物。選取pcr結(jié)果正確且特異的樣品所對(duì)應(yīng)的菌液，利用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒。（4）將1μg各重組質(zhì)粒分別用0.5μlsali和0.5μlnoti限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行雙酶切處理，將雙酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送上海invitrogen公司測(cè)序。酶切反應(yīng)可在0.5ml的ep管中進(jìn)行，酶切過(guò)程為37℃水浴，4小時(shí)。酶切完成后，取10μl酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見(jiàn)圖1，從圖中可以看出，酶切所得cat1-jd片段與預(yù)期大小相符，為801bp,，且測(cè)序完全正確，說(shuō)明hdac6-cat1-jd目的片段成功克隆進(jìn)入pet32a（+）載體。（5）測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pet32a-cat1-jd轉(zhuǎn)化至bl21感受態(tài)細(xì)菌中，獲得的細(xì)菌分別命名為bl/cat1-jd。分別挑取不同重組細(xì)菌的單菌落到3ml含有卡那抗生素（含量為50μg/ml）的lb液體培養(yǎng)基中，37℃搖床，振搖2-3小時(shí)，待菌液od600達(dá)到0.8-1.0左右時(shí)，加入終濃度為1.0mm的iptg（異丙基硫代半乳糖苷），繼續(xù)進(jìn)行振搖培養(yǎng)5小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，8000rpm離心3min，收集細(xì)菌，并用pbs溶液洗滌2次，最終用500μl的pbs重懸菌體后，進(jìn)行超聲波破碎，參數(shù)為功率200w，時(shí)間10min（工作3s，間隔7s），然后8000rpm離心5min，收集上清液，同時(shí)用500μl的pbs將沉淀重懸。（6）各取100μl1.7中誘導(dǎo)表達(dá)所得的上清液和沉淀，加入25μl5×loadingbuffer，100℃水浴煮樣8min，然后加到已配好的聚丙烯酰胺凝膠上樣孔中，每孔20μl。電泳時(shí)，以80v電壓跑過(guò)濃縮膠，以120v電壓跑完分離膠。然后將凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色液染色3小時(shí)，換脫色液3-5次，每次1小時(shí)，至背景顏色洗脫干凈，進(jìn)行拍照記錄。sds-page結(jié)果見(jiàn)圖2，從圖中可以看出，其中泳道2為bl21/cat1-jd菌體誘導(dǎo)產(chǎn)物包涵體純化產(chǎn)物，大小為48ku，說(shuō)明hdac6-cat1-jd重組蛋白成功表達(dá)且純化效果較好。

實(shí)施例2：針對(duì)hdac6-cat1納米抗體文庫(kù)的構(gòu)建：

(1)將1mgcat1-jd重組蛋白抗原與弗氏佐劑等體積混合，免疫一只新疆雙峰駝，每周一次，共連續(xù)免疫7次，免疫過(guò)程中刺激b細(xì)胞表達(dá)特異性的納米抗體；(2)7次免疫結(jié)束后，提取駱駝外周血淋巴細(xì)胞100ml，進(jìn)行免疫駱駝的elisa抗體水平檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，免疫后血清效價(jià)達(dá)10⁴，說(shuō)明hdac6-cat1-jd重組蛋白免疫效果較好；并提取總rna；(3)合成cdna并利用套式pcr擴(kuò)增vhh；(4)利用限制性?xún)?nèi)切酶pstⅰ及notⅰ酶切20ugpmecs噬菌體展示載體及10ugvhh并連接兩種片段；(5)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞tg1中，構(gòu)建人源抗體fc片段納米抗體噬菌體展示文庫(kù)并測(cè)定庫(kù)容，庫(kù)容的大小約為1.2×10⁸。

實(shí)施例3：針對(duì)cat1-jd重組蛋白的納米抗體篩選過(guò)程：

(1)取200ul重組tg1細(xì)胞至2×ty培養(yǎng)基中培養(yǎng)，期間加入40ul輔助噬菌體vcsm13侵染tg1細(xì)胞，并培養(yǎng)過(guò)夜以擴(kuò)增噬菌體，次日利用peg/nacl沉淀噬菌體，離心收集擴(kuò)增噬菌體；(2)將溶解在100mmph8.2nahco3中的cat1-jd重組蛋白200ug偶聯(lián)在酶標(biāo)板上，4℃放置過(guò)夜，同時(shí)設(shè)立負(fù)對(duì)照；(3)第二天加入100ul的3%bsa，室溫封閉2h；(4)2h后，加入100ul擴(kuò)增噬菌體（2×10¹¹tfu免疫駱駝納米抗體噬菌體展示基因庫(kù)），室溫作用1h；(5)用pbs+0.05%tween-20洗5遍，以洗掉結(jié)合的噬菌體；(6)用終濃度為25mg/ml的胰蛋白酶將于人源抗體fc片段特異性結(jié)合的噬菌體解離下，并感染處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌tg1細(xì)胞，37℃培養(yǎng)1h，產(chǎn)生并收集噬菌體用于下一輪的篩選，相同篩選過(guò)程重復(fù)3輪，逐步的到富集。

實(shí)施例4：用噬菌體的酶聯(lián)免疫方法（elisa）篩選特異性陽(yáng)性克?。?/p>

(1)從上述3輪篩選后細(xì)胞培養(yǎng)板中，挑選175個(gè)單菌落分別接種于含100ug/ml氨芐青霉素的tb培養(yǎng)基的96深孔板中，并設(shè)置空白對(duì)照，37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，加入終濃度為1mm的iptg，28℃培養(yǎng)過(guò)夜；(2)利用滲透脹破法獲得粗提抗體，并將抗體轉(zhuǎn)移至經(jīng)抗原包被的elisa板上，室溫放置1h；(3)用pbst洗去未結(jié)合的抗體，加入100ul經(jīng)1:2000稀釋后的mouseanti-hatagantibody（鼠抗ha抗體，購(gòu)自科文斯），在室溫放置1h；(4)用pbst洗去未結(jié)合的抗體，加入100ul經(jīng)1:2000稀釋后的anti-mousealkalinephosphataseconjugate（山羊抗小鼠堿性磷酸酶標(biāo)記抗體，購(gòu)自于西格瑪），在室溫放置1h；(5)用pbst洗去未結(jié)合的抗體，加入堿性磷酸酶顯色液，反應(yīng)5-10min后于酶標(biāo)儀上405波長(zhǎng)處，讀取吸收值；(6)當(dāng)樣品孔o(hù)d值大于對(duì)照孔5倍以上時(shí)，判定為陽(yáng)性克隆孔；(7)將陽(yáng)性克隆孔的菌轉(zhuǎn)搖在含有100ug/ul氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基中以便提取質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序。

根據(jù)序列比對(duì)軟件vectornti分析各個(gè)克隆株的基因序列，把fr1、fr2、fr3、fr4、cdr1、cdr2、cdr3序列相同的株視為同一克隆株，而序列不同的株視為不同克隆株，最終獲得16株cat1-jd重組蛋白特異性納米抗體。其抗體的氨基酸序列為seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16所示的fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4區(qū)，構(gòu)成整個(gè)vhh。

實(shí)施例5：cat1-jd重組蛋白特異性納米抗體在宿主菌大腸桿菌中的表達(dá)、純化及鑒定

(1)將上述測(cè)序分析所獲得不同克隆株的質(zhì)粒點(diǎn)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌wk6中，并將其涂布在lb+amp+glucose即含有氨芐青霉素和葡萄糖的培養(yǎng)平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜；(2)挑選單個(gè)菌落接種在5ml含有氨芐青霉素的lb培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜；(3)接種1ml的過(guò)夜培養(yǎng)菌種至330mltb培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)到od600nm值達(dá)到0.6-0.9時(shí)，加入1miptg，28℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜；(4)離心，收集大腸桿菌，利用滲透脹破法，獲得抗體粗提液；(5)通過(guò)鎳柱親和層析法純化出抗體，獲得高純度的納米抗體，如圖4所示，其中2株納米抗體seqidno:4和seqidno:6未成功純化，其余14株納米抗體均得到較好的純化，大小為15kda。（6）將抗體轉(zhuǎn)移至經(jīng)hdac6-wt包被的elisa板上，室溫放置1h；(7)用pbst洗去未結(jié)合的抗體，加入100ul經(jīng)1:2000稀釋后的mouseanti-hatagantibody（鼠抗ha抗體，購(gòu)自科文斯），在室溫放置1h；(8)用pbst洗去未結(jié)合的抗體，加入100ul經(jīng)1:2000稀釋后的anti-mousealkalinephosphataseconjugate（山羊抗小鼠堿性磷酸酶標(biāo)記抗體，購(gòu)自于西格瑪），在室溫放置1h；(9)用pbst洗去未結(jié)合的抗體，加入堿性磷酸酶顯色液，反應(yīng)5-10min后于酶標(biāo)儀上405波長(zhǎng)處，讀取吸收值，結(jié)果如圖5所示，其中9株納米抗體與hdac6-wt有較好的反應(yīng)，分別為seqidno:2、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:8、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16。

實(shí)施例6：針對(duì)cat1-jd重組蛋白的納米抗體在真核宿主中的表達(dá)及體內(nèi)表達(dá)后對(duì)底物乙?；降挠绊?/p>

(1)將上述測(cè)序分析所獲得不同克隆株的質(zhì)粒，與egfp串聯(lián)，構(gòu)建真核重組質(zhì)粒pcdna.1，利用脂質(zhì)體2000，將真核重組質(zhì)粒與pcdna3.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到hela細(xì)胞中，36h后裂解細(xì)胞，進(jìn)行western-blot鑒定，將蛋白轉(zhuǎn)印至nc膜上，加入10ml經(jīng)1:2000稀釋后的mouseanti-histagantibody（鼠抗his抗體，購(gòu)自西格瑪），在室溫放置1h；用pbst洗去未結(jié)合的抗體，加入10ml經(jīng)1:2000稀釋后的goatanti-rabbithrpconjugate（山羊抗小鼠辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體，購(gòu)自于西格瑪），在室溫放置1h；用pbst洗去未結(jié)合的抗體，曝光，結(jié)果如圖6所示，16株納米抗體均在真核宿主中表達(dá)；(2)將（1）中的細(xì)胞裂解物進(jìn)行western-blot鑒定，將蛋白轉(zhuǎn)印至nc膜上，加入10ml經(jīng)1:2000稀釋后的rabbitanti-tubulink40antibody（兔抗tubulink40抗體，購(gòu)自abcam），在室溫放置1h；用pbst洗去未結(jié)合的抗體，加入10ml經(jīng)1:2000稀釋后的goatanti-rabbithrpconjugate（山羊抗小鼠辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體，購(gòu)自于西格瑪），在室溫放置1h；用pbst洗去未結(jié)合的抗體，曝光，結(jié)果如圖7所示，1株納米抗體seqidno:5在真核體內(nèi)表達(dá)后，對(duì)底物乙?；缴?，有hdac6去乙?；敢种苿┑淖饔茫?3)將seqidno:5真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入cho-k1細(xì)胞，36h后進(jìn)行間接免疫熒光，用pbst洗去細(xì)胞培養(yǎng)液，固定細(xì)胞后，加入100μl經(jīng)1:2000稀釋后的rabbitanti-tubulink40antibody（兔抗tubulink40抗體，購(gòu)自abcam），在室溫放置1h；用pbst洗去未結(jié)合的抗體，加入100μl經(jīng)1:2000稀釋后的goatanti-rabbita568conjugate（山羊抗小鼠紅光標(biāo)記抗體，購(gòu)自于西格瑪），在室溫放置1h；用pbst洗去未結(jié)合的抗體，用熒光顯微鏡觀察，結(jié)果如圖8所示，與沒(méi)有轉(zhuǎn)染進(jìn)重組質(zhì)粒的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染seqidno:5真核重組質(zhì)粒的細(xì)胞紅光更明顯，說(shuō)明1株納米抗體seqidno:5在真核體內(nèi)表達(dá)后，對(duì)底物乙?；缴撸僖淮巫C明hdac6去乙?；敢种苿┑淖饔谩?/p>

實(shí)施例7：體外轉(zhuǎn)錄方法及各步效果圖設(shè)計(jì)體外轉(zhuǎn)錄pcr引物：t7-5utr-gfp-vhh-pcdna3.1-f（taatacgactcactataggggagacccaagctggcta），3urt-gfp-vhh-pcdna3.1-r（agaatagaatgacacctactc），包含t7啟動(dòng)子，5’utr和3’utr區(qū)，以抗egfp納米抗體重組pcdna3,1質(zhì)粒為模板，pcr獲得大量的dna模板；naac回收50μlpcr反應(yīng)體系，轉(zhuǎn)移至新的pcr管；用hiscribe?t7arcamrnakit(withtailing)（mrna體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自neb公司），將dna轉(zhuǎn)錄成mrna，如圖9所示，其中：1為pcr產(chǎn)物；2為mrnas加帽孵育0.5h；3為mrnas加帽孵育1.5h；4為dnase1處理后的mrna；5為mrna加尾poly（a），說(shuō)明體外mrna轉(zhuǎn)錄效果較好。

實(shí)施例8：體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物體內(nèi)表達(dá)圖

（1）將體外轉(zhuǎn)錄的mrna15ug加lipo20008ul，溶于250uldmem中，轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)含有g(shù)fp標(biāo)簽的抗actin抗體的cho-k1細(xì)胞，36h后進(jìn)行間接免疫熒光，用pbst洗去細(xì)胞培養(yǎng)液，固定細(xì)胞后，加入100μl經(jīng)1:2000稀釋后的mouseanti-hisantibody（鼠抗his抗體，購(gòu)自西格瑪），在室溫放置1h；用pbst洗去未結(jié)合的抗體，加入100μl經(jīng)1:2000稀釋后的goatanti-mousea568conjugate（山羊抗小鼠紅光標(biāo)記抗體，購(gòu)自于西格瑪），在室溫放置1h；用pbst洗去未結(jié)合的抗體，用熒光顯微鏡觀察，結(jié)果如圖10所示，含有g(shù)fp標(biāo)簽的抗actin抗體發(fā)綠色熒光，含有his標(biāo)簽的抗gfp納米抗體發(fā)紅色熒光，且兩種熒光重合。說(shuō)明體外轉(zhuǎn)錄的抗gfp納米抗體的mrna成功轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞，替代了質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的作用，且能正確識(shí)別gfp蛋白，起到一定的生物學(xué)功能。

（2）同時(shí)，在轉(zhuǎn)染后不同的時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，觀察mrna出現(xiàn)的時(shí)間，以dna為對(duì)照。分別以0h、3h、6h、10h、12h、24h為時(shí)間點(diǎn)，收集細(xì)胞，進(jìn)行間接免疫熒光，用pbst洗去細(xì)胞培養(yǎng)液，固定細(xì)胞后，加入100μl經(jīng)1:2000稀釋后的mouseanti-hisantibody（鼠抗his抗體，購(gòu)自西格瑪），在室溫放置1h；用pbst洗去未結(jié)合的抗體，加入100μl經(jīng)1:2000稀釋后的goatanti-mousea568conjugate（山羊抗小鼠紅光標(biāo)記抗體，購(gòu)自于西格瑪），在室溫放置1h；用pbst洗去未結(jié)合的抗體，用熒光顯微鏡觀察，mrna結(jié)果如圖11所示，dna結(jié)果如圖12所示，說(shuō)明mrna在轉(zhuǎn)錄后3h便開(kāi)始表達(dá)，而dna在轉(zhuǎn)錄后12h才開(kāi)始表達(dá)，mrna表達(dá)時(shí)間早于dna。

實(shí)施例9：rna轉(zhuǎn)入細(xì)胞后乙酰化改變圖

（1）方法同實(shí)施例6，以seqidno:5重組pcdna3.1質(zhì)粒為模板，體外轉(zhuǎn)錄seqidno:5的mrna。方法同實(shí)施例5，進(jìn)行western-blot鑒定。結(jié)果如圖12所示，seqidno:5的mrna在hela細(xì)胞中成功表達(dá)，且轉(zhuǎn)染有seqidno:5的mrna的細(xì)胞tubulin乙酰化水平上升，說(shuō)明mrna可以替代dna，起到hdac6去乙?；敢种苿┑淖饔谩?/p>

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解，在本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)中的描述只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>東南大學(xué)

<120>mrna編碼的納米抗體及其應(yīng)用

<130>20170406

<160>16

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>426

<212>dna

<213>人工合成

<400>1

gtgcagctgcaggagtctgggggaggctcggtgcaggtcggagggtctctgagactctcc60

tgtgcctcctctgcaaacccctacagcagctactcactgggctggttccgccaggctccg120

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