本發(fā)明屬于防偽鑒定技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種液態(tài)產(chǎn)品中外源DNA內(nèi)標(biāo)物的保護(hù)方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，由于商品摻假造假的現(xiàn)象層出不窮，消費(fèi)者對(duì)于商品的防偽和溯源尤為重視。尤其是對(duì)于食品類(lèi)產(chǎn)品，由于其關(guān)乎國(guó)民的身體健康，更是消費(fèi)者和國(guó)家監(jiān)管部門(mén)的關(guān)注重點(diǎn)。目前商品的防偽和溯源措施主要是外包裝防偽，即將各種特殊標(biāo)識(shí)附于外包裝上，或是利用特殊的外包裝構(gòu)造以便消費(fèi)者和檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的識(shí)別。然而，由于外包裝防偽的易破壞性和易仿造性，給不法分子留下了可乘之機(jī)。隨著食品產(chǎn)業(yè)溯源體系的建立和完善，通過(guò)在食品中加入外源核酸作為溯源標(biāo)記物的新型技術(shù)逐漸被開(kāi)發(fā)應(yīng)用。例如中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)CN 101665825A公開(kāi)了一種利用核酸檢測(cè)技術(shù)鑒別白酒真?zhèn)蔚姆椒?，其將?dòng)物、植物、微生物或人工合成的基因組DNA或基因片段加入到白酒內(nèi)作為其內(nèi)標(biāo)物，再運(yùn)用PCR技術(shù)檢測(cè)內(nèi)標(biāo)物的有無(wú)來(lái)判斷商品的真?zhèn)巍?/p>

然而，由于絕大多數(shù)的液態(tài)產(chǎn)品尤其是液態(tài)食品中存在諸多核酸破壞因子(如核酸酶、自由基和酸等)，DNA在液態(tài)產(chǎn)品中經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間存放后會(huì)發(fā)生脫嘌呤、氧化或斷裂等損傷，造成序列信息的丟失，最終導(dǎo)致檢測(cè)的假陰性，這將大大限制其作為標(biāo)記物在產(chǎn)品防偽和溯源中的應(yīng)用。因此，目前亟需一種提高DNA穩(wěn)定性的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)其在液態(tài)產(chǎn)品中的長(zhǎng)期穩(wěn)定存在。目前在實(shí)際應(yīng)用中已有一些提高DNA穩(wěn)定性的方法。比如，使用Tris-EDTA緩沖液溶解核酸來(lái)維持體系的弱堿性環(huán)境；在反應(yīng)體系中加入還原劑(如DTT)來(lái)防止核酸被氧化；或是將核酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造或修飾來(lái)提高其對(duì)核酸酶的耐受性等。但由于這些方法需要改變產(chǎn)品的理化性質(zhì)或加入有毒有害的化學(xué)試劑，或需要復(fù)雜、造價(jià)高的改造或修飾步驟，很難在實(shí)際產(chǎn)業(yè)中得到應(yīng)用。

顯然，如果能使用簡(jiǎn)單方便、成本低廉、無(wú)毒無(wú)害，且不影響DNA結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的方法提高外源DNA在產(chǎn)品中的穩(wěn)定性，將大大擴(kuò)大DNA標(biāo)記物在商品防偽和溯源中的應(yīng)用范圍和前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明旨在提供一種簡(jiǎn)單方便、成本低廉、無(wú)毒無(wú)害，且不影響DNA結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的方法，用以保護(hù)液態(tài)產(chǎn)品中的外源DNA。

一種液態(tài)產(chǎn)品中外源DNA內(nèi)標(biāo)物的保護(hù)方法，具體如下：將聚陽(yáng)離子化合物溶液與目的DNA溶液按照氨基磷酸比≥10:1的比例混合，混勻后2-20℃放置0.5-12小時(shí)，得到穩(wěn)定的DNA復(fù)合物溶液，可直接添加至液態(tài)產(chǎn)品中；所述的氨基磷酸比為聚陽(yáng)離子所攜帶的氨基摩爾數(shù)與DNA攜帶的磷酸基團(tuán)摩爾數(shù)的比值。

溶液中，核酸的磷酸基團(tuán)上的負(fù)電荷可與聚陽(yáng)離子化合物攜帶的正電荷相互作用，大大減緩DNA在酸性條件下的脫嘌呤反應(yīng)，從而提高了其對(duì)酸性環(huán)境的耐受性。此外，由于聚陽(yáng)離子化合物圍繞在DNA的周?chē)?，阻礙了核酸酶與DNA的結(jié)合，同時(shí)也阻礙了自由基對(duì)DNA的攻擊，從而也提高了DNA對(duì)核酸酶和自由基的耐受性。

本發(fā)明中將聚陽(yáng)離子化合物溶液與目的DNA溶液混合后放置的溫度控制在2-20℃之間，首先確保溶液處在液體狀態(tài)以進(jìn)行DNA與聚陽(yáng)離子化合物之間的相互作用，但是溫度不宜過(guò)高，經(jīng)驗(yàn)證，當(dāng)溫度超過(guò)20℃時(shí)，聚陽(yáng)離子化合物對(duì)DNA的保護(hù)效果不佳，且易導(dǎo)致微生物繁殖。

本發(fā)明中將聚陽(yáng)離子化合物溶液與目的DNA溶液混合后放置的時(shí)間控制在0.5-12小時(shí)，經(jīng)驗(yàn)證超過(guò)0.5小時(shí)時(shí)DNA即可與聚陽(yáng)離子化合物形成復(fù)合物，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)更有利于DNA與聚陽(yáng)離子化合物充分作用，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則易導(dǎo)致微生物繁殖。

進(jìn)一步地，聚陽(yáng)離子化合物溶液與目的DNA溶液混勻后放置的溫度為2-8℃，時(shí)間為6-12小時(shí)，在可能的范圍內(nèi)選擇低溫、長(zhǎng)時(shí)間，能保證DNA與聚陽(yáng)離子化合物充分作用，并防止微生物繁殖。

經(jīng)證實(shí)(參見(jiàn)實(shí)施例1)，氨基磷酸比在1-100:1時(shí)，聚陽(yáng)離子化合物都能夠發(fā)揮對(duì)DNA的保護(hù)作用，隨著氨基磷酸比的增大，保護(hù)作用逐漸增強(qiáng)。但當(dāng)氨基磷酸比大于10:1時(shí)，保護(hù)作用基本不變，因此氨基磷酸比的最優(yōu)選擇是10:1。既能達(dá)到理想的保護(hù)效果，又可有效控制成本。

進(jìn)一步地，所述的DNA包括但不限于基因組DNA、線粒體DNA、葉綠體DNA、質(zhì)粒DNA、PCR產(chǎn)物、DNA酶切片段或多聚寡核苷酸中的一種或多種。優(yōu)選質(zhì)粒DNA、PCR產(chǎn)物，更易制得，成本相對(duì)較低，適于工業(yè)化應(yīng)用。

所述的基因組DNA包括所有生物的基因組DNA，優(yōu)選鮭魚(yú)精DNA、鯡魚(yú)精DNA或λDNA中的一種或多種，因?yàn)檫@些基因組DNA量大易得，且已商品化，易購(gòu)買(mǎi)得到。

所述的質(zhì)粒DNA包括但不限于pUC18、pUC19、pUC57、pBR322、pTZ19R或pET28中的一種或多種。

進(jìn)一步地，所述的聚陽(yáng)離子化合物為一類(lèi)可在溶液中聚集正電荷的化合物，包括但不限于殼寡糖、殼聚糖、精胺、腐胺、尸胺、亞精胺、多肽或堿性蛋白質(zhì)中的一種或多種。

更進(jìn)一步地，所述堿性蛋白質(zhì)包括精蛋白和組蛋白等。

更進(jìn)一步地，所述殼聚糖的分子量在20-250kDa，一般市售殼聚糖的分子量均在該范圍內(nèi)，因此該類(lèi)殼聚糖更易得。

進(jìn)一步地，所述DNA復(fù)合物溶液的pH＝6-8，避免添加到產(chǎn)品中后影響產(chǎn)品本身的理化性質(zhì)。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種上述DNA保護(hù)方法的具體應(yīng)用，即應(yīng)用到液態(tài)產(chǎn)品的防偽和溯源中。

一種液態(tài)產(chǎn)品的防偽和溯源方法，具體步驟為：

(1)將聚陽(yáng)離子化合物溶液與目的DNA溶液按照氨基磷酸比≥10:1的比例混合，混勻后2-20℃放置0.5-12小時(shí)，得到穩(wěn)定的DNA復(fù)合物溶液，所述的氨基磷酸比為聚陽(yáng)離子化合物所攜帶的氨基摩爾數(shù)與DNA攜帶的磷酸基團(tuán)摩爾數(shù)的比值；

(2)將步驟(1)中得到的DNA復(fù)合物溶液添加到液態(tài)產(chǎn)品中，添加量以DNA的量計(jì)，使液態(tài)產(chǎn)品中DNA的含量為1ng/mL-50μg/mL；由于本發(fā)明方法對(duì)DNA的保護(hù)效果優(yōu)良，DNA在液態(tài)產(chǎn)品中可穩(wěn)定存在，因此加入量只要達(dá)到DNA的檢出限即可；實(shí)際添加的DNA復(fù)合物的體積遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于液態(tài)產(chǎn)品的體積，可有效保證產(chǎn)品的品質(zhì)和外觀等；

(3)檢測(cè)液態(tài)產(chǎn)品中是否含有所添加的DNA。

進(jìn)一步地，步驟(3)中檢測(cè)DNA的方法包括瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、常規(guī)PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR或恒溫核酸擴(kuò)增等方法中的一種或多種。

相比于現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明使用無(wú)毒無(wú)害的聚陽(yáng)離子化合物(如殼寡糖和殼聚糖)對(duì)外源DNA進(jìn)行保護(hù)，提高外源DNA對(duì)核酸酶、酸和自由基等條件的耐受性，使DNA內(nèi)標(biāo)物能夠穩(wěn)定地存在于成分復(fù)雜的液態(tài)產(chǎn)品中，以應(yīng)用于液態(tài)產(chǎn)品尤其是液態(tài)食品的溯源和防偽中。

(2)采用將DNA與聚陽(yáng)離子化合物混合放置的方式簡(jiǎn)單方便，技術(shù)水平要求低，方便批量生產(chǎn)。

(3)聚陽(yáng)離子化合物的種類(lèi)較多，原料易得，成本較低。

(4)由于核酸具有聚陰離子的基本特性，在溶液中，核酸的磷酸基團(tuán)上的負(fù)電荷可與聚陽(yáng)離子化合物攜帶的正電荷相互作用，形成相對(duì)穩(wěn)定的復(fù)合物。由于聚陽(yáng)離子化合物是通過(guò)正負(fù)電荷相互作用與DNA結(jié)合，并非共價(jià)結(jié)合，對(duì)DNA的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都幾乎無(wú)影響，因此不影響對(duì)DNA進(jìn)行電泳、PCR或其他方式的檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1：本發(fā)明實(shí)施例1-7實(shí)施方法的路線示意圖；

圖2：本發(fā)明實(shí)施例1的核酸瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖；其中，數(shù)字比值代表聚陽(yáng)離子化合物與DNA的氨基磷酸比；

圖3：本發(fā)明實(shí)施例1的核酸瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖；

圖4：本發(fā)明實(shí)施例2的核酸變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果圖；

圖5：本發(fā)明實(shí)施例3的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果；

圖6：本發(fā)明實(shí)施例3中，白酒中的DNA在20℃貯藏不同時(shí)間后的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果；

圖7：本發(fā)明實(shí)施例4的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果；

圖8：本發(fā)明實(shí)施例5的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果；

圖9：本發(fā)明實(shí)施例6的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果；

圖10：本發(fā)明實(shí)施例7的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實(shí)施例1 殼寡糖和精胺提高λDNA對(duì)DNase I的耐受性

1、殼寡糖與精胺溶液的制備

殼寡糖溶液的制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取150mg殼寡糖(購(gòu)于山東省萊州市海力生物制品有限公司；批號(hào)：HL130317G；分子量：6500Da；脫乙酰度：91.1％)，加入8mL pH 2.0的鹽酸溶液使殼寡糖完全溶解，然后用0.1M的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至7.0。最后，用滅菌超純水定容至10mL，于4℃保藏。使用時(shí)用滅菌超純水稀釋至所需工作液的濃度。

精胺溶液的制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取100mg精胺(購(gòu)于Sigma-Aldrich；貨號(hào)：S3256)，用8mL滅菌超純水溶解后，定容至10mL，于4℃保藏。使用時(shí)用滅菌超純水稀釋至所需工作液的濃度。

2、λDNA-殼寡糖復(fù)合物與λDNA-精胺復(fù)合物的制備

將λDNA與殼寡糖或精胺按照不同的氨基磷酸比(1:1-100:1)的比例混合后，使λDNA的濃度為300ng/μL，將混合物于4℃放置12小時(shí)，使λDNA與聚陽(yáng)離子化合物充分作用，通過(guò)靜電相互作用形成復(fù)合物。

3、復(fù)合物對(duì)DNase I的耐受性實(shí)驗(yàn)

將λDNA-殼寡糖復(fù)合物或λDNA-精胺復(fù)合物加入到含有DNase I的體系中，20μL體系中含λDNA 600ng，DNase I的含量為0.02U和1×DNase I buffer。37℃反應(yīng)10min后，在65℃下溫浴10min將DNase I滅活。然后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳的方法對(duì)λDNA的完整度進(jìn)行檢測(cè)。

圖2結(jié)果顯示，隨著氨基磷酸比的增加，聚陽(yáng)離子化合物對(duì)λDNA的保護(hù)作用逐漸增強(qiáng)。當(dāng)氨基磷酸比≥10:1時(shí)，殼寡糖和精胺對(duì)λDNA的保護(hù)效果良好。

4、DNA與聚陽(yáng)離子化合物復(fù)合結(jié)構(gòu)對(duì)保護(hù)效果的影響

為驗(yàn)證DNA復(fù)合物對(duì)保護(hù)效果的影響，設(shè)置未提前形成復(fù)合物的對(duì)照組，具體為：分別將λDNA、殼寡糖或精胺依次加入到含有DNase I的體系中，使體系中的氨基磷酸比為10:1(比例同實(shí)驗(yàn)組)。20μL體系中含λDNA 600ng，DNase I的含量為0.02U和1×DNase I buffer。37℃反應(yīng)10min后，在65℃下溫浴10min將DNase I滅活。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中λDNA的完整度進(jìn)行檢測(cè)。

圖3結(jié)果顯示，對(duì)照組中：將DNA與聚陽(yáng)離子化合物直接依次加入含有DNase I的體系中后，雖然聚陽(yáng)離子化合物有一定的保護(hù)作用，但是DNA仍降解的比較嚴(yán)重。而實(shí)驗(yàn)組中：將DNA與聚陽(yáng)離子化合物預(yù)混并4℃放置12小時(shí)，使二者形成復(fù)合物后再加入反應(yīng)體系中會(huì)明顯提高DNA對(duì)DNase I的耐受性。

實(shí)施例2 乳酸飲品中殼聚糖對(duì)多聚寡核苷酸的保護(hù)

1、外源單鏈多聚寡核苷酸與殼聚糖復(fù)合物的制備

殼聚糖溶液的制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取250mg殼聚糖(購(gòu)于浙江澳興生物科技有限公司；批號(hào)：20140220；分子量：50-100kDa)，加入20mL滅菌超純水，室溫下磁力攪拌2h，使殼聚糖粉末充分水合。向水合的殼聚糖溶液逐漸滴加20mL pH 2的鹽酸溶液，過(guò)夜磁力攪拌使其充分溶解。隨后，使用0.1M的氫氧化鈉溶液將其pH值調(diào)節(jié)至7.0。最后用滅菌超純水定容至100mL，于4℃保藏。使用時(shí)用滅菌超純水稀釋至所需工作液的濃度。

將單鏈多聚寡核苷酸(36mer，序列為GTCTTAAATAGGCCACTAAGTCGTTAATTCGAGACT)與殼聚糖按照氨基磷酸比10:1的比例混合，使DNA的終濃度達(dá)到100μM，并于8℃放置8小時(shí)，使DNA與殼聚糖充分作用，通過(guò)靜電相互作用形成復(fù)合物。

2、DNA-殼聚糖復(fù)合物在乳酸菌飲料中的長(zhǎng)期貯藏

取4μL步驟1中制備的復(fù)合物加入到396μL乳酸菌飲料(品名：伊利每益添低糖活性乳酸菌飲料；規(guī)格：350mL；制造單位：內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司)中，使多聚寡核苷酸的終濃度達(dá)到1μM(～10ng/μL)，混勻后，用封口膜將EP管口密封并分別置于20℃和37℃下貯藏，一段時(shí)間后取出樣品并檢測(cè)DNA的含量。同時(shí)設(shè)置了不添加殼聚糖的對(duì)照組，即將多聚寡核苷酸直接加入到上述乳酸菌飲料中，使DNA的終濃度與復(fù)合物中DNA的終濃度相同，其他貯藏條件完全相同。

3、多聚寡核苷酸穩(wěn)定性的檢測(cè)—變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

為檢測(cè)步驟2中殼聚糖對(duì)多聚寡核苷酸的保護(hù)效果，使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)長(zhǎng)時(shí)間貯藏后乳酸菌飲料中的多聚寡核苷酸的含量。為避免乳酸菌飲料中的成分影響電泳，將含有多聚寡核苷酸的乳酸菌飲料稀釋10倍后上樣。變性PAGE凝膠的濃度為15％，其中含8M尿素。分析結(jié)果見(jiàn)圖4。

結(jié)果表明，單鏈多聚寡核苷酸在乳酸菌飲料中的穩(wěn)定性較差，當(dāng)在20℃貯藏30天或在37℃貯藏5天后，大部分單鏈多聚寡核苷酸都被降解。將寡核苷酸與殼聚糖的復(fù)合物加入乳酸菌飲料中可以大大提高寡核苷酸的穩(wěn)定性，經(jīng)過(guò)37℃貯藏20天后DNA含量仍然較高。

實(shí)施例3 白酒中殼聚糖、殼寡糖和精胺對(duì)pUC18質(zhì)粒DNA的保護(hù)

1、外源質(zhì)粒DNA與殼聚糖、殼寡糖和精胺復(fù)合物的制備

殼聚糖溶液的制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取250mg殼聚糖(購(gòu)于Sigma-Aldrich；貨號(hào)：740500；分子量：110-150kDa)，加入20mL滅菌超純水，室溫下磁力攪拌2h，使殼聚糖粉末充分水合。向水合的殼聚糖溶液逐漸滴加20mL pH 2的鹽酸溶液，過(guò)夜磁力攪拌使其充分溶解。隨后，使用0.1M的氫氧化鈉溶液將pH值調(diào)節(jié)至7.0。最后用滅菌超純水定容至100mL，于4℃保藏。使用時(shí)用滅菌超純水稀釋至所需工作液的濃度。

殼寡糖溶液的制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取150mg殼寡糖(購(gòu)于山東省萊州市海力生物制品有限公司；批號(hào)：HL130317G；分子量：6500Da；脫乙酰度：91.1％)，加入8mL pH 2.0的鹽酸溶液使殼寡糖完全溶解，然后用0.1M的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至7.0。最后，用滅菌超純水定容至10mL，于4℃保藏。使用時(shí)用滅菌超純水稀釋至所需工作液的濃度。

精胺溶液的制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取100mg精胺(購(gòu)于Sigma-Aldrich；貨號(hào)：S3256)，用8mL滅菌超純水溶解后，定容至10mL，于4℃保藏。使用時(shí)用滅菌超純水稀釋至所需工作液的濃度。

將pUC18質(zhì)粒DNA分別與殼聚糖、殼寡糖和精胺溶液按照氨基磷酸比10:1的比例混合，使DNA的終濃度達(dá)到29ng/μL，并于4℃放置12小時(shí)，使DNA與聚陽(yáng)離子化合物充分作用，通過(guò)靜電相互作用形成復(fù)合物。

2、質(zhì)粒DNA-殼聚糖、質(zhì)粒DNA-殼寡糖、質(zhì)粒DNA-精胺復(fù)合物在白酒中的長(zhǎng)期貯藏

取4μL步驟1中制備的復(fù)合物加入到396μL白酒(品名：三井小刀；酒精度：45％vol；規(guī)格：248mL；制造單位：河北三井酒業(yè)股份有限公司)中，使質(zhì)粒DNA的終濃度達(dá)到290pg/μL(～10⁸拷貝/μL)，混勻后，用封口膜將EP管口密封并分別置于4℃、20℃和37℃下貯藏，一段時(shí)間后取出樣品并檢測(cè)質(zhì)粒DNA的含量。同時(shí)設(shè)置了不添加聚陽(yáng)離子化合物的對(duì)照組，即將質(zhì)粒DNA直接加入到上述白酒中，使質(zhì)粒DNA的終濃度與復(fù)合物中質(zhì)粒DNA的終濃度相同，其他貯藏條件完全相同。

3、質(zhì)粒DNA穩(wěn)定性的檢測(cè)—熒光定量PCR法

為檢測(cè)步驟2中殼聚糖、殼寡糖和精胺對(duì)質(zhì)粒DNA的保護(hù)效果，使用熒光定量PCR法(RT-qPCR)檢測(cè)長(zhǎng)時(shí)間貯藏后白酒中質(zhì)粒DNA的含量。為避免白酒中的成分影響RT-qPCR反應(yīng)，將含有質(zhì)粒DNA的白酒稀釋100倍后作為RT-qPCR反應(yīng)的模板。針對(duì)pUC18質(zhì)粒DNA設(shè)計(jì)的特異性PCR引物見(jiàn)表1，擴(kuò)增的目的產(chǎn)物長(zhǎng)度為170bp。反應(yīng)中每個(gè)體系均含有5μL 2×SYBR Select Master Mix(購(gòu)于Invitrogen，貨號(hào)：4472908)，0.3μM特異性引物，1μL上述稀釋后的含質(zhì)粒DNA的白酒，用ddH₂O補(bǔ)至10μL。反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性2min，95℃變性20s，59℃退火20s，72℃延伸20s，40個(gè)循環(huán)。分析結(jié)果見(jiàn)圖5和圖6。

圖5結(jié)果表明，純質(zhì)粒DNA在白酒中的穩(wěn)定性較差，經(jīng)過(guò)37℃、10d的貯藏后，對(duì)照組中白酒的DNA含量?jī)H為最初的0.07％。白酒中含乳酸、乙酸、己酸和丁酸等有機(jī)酸，總酸度為0.25-0.45g/L，因此外源DNA在白酒中會(huì)因脫嘌呤而降解。降低貯藏溫度后，DNA的穩(wěn)定性明顯提高，但長(zhǎng)時(shí)間貯藏后DNA的被破壞程度仍然較大。將質(zhì)粒DNA-殼聚糖、DNA-殼寡糖和DNA-精胺組成復(fù)合物后再加入白酒中可以大大提高DNA的穩(wěn)定性。其中殼聚糖對(duì)DNA的保護(hù)效果最好，經(jīng)過(guò)4℃30天、20℃20天和37℃10天的貯藏后，DNA含量沒(méi)有顯著變化。由于精胺和殼寡糖的分子量較小，與DNA形成的復(fù)合物較不穩(wěn)定，因此精胺和殼寡糖對(duì)于質(zhì)粒DNA的保護(hù)效果弱于殼聚糖。

圖6中表示了白酒中的質(zhì)粒DNA在20℃貯藏30天中的含量變化。結(jié)果顯示，純的DNA在白酒中的穩(wěn)定性較差，而DNA-殼聚糖復(fù)合物和DNA-殼寡糖復(fù)合物可在白酒中長(zhǎng)期穩(wěn)定存在。

表1.實(shí)施例3中使用的引物序列

實(shí)施例4 葡萄酒中亞精胺和殼聚糖對(duì)pUC18質(zhì)粒DNA的保護(hù)

1、外源質(zhì)粒DNA與亞精胺和殼聚糖復(fù)合物的制備

亞精胺溶液的制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取100mg亞精胺(購(gòu)于Sigma-Aldrich；貨號(hào)：S2626)，用8mL滅菌超純水溶解后，定容至10mL，于4℃保藏。使用時(shí)用滅菌超純水稀釋至所需工作液的濃度。

殼聚糖溶液的制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取250mg殼聚糖(購(gòu)于Sigma-Aldrich；貨號(hào)：740179；分子量：140-220kDa)，加入20mL滅菌超純水，室溫下磁力攪拌2h，使殼聚糖粉末充分水合。向水合的殼聚糖溶液逐漸滴加20mL pH 2的鹽酸溶液，過(guò)夜磁力攪拌使其充分溶解。隨后，使用0.1M的氫氧化鈉溶液將pH值調(diào)節(jié)至7.0。最后用滅菌超純水定容至100mL，于4℃保藏。使用時(shí)用滅菌超純水稀釋至所需工作液的濃度。

將pUC18質(zhì)粒DNA分別與亞精胺、殼聚糖按照氨基磷酸比10:1的比例混合，使DNA的終濃度達(dá)到2.9ng/μL，并于2℃放置10小時(shí)，使DNA與殼聚糖充分作用，通過(guò)靜電相互作用形成復(fù)合物。

2、質(zhì)粒DNA-亞精胺、質(zhì)粒DNA-殼聚糖復(fù)合物在葡萄酒中的長(zhǎng)期貯藏

取4μL步驟1中制備的復(fù)合物加入到396μL葡萄酒(品名：青島華東干紅葡萄酒；酒精度：13％vol；規(guī)格：750mL；制造單位：青島華東葡萄釀酒有限公司)中，使質(zhì)粒DNA的終濃度達(dá)到29pg/μL(～10⁷拷貝/μL)，混勻后，用封口膜將EP管口密封并分別置于4℃、20℃和37℃下貯藏，一段時(shí)間后取出樣品并檢測(cè)質(zhì)粒DNA的含量。同時(shí)設(shè)置了不添加聚陽(yáng)離子化合物的對(duì)照組，即將質(zhì)粒DNA直接加入到上述葡萄酒中，使DNA的終濃度與復(fù)合物中DNA的終濃度相同，其他貯藏條件完全相同。

3、質(zhì)粒DNA穩(wěn)定性的檢測(cè)—熒光定量PCR法

為檢測(cè)步驟2中亞精胺和殼聚糖對(duì)質(zhì)粒DNA的保護(hù)效果，使用熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)長(zhǎng)時(shí)間貯藏后葡萄酒中質(zhì)粒DNA的含量。為避免葡萄酒中的成分影響RT-qPCR反應(yīng)，將含有質(zhì)粒DNA的葡萄酒稀釋100倍后作為RT-qPCR反應(yīng)的模板。針對(duì)pUC18質(zhì)粒DNA設(shè)計(jì)的特異性PCR引物見(jiàn)表2，擴(kuò)增的目的產(chǎn)物長(zhǎng)度為138bp。反應(yīng)中每個(gè)體系均含有5μL 2×SYBR Select Master Mix(購(gòu)于Invitrogen，貨號(hào)：4472908)，0.3μM特異性引物，1μL上述稀釋后的含質(zhì)粒DNA的葡萄酒，用ddH₂O補(bǔ)至10μL。反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性2min，95℃變性20s，59℃退火20s，72℃延伸20s，40個(gè)循環(huán)。分析結(jié)果見(jiàn)圖7。

結(jié)果表明，純質(zhì)粒DNA在葡萄酒中的穩(wěn)定性較差，經(jīng)過(guò)37℃、10d的貯藏后，對(duì)照組中葡萄酒的質(zhì)粒DNA含量?jī)H為0.08％。葡萄酒的總酸度為1.66-4.52g/L，其中含酒石酸、蘋(píng)果酸和發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸、琥珀酸和醋酸等，因此外源DNA在葡萄酒中會(huì)因脫嘌呤而降解。將質(zhì)粒DNA-殼聚糖和DNA-亞精胺組成復(fù)合物后再加入葡萄酒中可以大大提高DNA的穩(wěn)定性。其中殼聚糖對(duì)DNA的保護(hù)效果要優(yōu)于亞精胺，經(jīng)過(guò)4℃30天、20℃20天和37℃10天的貯藏后，DNA-殼聚糖復(fù)合物中的DNA含量沒(méi)有顯著變化。

表2.實(shí)施例4中使用的引物序列

實(shí)施例5 牛奶中魚(yú)精蛋白對(duì)pUC19質(zhì)粒DNA的保護(hù)

1、外源質(zhì)粒DNA與魚(yú)精蛋白復(fù)合物的制備

魚(yú)精蛋白溶液的制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取10mg魚(yú)精蛋白(購(gòu)于Sigma-Aldrich；貨號(hào)：P4005)，加入8mL滅菌超純水和50μL 0.5M EDTA(pH 8.0)，待魚(yú)精蛋白溶解后，用滅菌超純水定容至10mL，于4℃保藏。使用時(shí)用滅菌超純水稀釋至所需工作液的濃度。

將pUC19質(zhì)粒DNA與魚(yú)精蛋白按照氨基磷酸比10:1的比例混合，使DNA的終濃度達(dá)到290pg/μL，并于6℃放置10小時(shí)，使DNA與魚(yú)精蛋白充分作用，通過(guò)靜電相互作用形成復(fù)合物。

2、DNA-魚(yú)精蛋白復(fù)合物在牛奶中的長(zhǎng)期貯藏

取4μL步驟1中制備的復(fù)合物加入到396μL牛奶(品名：伊利全脂滅菌純牛乳；規(guī)格：250mL盒裝；制造單位：內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司)中，使質(zhì)粒DNA的終濃度達(dá)到2.9pg/μL(～10⁶拷貝/μL)，混勻后，用封口膜將EP管口密封并分別置于4℃、20℃和37℃下貯藏，一段時(shí)間后取出樣品并檢測(cè)質(zhì)粒DNA的含量。同時(shí)設(shè)置了不添加魚(yú)精蛋白的對(duì)照組，即將質(zhì)粒DNA直接加入到上述牛奶中，使DNA的終濃度與復(fù)合物中DNA的終濃度相同，其他貯藏條件完全相同。

3、質(zhì)粒DNA穩(wěn)定性的檢測(cè)—熒光定量PCR法

為檢測(cè)步驟2中魚(yú)精蛋白對(duì)質(zhì)粒DNA的保護(hù)效果，使用熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)長(zhǎng)時(shí)間貯藏后牛奶中質(zhì)粒DNA的含量。為避免牛奶中的成分影響RT-qPCR反應(yīng)，將含有質(zhì)粒DNA的牛奶稀釋100倍后作為RT-qPCR反應(yīng)的模板。針對(duì)pUC19質(zhì)粒DNA設(shè)計(jì)的特異性PCR引物見(jiàn)表3，擴(kuò)增的目的產(chǎn)物長(zhǎng)度為154bp。反應(yīng)中每個(gè)體系均含有5μL 2×SYBR Select Master Mix(購(gòu)于Invitrogen，貨號(hào)：4472908)，0.3μM特異性引物，1μL上述稀釋后的含質(zhì)粒DNA的牛奶，用ddH₂O補(bǔ)至10μL。反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性2min，95℃變性20s，59℃退火20s，72℃延伸20s，40個(gè)循環(huán)。分析結(jié)果見(jiàn)圖8。

結(jié)果表明，37℃時(shí)，純質(zhì)粒DNA在牛奶中的穩(wěn)定性較低，經(jīng)10d貯藏后含量?jī)H為最初的1％。在加入DNA-魚(yú)精蛋白復(fù)合物后，DNA的穩(wěn)定性得到了明顯的提高，經(jīng)過(guò)4℃30天、20℃20天和37℃10天的貯藏后DNA含量沒(méi)有顯著變化。

表3.實(shí)施例5中使用的引物序列

實(shí)施例6 檸檬汁飲料中殼寡糖對(duì)pUC19質(zhì)粒DNA的保護(hù)

1、外源質(zhì)粒DNA與殼寡糖復(fù)合物的制備

殼寡糖溶液的制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取150mg殼寡糖(購(gòu)于山東省萊州市海力生物制品有限公司；批號(hào)：HL130317G；分子量：6500Da；脫乙酰度：91.1％)，加入5mL pH 2的鹽酸溶液使殼寡糖完全溶解，然后用0.1M的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至7.0。最后，用滅菌超純水定容至10mL，于4℃保藏。使用時(shí)用滅菌超純水稀釋至所需工作液的濃度。

將pUC19質(zhì)粒與殼寡糖按照氨基磷酸比10:1的比例混合，使DNA的終濃度達(dá)到290ng/μL，并于4℃放置10小時(shí)，使DNA與殼寡糖充分作用，通過(guò)靜電相互作用形成復(fù)合物。

2、DNA-殼寡糖復(fù)合物在檸檬汁飲料中的長(zhǎng)期貯藏

取4μL步驟1中制備的復(fù)合物加入到396μL檸檬汁飲料(品名：美汁源冰桔檸檬；規(guī)格：480mL；制造單位：上海申美飲料食品有限公司)中，使質(zhì)粒DNA的終濃度達(dá)到2.9ng/μL(～10⁹拷貝/μL)，混勻后，用封口膜將EP管口密封并分別置于4℃、20℃和37℃下貯藏，一段時(shí)間后取出樣品并檢測(cè)DNA的含量。同時(shí)設(shè)置了不添加殼寡糖的對(duì)照組，即將質(zhì)粒DNA直接加入到上述檸檬汁飲料中，使DNA的終濃度與復(fù)合物中DNA的終濃度相同，其他貯藏條件完全相同。

3、質(zhì)粒DNA穩(wěn)定性的檢測(cè)—熒光定量PCR法

為檢測(cè)步驟2中殼寡糖對(duì)質(zhì)粒DNA的保護(hù)效果，使用熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)長(zhǎng)時(shí)間貯藏后檸檬汁飲料中的質(zhì)粒DNA含量。為避免檸檬汁飲料中的成分影響RT-qPCR反應(yīng)，將含有質(zhì)粒DNA的檸檬飲料稀釋100倍后作為RT-qPCR反應(yīng)的模板。針對(duì)pUC19質(zhì)粒DNA設(shè)計(jì)的特異性PCR引物見(jiàn)表4，擴(kuò)增的目的產(chǎn)物長(zhǎng)度為208bp。反應(yīng)中每個(gè)體系均含有5μL 2×SYBR Select Master Mix(購(gòu)于Invitrogen，貨號(hào)：4472908)，0.3μM特異性引物，1μL上述稀釋后的含質(zhì)粒DNA的檸檬汁飲料，用ddH₂O補(bǔ)至10μL。反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性2min，95℃變性20s，59℃退火20s，72℃延伸20s，40個(gè)循環(huán)。分析結(jié)果見(jiàn)圖9。

37℃時(shí)，純質(zhì)粒DNA在檸檬汁飲料中的穩(wěn)定性較差，經(jīng)貯藏10d后，檸檬汁中的DNA含量?jī)H為最初的0.3％。這是由于檸檬汁的pH值較低，DNA在其中極易發(fā)生脫嘌呤反應(yīng)，由于殼寡糖可在酸性條件下可顯著抑制DNA的脫嘌呤，因此體系中加入DNA-殼寡糖復(fù)合物后顯著提高了DNA在檸檬汁飲料中的穩(wěn)定性。

表4.實(shí)施例6中使用的引物序列

實(shí)施例7 白醋中殼聚糖對(duì)PCR產(chǎn)物的保護(hù)

1、PCR產(chǎn)物與殼聚糖復(fù)合物的制備

殼聚糖溶液的制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取250mg殼聚糖(購(gòu)于Sigma-Aldrich；貨號(hào)：740063；分子量：60-120kDa)，加入20mL滅菌超純水，室溫下磁力攪拌2h，使殼聚糖粉末充分水合。向水合的殼聚糖溶液逐漸滴加20mL pH 2的鹽酸溶液，過(guò)夜磁力攪拌使其充分溶解。隨后，使用0.1M的氫氧化鈉溶液將pH值調(diào)節(jié)至7.0。最后用滅菌超純水定容至100mL，于4℃保藏。使用時(shí)用滅菌超純水稀釋至所需工作液的濃度。

PCR產(chǎn)物的制備：以pUC18質(zhì)粒為模板(10¹⁰拷貝/μL)，引物pUC19-364a/s為引物進(jìn)行普通PCR反應(yīng)，引物序列見(jiàn)表5，擴(kuò)增的目的產(chǎn)物長(zhǎng)度為364bp。50μL體系中含有5μL 10×pfu buffer，0.4μM引物pUC19-364a/s，0.2mM dNTPs，2U pfu DNA聚合酶(購(gòu)于Thermo Scientific)。PCR參數(shù)為：72℃引物延伸5min，94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，59℃退火30s，72℃延伸90s，35個(gè)循環(huán)后72℃保溫5min。將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行醇沉純化并用nano drop測(cè)定PCR產(chǎn)物的濃度。

將PCR產(chǎn)物與殼聚糖按照氨基磷酸比10:1的比例混合，使DNA的終濃度達(dá)到4ng/μL，并于2℃放置10小時(shí)，使DNA與殼聚糖充分作用，通過(guò)靜電相互作用形成復(fù)合物。

2、DNA-殼聚糖復(fù)合物在白醋中的長(zhǎng)期貯藏

取4μL步驟1中制備的復(fù)合物加入到396μL白醋(品名：海天白米醋；規(guī)格：450mL；制造單位：佛山市海天調(diào)味食品股份有限公司)中，使PCR產(chǎn)物的終濃度達(dá)到40pg/μL(～10⁸拷貝/μL)，混勻后，用封口膜將EP管口密封并分別置于4℃、20℃和37℃下貯藏，一段時(shí)間后取出樣品并檢測(cè)PCR產(chǎn)物的含量。同時(shí)設(shè)置了不添加殼聚糖的對(duì)照組，即將PCR產(chǎn)物直接加入到上述白醋中，使DNA的終濃度與復(fù)合物中DNA的終濃度相同，其他貯藏條件完全相同。

3、PCR產(chǎn)物穩(wěn)定性的檢測(cè)—熒光定量PCR法

為檢測(cè)步驟2中殼聚糖對(duì)PCR產(chǎn)物的保護(hù)效果，使用熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)長(zhǎng)時(shí)間貯藏后白醋中PCR產(chǎn)物的含量。為避免白醋中的成分影響RT-qPCR反應(yīng)，將含有PCR產(chǎn)物的白醋稀釋100倍后作為RT-qPCR反應(yīng)的模板。針對(duì)PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)的特異性PCR引物pUC18-156a/s的序列見(jiàn)表5，擴(kuò)增的目的產(chǎn)物長(zhǎng)度為156bp。反應(yīng)中每個(gè)體系均含有5μL 2×SYBR Select Master Mix(購(gòu)于Invitrogen，貨號(hào)：4472908)，0.3μM特異性引物，1μL上述稀釋后的含PCR產(chǎn)物的白醋，用ddH₂O補(bǔ)至10μL。反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性2min，95℃變性20s，59℃退火20s，72℃延伸20s，40個(gè)循環(huán)。分析結(jié)果見(jiàn)圖10。

純PCR產(chǎn)物在白醋中的穩(wěn)定性較差，經(jīng)37℃貯藏10d后，白醋中的DNA含量?jī)H為最初的0.1％。這是由于白醋的pH值較低(～pH 2.2)，DNA在其中極易發(fā)生脫嘌呤反應(yīng)，由于殼聚糖在酸性條件下可顯著抑制DNA的脫嘌呤，因此體系中加入DNA-殼聚糖復(fù)合物后顯著提高了DNA在白醋中的穩(wěn)定性。

表5.實(shí)施例7中使用的引物序列

上述的實(shí)施例的結(jié)果表明本發(fā)明的方法可大大提高DNA在液態(tài)產(chǎn)品中的穩(wěn)定性，經(jīng)高溫、長(zhǎng)時(shí)間貯藏后，產(chǎn)品中外源DNA的含量幾乎不變，因此可通過(guò)分子生物學(xué)手段對(duì)內(nèi)標(biāo)DNA的有無(wú)甚至含量進(jìn)行檢測(cè)，從而確定產(chǎn)品的真?zhèn)渭叭ハ?，從而擴(kuò)大DNA作為商品防偽和溯源內(nèi)標(biāo)物的應(yīng)用范圍。

應(yīng)當(dāng)理解的是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)上述說(shuō)明加以改進(jìn)或變換，而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 青島千卓分子生物科技有限公司

<120> 一種液態(tài)產(chǎn)品中外源DNA內(nèi)標(biāo)物的保護(hù)方法及其應(yīng)用

<130> 2016

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gtcttaaata ggccactaag tcgttaattc gagact 36

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ccgcctccat ccagtctatt aattgt 26

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

tcatgtaact cgccttgatc gttgg 25

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

acgaaaactc acgttaaggg at 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

agcattggta actgtcagac ca 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

tgtggaattg tgagcggata 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

gttttcccag tcacgacgtt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

gcctacatac ctcgctctgc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

ggcgctttct catagctcac 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

cagctcactc aaaggcggta 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

ttggagcgaa cgacctacac 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

aagataccag gcgtttcccc 20

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

cgaacgacct acaccgaact 20