本發(fā)明涉及一種熒光定量PCR反應(yīng)液及方法，尤其涉及一種應(yīng)用于Taqman-MGB探針的熒光定量PCR反應(yīng)液及方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)方法領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

Taqman熒光定量PCR技術(shù)擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的Taqman熒光探針，也稱水解探針，為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。常用的熒光淬滅基團(tuán)有TAMRA，BHQ1和MGB等。MGB(Minor Groove Binder)是小溝結(jié)合物，其本身是一個(gè)化學(xué)基團(tuán)，可以與探針-模板DNA雙鏈中的小溝進(jìn)一步形成氫鍵，從而提高Taqman-MGB探針與模板的結(jié)合穩(wěn)定性。

Taqman-MGB探針具有許多特殊、優(yōu)良的性質(zhì)：1、Taqman-MGB探針比普通Taqman探針(比如Taqman-TAMRA探針和Taqman-BHQ1探針，一般長(zhǎng)度為25-35bp)更短，一般為15bp左右；2、MGB可以提高探針Tm值10℃左右，提高配對(duì)與非配對(duì)模板間的Tm值差異；3、MGB探針特異性更高，可區(qū)分模板一個(gè)堿基的差異；4、MGB為不發(fā)光的熒光基團(tuán)，并且與報(bào)告基團(tuán)的空間位置更接近，可以使實(shí)驗(yàn)的背景更低，信噪比更高，結(jié)果更精確，靈敏度更高。

Taqman-MGB探針的特點(diǎn)使其多應(yīng)用于普通Taqman探針不能勝任的領(lǐng)域，比如SNP分型、已知點(diǎn)突變的突變型和雜合子基因的檢測(cè)以及microRNA的檢測(cè)等。

但現(xiàn)有技術(shù)的Taqman-MGB探針存在兩個(gè)缺陷：一是MGB探針酶切降解的過程中，需要用5'-3'外切酶高活性的DNA聚合酶，這種高外切酶活性的DNA聚合酶被少數(shù)廠家壟斷，成本很高；二是Taqman-MGB探針的熒光定量PCR反應(yīng)液需要專用的反應(yīng)液。

具體地，由于MGB具有與探針-模板DNA雙鏈中的小溝形成氫鍵的特點(diǎn)，具有普通外切酶活性的DNA聚合酶很難將MGB探針酶切降解。如果要水解MGB探針，需要5'-3'外切酶高活性的DNA聚合酶，而這種高外切酶活性的DNA聚合酶的生產(chǎn)技術(shù)一般為國(guó)外少數(shù)廠家壟斷，比如ABI公司(Life公司)。

由于Taqman-MGB探針在識(shí)別模板的過程中影響因素較多，普通Taqman探針的熒光定量PCR反應(yīng)液并不適用于Taqman-MGB探針?，F(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)水解Taqman-MGB探針專用反應(yīng)液的廠家只有1-2家，這些產(chǎn)品的價(jià)格昂貴，且無論在穩(wěn)定性、擴(kuò)增效率及檢測(cè)靈敏度上都并不完善。

因此，適用MGB的DNA聚合酶和反應(yīng)液限制了Taqman-MGB探針的應(yīng)用和推廣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明第一方面的目的是提供一種熒光定量PCR反應(yīng)液，包括具有外切酶活性的DNA聚合酶、DNA聚合酶增強(qiáng)劑、DNA聚合酶增強(qiáng)劑的保護(hù)劑、基礎(chǔ)熒光穩(wěn)定劑。具體為：

所述熒光定量PCR反應(yīng)液的成分為：10～50mM pH值8.0～8.9的Tris-HCl，10～60mM的KCl，2～5mM的MgCl₂，100～300μM的dNTP，0.025～0.1U/μL的DNA聚合酶，0.5×ROX，5～10％的基礎(chǔ)熒光穩(wěn)定劑，1～3％的DNA聚合酶增強(qiáng)劑，10～30％的DNA聚合酶增強(qiáng)劑的保護(hù)劑。

所述熒光定量PCR反應(yīng)液不限于以上成分，還可包括引物、模板、探針、水等用于PCR反應(yīng)的成分。

所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物與所述下游引物摩爾比為1:1，濃度為8～12μM，優(yōu)選10μM。所述探針為Taqman-MGB探針。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，Tris-HCl、KCl、MgCl₂、dNTP、DNA聚合酶和ROX可以是Buffer緩沖液，所述Buffer緩沖液可以是5×PCR Buffer、pH值為7.8～9.0。

本發(fā)明熒光定量PCR反應(yīng)液中涉及的百分比為體積百分比或質(zhì)量體積百分比，當(dāng)反應(yīng)液中的成分為液體時(shí)為體積百分比，當(dāng)反應(yīng)液中的成分為固體物質(zhì)時(shí)為質(zhì)量體積百分比。

所述DNA聚合酶為普通耐熱DNA聚合酶，具有5'-3'聚合酶活性和/或5'-3'外切酶活性。進(jìn)一步地，所述DNA聚合酶為具有較高的5'-3'外切酶活性的DNA聚合酶，優(yōu)選Takara EX Taq^TM HS酶。

所述基礎(chǔ)熒光穩(wěn)定劑選自NP-40、TritonX-100、NaCl、KCl中的一種或多種組合，所述NP-40和/或TritonX-100在所述基礎(chǔ)熒光穩(wěn)定劑中的體積百分比為16.7％～33.3％，所述NaCl和/或KCl的摩爾濃度為10～25mM。其主要作用為穩(wěn)定基礎(chǔ)熒光值，使熒光值在呈指數(shù)上升之前保持穩(wěn)定。

所述DNA聚合酶增強(qiáng)劑選自牛血清蛋白、二甲亞砜、甲酰胺、亞精胺、環(huán)糊精、甜菜堿中的一種或多種組合，所述牛血清蛋白在所述DNA聚合酶增強(qiáng)劑中的質(zhì)量體積比為0.5％～1％，所述亞精胺和或環(huán)糊精的摩爾濃度為50～150mM，所述甜菜堿和或甲酰胺和/或二甲亞砜的摩爾濃度為1.5～2.5M。所述DNA聚合酶增強(qiáng)劑具有明顯的提高DNA聚合酶的5'-3'外切酶活性的作用，并且具有促進(jìn)MGB與DNA小溝結(jié)合的能力，同時(shí)具有非常明顯的FAM、HEX和VIC熒光增強(qiáng)效果。使普通DNA聚合酶能夠水解Taqman-MGB探針。

所述DNA聚合酶增強(qiáng)劑的保護(hù)劑選自明膠、透明質(zhì)酸、二硫蘇糖醇中的一種或多種組合，所述明膠和/或透明質(zhì)酸在所述DNA聚合酶增強(qiáng)劑的保護(hù)劑中的質(zhì)量體積比為1.2％～3.6％，所述二硫蘇糖醇的摩爾濃度為0.01～0.05mM。所述DNA聚合酶增強(qiáng)劑的保護(hù)劑有效的延長(zhǎng)和穩(wěn)定了DNA聚合酶增強(qiáng)劑的活性。

所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物與所述下游引物摩爾比為1:1，濃度為8～12μM，優(yōu)選10μM。所述探針為Taqman-MGB探針。

進(jìn)一步地，所述反應(yīng)液的成分為：10mM pH值8.5的Tris-HCl，50mM的KCl，4mM的MgCl₂，200μM的dNTP，0.05U/μL的DNA聚合酶，0.5×ROX dye II，6％的基礎(chǔ)熒光穩(wěn)定劑，2％的DNA聚合酶增強(qiáng)劑，20％的DNA聚合酶增強(qiáng)劑的保護(hù)劑。

本發(fā)明第二方面的目的是提供一種熒光定量PCR反應(yīng)液的應(yīng)用方法，步驟如下：

(1)模板的制備：通過磁珠血漿/血清游離DNA/RNA提取試劑盒從混合血漿中提取血漿游離RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成得到混合血漿逆轉(zhuǎn)錄的cDNA。

(2)反應(yīng)液的制備：

按照本發(fā)明第一方面目的提供的一種熒光定量PCR反應(yīng)液的配方進(jìn)行反應(yīng)液制備。即，至少包含如下成分：10～50mM pH值8.0～8.9的Tris-HCl，10～60mM的KCl，2～5mM的MgCl₂，100～300μM的dNTP，0.025～0.1U/μL的DNA聚合酶，0.5×ROX，5～10％的基礎(chǔ)熒光穩(wěn)定劑、1～3％的DNA聚合酶增強(qiáng)劑、10～30％的DNA聚合酶增強(qiáng)劑的保護(hù)劑。

(3)反應(yīng)：

步驟(2)制備的反應(yīng)液在熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，模板選用步驟(1)制備的混合血漿逆轉(zhuǎn)錄的cDNA，PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火34秒，共40個(gè)循環(huán)。

本發(fā)明第三方面的目的是提供一種適用于Taqman-MGB探針的熒光定量PCR試劑盒，基于本發(fā)明涉及的一種熒光定量PCR反應(yīng)液。

本發(fā)明涉及的一種熒光定量PCR反應(yīng)液(以下簡(jiǎn)稱反應(yīng)液)，包含基礎(chǔ)熒光穩(wěn)定劑、DNA聚合酶增強(qiáng)劑以及保護(hù)劑。DNA聚合酶增強(qiáng)劑具有明顯的提高DNA聚合酶5'-3'外切酶活性的作用，使普通DNA聚合酶能夠水解Taqman-MGB探針。

本發(fā)明涉及的反應(yīng)液不僅適用于FAM、HEX和VIC標(biāo)記的Taqman-MGB探針，還同時(shí)適用于FAM、HEX和VIC標(biāo)記的Taqman-BHQ1和/或TAMARA探針，具有廣泛的應(yīng)用前景和巨大的市場(chǎng)推廣價(jià)值。

本發(fā)明含增強(qiáng)劑的一種熒光定量PCR反應(yīng)液擴(kuò)增樣本的Ct值較低；含基礎(chǔ)熒光穩(wěn)定劑的反應(yīng)液PCR擴(kuò)增曲線較平，穩(wěn)定基礎(chǔ)熒光值，提高擴(kuò)增效率；含保護(hù)劑的反應(yīng)液在-20℃環(huán)境下保存6個(gè)月后仍然具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，Ct值基本保持不變，延長(zhǎng)反應(yīng)液的有效期。

通過本發(fā)明涉及的反應(yīng)液與現(xiàn)有技術(shù)反應(yīng)液在Taqman-MGB探針應(yīng)用中的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明涉及的反應(yīng)液與現(xiàn)有技術(shù)反應(yīng)液的Ct值之差高達(dá)4.994，即本發(fā)明反應(yīng)液擴(kuò)增同樣一份臨床樣本的結(jié)果是現(xiàn)有技術(shù)反應(yīng)液的31.87倍，本發(fā)明涉及的反應(yīng)液的靈敏度明顯優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)，具有非常廣闊的市場(chǎng)前景。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中反應(yīng)液體系1與反應(yīng)液體系2對(duì)microRNA-21的進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增曲線；

圖2為實(shí)施例2中反應(yīng)液體系1與反應(yīng)液體系3對(duì)microRNA-21的進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增曲線；

圖3為實(shí)施例3中反應(yīng)液體系1與反應(yīng)液體系4在-20℃的條件下保存15天后，對(duì)microRNA-21的進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增曲線；

圖4為實(shí)施例4中反應(yīng)液體系1與商品化體系1對(duì)microRNA-21的進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增曲線；

圖5為實(shí)施例6中對(duì)反應(yīng)液體系1與反應(yīng)液體系4連續(xù)監(jiān)測(cè)micriRNA-21的Ct值結(jié)果趨勢(shì)圖；

圖6為實(shí)施例7中商品化反應(yīng)體系1的microRNA-21標(biāo)準(zhǔn)曲線1；

圖7為實(shí)施例7中商品化反應(yīng)體系1的microRNA-21標(biāo)準(zhǔn)曲線2；

圖8為實(shí)施例7中商品化反應(yīng)體系2的microRNA-21標(biāo)準(zhǔn)曲線1；

圖9為實(shí)施例7中商品化反應(yīng)體系2的microRNA-21標(biāo)準(zhǔn)曲線2；

圖10為實(shí)施例7中優(yōu)化反應(yīng)液體系(反應(yīng)液體系1)的microRNA-21標(biāo)準(zhǔn)曲線1；

圖11為實(shí)施例7中優(yōu)化反應(yīng)液體系(反應(yīng)液體系1)的microRNA-21標(biāo)準(zhǔn)曲線2。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施例，進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行具體說明。應(yīng)該理解，下面的實(shí)施例只是作為具體說明，而不限制本發(fā)明的范圍，同時(shí)本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明所做的顯而易見的改變和修飾也包含在本發(fā)明范圍之內(nèi)。本實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

本發(fā)明實(shí)施例中涉及的各實(shí)驗(yàn)材料說明：

microRNA-21是目前研究最多的miRNAs之一，參與多種腫瘤的發(fā)生和一些病理生理改變，本發(fā)明具體實(shí)施方式以血漿microRNA-21的檢測(cè)為例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行具體說明。

5×PCR Buffer pH8.5(江蘇然科生物技術(shù)有限公司)含：50mM的Tris-HCl，250mM的KCl，20mM的MgCl₂，1000μM的dNTP，5U的Takara EX Taq^TM HS酶，2.5×ROX。dNTP購(gòu)自上海生工，Takara EX Taq^TM HS酶和50×ROX購(gòu)自大連寶生物，microRNA-21、引物和探針由上海英駿合成。商品化熒光定量反應(yīng)預(yù)混液購(gòu)自大連寶生物(商品化體系1)，貨號(hào)為RR390；Taqman-MGB專用熒光定量反應(yīng)預(yù)混液購(gòu)自Life公司(商品化體系2)，貨號(hào)為4440040。

hsa-microRNA-21-5p水解探針序列：5'-CTGGATACGACTCAACA-3'(SEQ ID NO:1)，在其5'端帶有熒光基團(tuán)6-FAM(6-羧基熒光素)，3'端帶有熒光淬滅基團(tuán)MGB。

hsa-miR-21-5p上游引物：5'-GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG-3'(SEQ ID NO:2)

hsa-miR-21-5p下游引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'(SEQ ID NO:3)

試劑處理制備及反應(yīng)方法：

(1)模板的制備：從5份混合血漿中提取血漿游離RNA(磁珠法血漿(血清)游離DNA/RNA提取試劑盒，江蘇然科生物技術(shù)有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA(逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，江蘇然科生物技術(shù)有限公司)，命名為血漿1、血漿2、血漿3、血漿4、血漿5。

(2)反應(yīng)液的制備：

按照實(shí)施例1～5的配方表進(jìn)行反應(yīng)液制備，配方表中所述增強(qiáng)劑為DNA聚合酶增強(qiáng)劑，表中所述保護(hù)劑為DNA聚合酶增強(qiáng)劑的保護(hù)劑。

其中，表中所述基礎(chǔ)熒光穩(wěn)定劑的成分為25.5％的NP-40和12.5mM的NaCl，表中所述增強(qiáng)劑的成分為0.8％的牛血清蛋白、100mM環(huán)糊精和2M甜菜堿，表中所述保護(hù)劑的成分為2.5％的明膠和0.03mM二硫蘇糖醇。

模板選用5份混合血漿逆轉(zhuǎn)錄的cDNA。本發(fā)明中反應(yīng)液體系1為優(yōu)化反應(yīng)液體系。

(3)反應(yīng)：

反應(yīng)液在熒光定量PCR儀ViiA 7Dx中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)液體系1～4、商品化體系1的PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火34秒，共40個(gè)循環(huán)。

商品化體系2的PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性10分鐘；95℃變性30秒，60℃退火1分鐘，共40個(gè)循環(huán)。

實(shí)施例1

優(yōu)化反應(yīng)液體系中增強(qiáng)劑的作用，其配方如下：

實(shí)施例2

優(yōu)化反應(yīng)液體系中基礎(chǔ)熒光穩(wěn)定劑的作用，其配方如下：

實(shí)施例3

優(yōu)化反應(yīng)液體系中保護(hù)劑的作用，其配方如下：

實(shí)施例4

優(yōu)化反應(yīng)液體系和商品化體系1的熒光定量PCR比較，其配方如下：

實(shí)施例5

優(yōu)化反應(yīng)液體系和商品化體系2的熒光定量PCR比較，其配方如下：

實(shí)施例1～5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析：

實(shí)施例1結(jié)果如表1和圖1所示，含增強(qiáng)劑的反應(yīng)液體系1擴(kuò)增的5份血漿的microRNA-21的Ct值為31.61，SD為0.443，而不含增強(qiáng)劑的反應(yīng)液體系2的Ct值為37.803，SD為1.02。

表1實(shí)施例1的micriRNA-21的Ct值結(jié)果比較

實(shí)施例2結(jié)果如圖2所示，含基礎(chǔ)熒光穩(wěn)定劑的反應(yīng)液體系1的基礎(chǔ)熒光值曲線較平，而不含基礎(chǔ)熒光穩(wěn)定劑的反應(yīng)液體系2的基礎(chǔ)熒光值隨循環(huán)數(shù)增加呈緩慢上升趨勢(shì)。

實(shí)施例3含保護(hù)劑的反應(yīng)液體系1擴(kuò)增的5份血漿的microRNA-21的Ct值為31.61，而不含保護(hù)劑的反應(yīng)液體系4的Ct值為31.57，二者差別不大，但當(dāng)二者共同在-20℃的條件下保存15天，測(cè)得反應(yīng)液體系1擴(kuò)增的血漿的microRNA-21的Ct值為30.772，而不含保護(hù)劑的反應(yīng)液體系4的Ct值為32.891，如圖3所示。

實(shí)施例4的結(jié)果如表2和圖4所示，以5份血漿為樣本，反應(yīng)液體系1測(cè)定的micriRNA-21平均Ct值為31.629，SD為0.448，而商品化體系1的平均Ct值為36.623，SD為0.526。從5份血漿的microRNA-21結(jié)果可以看出，反應(yīng)液體系1與商品化體系1兩者之間的平均Ct值差為4.994(36.623-31.629)，也就是說反應(yīng)液體系1擴(kuò)增同樣一份臨床樣本的結(jié)果是商品化體系1的31.87倍，結(jié)果說明反應(yīng)在液體系1在Taqman-MGB探針應(yīng)用中的靈敏度明顯優(yōu)于商品化體系1。

表2反應(yīng)液體系1測(cè)定血漿中micriRNA-21結(jié)果與商品化體系1結(jié)果的比較

實(shí)施例5的結(jié)果如表3所示，以5份血漿為樣本，反應(yīng)液體系1測(cè)定的micriRNA-21平均Ct值為31.629，SD為0.448，而商品化體系2的平均Ct值為33.898，SD為0.542。反應(yīng)液體系1與商品化體系2兩者之間的平均Ct值差為2.269(33.898-31.629)，也就是說反應(yīng)液體系1擴(kuò)增同樣一份臨床樣本的結(jié)果是商品化體系2的4.82倍，結(jié)果說明反應(yīng)液體系1在Taqman-MGB探針應(yīng)用中的靈敏度同樣明顯優(yōu)于Taqman-MGB探針專用的商品化體系2。

表3反應(yīng)液體系1測(cè)定血漿中micriRNA-21結(jié)果與商品化體系2結(jié)果的比較

實(shí)施例6

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：

將實(shí)施例3的含保護(hù)劑的反應(yīng)液體系1和不含保護(hù)劑的反應(yīng)液體系4，各分裝12份，在-20℃環(huán)境下保存，每15天(0.5月)取出一支，以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增的穩(wěn)定性試驗(yàn)。

檢測(cè)結(jié)果如表4和圖5所示，優(yōu)化體系穩(wěn)定性的研究表明，含保護(hù)劑的反應(yīng)液體系1在6個(gè)月內(nèi)的Ct值平均為31.458，SD為0.586；而不含保護(hù)劑的優(yōu)化體系Ct值呈上升趨勢(shì)，在1個(gè)半月無法檢出micriRNA-21濃度。

表4連續(xù)監(jiān)測(cè)micriRNA-21的結(jié)果比較

實(shí)施例7

優(yōu)化反應(yīng)液體系(反應(yīng)液體系1)、商品化體系1與商品化體系2的標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。

標(biāo)準(zhǔn)曲線模板的制備：人工合成microRNA-21序列，用水稀釋microRNA-21序列至10⁷，10⁶，10⁵，10⁴copies/μl。以稀釋的microRNA-21序列為模板逆轉(zhuǎn)錄合成microRNA-21cDNA(逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，江蘇然科生物技術(shù)有限公司)。

分別以10⁷，10⁶，10⁵，10⁴copies/μl的microRNA-21逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如下：

表5商品化反應(yīng)體系1、商品化反應(yīng)體系2及優(yōu)化反應(yīng)液體系的microRNA-21標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

如表5和圖6～11所示的三組體系標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果，表明，商品化體系1的microRNA-21的擴(kuò)增效率為87.109％，R²為0.984；商品化體系2的microRNA-21的擴(kuò)增效率為82.43％，R²為0.999；本發(fā)明優(yōu)化體系microRNA-21的擴(kuò)增效率為96.149％，R²為0.995。

從標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果可以看出，本發(fā)明能有效的提高擴(kuò)增效率，擴(kuò)增效率明顯優(yōu)于商品化體系1和Taqman-MGB探針專用的商品化體系2。從三組體系標(biāo)準(zhǔn)曲線相應(yīng)濃度的Ct同樣可以看出，本發(fā)明在擴(kuò)增合成模板時(shí)的靈敏度也明顯優(yōu)于商品化體系的結(jié)果。

<110> 江蘇然科生物技術(shù)有限公司

<120> 一種熒光定量PCR反應(yīng)液及方法

<160> 3

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> hsa-microRNA-21-5p水解探針序列

<400> 1

CTGGATACGACTCAACA 17

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hsa-miR-21-5p上游引物

<400> 2

GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG 24

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hsa-miR-21-5p下游引物

<400> 3

GTGCAGGGTCCGAGGT 16