本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種產(chǎn)生pvy抗性的nteif4e-1基因突變體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

馬鈴薯y病毒(potatovirusy,pvy)是十大最具經(jīng)濟及科學(xué)價值的植物病毒之一。pvy病毒在世界范圍廣泛分布,能夠侵染馬鈴薯、番茄、煙草等茄科作物。pvy是馬鈴薯y病毒屬成員，是最大的植物病毒屬。pvy在世界范圍是煙草最重要的病害之一，主要通過蚜蟲傳播，導(dǎo)致煙草花葉或者葉片壞死。pvy寄主植物的感病基因主要是翻譯起始因子，包括真核起始因子4e（eif4e）和4g（eif4g）。病毒基因組連接蛋白（vpg）能夠與eif4e互作，模仿mrnas的5’-端帽子結(jié)構(gòu)，使得病毒基因組mrna能夠在寄主細(xì)胞翻譯，完成病毒的復(fù)制。

煙草中主要的pvy抗源是va隱性基因，來源于uv誘導(dǎo)獲得的突變體資源vam。研究表明vam中約有1mb左右的染色體片段缺失。通過常規(guī)育種手段或者雙單倍體方法，va基因被轉(zhuǎn)移至許多不同類型的煙草，廣泛用于pvy抗性品種選育。最近的研究表明，vam中的va抗性能夠被分解為兩個分離的隱性基因，其中va1負(fù)責(zé)限制pvy病毒的細(xì)胞間轉(zhuǎn)移，va2能夠抑制病毒積累。盡管va基因被廣泛使用，但其對煙草也有不利影響，抗病品種的葉片往往較短、較窄，產(chǎn)量也會下降。這表明vam中缺失的染色體片段中除了va基因外還有其他重要基因，導(dǎo)致煙草表型不正常。此外，在部分抗病品種中，葉片表面無法產(chǎn)生分泌物，影響煙草香氣品質(zhì)。對pvy抗性分離的重組自交系轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)煙草中eif4e基因是vam缺失片段中負(fù)責(zé)pvy隱性抗性，即該基因是煙草感病基因。在感病白肋煙品種bb16nn的ems突變體庫中篩選獲得eif4e基因終止突變體（w50*），elisa分析表明其具有pvy抗性。

國際上有兩種類型的煙草在生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，白肋煙和烤煙，其中白肋煙生產(chǎn)主要在西方發(fā)達國家及南美洲，我國主要種植烤煙。目前尚無烤煙pvy感病基因研究結(jié)果發(fā)表，烤煙eif4e基因突變能否導(dǎo)致其產(chǎn)生pvy抗性仍有待研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種產(chǎn)生pvy抗性的nteif4e-1的基因突變體；第二目的在于提供所述的產(chǎn)生pvy抗性的nteif4e-1的基因突變體的應(yīng)用。

本發(fā)明的第一目的是這樣實現(xiàn)的，相對于核苷酸序列為seqidno.1所示的nteif4e-1基因，所述的產(chǎn)生pvy抗性的nteif4e-1基因突變體含有的nteif4e-1基因序列中159位的g被a取代發(fā)生了點突變，所述的產(chǎn)生pvy抗性的nteif4e-1基因突變體的核苷酸序列如seqidno.3所示。

本發(fā)明的的第二目的是這樣實現(xiàn)的，所述的產(chǎn)生pvy抗性的nteif4e-1基因突變體編碼的氨基酸序列如seqidno.4所示。

本發(fā)明經(jīng)烤煙品種云煙87的ems突變體創(chuàng)制，利用tilling技術(shù)篩選nteif4e-1基因突變株，突變材料中目標(biāo)突變的測序驗證及nteif4e-1基因純合終止突變體材料的pvy抗性分析。采用本方法獲得nteif4e-1基因發(fā)生終止突變的烤煙材料能夠抗pvy病毒。

附圖說明

圖1為nteif4e-1基因突變毛細(xì)管電泳檢測；

圖2為nteif4e-1基因突變位置；

圖3為突變體株系測序峰圖；

圖4為pvy抗性鑒定表型（整株）；

圖5為pvy抗性鑒定表型（葉片）。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例附圖對本發(fā)明作進一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明所述的產(chǎn)生pvy抗性的nteif4e-1基因突變體，相對于核苷酸序列為seqidno.1所示的nteif4e-1基因，所述的產(chǎn)生pvy抗性的nteif4e-1基因突變體含有的nteif4e-1基因序列中159位的g被a取代發(fā)生了點突變，所述的產(chǎn)生pvy抗性的nteif4e-1基因突變體的核苷酸序列如seqidno.3所示。

所述的產(chǎn)生pvy抗性的nteif4e-1的基因突變體編碼的氨基酸序列如seqidno.4所示。

本發(fā)明所述的產(chǎn)生pvy抗性的nteif4e-1的基因突變體應(yīng)用為所述的產(chǎn)生pvy抗性的nteif4e-1的基因突變體在獲得具有pv抗性的煙草植株中的應(yīng)用。

下面以具體實施案例對本發(fā)明做進一步說明：

實施例1

烤煙突變體庫創(chuàng)制

一、烤煙種子ems處理

烤煙（品種：云煙87）種子用50%的市售商品漂白液浸泡12分鐘后，用去離子水快速清洗，并在去離子水中浸泡12小時。棄去離子水，加入等體積0.5%ems（甲基磺酸乙酯）處理12小時。棄處理液，加入去離子水清洗6-8次，每次約1分鐘。種子收集于布氏漏斗，抽干待用。

二、m1植株田間種植

ems處理完畢種子播種于漂浮盤，每穴一粒種子，出苗后移栽至田間，正常農(nóng)藝措施管理?，F(xiàn)蕾后單株套袋編號收種獲得m2種子。

三、突變體基因組dna提取及混樣

利用試劑盒提取基因組dna，步驟如下：

稱取0.1g鮮樣，液氮研磨、細(xì)碎后，轉(zhuǎn)入2.0ml樣品管中，立即加入600μlap1緩沖液和4μlrnasea貯存液（100mg/ml）。65℃中水浴處理10分鐘，期間顛倒ep管2-3次。加入190μlap2緩沖液，混勻置于冰上5分鐘，14000rpm室溫離心5分鐘。吸取上清液至qiashreddermini柱，14000rpm室溫離心2分鐘。取450—650μl過濾液至2.0ml離心管中，再加入675-900μl的緩沖液ap3/e。取650μl混合物至2ml的dneasy柱內(nèi)，室溫以≥8000rpm離心1-2分鐘。將上述的dneasy柱放入新的2ml收集管中，加入500μlaw緩沖液，以≥8000rpm離心2分鐘，丟棄流出液，再用aw緩沖液重復(fù)清洗一次。將dneasy柱放在1.5ml離心管中，加入100μlae緩沖液，室溫放置5分鐘，離心所得濾液即為基因組dna。

大田種植約2200份m2代ems突變體植株，采集葉片并利用上述方法提取基因組dna，將所有樣品dna濃度稀釋至40ng/μl，最終建立m2代云煙87突變體的dna庫，每8份dna混樣，構(gòu)成8倍混合池，保存于96孔板中。

實施例2

nteif4e-1基因終止突變體篩選

一、tilling引物

nteif4e-1基因cds全長660bp，包含5個外顯子，第一個外顯子最長，約為251bp。本研究針對第一個外顯子區(qū)域篩選突變體，

引物序列為：

isoform_c_mf_1：tagccactaatattccaccgtc；

isoform_c_mr_1：tacattagtagtgtttgatttggt,

擴增長度約為590bp左右。

二、pcr擴增條件

pcr反應(yīng)體系如下：總體積為10μl，其中20ng/μldna樣品1.0μl、10×pcrbuffer1.0μl，dntps0.8μl，引物各0.16μl，taqdna酶0.1μl，ddh2o6.78μl。

pcr反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性3分鐘；94℃變性30秒，62℃退火30秒（每個循環(huán)下降1℃），72℃延伸90秒，運行7個循環(huán)；94℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸90秒，運行40個循環(huán)；最后72℃延伸5分鐘。pcr擴增產(chǎn)物可以在4℃保存。

三、pcr產(chǎn)物酶切及電泳

利用celi酶特異性切割異源雙鏈的特性，對pcr產(chǎn)物進行酶切，酶切體系如下：pcr產(chǎn)物4μl，10×buffer1μl，celi酶0.5μl，補充h2o至總體積為10μl。酶切體系利用自動毛細(xì)管電泳系統(tǒng)進行分離，分離條件如下：樣品上樣電壓為9kv，上樣30sec，marker的上樣電壓為7.5kv，上樣5sec，預(yù)電泳電壓9kv，分離電泳電壓9kv，運行時間80min，電泳結(jié)果用prosize2.0軟件分析。tilling篩選共獲得13個nteif4e-1基因突變體，有2個突變發(fā)生在內(nèi)含子區(qū)域，其余11個突變均導(dǎo)致氨基酸變化。其中編號918＃單株，有一個密碼子從tgg突變?yōu)閠ga（w53*），為nteif4e-1基因終止突變，結(jié)果見表1和圖1、圖2。

表1云煙87突變體庫中nteif4e-1基因突變體分析

實施例3

nteif4e-1基因終止突變驗證

一、m3代突變體基因組dna提取及pcr擴增

根據(jù)m2代植株tilling篩選結(jié)果，選擇nteif4e-1基因目標(biāo)區(qū)域發(fā)生突變單株的種子（m3代），在育苗盤中播種。采用試劑盒法提取幼苗葉片基因組dna。以isoform_c_mf_1和isoform_c_mr_1引物，以基因組dna為模板擴增nteif4e-1基因第一個外顯子區(qū)域。pcr反應(yīng)體系如下：總體積為25μl，其中20ng/μldna樣品1.0μl、10×pcrbuffer2.5μl，dntps2μl，引物各0.5μl，taqdna酶0.3μl，ddh2o18.2μl。pcr反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性3分鐘；94℃變性30秒，55℃退火30秒（每個循環(huán)下降1℃），72℃延伸90秒，運行30個循環(huán)；72℃延伸5分鐘。pcr擴增產(chǎn)物可以在4℃保存。、

二、pcr產(chǎn)物topo克隆及測序

pcr產(chǎn)物回收后連接ptopo載體（invitrogen），體系如下：pcr產(chǎn)物4μl，pcr-bluntii-topo質(zhì)粒1μl，saltsolution1μl。反應(yīng)組分25℃孵育30min，轉(zhuǎn)e.coli.感受態(tài)細(xì)胞中混勻，冰浴30min，42℃熱休克90sec后立即放入冰浴中2min，加入0.35ml的lb液體培養(yǎng)基，37℃210rpm振蕩培養(yǎng)1h。離心1min（7500rpm），棄上清至約100μl混勻，均勻涂布于km抗性培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)。選擇陽性克隆提取質(zhì)粒后進行sanger測序，結(jié)果（見圖3）表明m3代突變體中nteif4e-1基因tgg突變?yōu)閠ga仍被穩(wěn)定遺傳，且篩選到純合終止突變體（w53*）。

實施例4

nteif4e-1基因終止突變體pvy抗性分析

m3代純合突變株系移栽至小花盆接種pvy病毒分離物，接種23天后采用elisa分析植株抗性。洗滌采用自動洗板儀（bio-rad公司產(chǎn)品）洗板三次。加入底物后50min、2hr分別在酶標(biāo)儀（benchmark型，bio-rad公司產(chǎn)品）上測定405nm的吸光度（od值），樣品od值與陰性對照od值的比值≥2.0判斷為陽性（＋）,比值＜1.5判斷為陰性（－），1.5≤比值＜2.0判斷為＋－。結(jié)果表明，接種23天后純合終止突變株均無感病癥狀，elisa檢測均為pvy陰性，對照云煙87發(fā)病率達到100%，elisa檢測均為pvy陽性。這表明eif4e_1基因終止突變能夠抑制pvy病毒在煙草中復(fù)制或運輸，使感病烤煙獲得抗pvy表型，結(jié)果見表2。

表2elisa檢測m3代純合突變材料pvy抗性

sequencelisting

<110>云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院

<120>一種產(chǎn)生pvy抗性的nteif4e-1基因突變體及其應(yīng)用

<130>2017

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>660

<212>dna

<213>nteif4e-1基因核苷酸

<400>1

atggcagaggaagctgagaaattgcgggtagatgaagtagaagtagtcgacgatggacct60

gaagaaggagaaattgtggatgaatctgatgatacggcgtcgtatttgggcaaagaaatc120

aaacctaagcatccattagagaattcttggactttttggtttgataatcctatggctaaa180

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gatttttggggtgtttacaataatatcaaccacccaagcaagttagttgtgggagcagac300

tttcattgttttaagcataaaattgagccaaagtgggaagatcctgtatgtgcgaatgga360

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gtccgaaataagggggataaaatagctttatggaccaagaatgctgcaaatgaaacagct540

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atatttcatgacgactcaatgaggctcggcagaggtgccaagaatcgttatacagtatag660

<210>2

<211>219

<212>prt

<213>nteif4e-1基因氨基酸

<400>2

metalagluglualaglulysleuargvalaspgluvalgluvalval

151015

aspaspglyproglugluglygluilevalaspgluseraspaspthr

202530

alasertyrleuglylysgluilelysprolyshisproleugluasn

354045

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505560

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859095

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100105110

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115120125

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130135140

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165170175

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180185190

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195200205

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210215

<210>3

<211>660

<212>dna

<213>nteif4e-1基因突變體核苷酸

<400>3

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gaagaaggagaaattgtggatgaatctgatgatacggcgtcgtatttgggcaaagaaatc120

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atatttcatgacgactcaatgaggctcggcagaggtgccaagaatcgttatacagtatag660

<210>4

<211>52

<212>prt

<213>nteif4e-1基因突變體氨基酸

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50

<210>5

<211>22

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<212>dna

<213>isoform_c_mr_1

<400>6

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