假單胞菌中新型重組系統(tǒng)及其應(yīng)用的制作方法
本發(fā)明涉及一種革蘭氏陰性桿菌中的重組系統(tǒng)及其構(gòu)建與應(yīng)用，尤其一種假單胞菌(銅綠假單胞菌、丁香假單胞菌、熒光假單胞菌或/和惡臭假單胞菌)中的重組系統(tǒng)及其構(gòu)建與應(yīng)用，屬于微生物基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
噬菌體編碼的重組系統(tǒng)在修飾原核基因組和構(gòu)建真核轉(zhuǎn)基因物種時，能夠有非常廣泛的應(yīng)用。它僅僅需要35個核苷酸作為同源臂，應(yīng)用主要包括構(gòu)建突變體-點突變、刪除、插入和替換。較短的同源臂是這個技術(shù)的主要優(yōu)勢，這種技術(shù)被命名為重組工程。
在大腸桿菌中，應(yīng)用最廣泛的重組系統(tǒng)是λred系統(tǒng)和racrecet系統(tǒng)。λred系統(tǒng)利用來自于λ噬菌體的red操縱子(redα，redβ和redγ)來介導(dǎo)線狀和環(huán)狀dna分子進行同源重組。racrecet系統(tǒng)利用rac前噬菌體的rece和rect蛋白在大腸桿菌中介導(dǎo)兩個線狀dna分子發(fā)生同源重組。redα和rece是5’-3’雙鏈dna核酸外切酶，redβ和rect是單鏈退火蛋白。文獻報道redα/redβ和rece/rect通過蛋白-蛋白相互作用來促進雙鏈dna的同源重組。
redγ可以抑制recbcd的外切酶活性，recbcd是一個多功能酶復(fù)合物，它能加工處理由雙鏈斷裂產(chǎn)生的dna末端。redγ可以形成一個二聚體的dna類似物，與recbcd系統(tǒng)中核酸外切酶和解旋酶相互并且抑制這些酶的活性。文獻報道在rece/rect或者redα/redβ系統(tǒng)中加入redγ可以提高dna重組效率。來自發(fā)光桿菌(photorhabdusluminescens)的pluγ也可以模仿雙螺旋dna的形狀和構(gòu)造，抑制宿主體內(nèi)核酸外切酶復(fù)合體plu0632/plu0630/plu0633，從而在體內(nèi)能夠有效的提高同源重組的效率。
類似λred系統(tǒng)和racrecet系統(tǒng)的構(gòu)建，在其它細菌的噬菌體或者原噬菌體基因組中搜尋并克隆含有核酸外切酶和單鏈退火蛋白的操縱子，在這個操縱子中插入能夠提高重組效率的redγ或者pluγ蛋白基因，構(gòu)建成一個完整的dna重組系統(tǒng)，在大腸桿菌中構(gòu)建完成后把這套重組系統(tǒng)通過電擊轉(zhuǎn)化或者接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入操縱子來源的宿主進行遺傳修飾。許多文獻報道通過使用噬菌體重組功能操縱子構(gòu)建的重組系統(tǒng)，例如發(fā)光桿菌、致病桿菌(xenorhabdus)、枯草芽孢桿菌(b.subtilis)、梭菌(clostridium)、丁香假單胞菌(p.syringae)、結(jié)核分枝桿菌(m.tuberculosis)、乳酸桿菌(lactobacillusplantarum)等等，但是宿主專一性導(dǎo)致這些重組系統(tǒng)的應(yīng)用范圍很窄。
假單胞菌是一種革蘭氏陰性菌，需氧條件生長，屬于假單胞菌科，研究最多的幾種假單胞菌是人類條件致病菌銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)，植物條件致病菌丁香假單胞菌(pseudomonassyringae)，植物促生菌熒光假單胞菌(pseudomonasfluorescens)，還有在生物修復(fù)和生物防治過程中經(jīng)常使用的惡臭假單胞菌(pseudomonasputida)。傳統(tǒng)的基因操作技術(shù)是通過限制性內(nèi)切酶、dna連接酶與pcr擴增等技術(shù)在體外實現(xiàn)目的基因的插入、敲除和點突變等修飾，但操作繁瑣而且效率較低，由于限制性酶切位點的限制和操作繁瑣和效率低下等缺點限制了對假單胞菌基因組的研究和改造。有關(guān)假單胞菌(銅綠假單胞菌、丁香假單胞菌、熒光假單胞菌和惡臭假單胞菌)中的重組系統(tǒng)及其構(gòu)建與應(yīng)用的研究及專利鮮見報道。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種假單胞菌(銅綠假單胞菌、丁香假單胞菌、熒光假單胞菌或/和惡臭假單胞菌)中的重組系統(tǒng)及其構(gòu)建與應(yīng)用。
為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：
本發(fā)明所述的假單胞菌中新型重組系統(tǒng)由一系列同源重組系統(tǒng)表達質(zhì)粒構(gòu)成，其特征在于：所述表達質(zhì)粒在可誘導(dǎo)啟動子下，表達一個操縱子，該操縱子除包含宿主特異性核酸外切酶以及單鏈dna退火蛋白兩個基因外，第三個基因是來源于大腸桿菌lambda噬菌體的redγ，或是來源于發(fā)光桿菌(photorhabdusluminescens)前噬菌體的pluγ(plu2934)，或是其它外源的核酸外切酶recbcd抑制蛋白；或者，該操縱子除包含宿主特異性核酸外切酶，單鏈dna退火蛋白以及外源或內(nèi)源核酸外切酶recbcd抑制蛋白三個基因外，第四個基因是來源于細菌染色體的單鏈dna結(jié)合蛋白ssb，或是來源于細菌質(zhì)粒上的ssb，或是來源于細菌噬菌體的ssb，或是來源于細菌前噬菌體的ssb。
上述假單胞菌中新型重組系統(tǒng)中，進一步優(yōu)化的技術(shù)方案是：所述重組系統(tǒng)中的系列同源重組系統(tǒng)表達質(zhì)粒包括pbbr1復(fù)制起點、卡那霉素抗性基因和鼠李糖誘導(dǎo)型啟動子的重組系統(tǒng)；其命名分別是pbbr1-rha-red_gba-kan，核苷酸序列如seqidno.23所示；pbbr1-rha-plu_gba-kan，核苷酸序列如seqidno.24所示；pbbr1-rha-tepsy-kan，核苷酸序列如seqidno.25所示；pbbr1-rha-plugam-tepsy-kan，核苷酸序列如seqidno.26所示；pbbr1-rha-redgam-tepsy-kan，核苷酸序列如seqidno.27所示；pbbr1-rha-bas-kan，核苷酸序列如seqidno.28所示；pbbr1-rha-plugam-bas-kan，核苷酸序列如seqidno.29所示；pbbr1-rha-redgam-bas-kan，核苷酸序列如seqidno.30所示；其中，rectepsy是來源于丁香假單胞菌(pseudomonassyringae)的前噬菌體中的rectepsy，b是單鏈dna退火蛋白或稱為重組酶，a是5’－3’雙鏈dna核酸外切酶，s是來源于銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)噬菌體vb_paep_tr60_ab31的單鏈dna結(jié)合蛋白(ssb)，redγ是來源于lambda噬菌體的大腸桿菌核酸外切酶recbcd的抑制蛋白，pluγ是來源于發(fā)光桿菌(photorhabdusluminescens)前噬菌體的核酸外切酶recbcd的抑制蛋白。
上述假單胞菌中新型重組系統(tǒng)中，最優(yōu)化的技術(shù)方案是：所述重組系統(tǒng)中的系列同源重組系統(tǒng)表達質(zhì)粒是：pbbr1-rha-bas-kan，pbbr1-rha-plugam-tepsy-kan，pbbr1-rha-redgam-tepsy-kan，pbbr1-rha-redgam-bas-kan或pbbr1-rha-plugam-bas-kan。
上述假單胞菌中新型重組系統(tǒng)中，所述假單胞菌優(yōu)選是銅綠假單胞菌、丁香假單胞菌、熒光假單胞菌或/和惡臭假單胞菌。
本發(fā)明所述假單胞菌中新型重組系統(tǒng)在假單胞菌屬不同種中介導(dǎo)短同源臂和長同源臂之間的同源重組進行基因組dna或質(zhì)粒遺傳修飾中的應(yīng)用。其中，所述短同源臂是指50bp-150bp的同源臂，所述長同源臂是指大于150bp的同源臂。
各種菌株中最佳的重組系統(tǒng)是不同的，最佳的重組條件也不相同，進行條件優(yōu)化例如感受態(tài)細胞制備方法優(yōu)化，dna轉(zhuǎn)化量優(yōu)化，抗生素選擇濃度優(yōu)化，同源臂長度優(yōu)化等可以提高重組效率，進一步利用不同菌株最佳的重組系統(tǒng)進行高效的基因修飾。
上述介導(dǎo)短同源臂和長同源臂之間的同源重組進行基因組dna或質(zhì)粒遺傳修飾時，在銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)中優(yōu)選pbbr1-rha-redgam-bas-kan質(zhì)粒，在丁香假單胞菌(pseudomonassyringae)中優(yōu)選pbbr1-rha-redgam-bas-kan質(zhì)粒，pbbr1-rha-redgam-tepsy-kan質(zhì)粒或pbbr1-rha-plugam-tepsy-kan質(zhì)粒，在惡臭假單胞菌(pseudomonasputida)中優(yōu)選pbbr1-rha-bas-kan質(zhì)粒，在熒光假單胞菌(pseudomonasfluorescens)優(yōu)選pbbr1-rha-bas-kan質(zhì)?；騪bbr1-rha-plugam-tepsy-kan質(zhì)粒。
本發(fā)明報道了一系列可以應(yīng)用于假單胞菌的重組系統(tǒng)，尤其是在銅綠假單胞菌、丁香假單胞菌、熒光假單胞菌和惡臭假單胞菌中構(gòu)建最佳的重組系統(tǒng)，這些重組系統(tǒng)是來自于銅綠假單胞菌噬菌體ab31和丁香假單胞菌原噬菌體的兩個宿主特異性具有重組功能的操縱子。blast分析顯示orf38，orf37和orf36分別是redβ，redα和單鏈dna結(jié)合蛋白(ssb)的同源蛋白。重組實驗結(jié)果顯示帶有redγ/pluγ的雜合系統(tǒng)能夠在一些假單胞菌中很好的工作，同時發(fā)現(xiàn)ssb蛋白可以顯著提高重組效率。利用這些重組系統(tǒng)，我們成功的對假單胞菌進行了高效簡潔的質(zhì)粒修飾和點突變、插入刪除的基因組修飾，應(yīng)用前景廣闊。
附圖說明
圖1：在假單胞菌中不同重組酶組合的重組效率比較。
(a)假單胞菌中線環(huán)重組的示意圖。pcr產(chǎn)物是兩端帶有100bp的同源臂(藍色)，中間為慶大霉素抗性基因(genta)，替換掉表達質(zhì)粒中重組相關(guān)的基因形成新的質(zhì)粒。
(b)銅綠假單胞菌在30℃條件下表達pbbr1-rha-red_gba-kan，pbbr1-rha-plu_gba-kan，pbbr1-rha-tepsy-kan，pbbr1-rha-plugam-tepsy-kan，pbbr1-rha-redgam-tepsy-kan，pbbr1-rha-bas-kan，pbbr1-rha-plugam-bas-kan，pbbr1-rha-redgam-bas-kan進行線環(huán)重組效率比較的結(jié)果。
(c)銅綠假單胞菌在37℃條件下表達(b)中一系列重組系統(tǒng)進行線環(huán)重組效率比較的結(jié)果。
(d)熒光假單胞菌在30℃條件下表達(b)中一系列重組系統(tǒng)進行線環(huán)重組效率比較的結(jié)果。
(e)丁香假單胞菌在30℃條件下表達(b)中一系列重組系統(tǒng)進行線環(huán)重組效率比較的結(jié)果。
(f)惡臭假單胞菌在30℃條件下表達pbbr1-rha-red_gba-kan，pbbr1-rha-plu_gba-kan，pbbr1-rha-tepsy-kan，pbbr1-rha-plugam-tepsy-kan，pbbr1-rha-redgam-tepsy-kan，pbbr1-rha-bas-kan，pbbr1-rha-plugam-bas-kan，pbbr1-rha-redgam-bas-kan進行線環(huán)重組效率比較的結(jié)果。
圖2：假單胞菌電轉(zhuǎn)條件的優(yōu)化。
(a)、(b)、(c)和(d)是銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌、丁香假單胞菌和熒光假單胞菌的生長曲線。初始的菌液濃度od600是0.085。
(e)、(f)、(g)和(h)分別是銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌、丁香假單胞菌和熒光假單胞菌不同時間的轉(zhuǎn)化效率。
圖3：假單胞菌中重組時轉(zhuǎn)化dna量和同源臂長度的優(yōu)化。
銅綠假單胞菌攜帶pbbr1-rha-plugam-tepsy-kan(a)，惡臭假單胞菌攜帶pbbr1-rha-bas-kan系統(tǒng)(b)，丁香假單胞菌攜帶pbbr1-rha-bas-kan(c)，熒光假單胞菌攜帶pbbr1-rha-redgam-tepsy-kan(d)中轉(zhuǎn)化不同濃度dna對重組效率的影響。
銅綠假單胞菌攜帶pbbr1-rha-plugam-tepsy-kan(e)，惡臭假單胞菌攜帶pbbr1-rha-bas-kan(f)，丁香假單胞菌攜帶pbbr1-rha-bas-kan(g)，熒光假單胞菌攜帶pbbr1-rha-redgam-tepsy-kan(h)中轉(zhuǎn)化不同長度同源臂的pcr產(chǎn)物對重組效率的影響。
圖4：在銅綠假單胞菌中通過同源重組進行基因組修飾后的菌落pcr鑒定。
(a)銅綠假單胞菌中基因組修飾的示意圖和菌落pcr的示意圖。
(b)通過插入慶大霉素篩選標(biāo)記來敲除phnab基因，克隆1和2都是正確的。
(c)在敲除phnab基因后使用cre酶的位點特異性重組刪除慶大霉素抗性篩選標(biāo)記，六個克隆都是正確的。
(d)通過插入慶大霉素篩選標(biāo)記來敲除lasb基因，克隆1和2都是正確的。
(e)在敲除lasb基因后使用cre酶的位點特異性重組刪除慶大霉素抗性篩選標(biāo)記，克隆都是正確的。
(f)通過插入慶大霉素篩選標(biāo)記來敲除mdoh基因，克隆是正確的。
(g)在敲除mdoh基因后使用cre酶的位點特異性重組刪除慶大霉素抗性篩選標(biāo)記，四個克隆都是正確的。
圖5：在銅綠假單胞菌中使用新型重組系統(tǒng)進行點突變。
(a)在銅綠假單胞菌中進行點突變的示意圖和菌落pcr鑒定的示意圖。
(b)在toxa靶位點插入sacb-慶大霉素組件，泳道c是野生型菌株作為陰性對照，泳道m(xù)是takaradl5000，泳道1和2是重組子，克隆1和2都是正確的。
(c)通過單鏈核苷酸配對插入點突變，三個克隆都是正確的。
(d)突變體的測序驗證。
圖6：sacb的功能驗證，在含有10％蔗糖的lb(左邊平板)和lb(右邊平板)。
1.銅綠假單胞菌的野生型菌株；2-8.pao1插入sacb-慶大霉素組件后的不同突變克隆。
圖7：在丁香假單胞菌和熒光假單胞菌中進行基因修飾后的菌落pcr驗證。pcr產(chǎn)物跨過完整的插入片段。
(a)在丁香假單胞菌預(yù)測的生物合成基因前插入啟動子(pgenta)。
(b)對熒光假單胞菌pf5的rets基因進行敲除，泳道1是插入慶大霉素-sacb組件(pf5-δrets-genta-loxm)，泳道2,3是利用cre酶進行位點特異性重組后的最終突變菌株(pf5-δrets)。
圖8：ssb對pbbr1-rha-ba-kan和pbbr1-rha-redgam-ba-kan系統(tǒng)重組功能的影響。
在大腸桿菌(a)，在銅綠假單胞菌(b)和在丁香假單胞菌(c)中研究ssb對pbbr1-rha-ba-kan和pbbr1-rha-redgam-ba-kan重組功能的影響。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，實施例中方法如無特殊說明的采用常規(guī)方法，使用的試劑如無特殊說明的使用常規(guī)市售試劑或按常規(guī)方法配置的試劑。
試劑與儀器：
本實施例中試劑主要為分子生物學(xué)實驗試劑，單鏈核苷酸是從上海生工生物技術(shù)有限公司合成，限制性內(nèi)切酶、dna聚合酶和dna標(biāo)記來自新英格蘭生物公司(newenglandbiolabs)，抗生素從英杰公司(invitrogen)購買。
進行重組的電轉(zhuǎn)化細胞的制備：
各種表達質(zhì)粒要分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌gb05購于德國genebridges公司、銅綠假單胞菌pao1購于德國dsmz(保藏號：dsm1707)、熒光假單胞菌pf5購于美國美國典型培養(yǎng)物保藏中心atcc(保藏號：
實施例1：構(gòu)建一系列同源重組表達質(zhì)粒
以λbeta或者racrect的氨基酸序列作為參考，blast分析來自假單胞菌和假單胞菌噬菌體的基因組，尋找潛在的具有重組功能的蛋白。從假單胞菌和假單胞菌噬菌體中發(fā)現(xiàn)了兩個包含成對核酸外切酶-重組酶的操縱子，一個操縱子是來自丁香假單胞菌的rectepsy，這個操縱子已經(jīng)成功用于構(gòu)建重組系統(tǒng)；第二個操縱子來自于假單胞菌噬菌體vb_paep_tr60_ab31，這個操縱子編碼三個蛋白:orf38(b)含有177個氨基酸，序列與redβ有62％的同源性；orf37(a)含有195個氨基酸，序列與redα有32％的同源性；orf36(s)含有148個氨基酸，序列與大腸桿菌的單鏈dna結(jié)合蛋白ssb有54％的同源性。
一系列重組功能質(zhì)粒以廣宿主的復(fù)制子pbbr1為基礎(chǔ)進行構(gòu)建，重組功能蛋白利用鼠李糖啟動子進行誘導(dǎo)表達。
pbbr1-rha-red_gba-kan質(zhì)粒的構(gòu)建方法：從大腸桿菌中提取pbbr1-rha-gfp-kan質(zhì)粒，取40ul質(zhì)粒用ndei酶切3h，瓊脂糖凝膠電泳90v進行跑膠，直至片段跑至凝膠底部后進行線性載體的凝膠回收，以psc101-bad-gba-tet質(zhì)粒為模板，gba-3/gba-5為引物擴增red_gba片段，將gb-dir細菌過夜培養(yǎng)并30℃轉(zhuǎn)接1.3ml培養(yǎng)2h，加入20ul阿拉伯糖誘導(dǎo)劑37℃誘導(dǎo)40min，將pbbr1-rha-kan線性載體與red_gba片段1350v電擊共轉(zhuǎn)化入誘導(dǎo)的gb05-dir中，37℃復(fù)蘇1h，10000rpm離心菌體并劃線涂布至卡那霉素15的抗性平板，37℃過夜培養(yǎng)并挑單克隆進行鑒定，正確的克隆進行菌保。
其它質(zhì)粒的構(gòu)建方法類似：pbbr1-rha-plu_gba-kan質(zhì)粒由pbbr1-rha-kan線性載體與plu_gba片段電擊共轉(zhuǎn)化入gb05-dir中，阿拉伯糖誘導(dǎo)進行線線重組得到；pbbr1-rha-tepsy-kan質(zhì)粒由pbbr1-rha-kan線性載體與tepsy片段電擊共轉(zhuǎn)化入gb05-dir中，阿拉伯糖誘導(dǎo)進行線線重組得到；pbbr1-rha-plugam-tepsy-kan質(zhì)粒由pbbr1-rha-tepsy-kan線性載體與plugam片段電擊共轉(zhuǎn)化入gb05-dir中，阿拉伯糖誘導(dǎo)進行線線重組得到；pbbr1-rha-redgam-tepsy-kan質(zhì)粒由pbbr1-rha-tepsy-kan線性載體與redgam片段電擊共轉(zhuǎn)化入gb05-dir中，阿拉伯糖誘導(dǎo)進行線線重組得到；pbbr1-rha-bas-kan質(zhì)粒由pbbr1-rha-kan線性載體與bas片段電擊共轉(zhuǎn)化入gb05-dir中，阿拉伯糖誘導(dǎo)進行線線重組得到；pbbr1-rha-plugam-bas-kan質(zhì)粒由pbbr1-rha-bas-kan線性載體與plugam片段電擊共轉(zhuǎn)化入gb05-dir中，阿拉伯糖誘導(dǎo)進行線線重組得到；pbbr1-rha-redgam-bas-kan質(zhì)粒由pbbr1-rha-bas-kan線性載體與redgam片段電擊共轉(zhuǎn)化入gb05-dir中，阿拉伯糖誘導(dǎo)進行線線重組得到。
在宿主特異性核酸外切酶以及單鏈dna退火蛋白兩個基因外，或者在宿主特異性核酸外切酶，單鏈dna退火蛋白以及外源或內(nèi)源核酸外切酶recbcd抑制蛋白三個基因外，第三個基因或者第四個基因也可以是來源于細菌染色體的單鏈dna結(jié)合蛋白ssb，或者來源于細菌質(zhì)粒上的ssb，或者來源于細菌噬菌體的ssb，或者來源于細菌前噬菌體的ssb。
實施例2：假單胞菌中不同重組系統(tǒng)的效率比較
將pbbr1-rha-red_gba-kan，pbbr1-rha-plu_gba-kan，pbbr1-rha-tepsy-kan，pbbr1-rha-plugam-tepsy-kan，pbbr1-rha-redgam-tepsy-kan，pbbr1-rha-bas-kan，pbbr1-rha-plugam-bas-kan，pbbr1-rha-redgam-bas-kan通過電擊轉(zhuǎn)化導(dǎo)入到四種假單胞菌(銅綠假單胞菌、丁香假單胞菌、熒光假單胞菌和惡臭假單胞菌)。圖1a是重組系統(tǒng)效率比較的示意圖。銅綠假單胞菌在37℃和30℃都有良好的生長狀況，因此需要在這兩種溫度下進行效率比較。銅綠假單胞菌本身具有多種抗藥性并且很容易獲得更強的耐藥機制，所以在銅綠假單胞菌中進行重組效率比較之后要計算正確率。
在銅綠假單胞菌中，redγ和pluγ蛋白加入到bas重組系統(tǒng)中能夠顯著提高同源重組的正確率，但是對于pbbr1-rha-tepsy-kan質(zhì)粒，只有在30℃培養(yǎng)下加入pluγ蛋白才會提高正確率(圖1b)。在37℃培養(yǎng)時，pbbr1-rha-bas-kan質(zhì)?？梢怨ぷ鳎尤雛edγ蛋白后可以顯著提高基因重組的正確率(圖1c)。因此我們在銅綠假單胞菌中進行遺傳修飾時，30℃條件下使用pbbr1-rha-plugam-tepsy-kan質(zhì)粒，37℃條件下使用pbbr1-rha-redgam-bas-kan質(zhì)粒。與銅綠假單胞菌的情況相似，在熒光假單胞菌中把redγ和pluγ蛋白加到pbbr1-rha-tepsy-kan和pbbr1-rha-bas-kan質(zhì)粒上時，也可以顯著提高重組效率(圖1d)。然而在丁香假單胞菌和惡臭假單胞菌中，把redγ和pluγ蛋白加入到pbbr1-rha-bas-kan質(zhì)粒上時會降低重組效率(圖1e，1f)。
最終確定假單胞菌(銅綠假單胞菌、丁香假單胞菌、熒光假單胞菌和惡臭假單胞菌)中高效率的重組表達質(zhì)粒為pbbr1-rha-bas-kan質(zhì)粒、pbbr1-rha-redgam-tepsy-kan質(zhì)粒、pbbr1-rha-plugam-tepsy-kan質(zhì)粒、pbbr1-rha-plugam-bas-kan質(zhì)粒和pbbr1-rha-redgam-bas-kan質(zhì)粒。其中s是來源于噬菌體vb_paep_tr60_ab31的單鏈dna結(jié)合蛋白(ssb)，redγ是來源于lambda噬菌體的大腸桿菌核酸外切酶recbcd的抑制蛋白，pluγ是來源于發(fā)光桿菌(photorhabdusluminescens)前噬菌體的核酸外切酶recbcd的抑制蛋白。
實施例3：假單胞菌中重組系統(tǒng)工作條件的優(yōu)化從而提高重組效率
根據(jù)實施例2所述，每種假單胞菌的最佳重組系統(tǒng)不同，這幾種重組系統(tǒng)在不同的假單胞菌中，在感受態(tài)細胞制備方法優(yōu)化，dna轉(zhuǎn)化量優(yōu)化，抗生素選擇濃度優(yōu)化，同源臂長度優(yōu)化的基礎(chǔ)之上，可以提高重組效率。
外源dna電擊轉(zhuǎn)化進入細胞的能力與dna分子發(fā)生同源重組的效率有很大關(guān)系，外源dna電擊轉(zhuǎn)化進入細胞的最佳時期是指數(shù)生長期。本發(fā)明測定了銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌、丁香假單胞菌和熒光假單胞菌的生長曲線(圖2abcd)。數(shù)據(jù)顯示銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌、丁香假單胞菌和熒光假單胞菌的指數(shù)生長期分別開始于2h，2h，3h和1h。根據(jù)測定的生長曲線，可以分析轉(zhuǎn)化的最佳時間。結(jié)果顯示銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌、丁香假單胞菌和熒光假單胞菌最佳的轉(zhuǎn)化時間分別是2.5h，2.5h，4h和1.5h(圖2efgh)。
本發(fā)明同時檢測轉(zhuǎn)化dna的濃度是否會影響基因重組效率。銅綠假單胞菌攜帶pbbr1-rha-plugam-tepsy-kan質(zhì)粒，惡臭假單胞菌攜帶pbbr1-rha-bas-kan質(zhì)粒，丁香假單胞菌攜帶pbbr1-rha-bas-kan質(zhì)粒，熒光假單胞菌攜帶pbbr1-rha-redgam-tepsy-kan質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化定量同體積的pcr產(chǎn)物(慶大霉素抗性基因)，其中dna量是100ng，250ng，500ng，1000ng，1500ng和2000ng的梯度，然后統(tǒng)計重組效率。通過這個梯度dna濃度的檢測顯示假單胞菌進行重組時的飽和dna量是1500ng(圖3abcd)。
本發(fā)明還研究了同源臂長度對同源重組效率的影響。銅綠假單胞菌攜帶pbbr1-rha-plugam-tepsy-kan質(zhì)粒，惡臭假單胞菌攜帶pbbr1-rha-bas-kan質(zhì)粒，丁香假單胞菌攜帶pbbr1-rha-bas-kan質(zhì)粒，熒光假單胞菌攜帶pbbr1-rha-redgam-tepsy-kan質(zhì)粒分別電擊轉(zhuǎn)入不同長度同源臂的pcr產(chǎn)物(慶大霉素抗性基因)。在銅綠假單胞菌中可以歸結(jié)為兩種類型，一種類型是同源臂長度小于50bp，基本沒有重組功能(圖3e)；第二種類型是同源臂長度從75bp到150bp，在這個長度范圍內(nèi)，重組效率有顯著提高(圖3e)。對于惡臭假單胞菌、丁香假單胞菌和熒光假單胞菌最短的同源臂長度分別是75bp(圖3f)，50bp(圖3g)，100bp(圖3h)。
實施例4：在不同的假單胞菌中利用各自最佳的新型重組系統(tǒng)進行基因組的遺傳修飾
本發(fā)明已經(jīng)成功建立了不同假單胞菌的最佳重組系統(tǒng)并對這一系列的重組系統(tǒng)的工作條件進行了優(yōu)化，下一步利用這一系列最佳的重組系統(tǒng)對不同假單胞菌進行基因組的遺傳修飾。在假單胞菌屬不同種中介導(dǎo)短同源臂(50bp-150bp)和長同源臂(大于150bp)之間的同源重組，進行基因組dna遺傳修飾。在銅綠假單胞菌中優(yōu)選pbbr1-rha-plugam-bas-kan質(zhì)粒，在丁香假單胞菌中優(yōu)選pbbr1-rha-redgam-bas-kan質(zhì)粒，pbbr1-rha-redgam-tepsy-kan質(zhì)?；騪bbr1-rha-plugam-tepsy-kan質(zhì)粒，在惡臭假單胞菌中優(yōu)選pbbr1-rha-bas-kan質(zhì)粒，在熒光假單胞菌優(yōu)選pbbr1-rha-bas-kan質(zhì)?；騪bbr1-rha-plugam-tepsy-kan質(zhì)粒。
銅綠假單胞菌pao1的基因組修飾包括基因敲除和基因敲入。圖4a顯示的是基因敲除過程示意圖，首先通過同源重組將一段pcr產(chǎn)物插入到靶基因，這段pcr產(chǎn)物包括慶大霉素的抗性基因，同源臂(75bp)和位點特異性重組酶識別位點loxm(lox71-lox66)，靶基因分別是：；phnab基因，它是綠膿菌素生物合成的必需基因；lasb基因，它編碼彈性蛋白酶b；mdoh基因，它編碼一個蛋白涉及周質(zhì)葡聚糖的生物合成?；蛑亟M后，利用5’-3’端的菌落pcr進行驗證(圖4bcd)。使用pbbr1-rha-plugam-tepsy-kan質(zhì)粒進行一次電轉(zhuǎn)化大約能得到100個左右正確的慶大霉素抗性克隆。但是使用pbbr1-rha-redgam-bas-kan質(zhì)粒進行遺傳修飾時，正確率就會下降。為了得到銅綠假單胞菌pao1的無痕修飾突變體，通過cre酶的位點特異性重組將抗性基因敲除，最后對各種突變體進行菌落pcr鑒定(圖4efg)。
toxa有三個結(jié)構(gòu)域：氨基末端結(jié)構(gòu)域i包括一個真核細胞的識別位點，中間的結(jié)構(gòu)域ii包括蛋白轉(zhuǎn)移功能，羧基末端結(jié)構(gòu)域iii有一個生物酶的結(jié)合位點。結(jié)構(gòu)域iii上的578位谷氨酸是活性位點，把這個氨基酸替換可以構(gòu)建一株減毒的菌株。toxa的點突變(把578位的密碼子由gag變?yōu)間ac，把谷氨酸變?yōu)樘於彼?可以通過簡捷的兩步重組獲得(圖5a)。第一步重組中，通過表達pbbr1-rha-plugam-tepsy-kan質(zhì)?；蛘遬bbr1-rha-redgam-bas-kan質(zhì)粒，將帶有慶大霉素抗性基因和一個反向篩選標(biāo)記(sacb)的pcr產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進銅綠假單胞菌細胞，與靶基因進行同源重組。隨機選擇重組克隆進行3’端和5’端的菌落pcr鑒定(圖5b)，正確克隆隨后進行sacb的功能驗證(圖6)。第二步的重組中，通過表pbbr1-rha-plugam-tepsy-kan質(zhì)?；蛘遬bbr1-rha-redgam-bas-kan質(zhì)粒，將包含點突變(把578位的密碼子由gag變?yōu)間ac，把谷氨酸變?yōu)樘於彼?的單鏈dna轉(zhuǎn)化到之前構(gòu)建的突變體中，重組后將得到點突變的菌株。最終的突變菌種通過菌落pcr驗證(圖5c)和測序驗證(圖5d)。
為了擴展新型重組系統(tǒng)的應(yīng)用范圍，本發(fā)明還可以通過插入啟動子(papra)的方式來激活次級代謝產(chǎn)物的生物合成途徑。通過表達pbbr1-rha-bas-kan質(zhì)粒，將啟動子(pgenta)插入到丁香假單胞菌番茄變種dc3000(pseudomonassyringaepv.tomatostr.dc3000)(圖7a)。但是在hplc-ms分析中均沒有獲得相應(yīng)的化合物。
在熒光假單胞菌中，一種叫做rets的混合傳感激酶能夠抑制一些抗生素的產(chǎn)生，包括2,4-二乙酰基間苯三酚、吡咯硝基和黃綠膿菌素。在熒光假單胞菌中對rets進行基因失活，可能會提高這株菌的生防能力。在熒光假單胞菌中通過表達pbbr1-rha-redgam-tepsy-kan質(zhì)粒，可以將rets基因進行敲除，突變菌株通過菌落pcr進行驗證(圖7b)。
實施例5：ssb蛋白的表達可以提高銅綠假單胞菌和大腸桿菌的重組效率
在大腸桿菌中，ssb蛋白的表達可以顯著提高pbbr1-rha-redgam-ba-kan質(zhì)粒的重組效率，但是ssb蛋白卻不能提高pbbr1-rha-ba-kan質(zhì)粒的重組效率(圖8a)，在銅綠假單胞菌中也得到了類似的結(jié)果(圖8b)。在丁香假單胞菌中，ssb蛋白可以顯著提高pbbr1-rha-ba-kan質(zhì)粒的重組效率，但是加入了redγ蛋白后重組效率反而降低了，而且ssb也不會提高重組效率(圖8c)。結(jié)果表明ssb提高重組效率可能與宿主蛋白有關(guān)系。
序列表
<110>山東大學(xué)
<120>假單胞菌中新型重組系統(tǒng)及其應(yīng)用
<141>2017-04-18
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