本發(fā)明屬于檢測領域，具體涉及一種熒光生物探針、包含該熒光生物探針的生物檢測系統(tǒng)及其檢測Hg²⁺濃度的方法。

背景技術：

汞是最具毒性和最危險的重金屬元素之一，通過食物鏈在生物體內累積，給人們帶來了嚴重的健康危害，如生長發(fā)育緩慢、器官損傷、神經系統(tǒng)損傷，甚至死亡。美國環(huán)保署(USEPA)規(guī)定的飲用水中汞離子(Hg²⁺)的含量最高不超高10nmol/L。因此，有必要發(fā)展一種高選擇性和高靈敏性的分析方法用于環(huán)境中汞離子的檢測。近來，Ono等人證明了Hg²⁺能夠高特異性和高選擇性的嵌入DNA的兩個胸腺嘧啶(T)中間，形成T-Hg²⁺-T的錯配堿基對(Miyake Y,Togashi H,Tashiro M,et al.MercuryII-mediated formation of thymine-HgII-thymine base pairs in DNA duplexes[J].Journal of the American Chemical Society,2006,128(7):2172-2173.)，基于這一特性，通過結合一些信號轉換策略，發(fā)展了許多不同的檢測方法，如比色法(Zhu Y,Cai Y,Zhu Y,et al.Highly sensitive colorimetric sensor for Hg²⁺detection based on cationic polymer/DNA interaction[J].Biosensors and Bioelectronics,2015,69:174-178.)、熒光法(Yuan M,Zhu Y,Lou X,et al.Sensitive label-free oligonucleotide-based microfluidic detection of mercury(II)ion by using exonuclease I[J].Biosensors and Bioelectronics,2012,31(1):330-336.)、電化學法(Xuan F,Luo X,Hsing I M.Conformation-dependent exonuclease III activity mediated by metal ions reshuffling on thymine-rich DNA duplexes for an ultrasensitive electrochemical method for Hg²⁺detection[J].Analytical Chemistry,2013,85(9):4586-4593.)等，但是上述方法的檢出下限一般都高于10nmol/L，無法滿足實際需求。為了提高檢測靈敏度，可以使用不同的酶來實現信號放大，如核酸外切酶(Chen J,Zhou S,Wen J.Disposable strip biosensor for visual detection of Hg²⁺based on Hg²⁺-triggered toehold binding and exonuclease III-assisted signal amplification[J].Analytical Chemistry,2014,86(6):3108-3114.)、聚合酶(Jia H,Wang Z,Wang C,et al.Real-time fluorescence detection of Hg²⁺ions with high sensitivity by exponentially isothermal oligonucleotide amplification[J].RSC Advances,2014,4(19):9439-9444.)、核酸內切酶(Li F,Feng Y,Liu S,et al.Triggered activity of a nicking endonuclease for mercuric(II)ion-mediated duplex-like DNA cleavage[J].Chemical Communications,2011,47(22):6347-6349.)、連接酶(Bi S,Ji B,Zhang Z,et al.Metal ions triggered ligase activity for rolling circle amplification and its application in molecular logic gate operations[J].Chemical Science,2013,4(4):1858-1863.)等，但基于酶的方法不僅增加了實驗的復雜性和檢測成本，而且Hg²⁺還有可能使酶變性，實際中難以應用。因此，開發(fā)一種靈敏度更高、操作簡便快捷且成本低廉的Hg²⁺濃度檢測方法，具有重要的應用前景。

技術實現要素：

本發(fā)明的一個目的是提供一種熒光生物探針，本發(fā)明的熒光生物探針可以檢測濃度低至50-1200pM的Hg²⁺，且操作簡單快捷、成本低廉，能夠廣泛應用于藥品、食品安全、臨床和環(huán)境檢測等領域。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于Hg²⁺檢測的熒光生物檢測系統(tǒng)，其特征在于包括本發(fā)明的熒光生物探針、輔助DNA和氧化石墨烯(GO)。

本發(fā)明的還一個目的是提供一種檢測Hg²⁺濃度的生物檢測方法。

為實現上述發(fā)明目的，提供以下技術方案：

一種熒光生物探針，由三種核酸片段H1、H2和H3組成，其中H1、H2和H3的5’端標記熒光基團FAM，H1、H2和H3的堿基序列見圖9，H1、H2和H3在游離狀態(tài)下各自形成莖環(huán)的發(fā)卡結構，H1、H2、H3環(huán)部10個堿基，莖部15對互補堿基，末端單鏈10個堿基，H1、H2和H3的5’末端單鏈吸附在氧化石墨烯表面，熒光淬滅，在Hg²⁺存在下，輔助DNA可以催化吸附于氧化石墨烯表面的H1、H2和H3組裝生成”Y”字形剛性雙鏈DNA(dsDNA)結構，脫離石墨烯表面，恢復熒光信號。

根據本發(fā)明，所述的熒光生物探針H1、H2和H3的發(fā)卡結構可以通過95℃下攪拌5min獲得。

第二方面，本發(fā)明提供一種用于Hg²⁺檢測的熒光生物檢測系統(tǒng)，包括本發(fā)明的熒光生物探針，輔助DNA和氧化石墨烯，其特征在于所述的熒光生物探針由三種核酸片段H1、H2和H3組成，其中H1、H2和H3的5’端標記熒光基團FAM，H1、H2和H3的堿基序列見圖9，H1、H2和H3在游離狀態(tài)下各自形成莖環(huán)的發(fā)卡結構，H1、H2、H3環(huán)部10個堿基，莖部15對互補堿基，末端單鏈10個堿基；所述的輔助DNA是由20個堿基組成的DNA片段，堿基序列見圖9；所述的氧化石墨烯可以采用修飾的Hummer法等方法合成制備。本發(fā)明的熒光生物探針H1、H2和H3的5’末端單鏈吸附在氧化石墨烯表面，熒光淬滅，在Hg²⁺存在下，輔助DNA可以催化吸附于氧化石墨烯表面的H1、H2和H3組裝生成”Y”字形剛性雙鏈DNA(dsDNA)結構，脫離石墨烯表面，恢復熒光信號。

根據本發(fā)明的熒光生物檢測系統(tǒng)，所述的熒光生物探針H1、H2和H3的發(fā)卡結構可以通過95℃下攪拌5min獲得。

根據本發(fā)明的熒光生物檢測系統(tǒng)，其中熒光生物探針H1、H2和H3為濃度30-200nmol/L的H1、H2和H3Tris-HCl緩沖溶液。優(yōu)選地，熒光生物探針H1、H2和H3為濃度50-200nmol/L的H1、H2和H3Tris-HCl緩沖溶液。進一步優(yōu)選地，熒光生物探針H1、H2和H3為濃度50nmol/L的H1、H2和H3Tris-HCl緩沖溶液。

根據本發(fā)明的熒光生物檢測系統(tǒng)，其中輔助DNA為濃度20-500nmol/L的輔助DNA Tris-HCl緩沖溶液。優(yōu)選地，輔助DNA為濃度100-500nmol/L的輔助DNA Tris-HCl緩沖溶液。進一步優(yōu)選地，輔助DNA為濃度100nmol/L的輔助DNA Tris-HCl緩沖溶液。

根據本發(fā)明的熒光生物檢測系統(tǒng)，其中Tris-HCl緩沖溶液為濃度50mmol/L，pH 8.0，含50mmol/L MgCl₂的溶液。

根據本發(fā)明的熒光生物檢測系統(tǒng)，其中氧化石墨烯表面(GO)可以采用修飾的Hummer方法制備。

根據本發(fā)明的熒光生物檢測系統(tǒng)，其中氧化石墨烯表面(GO)為濃度99-μg/mL。

第三方面，本發(fā)明提供一種Hg²⁺濃度的生物檢測方法，所述方法包括如下步驟：

(1)室溫下，將待測品、熒光生物探針H1、H2和H3的Tris-HCl緩沖溶液以及輔助DNA的Tris-HCl緩沖溶液混合，攪拌時間T1后，加入氧化石墨烯繼續(xù)攪拌時間T2；

(2)測定步驟(1)所得物的熒光發(fā)射光譜強度，根據熒光強度-Hg²⁺濃度標準曲線得到待測樣品的Hg²⁺濃度值。

根據本發(fā)明的生物測試方法，步驟(1)中熒光生物探針H1、H2和H3的使用前加熱至95℃反應5min，然后逐漸冷卻至室溫。根據本發(fā)明的生物測試方法，步驟(1)中熒光生物探針H1、H2和H3的Tris-HCl緩沖溶液濃度為30-200nmol/L。優(yōu)選地，步驟(1)中熒光生物探針H1、H2和H3的Tris-HCl緩沖溶液濃度為50-200nmol/L。進一步優(yōu)選地，步驟(1)中熒光生物探針H1、H2和H3的Tris-HCl緩沖溶液濃度為50nmol/L。

根據本發(fā)明的生物測試方法，步驟(1)中輔助DNA的Tris-HCl緩沖溶液濃度為20-500nmol/L。優(yōu)選地，步驟(1)中輔助DNA的Tris-HCl緩沖溶液濃度為100-500nmol/L。進一步優(yōu)選地，步驟(1)中輔助DNA的Tris-HCl緩沖溶液濃度為100nmol/L。

根據本發(fā)明的生物測試方法，步驟(1)中Tris-HCl緩沖溶液為50mmol/L，pH 8.0，含50mmol/L MgCl₂。

根據本發(fā)明的生物測試方法，步驟(1)中的攪拌時間T1為0.2-5h。優(yōu)選地，步驟(1)中的攪拌時間T1為1-5h。進一步優(yōu)選地，步驟(1)中的攪拌時間T1為1h。

根據本發(fā)明的生物測試方法，步驟(1)中的氧化石墨烯可以采用修飾的Hummer方法制備。

根據本發(fā)明的生物測試方法，步驟(1)中的氧化石墨烯濃度為99μg/mL。

根據本發(fā)明的生物測試方法，步驟(1)中的攪拌時間T2為5-30min。優(yōu)選地，步驟(1)中的攪拌時間T2為5-10min。進一步優(yōu)選地，步驟(1)中的攪拌時間T2為5min。

根據本發(fā)明的生物測試方法，步驟(2)中的檢測條件為FAM的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別設定為492nm和517nm，狹縫寬度為10nm，樣品的熒光發(fā)射光譜用492nm的光激發(fā)，掃描范圍505-600nm，掃描步長為1nm。

在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供的一種Hg²⁺的生物檢測方法，所述方法包括如下步驟：

(1)室溫下，將一系列濃度的Hg²⁺溶液標準品、熒光生物探針H1、H2和H3的Tris-HCl緩沖溶液以及輔助DNA的Tris-HCl緩沖溶液混合，攪拌時間T1后，加入氧化石墨烯繼續(xù)攪拌時間T2；

(2)測定步驟(1)所得物的熒光發(fā)射光譜強度，制備熒光強度-Hg²⁺濃度標準曲線；

(3)室溫下，取待測樣品，重復步驟(1)；

(4)測定步驟(3)所得物的熒光發(fā)射光譜強度，根據熒光強度-Hg²⁺濃度標準曲線得到待測樣品的Hg²⁺濃度值。

在一些具體的實施方案中，本發(fā)明提供的一種Hg²⁺的生物檢測方法，所述方法包括如下步驟：

(1)配制一系列濃度的Hg²⁺溶液標準品，如50pM、100pM、200pM、500pM、800pM、1000pM、1200pM、1500pM、2000pM；

(2)室溫下，分別將步驟(1)配制的Hg²⁺溶液標準品、熒光生物探針H1、H2和H3的Tris-HCl緩沖溶液以及輔助DNA的Tris-HCl緩沖溶液混合，攪拌時間0.5-2h后，加入氧化石墨烯繼續(xù)攪拌時間5-10min，其中，所述的熒光生物探針H1、H2和H3的Tris-HCl緩沖溶液的濃度為30-200nmol/L，所述的輔助DNA的Tris-HCl緩沖溶液的濃度為20-500nmol/L，所述的Tris-HCl緩沖溶液為濃度50mmol/L，pH 8.0，含50mmol/L MgCl₂的溶液，所述的氧化石墨烯通過修飾Hummer方法制備，濃度99μg/mL；

(3)測定步驟(1)所得物的熒光發(fā)射光譜強度，制備熒光強度-Hg²⁺濃度標準曲線；

(4)室溫下，取待測樣品，重復步驟(2)；

(5)測定步驟(4)所得物的熒光發(fā)射光譜強度，根據熒光強度-Hg²⁺濃度標準曲線得到待測樣品的Hg²⁺濃度值。

在另一些具體的實施方案中，本發(fā)明提供的一種Hg²⁺的生物檢測方法，所述方法包括如下步驟：

(1)配制一系列濃度的Hg²⁺溶液標準品，如50pM、100pM、200pM、500pM、800pM、1000pM、1200pM、1500pM、2000pM；

(2)室溫下，分別將步驟(1)配制的Hg²⁺溶液標準品、熒光生物探針H1、H2和H3的Tris-HCl緩沖溶液以及輔助DNA的Tris-HCl緩沖溶液混合，攪拌時間0.5-2h后，加入氧化石墨烯繼續(xù)攪拌時間5-10min，其中，所述的熒光生物探針H1、H2和H3的Tris-HCl緩沖溶液的濃度為50-200nmol/L，所述的輔助DNA的Tris-HCl緩沖溶液的濃度為100-500nmol/L，所述的Tris-HCl緩沖溶液為濃度50mmol/L，pH 8.0，含50mmol/L MgCl₂的溶液，所述的氧化石墨烯通過修飾Hummer方法制備，濃度99μg/mL；

(3)測定步驟(1)所得物的熒光發(fā)射光譜強度，制備熒光強度-Hg²⁺濃度標準曲線；

(4)室溫下，取待測樣品，重復步驟(2)。

(5)測定步驟(4)所得物的熒光發(fā)射光譜強度，根據熒光強度-Hg²⁺濃度標準曲線得到待測樣品的Hg²⁺濃度值。

本發(fā)明提供的熒光生物檢測系統(tǒng)，通過吸附在氧化石墨烯表面而導致熒光猝滅的本發(fā)明的熒光生物探針，在Hg²⁺和輔助DNA的作用下，組裝生成”Y”字形剛性雙鏈DNA(dsDNA)結構，脫離氧化石墨烯表面，恢復熒光信號的原理測定樣品Hg²⁺濃度，基于有效的“打開”檢測模式，靈敏度高，選擇性強，Hg²⁺的線性范圍為50-1200pM，且重復性好，方法簡單可靠，克服了現有的“信號關閉”檢測模式的假陽性、選擇性差等缺陷。此外，相比于基于酶的放大技術，本發(fā)明提供的熒光生物檢測系統(tǒng)采用的催發(fā)發(fā)卡組裝無酶放大技術展現出更高的放大效率。

術語解釋

本發(fā)明所述的“pM”是指濃度單位pmol/L。

附圖說明

圖1是本發(fā)明熒光生物檢測系統(tǒng)檢測Hg²⁺的原理示意圖。

圖2是實施例2中Hg²⁺的熒光發(fā)射光譜。

圖3是實施例3中Hg²⁺的熒光發(fā)射光譜。

圖4是實施例4中Hg²⁺的熒光發(fā)射光譜。

圖5是實施例5中Hg²⁺的熒光發(fā)射光譜。

圖6是熒光生物傳感器的選擇性分析結果。

圖7是50nmol/L H1、H2、H3，100nmol/L輔助DNA1和99μg/mL GO的Tris-HCl緩沖溶液(50mmol/L，pH 8.0，含50mmol/L MgCl₂)中的不同濃度Hg²⁺的熒光發(fā)射光譜。

圖8是圖7中所測得的熒光強度與Hg²⁺濃度關系的曲線圖。

圖9是生物熒光探針H1、H2和H3和輔助DNA的堿基序列。

具體實施方式

以下結合實施例對本發(fā)明進行詳細說明，但并不因此限制本發(fā)明。本文中使用的原料、試劑均可以通過商購或本領域常規(guī)的方法制備。

實施例1 氧化石墨烯(GO)的制備

稱取2g石墨粉末溶于50mL濃硫酸中，攪拌2h；20℃條件下緩慢加入10g高錳酸鉀，然后轉移至35℃水浴中強烈攪拌4h；加入600mL超純水稀釋反應液；逐漸滴加20mL 30％H₂O₂溶液；將反應混合物分別依次用0.1mol/L HCl和超純水洗滌5次，超聲分散1h；以5000rpm的速度離心GO混合物10min，取上清液作為實驗備用GO。

實施例2-5 熒光生物檢測系統(tǒng)的參數測定

步驟(1)：室溫下，將Hg²⁺濃度為1nM的Hg(NO₃)₂溶液、熒光生物探針H1、H2和H3的Tris-HCl緩沖溶液(50mmol/L，pH 8.0，含50mmol/L MgCl₂)以及輔助DNA的Tris-HCl緩沖溶液混合，攪拌時間T1后，加入實施例1制得的氧化石墨烯(99μg/mL)繼續(xù)攪拌5min，其中，熒光生物探針H1、H2和H3在使用前均加熱至95℃反應5min，然后逐漸冷卻至室溫，以便形成發(fā)卡結構；

步驟(2)：測定步驟(1)所得物的熒光發(fā)射光譜強度，對待測品Hg²⁺進行定性和/或定量分析。實驗結果見表1，圖2-圖5。

表1

實驗結果表明，熒光生物探針H1、H2、H3的濃度為30-200nmol/L，輔助DNA的濃度為20-500nmol/L，攪拌時間T1為0.2-5h，的生物檢測系統(tǒng)熒光強度高，靈敏度好。

實施例6 熒光生物傳感器的重復性分析

配制Hg²⁺濃度分別為50、500和1000pmol/L的硝酸汞溶液各六組，分別與H1、H2、H3(濃度均為50nmol/L)和輔助DNA(濃度為100nmol/L)的Tris-HCl緩沖溶液(50mmol/L，pH 8.0，含50mmol/L MgCl₂)混合，室溫下反應1h，

隨后加入99μg/mL GO反應5min，測定其熒光信號。用六次平行試驗的相對標準偏差(RSD)來估算本文提出的傳感器的重復性，實驗結果表明，相對標準偏差分別為10.4％，9.7％和8.8％，因此，本發(fā)明提供的熒光生物檢測系統(tǒng)重復性良好。

實施例7 熒光生物傳感器的選擇性分析

配置三個不同Hg²⁺濃度(50、500、1000pmol/L)的硝酸汞溶液以及濃度為Hg²⁺濃度100倍的干擾離子(Mg²⁺,Ca²⁺,Zn²⁺,Pb²⁺,Cu²⁺,Fe²⁺,Co²⁺,Sn²⁺)，上述不同濃度Hg²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Co²⁺和Sn²⁺溶液分別與H1、H2、H3(均為50nmol/L)和輔助DNA1(100nmol/L)的Tris-HCl緩沖溶液(50mmol/L，pH 8.0，含50mmol/L MgCl₂)混合，室溫下反應1h，隨后加入99μg/mL GO反應5min，測定其熒光信號。

實驗結果見圖6，干擾離子(Mg²⁺,Ca²⁺,Zn²⁺,Pb²⁺,Cu²⁺,Fe²⁺,Co²⁺,Sn²⁺)的熒光信號強度與對應濃度Hg²⁺熒光強度比較，約低1個數量級，因此，本發(fā)明提供的熒光生物檢測系統(tǒng)具高度的靈敏性和選擇性，可以從復雜的金屬離子樣品中高度靈敏和選擇地檢測出Hg²⁺及其濃度。

實施例8 Hg2+濃度的測定

步驟a：配制Hg²⁺濃度為50pM、100pM、200pM、500pM、800pM、1000pM、1200pM、1500pM、2000pM的標準品溶液；

步驟b：分別將不同Hg²⁺濃度的硝酸汞溶液與H1、H2、H3(均為50nmol/L)和輔助DNA1(100nmol/L)的Tris-HCl緩沖溶液(50mmol/L，pH 8.0，含50mmol/L MgCl2)混合，室溫下反應1h，隨后加入99μg/mL GO的Tris-HCl緩沖溶液(50mmol/L，pH 8.0，含50mmol/L MgCl2)反應5min。用熒光光度計檢測熒光發(fā)射光譜，結果見圖7，繪制標準曲線，結果見圖8，在Hg²⁺位于50-1200pmol/L范圍內，該生物傳感器具有很好的線性關系，線性相關系數為R²＝0.995，最低檢出限為25pM(3倍空白樣品標準偏差)，遠遠低于美國環(huán)保署(USEPA)規(guī)定的環(huán)境中Hg²⁺存在的最大水平(10nM)。

步驟c：將待測品用步驟b的生物檢測系統(tǒng)檢測熒光強度，根據標準曲線測定待測品的Hg²⁺濃度。

以上描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中的具體細節(jié)，在本發(fā)明的技術構思范圍內，可以對本發(fā)明的技術方案進行多種變型，這些變型均屬于本發(fā)明的保護范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 重慶工商大學

<120> 一種熒光生物探針及其檢測Hg2+濃度的方法

<130> 2016

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtgccatt cactcaactt catcacacat tcaactgatg aagttgagtg 50

<210> 2

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cactcaactt catcagttga atgtggagtg aatggcacat tcaactgatg 50

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

catcagttga atgtgccatt cactctgatg aagttgagtg aatggcacat 50

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgttgttgtt gtgtgtttgg 20