本發(fā)明屬于煙草抗病育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種分子標(biāo)記輔助選擇定向改良煙草黑脛病抗性的育種方法。

背景技術(shù)：

分子生物學(xué)技術(shù)，尤其是分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展為品種改良提供了有效手段。分子標(biāo)記輔助選擇育種是在育種過程中，借助與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記對目標(biāo)性狀進(jìn)行選擇。2010年啟動的中國煙草基因組計劃重大專項(xiàng)，繪制了以絨毛狀煙草、林煙草、栽培煙草全基因組序列圖譜、煙草分子遺傳連鎖圖譜、煙草單倍體型圖為核心的一整套高質(zhì)量的基因組圖譜，為分子標(biāo)記輔助育種奠定了堅實(shí)基礎(chǔ)；

烤煙品種紅花大金元是云南在上世紀(jì)70年代選育的優(yōu)質(zhì)特色品種，清香型風(fēng)格突出，深受卷煙工業(yè)企業(yè)的喜愛，但易感黑脛病。20多年來，我國煙草育種工作者試圖利用常規(guī)育種技術(shù)改良紅花大金元對黑脛病的抗性，但一直未獲成功，選育的后代材料存在無法保持紅花大金元品種的特征特性以及黑脛病抗性丟失的問題；而且在傳統(tǒng)回交育種中，往往需要經(jīng)過回交五代才能達(dá)到較高的遺傳背景回復(fù)率，育種進(jìn)程較長；并且，需要大規(guī)模在田間種植進(jìn)行表型篩選，田間工作量較大，并且受環(huán)境影響較大，甚至出現(xiàn)結(jié)果不準(zhǔn)確的問題。因此，研發(fā)一種能解決上述問題的育種方法是非常必要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種分子標(biāo)記輔助選擇定向改良煙草黑脛病抗性的育種方法。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，具體包括以下步驟：

A、分子標(biāo)記的獲得：用全基因組序列數(shù)據(jù)開發(fā)的SSR標(biāo)記對輪回親本、供體親本及其F₁的葉片提取DNA進(jìn)行分子標(biāo)記篩選，選出在兩親本間有多態(tài)、且在F₁中呈共顯性的分子標(biāo)記，再對F₁與輪回親本回交得到的BC₁F₁作圖群體進(jìn)行分子標(biāo)記的基因型分析、構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，以及對BC₁F₁進(jìn)行黑脛病抗性鑒定，選出與抗黑脛病緊密連鎖的分子標(biāo)記作為前景標(biāo)記，其他與抗黑脛病非連鎖的分子標(biāo)記作為背景標(biāo)記；

B、分子標(biāo)記輔助第一次選擇：將步驟A中的BC₁F₁抗病單株自交得到BC₁F₂，對BC₁F₂進(jìn)行黑脛病抗性鑒定，提取不發(fā)病單株葉片的DNA，利用步驟A中的前景標(biāo)記對BC₁F₂輔助前景選擇，再用步驟A中的背景標(biāo)記輔助背景選擇，選出含抗黑脛病基因、表型接近輪回親本且背景回復(fù)率高的后代單株，再與輪回親本回交，得到BC₂F₁；

C、分子標(biāo)記輔助第二次選擇：對BC₂F₁的后代進(jìn)行黑脛病抗性鑒定，提取不發(fā)病單株葉片的DNA，利用步驟A中的前景標(biāo)記對BC₂F₁輔助前景選擇，再用步驟A中的背景標(biāo)記輔助背景選擇，選出含抗黑脛病基因、表型接近輪回親本且背景回復(fù)率高的后代單株，再與輪回親本回交，得到BC₃F₁；

D、分子標(biāo)記輔助第三次選擇：對BC₃F₁的后代進(jìn)行黑脛病抗性鑒定，提取不發(fā)病單株葉片的DNA，利用步驟A中的前景標(biāo)記對BC₃F₁輔助前景選擇，再用步驟A中的背景標(biāo)記輔助背景選擇，選出含抗黑脛病基因、表型接近輪回親本且背景回復(fù)率高的后代單株，再與輪回親本回交，得到BC₄F₁；

E、分子標(biāo)記輔助第四次選擇：在歷年煙草黑脛病重病田塊種植BC₄F₁，提取BC₄F₁單株葉片的DNA，利用步驟A中的前景標(biāo)記對BC₄F₁輔助前景選擇，再用步驟A中的背景標(biāo)記輔助背景選擇，選出含抗黑脛病基因、表型接近輪回親本且背景回復(fù)率高的BC₄F₁單株，自交得到BC₄F₂；

F、分子標(biāo)記輔助第五次選擇：提取BC₄F₂單株葉片的DNA，利用步驟A中的前景標(biāo)記對BC₄F₂輔助前景選擇，再用步驟A中的背景標(biāo)記輔助背景選擇，選出純合、背景回復(fù)率高、漸滲片段相對較短的抗性單株作為定向改良新品系。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下技術(shù)效果：

1、本發(fā)明利用精確的緊密連鎖分子標(biāo)記輔助對抗黑脛病基因進(jìn)行前景選擇以及利用紅花大金元優(yōu)良性狀的高密度分子標(biāo)記進(jìn)行全基因組遺傳背景選擇，相對較短的含抗病基因的漸滲片段導(dǎo)入到優(yōu)良品種紅花大金元中，達(dá)到了既完整保留紅花大金元的現(xiàn)有優(yōu)良性狀、又增加了抗黑脛病能力的效果，并且田間生長整齊，遺傳性狀穩(wěn)定；

2、本發(fā)明輔助背景選擇時采用遞進(jìn)式兩步法輔助背景選擇，先利用均勻分布于煙草全基因組24個連鎖群上的120個背景標(biāo)記，約1/5的背景標(biāo)記輔助背景的初步選擇，淘汰一批單株后，再利用剩余的457個全基因組范圍的背景標(biāo)記輔助背景選擇，遞進(jìn)式兩步法輔助背景選擇既可以有效覆蓋定向改良原始品種的全基因組遺傳背景，又可以減少4/5的背景分子標(biāo)記輔助選擇的工作量，從而大大提高定向改良效率；

3、本發(fā)明中回交3代BC₃F₁經(jīng)分子標(biāo)記輔助選擇的單株的背景回復(fù)率可達(dá)到97.5%以上，大大提高輪回親本的背景回復(fù)率，有效縮短育種進(jìn)程；

4、本發(fā)明前景標(biāo)記是與抗煙草黑脛病緊密連鎖的分子標(biāo)記，背景標(biāo)記覆蓋改良原始品種全基因組，通過增加回交代數(shù)分子標(biāo)記輔助選擇，繪制各代典型單株的基因型，比較基因圖就可以相當(dāng)直觀地選出純合、背景回復(fù)率高、漸滲片段相對較短的抗性單株，定向改良精確度高；

5、本發(fā)明使用室內(nèi)、溫室培養(yǎng)的煙苗進(jìn)行分子標(biāo)記分析，而不需要大規(guī)模的田間種植進(jìn)行表型篩選，只需要對分子標(biāo)記輔助選出的后代進(jìn)行田間驗(yàn)證，具有田間工作量少、絕大部分工作受環(huán)境影響小、結(jié)果更準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

圖1為分子標(biāo)記輔助選擇定向改良煙草黑脛病抗性的育種流程圖；

圖2為分子標(biāo)記輔助選擇繪制BC₁F₂典型單株W67-23的基因型示意圖；

圖3為分子標(biāo)記輔助選擇繪制BC₄F₂典型單株A091的基因型示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

如附圖1~3所示本發(fā)明具體包括以下步驟：

A、分子標(biāo)記的獲得：用全基因組序列數(shù)據(jù)開發(fā)的SSR標(biāo)記對輪回親本、供體親本及其F₁的葉片提取DNA進(jìn)行分子標(biāo)記篩選，選出在兩親本間有多態(tài)、且在F₁中呈共顯性的分子標(biāo)記，再對F₁與輪回親本回交得到的BC₁F₁作圖群體進(jìn)行分子標(biāo)記的基因型分析、構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，以及對BC₁F₁進(jìn)行黑脛病抗性鑒定，選出與抗黑脛病緊密連鎖的分子標(biāo)記作為前景標(biāo)記，其他與抗黑脛病非連鎖的分子標(biāo)記作為背景標(biāo)記；

B、分子標(biāo)記輔助第一次選擇：將步驟A中的BC₁F₁抗病單株自交得到BC₁F₂，對BC₁F₂進(jìn)行黑脛病抗性鑒定，提取不發(fā)病單株葉片的DNA，利用步驟A中的前景標(biāo)記對BC₁F₂輔助前景選擇，再用步驟A中的背景標(biāo)記輔助背景選擇，選出含抗黑脛病基因、表型接近輪回親本且背景回復(fù)率高的后代單株，再與輪回親本回交，得到BC₂F₁；

C、分子標(biāo)記輔助第二次選擇：對BC₂F₁的后代進(jìn)行黑脛病抗性鑒定，提取不發(fā)病單株葉片的DNA，利用步驟A中的前景標(biāo)記對BC₂F₁輔助前景選擇，再用步驟A中的背景標(biāo)記輔助背景選擇，選出含抗黑脛病基因、表型接近輪回親本且背景回復(fù)率高的后代單株，再與輪回親本回交，得到BC₃F₁；

D、分子標(biāo)記輔助第三次選擇：對BC₃F₁的后代進(jìn)行黑脛病抗性鑒定，提取不發(fā)病單株葉片的DNA，利用步驟A中的前景標(biāo)記對BC₃F₁輔助前景選擇，再用步驟A中的背景標(biāo)記輔助背景選擇，選出含抗黑脛病基因、表型接近輪回親本且背景回復(fù)率高的后代單株，再與輪回親本回交，得到BC₄F₁；

E、分子標(biāo)記輔助第四次選擇：在歷年煙草黑脛病重病田塊種植BC₄F₁，提取BC₄F₁單株葉片的DNA，利用步驟A中的前景標(biāo)記對BC₄F₁輔助前景選擇，再用步驟A中的背景標(biāo)記輔助背景選擇，選出含抗黑脛病基因、表型接近輪回親本且背景回復(fù)率高的BC₄F₁單株，自交得到BC₄F₂；

F、分子標(biāo)記輔助第五次選擇：提取BC₄F₂單株葉片的DNA，利用步驟A中的前景標(biāo)記對BC₄F₂輔助前景選擇，再用步驟A中的背景標(biāo)記輔助背景選擇，選出純合、背景回復(fù)率高、漸滲片段相對較短的抗性單株作為定向改良新品系。

所述的定向改良新品系有多個時，首先利用步驟A中的前景標(biāo)記、背景標(biāo)記分別對定向改良新品系進(jìn)行輔助前景選擇、輔助背景選擇，選出含抗黑脛病基因且背景回復(fù)率保持穩(wěn)定的品系，再進(jìn)一步選出與輪回親本的主要植物學(xué)性狀、農(nóng)藝性狀最接近的品系為最優(yōu)品系。

所述的前景標(biāo)記有4個，分別為Scf_30K、TM62、ST141和InDel0617。

Scf_30K分子標(biāo)記引物序列為：

Scf_30KF：5’-GAGAAGCCCATCACCTTTTG-3’，

Scf_30KR：5’-TTCGAAATAAAGGCTCCCTCT-3’；

TM62分子標(biāo)記引物序列為：

TM62F：5’-AG ACGGGGC TAAATTTGACA-3’，

TM62R：5’-AGCGGAAGAGTT GAGGA CA A-3’；

ST141分子標(biāo)記引物序列為：

ST141F：5’-CCATTCTAGCAAAGCCCATAA-3’，

ST141R：5’-CAGA GGCAACAATGCATACG-3’；

InDel0617分子標(biāo)記引物序列為：

InDel0617F：5’-TGGCTTTGCGGTCCTATTAC-3’，

InDel0617R：5’-GCTCTGCAGATGCAAAGGTT-3’。

所述的背景標(biāo)記有577個。

所述的輔助背景選擇為遞進(jìn)式兩步法輔助背景選擇，所述的遞進(jìn)式兩步法輔助背景選擇是先利用均勻分布于煙草全基因組24個連鎖群上共120個背景標(biāo)記輔助背景選擇，再利用剩余的457個全基因組范圍的背景標(biāo)記輔助背景選擇。

所述的BC₃F₁經(jīng)分子標(biāo)記輔助選擇的單株的背景回復(fù)率大于96.5%。

所述的定向改良新品系的背景回復(fù)率大于99%。

所述的輪回親本、供體親本及其F₁、BC₁F₁、BC₁F₂、BC₂F₁、BC₃F₁煙苗均在室內(nèi)或溫室培養(yǎng)。

所述的輪回親本為紅花大金元，所述的供體親本為抗黑脛病基因來源于煙草野生種N.plumbaginifolia的育種中間材料RBST。

所述的歷年煙草黑脛病重病田塊至少包括2地4點(diǎn)。

所述的遺傳連鎖圖譜構(gòu)建是利用作圖軟件JoinMap 4.0（Van Ooijen, J.W. JoinMap? 4.0, Software for the calculation of genetic linkage maps in experimental populations. Kyazma B.V, Wageningen. 2006）進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建。Grouping選擇recombination frequency 參數(shù)，閾值為Start（0.250）、End（0.050）、Step（-0.050）；Mapping algorithm選擇regression mapping 參數(shù)，mapping function選擇Kosambi 函數(shù)；其余參數(shù)采用默認(rèn)值。利用MapChart 2.2軟件（Voorrips, R.E. MapChart: software for the graphical presentation of linkage maps and QTLs. The Journal of Heredity. 2002, 93:77-78）繪制遺傳圖譜。

所述的步驟B~F中PCR反應(yīng)體系：PCR擴(kuò)增體系為20 μL，其中包含2.0 μL 的1 x buffer （10 mM Tris-Cl、PH=8.4，50 mM KCl，1.5 mM MgCl₂），200 μM 的 dNTPs（Takara Biotechnology Co. Ltd.，大連），0.5 μM 的上下游引物（Takara），1.0 U 的 rTaq 聚合酶（Takara），20-50ng模板DNA，最后用ddH₂O補(bǔ)齊20 μL。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5分鐘，30個循環(huán)（95℃變性30秒，復(fù)性30s，72℃延伸30s），72℃延伸5分鐘，4℃保存。其中復(fù)性溫度共有三個梯度57℃、60℃、62℃，不同的標(biāo)記對應(yīng)不同的退火溫度。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加1/6體積的6 × Loading Buffer，取2.5μL利用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠（non-denaturing PAGE，220V，3.5h）在電泳儀上電泳分離，然后進(jìn)行銀染檢測。

實(shí)施例1：前景、背景分子標(biāo)記的獲得

用紅花大金元全基因組數(shù)據(jù)開發(fā)的23626個SSR標(biāo)記對云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院研和實(shí)驗(yàn)基地溫室種植的輪回親本紅花大金元、供體親本RBST（中國發(fā)明專利ZL 201410819251.2）及其F₁葉片提取的DNA在云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院玉溪市南祥路14號實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分子標(biāo)記篩選，篩選出在兩親本間有多態(tài)、且在F₁中呈共顯性的分子標(biāo)記601個，再用作圖軟件Joinmap 4.0對601個標(biāo)記在云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院研和實(shí)驗(yàn)基地大田獲得的213株BC₁F₁作圖群體進(jìn)行分子標(biāo)記的基因型分析、構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，最終構(gòu)建獲得了一張含有581個SSR標(biāo)記的覆蓋煙草全基因組的高密度遺傳圖譜，結(jié)合3批次溫室8030株BC₁F₁黑脛病抗性鑒定（中國發(fā)明專利申請?zhí)?01510617233.0）結(jié)果，選出與抗黑脛病基因兩側(cè)緊密連鎖的分子標(biāo)記Scf_30K、TM62、ST141和InDel0617（中國發(fā)明專利申請?zhí)?01610054257.4）作為前景標(biāo)記，其他的577個與抗性非連鎖的SSR標(biāo)記作為背景標(biāo)記。

實(shí)施例2：BC₁F₂分子標(biāo)記輔助選擇

2012年的BC₁F₁抗病單株自交得到BC₁F₂，BC₁F₂播種育苗3盤（128株/盤），成苗后移栽至小花盆、還苗后進(jìn)行黑脛病抗性鑒定，不發(fā)病單株移栽至大田，共移栽90株，然后提取各不發(fā)病單株葉片DNA；先利用與抗黑脛病基因兩側(cè)緊密連鎖的4個前景標(biāo)記Scf_30K、TM62、ST141和InDel0617助前景選擇，選擇含有抗黑脛病基因的單株，再利用基于構(gòu)建的改良原始品種全基因組遺傳圖譜上24個連鎖群、每個連鎖群選擇5個背景標(biāo)記共120個均勻分布在各連鎖群的背景標(biāo)記輔助背景選擇，初步選出含有抗黑脛病基因、背景回復(fù)率高的8個單株；再利用剩余的分布煙草全基因組的457個背景標(biāo)記進(jìn)一步對這8個單株輔助背景選擇，繪制各單株的基因型，選出W67-23和89共2株抗黑脛病、含有85%以上紅花大金元基因組片段的BC₁F₂；根據(jù)表型觀測，W67-23與紅花大金元株型更接近，故選擇W67-23與輪回親本紅花大金元回交，得到BC₂F₁。

實(shí)施例3：BC₂F₁分子標(biāo)記輔助選擇

BC₂F₁播種育苗5盤（168株/盤），成苗后移栽至小花盆、還苗后進(jìn)行黑脛病抗性鑒定，不發(fā)病單株移栽至大田，共移栽306株，然后提取各不發(fā)病單株葉片DNA；先利用與抗黑脛病基因兩側(cè)緊密連鎖的4個前景標(biāo)記Scf_30K、TM62、ST141和InDel0617輔助前景選擇，選擇含有抗黑脛病基因的單株；基于構(gòu)建的改良原始品種全基因組遺傳圖譜上24個連鎖群、每個連鎖群選擇5個背景標(biāo)記共120個均勻分布在各連鎖群的背景標(biāo)記輔助背景的初步選擇，初步選出含有抗黑脛病基因、背景回復(fù)率高的33個單株；再利用剩余的分布煙草全基因組的457個背景標(biāo)記進(jìn)一步對這33個單株進(jìn)一步輔助背景選擇，繪制各單株的基因型，結(jié)合表型觀測，選出編號分別為T27、T53、T101、T115、T204和T251的6個單株，這6個BC₂F₁單株背景回復(fù)率均在93%以上，再用這6個單株均與紅花大金元回交，得到BC₃F₁。

實(shí)施例4：BC₃F₁分子標(biāo)記輔助選擇

各BC₃F₁單株成苗后，經(jīng)黑脛病抗性鑒定，然后提取各不發(fā)病單株葉片DNA，共提取了13567個單株DNA，其中來自T27、T53、T101、T115、T204、T251與紅花大金元回交獲得的BC₃F₁單株數(shù)分別為1110株、4544株、3325株、1581株、1872株、1135株；先利用與抗黑脛病基因兩側(cè)緊密連鎖的4個前景標(biāo)記Scf_30K、TM62、ST141和InDel0617輔助前景選擇，初步得到約1800個候選單株，移栽至臨時大棚；經(jīng)表型觀察選出7株，直接用577個背景標(biāo)記輔助背景選擇；這7個單株均含抗黑脛病基因，估算紅花大金元背景回復(fù)率見表1，T53-64的背景回復(fù)率達(dá)到97.6%，其余6個單株的背景回復(fù)率在96.7%~97.5%之間，這7個單株均與紅花大金元進(jìn)行了回交，獲得了BC₄F₁。

表1 7個BC₃F₁單株根據(jù)分子標(biāo)記分析估算的紅花大金元背景回復(fù)率

實(shí)施例5：BC₄F₁田間試驗(yàn)和后代單株選擇

2015年安排在玉溪峨山及研和試驗(yàn)基地，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，3次重復(fù)。除黑脛病防治措施外，其余各項(xiàng)農(nóng)事操作同當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)措施；試驗(yàn)材料為實(shí)施例4得到的7個BC₄F₁株系，親本紅花大金元、RBST。

旺長期觀察各試驗(yàn)點(diǎn)黑脛病發(fā)病情況表明，玉溪峨山試點(diǎn)發(fā)病較重，其次是研和基地病圃試點(diǎn)?，F(xiàn)蕾開花期，玉溪峨山試點(diǎn)發(fā)病最重，紅花大金元絕大部分死亡，BC₄F₁株系存活株數(shù)接近于死亡株數(shù)，RBST全部存活；研和基地病圃的紅花大金元絕大部分死亡，BC₄F₁株系存活株數(shù)略多于死亡株數(shù)，RBST全部存活，符合預(yù)期。

經(jīng)表型觀測，各株系仍有一定分離，現(xiàn)蕾后選取表型接近紅花大金元的植株套袋自交，每片葉片掛牌。打頂后，掛牌、套袋單株測定了打頂株高、葉片數(shù)、莖圍、節(jié)距、腰葉長寬等農(nóng)藝性狀，供單株選擇時參考（表2）。

表2 部分掛牌單株的農(nóng)藝性狀

BC₄F₁株系進(jìn)入旺長期后，所有試點(diǎn)的所有BC₄F₁單株均取葉片提取DNA，試點(diǎn)1（研和基地大田）取樣863株，試點(diǎn)2（研和基地病圃）取樣1126株，試點(diǎn)3（玉溪峨山）取樣1155株。

利用與抗黑脛病基因兩側(cè)緊密連鎖的4個前景標(biāo)記Scf_30K、TM62、ST141和InDel0617輔助前景選擇，兼顧表型觀測、農(nóng)藝性狀結(jié)果，初步選出32個單株；再直接用577個背景標(biāo)記輔助背景選擇，選出6個BC₄F₁單株；估算6個BC₄F₁單株的紅花大金元背景回復(fù)率（表3），最高達(dá)到99.1%，其次是98.3%，剩下4個單株介于97.4%-97.9%之間；6個BC₄F₁自交得到BC₄F₂。

表3 6個BC₄F₁單株根據(jù)分子標(biāo)記分析估算的紅花大金元背景回復(fù)率

BC₄F₁成熟時分單株采烤，8個BC₄F₁單株初烤煙葉卷煙，評吸鑒定發(fā)現(xiàn)2個BC₄F₁單株（A2和H2）與對照紅花大金元評吸得分、主要特征比較接近，2個BC₄F₁單株（T1和T2）略遜于對照紅花大金元（表4）。

表4 8個BC₄F₁單株初烤煙葉的評吸鑒定結(jié)果

實(shí)施例6：BC₄F₂后代單株選擇

BC₄F₂播種育苗，在移栽至小花盆的同時取葉片提取DNA，共提取2067個BC₄F₂單株DNA；首先利用與抗黑脛病基因兩側(cè)緊密連鎖的4個前景標(biāo)記Scf_30K、TM62、ST141和InDel0617輔助前景選擇，選擇含有抗黑脛病基因的單株；再利用基于構(gòu)建的改良原始品種全基因組遺傳圖譜上24個連鎖群、每個連鎖群選擇5個背景標(biāo)記共120個均勻分布在各連鎖群的背景標(biāo)記輔助背景的初步選擇，初步選出含有抗黑脛病基因、背景回復(fù)率高的33個單株；這33個BC₄F₂單株成苗后進(jìn)行黑脛病抗性鑒定，驗(yàn)證基因型分析與表型分析的吻合程度；然后再利用剩余的分布煙草全基因組的457個背景標(biāo)記進(jìn)一步對這33個單株輔助背景選擇，繪制各單株的基因型；根據(jù)分子標(biāo)記輔助選擇結(jié)果和農(nóng)藝性狀表現(xiàn)，選出8個BC₄F₂單株，其中背景回復(fù)率最高可達(dá)99.5%（表 5）。

表 5 8個BC₄F₂單株根據(jù)分子標(biāo)記分析估算的紅花大金元背景回復(fù)率

最后，綜合考慮實(shí)施例5中BC₄F₁單株的表現(xiàn)，H2和A2農(nóng)藝性狀、感官評吸與紅花大金元非常接近，T1長勢較強(qiáng)、感官評吸略遜于紅花大金元；而BC₄F₂單株A091、H291、T033和T056含有純合抗黑脛病基因、高抗黑脛病菌0號生理小種，其中A091和H291的遺傳背景回復(fù)率在99%以上，A091和H291兩個單株已套袋繁殖種子，并與紅花大金元雜交，作為定向改良的抗黑脛病紅花大金元新品系用于生產(chǎn)試驗(yàn)示范，T033和T056也已套袋繁殖種子、可作為抗黑脛病新品系加以利用。

實(shí)施例7：定向改良品系的田間比較鑒定

2016年試驗(yàn)安排在大理彌渡、昆明石林及玉溪研和試驗(yàn)基地。其中大理彌渡兩個點(diǎn)，東海點(diǎn)5畝、西河點(diǎn)5畝；昆明石林兩個點(diǎn)，景區(qū)點(diǎn)5畝、煙莊點(diǎn)6畝；玉溪研和試驗(yàn)基地兩個點(diǎn)，大田點(diǎn)2.3畝、病圃點(diǎn)2.3畝。

改良新品系（A091B、H291B、T033B、T056B）和對照品種紅花大金元（HDS）同田相鄰種植，不設(shè)重復(fù)。大理彌渡4月14日播種，漂浮育苗；西河點(diǎn)、東海點(diǎn)分別于5月20日、21日膜下小苗移栽。昆明石林4月19日播種，漂浮育苗；5月31日膜下小苗移栽。玉溪研和試驗(yàn)基地4月22日播種，漂浮育苗；大田點(diǎn)、病圃點(diǎn)分別于6月2日、6月3日膜下小苗移栽。栽培管理參照當(dāng)?shù)丶t花大金元生產(chǎn)技術(shù)措施。

彌渡東海點(diǎn)A091B于7月12日現(xiàn)蕾，7月15日開花，7月20日打頂，與同田對照DHS一致。A091B株式塔形，田間生長勢中，腰葉長橢圓形，葉色綠，葉耳大，生長整齊，與同田對照HDS相當(dāng)（表6）；H291也接近HDS。T033B株式塔形，田間生長勢強(qiáng)，葉面較平；T056B田間生長勢稍強(qiáng)于T033B。西河點(diǎn)前期比較干旱，田間長勢整體弱于東海點(diǎn)。A091B于7月13日現(xiàn)蕾，7月16日開花，7月21日打頂；植物學(xué)性狀與東海點(diǎn)表現(xiàn)類似。其余試點(diǎn)陸續(xù)進(jìn)入現(xiàn)蕾開花期，主要植物學(xué)性狀與彌渡表現(xiàn)類似。

表6 改良新品系與對照品種的主要植物學(xué)性狀（大理彌渡）

現(xiàn)蕾-開花期調(diào)查黑脛病自然發(fā)病情況，所有試點(diǎn)新品系黑脛病自然發(fā)病率均為0；彌渡東海點(diǎn)HDS黑脛病自然發(fā)病率為6.99%、西河點(diǎn)為7.87%，研和大田點(diǎn)HDS黑脛病自然發(fā)病率為3.07%（表7）。研和病圃點(diǎn)采用人工接種誘發(fā)鑒定，新品系無黑脛病發(fā)生，HDS發(fā)病率已達(dá)34.00%（表7）。

表7 改良新品系與對照品種的黑脛病自然發(fā)病情況

打頂后測量打頂株高、有效葉數(shù)、莖圍、節(jié)距和腰葉長寬等農(nóng)藝性狀。彌渡東海點(diǎn)A091B與同田HDS各測定20株，A091B平均打頂株高105.8cm，有效葉數(shù)17.7片，莖圍11.1cm，節(jié)距6.4cm，腰葉長82.6cm、寬31.6cm，與對照HDS接近、無顯著差異（表8）。西河點(diǎn)A091B與同田HDS各測定30株，平均打頂株高109.3cm，有效葉數(shù)17.9片，莖圍11.6cm，節(jié)距6.1cm，腰葉長79.4cm、寬29.1cm，與對照HDS接近（表8）。

表8 改良新品系A(chǔ)091B與對照品種HDS的主要農(nóng)藝性狀（大理彌渡）

打頂后測量打頂株高、有效葉數(shù)、莖圍、節(jié)距和腰葉長寬等農(nóng)藝性狀。彌渡東海點(diǎn)A091B與同田HDS各測定20株，A091B平均打頂株高105.8cm，有效葉數(shù)17.7片，莖圍11.1cm，節(jié)距6.4cm，腰葉長82.6cm、寬31.6cm，與對照HDS接近、無顯著差異（表8）。西河點(diǎn)A091B與同田HDS各測定30株，平均打頂株高109.3cm，有效葉數(shù)17.9片，莖圍11.6cm，節(jié)距6.1cm，腰葉長79.4cm、寬29.1cm，與對照HDS接近（表8）。

隨機(jī)選取A091B新品系共30個單株，提取DNA；首先，利用與目的基因緊密連鎖的4個前景標(biāo)記輔助前景選擇；結(jié)果表明，A091B含抗黑脛病基因；然后，直接利用577個背景標(biāo)記輔助背景選擇，選取背景回復(fù)率較高的前5個BC₄F₁單株；最后，再結(jié)合入選的5個BC₄F₁單株的田間綜合表現(xiàn)（植物學(xué)性狀、農(nóng)藝性狀）及評吸鑒定結(jié)果，最終選擇編號為A091B的單株，經(jīng)分析可知，其基因組除3個含有抗黑脛病基因前景小片段外，其余全部回復(fù)為紅花大金元的基因型，背景回復(fù)率99%。

綜上所述，A091B高抗黑脛病菌，主要植物學(xué)性狀和農(nóng)藝性狀與對照品種紅花大金元（DHS）相當(dāng)，保持了紅花大金元的特征特性，田間生長整齊，遺傳性狀穩(wěn)定，實(shí)現(xiàn)了紅花大金元品種抗黑脛病的定向改良，通過區(qū)試、工業(yè)驗(yàn)證的新品系就可以作為新品種申請審定。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院

<120> 一種分子標(biāo)記輔助選擇定向改良煙草黑脛病抗性的育種方法

<130> 2016

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Scf_30KF

<400> 1

gagaagccca tcaccttttg 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Scf_30KR

<400> 2

ttcgaaataa aggctccctc t 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> TM62F

<400> 3

agacggggct aaatttgaca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> TM62R

<400> 4

agcggaagag ttgaggacaa 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> ST141F

<400> 5

ccattctagc aaagcccata a 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> ST141R

<400> 6

cagaggcaac aatgcatacg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> InDel0617F

<400> 7

tggctttgcg gtcctattac 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> InDel0617R

<400> 8

gctctgcaga tgcaaaggtt 20