本發(fā)明屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種三結(jié)構(gòu)域蛋白8基因(The tripartite motif proteins，TRIM8)作為藥物靶標(biāo)在篩選預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物中應(yīng)用。

背景技術(shù)：

非酒精性脂肪肝(NAFLD)是指除酒精和其他明確的損肝因素所致，以彌散性肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)貯積為特征的臨床病理綜合征。疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及其相關(guān)肝硬化和肝細(xì)胞癌^[1-2]。隨著生活水平的提高及飲食結(jié)構(gòu)的改變，NAFLD的發(fā)病率逐年提高，在我國已成為僅次于病毒性肝炎的第二大慢性肝病。Ⅱ型糖尿病(T2DM)又稱非胰島素依賴型糖尿病，是一種以高血糖為表現(xiàn)特征的代謝綜合征^[3]。有研究表明，T2DM患者并發(fā)脂肪肝的患病率為55％，嚴(yán)重者可演變?yōu)楦斡不?sup>[4]。肝臟是調(diào)節(jié)糖代謝的主要器官，所以肝臟病變也可反過來導(dǎo)致或加重糖尿病，由此形成機(jī)體的惡性循環(huán)^[5]。胰島素抵抗架起了T2DM和NAFLD間相互聯(lián)系的病生理橋梁。盡管基礎(chǔ)與臨床對兩者做了大量研究但是具體機(jī)制尚未完全闡述，臨床上仍然缺乏確切有效的治療方法。目前針對非酒精性脂肪肝的治療主要集中在以下幾方面：(1)基礎(chǔ)治療：生活方式干預(yù)是目前唯一被公認(rèn)的NAFLD有效防治方法^[6]。雖然生活方式的干預(yù)在NAFLD患者中取得了明顯的療效，但是患者的依從性不佳的問題是亟待解決的難題；(2)藥物治療：主要包括改善IR類降糖藥物、降脂藥物、抗氧化劑、GLP-1受體激動劑和DPP-4抑制劑及其他保肝抗炎藥。GLP-1受體激動劑、DPP-4抑制劑等可安全有效降糖，肝腎毒性小，給T2DM合并NAFLD患者的防治帶來了新希望，但是該類藥物上市時間尚短，其遠(yuǎn)期的療效和安全性以及對脂肪肝組織學(xué)的改善等問題尚待更多的詢證醫(yī)學(xué)證據(jù)加以闡明；(3)外科手術(shù)：減重手術(shù)成為潛在的治療NAFLD方法，對于那些病態(tài)肥胖的患者，減重手術(shù)是有效的，并可減低肥胖相關(guān)疾病的發(fā)病率和病死率，但手術(shù)的長期療效、術(shù)后的慢性并發(fā)癥等潛在風(fēng)險尚待進(jìn)一步的研究加以評價。生活方式的干預(yù)同樣是T2DM防治的基礎(chǔ)，傳統(tǒng)抗糖尿病藥物為目前T2DM患者的臨床治療主要用藥，但是這些藥物均存在不同程度的不良反應(yīng)，如引發(fā)低血糖、胃腸道不適、肥胖等。對于糖尿病的治療藥物研究，也從對傳統(tǒng)機(jī)制的藥物研究過渡到對具有新靶點和新作用機(jī)制的藥物研究。其中基于這些新靶點設(shè)計的糖尿病治療新藥有些已上市，且獲得良好的降糖效果，如GLP-1受體激動劑、DPP-4抑制劑及SGLT-2抑制劑等，但大部分藥物仍處于臨床或臨床前研究階段，其療效和安全性還有待進(jìn)一步臨床驗證。

TRIM(The tripartite motif proteins)超家族，屬于最突出的E3泛素化連接酶家族一種，存在于所有多細(xì)胞的動物體內(nèi)，是包含了較多蛋白的一個相當(dāng)大的家族。它們的命名主要來源于N端特征性的三種主體結(jié)構(gòu)：高度保守RING序列的結(jié)構(gòu)域，緊接著的一個或者兩個B-BOX結(jié)構(gòu)域和一個coiled-coil(CC)結(jié)構(gòu)域。這種主體結(jié)構(gòu)也經(jīng)常被稱為RBCC結(jié)構(gòu)^[7-10]。TRIM蛋白涉及到許多不同的功能，例如泛素連接酶的功能，小泛素樣調(diào)節(jié)功能等等，已被證實在許多生物過程中發(fā)揮著不同作用，比如細(xì)胞凋亡，細(xì)胞分化，腫瘤發(fā)生以及免疫反應(yīng)等^[11]。TRIM8是TRIM家族中的一員，RING結(jié)構(gòu)的存在決定了它同樣具有E3泛素化連接酶的作用?，F(xiàn)階段對TRIM8的研究主要集中在腫瘤，免疫及炎癥方面。研究發(fā)現(xiàn)它可對抗細(xì)胞增殖，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，促進(jìn)炎癥因子的釋放從而調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)等等。Mariano F等發(fā)現(xiàn)TRIM8可以調(diào)控P53活性促進(jìn)細(xì)胞周期停滯，抑制細(xì)胞增殖從而加強(qiáng)P53的腫瘤抑制活性^[12]。

參考文獻(xiàn)：

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技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于提供TRIM8基因的表達(dá)與脂肪肝、Ⅱ型糖尿病之間的相互關(guān)系，提供一個用于治療脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的靶基因TRIM8的新用途，進(jìn)而把TRIM8基因應(yīng)用于脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的治療。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

本發(fā)明以野生型C57小鼠(WT)與TRIM8基因敲除小鼠(TRIM8-KO)為實驗對象，通過高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型(diet induced obesity，DIO)研究TRIM8基因的功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與WT小鼠對比，TRIM8-KO小鼠其體重于第4、6、8周明顯低于同種飼料飼養(yǎng)的WT小鼠，并且TRIM8-KO小鼠的空腹血糖水平低于對照組WT小鼠。進(jìn)一步通過腹腔注射葡萄糖耐量實驗發(fā)現(xiàn)TRIM8-KO小鼠對葡萄糖的耐受能力明顯加強(qiáng)。從小鼠肝臟重量及肝臟/體重比以及脂質(zhì)成分病理染色結(jié)果等均說明HFD組(High fat diet，高脂飲食)的TRIM8-KO小鼠脂肪肝病變明顯得到改善，脂質(zhì)蓄積顯著減少。這表明TRIM8基因敲除可以降低脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的發(fā)生。

因此，TRIM8基因可作為藥物靶點，構(gòu)建TRIM8基因過表達(dá)的體外細(xì)胞模型或動物模型，用于篩選預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物；TRIM8基因也可作為基因治療中的靶基因，設(shè)計并制備預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物和/或生物學(xué)試劑，通過基因工程技術(shù)達(dá)到預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的目的。例如以TRIM8為靶基因，設(shè)計可干擾TRIM8表達(dá)的雙鏈siRNA，通過化學(xué)方法合成以后，注射入人體通過RNA干擾的方法使TRIM8基因沉默來治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿?。贿€可以設(shè)計并構(gòu)建TRIM8的突變體，注射后進(jìn)入細(xì)胞，競爭TRIM8原形的作用底物，從而抑制TRIM8的功能，起到治療目的；此外，還可以以TRIM8為靶點設(shè)計小分子化合物抑制劑，利用TRIM8基因過表達(dá)的體外細(xì)胞模型或動物模型，通過篩選，發(fā)現(xiàn)其中能夠特異性抑制TRIM8的分子，從而為脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的治療提供新的治療性分子。

針對TRIM8的上述功能，提供TRIM8作為藥物靶標(biāo)在篩選保護(hù)神肝臟及糖代謝的藥物中的應(yīng)用。

針對TRIM8的上述功能，提供TRIM8作為藥物靶標(biāo)在篩選預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物中的應(yīng)用。

針對TRIM8的上述功能，提供TRIM8的抑制劑在制備預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物中的應(yīng)用。

一種預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物，包含TRIM8的抑制劑。

所述的TRIM8的抑制劑優(yōu)選為TRIM8基因的siRNA、TRIM8基因的RNA干擾載體，TRIM8的抗體及其他能夠抑制TRIM8表達(dá)的抑制劑。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：

(1)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)TRIM8的新功能，即TRIM8具有惡化脂肪肝和Ⅱ型糖尿病的作用。

(2)基于TRIM8在惡化脂肪肝和Ⅱ型糖尿病疾病中的功能，其為研制預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物提供靶標(biāo)。

(3)TRIM8的抑制劑可用于制備預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物。

附圖說明

圖1是WT和TRIM8-KO小鼠的體重和空腹血糖結(jié)果圖；

A為小鼠體重結(jié)果圖，B為空腹血糖水平統(tǒng)計圖，C為空腹血清胰島素水平圖(*：p＜0.05vs WT NC組，**：p＜0.01vs WT NC組，#：p＜0.05vs WT HFD組，##：p＜0.01vs WT HFD組)。

圖2是WT和TRIM8-KO小鼠通過腹腔注射葡萄糖耐量結(jié)果圖；

A為通過腹腔注射葡萄糖后不同時間點小鼠血糖水平統(tǒng)計圖，B為各組小鼠糖耐量曲線下面積(area under the curve，AUC)比較圖(*：p＜0.05vs WT NC組，**：p＜0.01vs WT NC組，#：p＜0.05vs WT HFD組，##：p＜0.01vs WT HFD組)。

圖3是TRIM8-KO和WT小鼠的肝臟重量結(jié)果圖；

A為肝臟重量統(tǒng)計柱狀圖，B為肝臟重量與小鼠本身體重比值統(tǒng)計柱狀圖(*：p＜0.05vs WT NC組，**：p＜0.01vs WT NC組，#：p＜0.05vs WT HFD組，##：p＜0.01vs WT HFD組)。

圖4是TRIM8-KO和WT小鼠的肝臟脂質(zhì)結(jié)果圖；

分別為肝臟膽固醇，肝臟甘油三酯及肝臟游離脂肪酸統(tǒng)計柱狀圖(*：p＜0.05vs WT NC組，**：p＜0.01vs WT NC組，#：p＜0.05vs WT HFD組，##：p＜0.01vs WT HFD組)。

具體實施方式

通過以下詳細(xì)說明結(jié)合附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點和優(yōu)點。所提供的實施例僅是對本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。

實驗用動物及飼養(yǎng)：

實驗動物種屬，性別，周齡及來源：C57BL/6(WT)小鼠和TRIM8-KO小鼠，雄性，8周齡。C57BL/6小鼠購自北京華阜康生物科技有限公司；TRIM8基因敲除小鼠的構(gòu)建過程如下：

1、全身性TRIM8基因敲除小鼠的構(gòu)建：

利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建全身性TRIM8基因敲除小鼠。首先，通過在線CRISPR設(shè)計工具(http://crispr.mit.edu)預(yù)測小鼠TRIM8的引導(dǎo)序列，設(shè)計2條單鏈oligo：

oligo1：TAGGCCGGTTCCACGAAAACGTGC，

oligo2：AAACGCACGTTTTCGTGGAACCGG。

oligo1和oligo2退火形成雙鏈DNA，將雙鏈DNA連入經(jīng)BsaI限制性內(nèi)切酶酶切的pUC57-sgRNA(Addgene 51132)構(gòu)建sgRNA表達(dá)載體。

以上述構(gòu)建的sgRNA表達(dá)載體為模板，使用如下引物通過PCR擴(kuò)增含有T7啟動子及引導(dǎo)序列的DNA片段：

Forward primer：GATCCCTAATACGACTCACTATAG，

Reverse primer：AAAAAAAGCACCGACTCGGT。

以所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為模板使用MEGAshortscript Kit(Ambion，AM1354)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；Cas9質(zhì)粒(Addgene 44758)通過T7Ultra kit(Ambion，Am1345)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。將轉(zhuǎn)錄得到的Cas9和引導(dǎo)序列RNA的mRNA使用miRNeasy Micro Kit(Qiaen，217084)純化后，通過FemtoJet 5247顯微注射系統(tǒng)注射入野生型C57BL/6小鼠的單細(xì)胞受精卵內(nèi)。選取經(jīng)顯微注射后存活的受精卵，將其移植到健康雌鼠輸卵管中，經(jīng)過19天妊娠之后得到F0代小鼠。

F1代及F2代小鼠通過PCR鑒定，野生型小鼠包含一段長295bp的DNA序列，而突變小鼠(TRIM8基因敲除小鼠)含有287bp的DNA序列，最終蛋白產(chǎn)物通過western blot進(jìn)行檢測鑒定。其中，PCR鑒定引物如下：

TRIM8-F：5’-TGTACCAGACGGATCCCCA-3’，

TRIM8-R：5’-TCCACGATGTTGGTGAGCTT-3’。

實驗所用小鼠為突變體純合子。

實驗動物飼料配方：高脂飼料(HFD)(購自北京華阜康生物科技有限公司，貨號D12942)：熱量百分比：蛋白質(zhì):20％；碳水化合物:20％；脂肪:60％，總的熱量質(zhì)量比:5.24kcal/g。低脂飼料(NC)(購自北京華阜康生物科技有限公司，貨號D12450B)：熱量百分比：蛋白質(zhì):20％；碳水化合物:70％；脂肪:10％，總的熱量質(zhì)量比:3.85kcal/g。

動物飼養(yǎng)及環(huán)境條件：所有的實驗小鼠均飼養(yǎng)在武漢大學(xué)SPF級動物房。每12小時交替照明，溫度24±2℃，濕度40％-70％，小鼠自由飲水進(jìn)食。

【實施例1】小鼠脂肪肝、Ⅱ型糖尿病模型(diet induced obesity，DIO)獲得

(1)實驗動物分組：選用8周齡，雄性，WT小鼠和TRIM8-KO小鼠，分別給與兩種特殊飼料D12942高脂飼料(High fat diet，HFD)和D12450B低脂飼料(Normal chow，NC)飼養(yǎng)，即WT NC組，KO NC組，WT HFD組，KO HFD組共4個組別。

(2)模型通過高脂飼料誘導(dǎo)操作流程：

采用WT和KO小鼠，建立DIO模型，進(jìn)行表型相關(guān)分析，明確XX基因?qū)χ靖?、Ⅱ型糖尿病發(fā)揮的作用。選用8周齡，雄性，WT小鼠和XX-KO(TG)小鼠，分別給與兩種特殊飼料D12942高脂飼料(Highfat diet，HFD)和D12450B低脂飼料(Normal chow，NC)飼養(yǎng)，即WT NC組，KO NC組，WT HFD組，KO HFD組共4個組別。每周均詳細(xì)記錄小鼠攝食量，小鼠空腹體重和空腹血糖每隔2周檢測1次。實驗第12周，進(jìn)行腹腔注射葡萄糖實驗(IPGTT)，以評價小鼠機(jī)體對葡萄糖耐受能力。第16周終末取材，取出小鼠肝臟拍照，然后一部分置于甲醛溶液中固定或O.C.T冰凍切片包埋劑(Tissue Freezing Medium)包埋作為病理分析用。

【實施例2】小鼠空腹體重、血糖水平及血清胰島素水平的測定

(1)小鼠空腹體重檢測

①禁食：上午8:00將待實驗小鼠禁食(不禁水)，下午2:00開始實驗操作。

②稱重：分別在第0周、2周、4周、6周、8周、10周、12周稱重，將一塑料小桶放在動態(tài)電子天平上，抓起小鼠，放入稱量小桶中，測量體重記錄數(shù)據(jù)。飼料量檢測：待稱體重操作完成后，給小鼠加飼料，并在動態(tài)電子天平上記錄小鼠的飼料量。

(2)空腹血糖水平檢測實驗

將所有待實驗的小鼠從上午8:00至下午2:00間禁食(不禁水)，即禁食6小時后開始實驗操作。

①血糖儀準(zhǔn)備：檢查血糖儀(美國強(qiáng)生公司，ONETOUCH)電池，按右側(cè)開關(guān)，將試紙正確放入左側(cè)插槽，屏幕顯示與血糖試紙條相應(yīng)代碼的數(shù)字，隨后顯示滴血圖案，提示血糖儀進(jìn)入待測狀態(tài)。

②固定小鼠：右手抓鼠尾，左手持一塊毛巾，將毛巾對折，用拇指和食指捏住毛巾對折處，將鼠頭部和身體包入手掌內(nèi)的毛巾，拇指和食指在將鼠尾根部固定。

③剪尾：眼科剪迅速在距鼠尾末端0.1-0.2cm處剪下鼠尾，待血滴自行流出。

④血糖檢測：將血糖儀試紙邊緣輕觸血滴，血液浸入試紙，血糖儀倒計時5秒顯示讀數(shù)。

(3)空腹血清胰島素水平檢測

①試劑及耗材準(zhǔn)備：

樣品(冰凍血清)，去離子水一瓶(1000mL)，小鼠胰島素ELISA試劑盒(Millipore，貨號EZRMI-13K)含胰島素ELISA酶標(biāo)板(1塊，儲存于2-8℃)、酶標(biāo)板封口膜(1片)、10×HRP洗脫緩沖液(2瓶，每瓶50mL,使用前使用去離子水稀釋10倍)、胰島素標(biāo)準(zhǔn)品(濃度為：0.2，0.5，1，2，5，10ng/mL，每種量為0.25mL)、胰島素質(zhì)量對照buffer(0.25mL)、基質(zhì)溶液(0.5mL)、分析緩沖液(20mL)、胰島素檢測抗體(10mL)、酶溶液(12mL)、底物(12mL)、終止溶液(12mL)。

②實驗步驟：

A.確認(rèn)溫箱開啟，熟悉酶標(biāo)儀操作，將待檢測的血清標(biāo)本從-80℃冰箱中找出；

B.將待檢測的血清在室溫下復(fù)融至液態(tài)，準(zhǔn)備檢測；

C.稀釋10×HRP洗脫緩沖液，每瓶用450mL去離子水稀釋；

D.將取下來的酶標(biāo)板條安裝到一個空的酶標(biāo)板架上300μL TBS洗脫緩沖液洗滌3次。洗滌完畢將酶標(biāo)板倒扣在吸水紙上，輕輕拍幾次，將殘液吸凈(注意：在進(jìn)行下一步之前避免酶標(biāo)板干燥，將未使用的酶標(biāo)板條密封在裝酶標(biāo)板的袋子里，2-8℃保存)；

E.將10μL分析緩沖液加入非特異性孔(NSB)和所有的樣品孔；

F.在NSB孔，標(biāo)準(zhǔn)孔和對照孔加入10μL基質(zhì)溶液；

G.在預(yù)設(shè)的標(biāo)準(zhǔn)孔里加入10μL胰島素標(biāo)準(zhǔn)品；

H.在預(yù)設(shè)的質(zhì)量對照孔里加入胰島素質(zhì)量對照buffer1和2各10μL；

I.在每個樣品孔里加入10μL樣品；

J.每孔中加入80μL胰島素檢測抗體(以上所有加樣步驟在1個小時之內(nèi)完成，室溫孵育2小時，在此期間將酶標(biāo)板至于酶標(biāo)板振蕩器上，調(diào)整轉(zhuǎn)速為400-500rpm震蕩)；

K.取下封口膜，棄去液體，在吸水紙上輕輕拍打，吸凈殘液；

L.使用洗脫緩沖液洗板3次，每次300μL，每次洗板完畢都用吸水紙吸去殘液；

M.每孔加入酶溶液100μL，封口膜封口后，室溫下酶標(biāo)板振蕩器震蕩30分鐘，取下封口膜，棄去溶液，拍打吸干；

N.使用洗脫緩沖液洗板6次，每次300μL，每次洗板完畢都用吸水紙吸去殘液加入100μL底物溶液，酶標(biāo)板震蕩器上震蕩15分鐘左右。此時可以看到標(biāo)準(zhǔn)孔出現(xiàn)深淺漸變的藍(lán)色。(注意：在這一步，藍(lán)色的出現(xiàn)和進(jìn)展可能明顯快于15分鐘，也可能明顯慢于15分鐘，取決于室溫溫度。請通過視覺來判斷孵育的時間?；蛘呤褂妹笜?biāo)儀370nm波長檢測，讀數(shù)在1.2到1.8之間，則為合適的孵育時間)

O.加入100μL終止溶液，震蕩酶標(biāo)板確保充分的混勻，此時藍(lán)色變?yōu)辄S色。5分鐘內(nèi)在450nm和590nm處分別讀取吸光值。根據(jù)測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過吸光值換算出濃度。、

Ⅱ型糖尿病損傷嚴(yán)重程度的評估指標(biāo)主要包括體重、血糖等水平，這些指標(biāo)均與糖尿病嚴(yán)重程度正相關(guān)。體重、血糖、血清胰島素水平變化結(jié)果如圖1所示，WT小鼠在給與HFD飼料飼養(yǎng)后，從第4周開始體重明顯高于其NC飼料組，給與TRIM8-KO小鼠12周的HFD飼料和NC飼料飼養(yǎng)后，從第4周開始HFD組的TRIM8-KO小鼠體重明顯低于HFD組的WT小鼠體重，一直持續(xù)到第8周(見圖1A)；經(jīng)空腹血糖及血清胰島素水平檢測發(fā)現(xiàn)在HFD組的小鼠從第2周開始，空腹血糖及血清胰島素水平明顯較相應(yīng)NC對照組升高，HFD組的TRIM8-KO小鼠空腹血糖及血清胰島素水平明顯低于WT組小鼠空腹血糖水平(見圖1B、C)。表明TRIM8基因敲除后顯著改善了小鼠在HFD飼養(yǎng)狀態(tài)下的糖代謝穩(wěn)態(tài)，TRIM8基因敲出能顯著提高小鼠的糖代謝能力，表明TRIM8基因可促進(jìn)高脂誘導(dǎo)引起的Ⅱ型糖尿病的發(fā)生發(fā)展。

【實施例3】葡萄糖耐量實驗(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)

實驗第12周，進(jìn)行腹腔注射葡萄糖實驗(IPGTT)，以評價小鼠機(jī)體對糖耐受能力。

(1)在測血糖之前，先測量小鼠的空腹體重，根據(jù)10μL/g計算葡萄糖的注射體積。

(2)先檢測葡糖糖注射前即0分鐘時空腹血糖，在檢測完畢后迅速經(jīng)腹腔注射葡萄糖液。

(3)腹腔注射操作方法：①固定小鼠；抓起小鼠，左手的小指和無名指抓小鼠的尾巴，另三手指抓住小鼠的頸部，使小鼠的頭部向下，將小鼠腹部充分暴露。②進(jìn)針定位及注射：從腹部一側(cè)進(jìn)針右手持注射器，將尖端與小鼠腹部成45°的夾角，進(jìn)針，回抽，注射時針頭在腹部皮下穿行一小段距離，穿過腹中線后在腹部另一側(cè)進(jìn)入腹腔，注射完藥物后，緩緩拔出針頭，并輕微旋轉(zhuǎn)針頭，防止漏液。

(4)分別于腹腔注射后15分、30分、60分、120分鐘時間點剪尾測小鼠血糖值，并記錄血糖數(shù)值和檢測時間。

進(jìn)一步通過腹腔注射葡萄糖耐量實驗(intraperitoneal glucose tolerancetests，IPGTT)來評估各組小鼠對葡萄糖的處理能力，在實驗第12周，通過注射1.0g/kg體重的葡萄糖后，HFD組的WT小鼠和TRIM8-KO小鼠血糖水平在15分鐘時間點劇增達(dá)到峰值，隨著時間推移至注射后30分鐘，兩組小鼠血糖水平稍微下降，但仍處于高于空腹血糖水平(0分鐘時血糖)，在2小時時恢復(fù)至空腹血糖水平，且TRIM8-KO小鼠血糖水平從15分鐘至2小時一直處于低于WT小鼠的血糖水平(圖2A)。比較各組小鼠血糖曲線下面積(area under the curve，AUC)，發(fā)現(xiàn)WT小鼠HFD組的AUC顯著高于NC組，而TRIM8-KO HFD組的AUC顯著低于WT HFD組的AUC(圖2B)，表明TRIM8基因不利于維持糖代謝的穩(wěn)態(tài)。

【實施例4】肝臟大體外觀及肝臟組織脂質(zhì)成分測定

(1)終末肝臟組織取材

1)小鼠稱重后，迅速脫頸處死。仰臥固定小鼠，用蒸餾水將小鼠胸部，腹部毛發(fā)潤濕。

2)用一鑷子鉗夾小鼠腹部正中皮膚，沿腹部正中向頭部剪開皮膚至劍突下，向尾端剪開皮膚，逐層暴露皮下筋膜，肌肉等，打開腹腔，充分暴露各臟器。

3)迅速找到并取下小鼠的肝臟，將取下的肝臟標(biāo)本置于滅菌紗布上，拭干肝臟表面上殘留血液，將肝臟置于無菌培養(yǎng)皿中，迅速稱重。

(2)小鼠肝組織脂質(zhì)檢測

①從-80℃冰箱取出肝臟組織樣品，稱量50mg組織，使用研磨器將肝臟組織研磨成粉末狀，溶于1mLPBS中，混勻后再與1mL氯仿/甲醇(2:1)共孵育過夜。

②以12000g高速離心15min后，收集管底脂質(zhì)層物質(zhì)，風(fēng)干，以去除水分。

③將分離出的脂質(zhì)層物質(zhì)溶于200μL含1％Triton X-100的PBS溶液中，仔細(xì)吹吸混勻。

④開啟電腦labman軟件，打印機(jī)，再開啟生化分析儀；

⑤選擇并清洗檢測探針、比色杯等，保證探針通暢、比色杯無雜質(zhì)附著，吸光值在設(shè)定的參考范圍；

⑥在labman軟件上檢查所需檢測指標(biāo)試劑是否足夠，設(shè)定檢測指標(biāo)和檢測順序等。

⑦將制得的混勻液上機(jī)檢測，分析。

圖3結(jié)果表明，在HFD組的TRIM8-KO小鼠無論肝臟重量還是肝臟重量與小鼠本身體重比值均較HFD組的WT小鼠低。進(jìn)一步通過肝臟脂質(zhì)對比后發(fā)現(xiàn)無論是肝臟膽固醇，肝臟甘油三酯還是肝臟游離脂肪酸，HFD組的TRIM8-KO小鼠均較HFD組的WT小鼠降低(如圖4A-C)。這些結(jié)果說明TRIM8基因敲除小鼠的脂肪肝明顯改善。

上述結(jié)果顯示TRIM8-KO小鼠在HFD的誘導(dǎo)下發(fā)生的Ⅱ型糖尿病和脂肪肝病變顯著減低。這些結(jié)果表明TRIM8基因敲出對改善Ⅱ型糖尿病和脂肪肝具有顯著的作用。本發(fā)明結(jié)果說明TRIM8基因在脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病模型中有著重要的惡化作用。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 武漢大學(xué)

<120> 三結(jié)構(gòu)域蛋白8在治療非酒精性脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的功能和應(yīng)用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> oligo1

<400> 1

taggccggtt ccacgaaaac gtgc 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> oligo2

<400> 2

aaacgcacgt tttcgtggaa ccgg 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增含有T7啟動子及引導(dǎo)序列的DNA片段上游引物

<400> 3

gatccctaat acgactcact atag 24

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增含有T7啟動子及引導(dǎo)序列的DNA片段下游引物

<400> 4

aaaaaaagca ccgactcggt 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> TRIM8-F

<400> 5

tgtaccagac ggatcccca 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> TRIM8-R

<400> 6

tccacgatgt tggtgagctt 20