本發(fā)明屬于生物分子技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種高效準(zhǔn)確篩選產(chǎn)發(fā)菜多糖重組酵母菌株的方法，具體涉及一種利用雙重PCR技術(shù)篩選產(chǎn)發(fā)菜多糖重組酵母菌株的方法。

背景技術(shù)：

目前，重組菌株的篩選方法主要有BTB顯色法、代謝產(chǎn)物定性法等，這些方法有的雖被廣泛采用，但篩選對(duì)象不同所選用的方法也不同。重組菌株代謝產(chǎn)物大多具有酸堿性質(zhì)，且產(chǎn)量較大，可使用代謝產(chǎn)物定性法進(jìn)行篩選。但是發(fā)菜多糖在培養(yǎng)液中呈中性，且代謝產(chǎn)物產(chǎn)量少，常規(guī)篩選方法不僅費(fèi)時(shí)、困難，而且會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。此外，關(guān)于發(fā)狀念珠藻功能成分發(fā)菜多糖的生物合成相關(guān)基因的研究報(bào)道較少。因此，選擇合適的篩選方法至關(guān)重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種利用雙重PCR技術(shù)篩選產(chǎn)發(fā)菜多糖重組酵母菌株的方法，篩選較為容易、省時(shí)，且不影響試驗(yàn)結(jié)果。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種利用雙重PCR技術(shù)篩選產(chǎn)發(fā)菜多糖重組酵母菌株的方法，具體按以下步驟進(jìn)行：

步驟1：利用酵母DNA提取試劑盒提取發(fā)菜酵母重組菌株，提取重組菌株基因組DNA；

步驟2：設(shè)計(jì)引物序列為5’-3’ 的引物1和引物序列為5’-3’ 的引物2；

步驟3： PCR總體積為25μL，其中包括2×Taq PCRMaster Mix 10.5μL，上游引物 1.0μL，下游引物1.0μL，模板 DNA 1.5μL，其余用水補(bǔ)足；反應(yīng)程序：94 ℃變性2 min；94 ℃20 s ，52 ℃ 25 s ，72 ℃ 30 s，18個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸2 min；進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增：

步驟4：模板 DNA 3μl，雙重引物上下游各加1.5μl，2×Taq PCRMaster Mix 10.5μL，加 ddH₂O 至25μl；擴(kuò)增PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94℃變性 2min；然后 94℃，20sec、52℃，25sec、72℃，30sec，進(jìn)行 20 個(gè)循環(huán)；最后 72℃延伸 2min，4℃保溫，進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在 -20℃保存；

步驟5：對(duì)Pho1 F/R和Pho2 F/R兩對(duì)引物進(jìn)行引物配比，雙重PCR擴(kuò)增體系為：模板 DNA 3μl，2×Taq PCRMaster Mix 10.5μL，引物濃度分別為1.5μl，加 ddH₂O 至25μl，擴(kuò)增PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃變性 2min；然后 94℃，20sec、52℃，25sec、72℃，30sec，進(jìn)行 20 個(gè)循環(huán)；最后 72℃延伸 2min，4℃保溫；

步驟6：用步驟5得到的雙重PCR擴(kuò)增體系，對(duì)產(chǎn)發(fā)菜多糖重組酵母菌株進(jìn)行篩選。

本發(fā)明篩選方法根據(jù)發(fā)狀念珠藻N. flagelliforme（簡(jiǎn)稱發(fā)菜）光合作用基因相關(guān)酶基因序列，設(shè)計(jì)合成了2對(duì)特異性引物（Pro1基因和Pro2基因），分別建立Pro1和Pro2基因的單重PCR擴(kuò)增方法。在單重PCR基礎(chǔ)上通過對(duì)PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化，建立了篩選產(chǎn)發(fā)菜多糖酵母重組菌株的雙重PCR檢測(cè)方法，即利用一次PCR反應(yīng)，從重組酵母菌株中可同時(shí)擴(kuò)增出2條大小分別為800 bp（Pro1基因）、550 bp（Pro2基因）的特異性片段，而以酵母基因組DNA作為對(duì)照組擴(kuò)增結(jié)果為陰性。利用該篩選方法可在同一管中同時(shí)擴(kuò)增出Pro1和Pro2兩對(duì)基因，大大節(jié)省了篩選時(shí)間和篩選成本，通過擴(kuò)增兩個(gè)相關(guān)基因，檢測(cè)相關(guān)基因的分布狀況，在基因型上快速、高效、準(zhǔn)確的對(duì)發(fā)菜酵母重組菌株進(jìn)行高通量篩選。為遠(yuǎn)緣、超遠(yuǎn)緣基因重組細(xì)胞的篩選提供了切實(shí)可行的生物分子篩選檢測(cè)方法。該篩選方法是一種從基因型上高效、準(zhǔn)確篩選發(fā)菜酵母重組菌株的方法。

附圖說明

圖1是本發(fā)明篩選方法中引物1的單重PCR凝膠電泳圖。

圖2是本發(fā)明篩選方法中引物2的單重PCR凝膠電泳圖。

圖3是發(fā)明篩選方法中雙重PCR凝膠電泳圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。

由于發(fā)菜多糖在培養(yǎng)液中呈中性，且代謝產(chǎn)物產(chǎn)量少，采用常規(guī)篩選方法篩選酵母重組菌株時(shí)，不僅費(fèi)時(shí)、篩選困難，而且影響試驗(yàn)結(jié)果。為了客服現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種篩選省時(shí)容易，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不大的篩選產(chǎn)發(fā)菜多糖重組酵母菌株的方法，該篩選方法具體按以下不在進(jìn)行：

步驟1：重組菌株基因組DNA的 提取：利用酵母DNA提取試劑盒提取發(fā)菜酵母重組菌株，提取重組菌株基因組DNA；

步驟2：引物的設(shè)計(jì)與合成：雙重PCR所用引物：引物1引物序列(5’-3’) ，（F：ACCACCTTCGTCACCTCT， R：GGATACCCTCGTTCAGCA），如圖1所示，通道1#、2#、3#以發(fā)菜基因組DNA作為模板添加引物1進(jìn)行單重PCR在800bp出現(xiàn)條帶，通道4#、5#、6#以酵母基因組DNA作為模板添加引物1進(jìn)行單重PCR在800bp沒有出現(xiàn)條帶；引物2引物序列(5’-3’) ，（F：TAGGAAGAAGCGAAAGCG，R：CAGTTGATGGAATGGGTG），如圖2所示，通道1#、2#、3#以發(fā)菜基因組DNA作為模板添加引物2進(jìn)行單重PCR在550bp出現(xiàn)條帶，通道4#、5#、6#以酵母基因組DNA作為模板添加引物2進(jìn)行單重PCR在550bp處沒有出現(xiàn)條帶；

引物1和引物2的序列信息表，如表1所示。

表1 引物序列信息表

步驟3：?jiǎn)沃豍CR擴(kuò)增條件：PCR總體積為25μL，其中包括2×Taq PCRMaster Mix 10.5μL，上游引物（10μmol/L） 1.0μL，下游引物（10μmol/L）1.0μL，模板 DNA 1.5μL，其余用水補(bǔ)足；反應(yīng)程序：94 ℃變性2 min；94 ℃20 s ，52 ℃ 25 s ，72 ℃ 30 s，18個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸2 min；

步驟4：雙重PCR擴(kuò)增條件：PCR 反應(yīng)其它參數(shù)采用以下體系進(jìn)行擴(kuò)增：模板 DNA 3μl，雙重引物上下游各加1.5μl，2×Taq PCRMaster Mix 10.5μL，加 ddH₂O 至25μl；擴(kuò)增PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94℃變性 2min；然后 94℃，20sec、52℃，25sec、72℃，30sec，進(jìn)行 20 個(gè)循環(huán)；最后 72℃延伸 2min，4℃保溫，擴(kuò)增產(chǎn)物在 -20℃保存；

如圖3所示，通道1#、2#、3#以發(fā)菜基因組DNA作為模板添加引物1和引物2進(jìn)行雙重PCR在800bp和550bp均出現(xiàn)條帶，條帶單一清晰；而通道4#、5#、6#以酵母基因組DNA作為模板添加引物1和引物2進(jìn)行雙重PCR在800bp和550bp處沒有出現(xiàn)條帶。

步驟5：用步驟4得到的雙重PCR擴(kuò)增體系，對(duì)產(chǎn)發(fā)菜多糖重組酵母菌株進(jìn)行篩選。

本發(fā)明篩選方法采用雙重PCR高通量篩選體系，可以在基因型上快速、高效、準(zhǔn)確的對(duì)發(fā)菜酵母重組菌株進(jìn)行高通量篩選。為遠(yuǎn)緣、超遠(yuǎn)緣基因重組細(xì)胞的篩選提供了切實(shí)可行的生物分子篩選檢測(cè)方法。

實(shí)施例

利用酵母DNA提取試劑盒提取發(fā)菜酵母重組菌株，提取重組菌株基因組DNA；引物1引物序列(5’-3’) ，（F：ACCACCTTCGTCACCTCT， R：GGATACCCTCGTTCAGCA）；引物2引物序列(5’-3’) ，（F：TAGGAAGAAGCGAAAGCG，R：CAGTTGATGGAATGGGTG）；單重PCR擴(kuò)增條件：PCR總體積為25μL，其中包括2×Taq PCRMaster Mix 10.5μL，上游引物（10μmol/L） 1.0μL，下游引物（10μmol/L）1.0μL，模板 DNA 1.5μL，其余用水補(bǔ)足；反應(yīng)程序：94 ℃變性2 min；94 ℃20 s ，52 ℃ 25 s ，72 ℃ 30 s，18個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸2 min；PCR 反應(yīng)其它參數(shù)采用以下體系進(jìn)行擴(kuò)增：模板 DNA 3μl，雙重引物上下游各加1.5μl，2×Taq PCRMaster Mix 10.5μL，加 ddH₂O 至25μl；擴(kuò)增PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94℃變性 2min；然后 94℃，20sec、52℃，25sec、72℃，30sec，進(jìn)行 20 個(gè)循環(huán)；最后 72℃延伸 2min，4℃保溫，擴(kuò)增產(chǎn)物在 -20℃保存；對(duì)Pho1 F/R和Pho2 F/R兩對(duì)引物進(jìn)行引物配比，最終確定體系為：模板 DNA 3μl，2×Taq PCRMaster Mix 10.5μL，引物濃度分別為（10μM）為1.5μl，加 ddH₂O 至25μl，擴(kuò)增PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃變性 2min；然后 94℃，20sec、52℃，25sec、72℃，30sec，進(jìn)行 20 個(gè)循環(huán)；最后 72℃延伸 2min，4℃保溫；用雙重PCR擴(kuò)增體系，對(duì)產(chǎn)發(fā)菜多糖重組酵母菌株進(jìn)行篩選。

本發(fā)明篩選方法的優(yōu)越性：

1）與傳統(tǒng)重組菌株的篩選方法，如代謝產(chǎn)物分析法相比，雙重PCR高通量篩選體系可以一次性擴(kuò)增和篩選96個(gè)重組菌株，大大縮短篩選時(shí)間，節(jié)省篩選成本，提高篩選效率，實(shí)現(xiàn)高通量篩選。

2）與傳統(tǒng)重組菌株篩選方法，如代謝產(chǎn)物顯色法相比，雙重PCR高通量篩選體系從基因角度對(duì)重組菌株進(jìn)行篩選，篩選方法更加準(zhǔn)確，可行度好。

3）與傳統(tǒng)重組菌株的篩選方法，雙重PCR高通量篩選體系可以短時(shí)間完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)篩選過程，防止長(zhǎng)時(shí)間篩選過程對(duì)菌種的污染，減少污染率和菌種的儲(chǔ)藏成本。