本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種診斷前列腺癌的產(chǎn)品及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：前列腺癌是發(fā)生于男性前列腺組織中的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)已經(jīng)成為男性第二大類常見腫瘤，位于癌癥相關(guān)死亡率第六位。在歐美等發(fā)達(dá)國家和地區(qū)，它是男性最常見的惡性腫瘤，其死亡率居各種癌癥的第二位；在亞洲，其發(fā)病率低于西方國家，但近年來呈迅速上升趨勢，且增長比歐美發(fā)達(dá)國家更加迅速。我國前列腺癌發(fā)病率也在逐年提高，已位于男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第三位，僅次于膀胱癌和腎癌。前列腺癌一般在50歲以后發(fā)病，95％發(fā)生于60歲以上的老年男性，發(fā)生率持續(xù)地隨著年齡增長而增加。前列腺癌早期多無任何癥狀，即使有所不適，也不足以引起病人的重視，當(dāng)腫瘤增大壓迫尿道時(shí)，又往往與前列腺增生相混淆。在我國約80％的病人首先發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶才發(fā)現(xiàn)前列腺癌。此時(shí)，病變已達(dá)晚期，預(yù)后不良。所以，前列腺癌的早期診斷對前列腺癌病人的治療有極為重大的意義。目前前列腺癌的臨床診斷方式目前主要有前列腺直腸指檢(DRE)、血清前列腺特異性抗原(PSA)檢測、直腸超聲波檢測、活組織病理檢查等。直腸指檢是前列腺癌診斷的經(jīng)典技術(shù)，主要通過醫(yī)生的食指觸摸前列腺，以判斷前列腺結(jié)節(jié)的大小和形狀，從而判斷是否患有前列腺癌。但直腸指檢的局限性也很強(qiáng)：(1)患者前列腺腫塊不大時(shí)，易漏診；(2)部分患者前列腺癌腫大不明顯，但已屬于晚期；(3)患者直腸有疾患時(shí)不能使用此檢測；(4)醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)不足時(shí)可能有漏診或者誤診的可能。前列腺超聲波檢測雖然操作簡單直觀、無損傷，但該方法容易與前列腺炎和前列腺肥大混同，已不再用于前列腺癌分期診斷。活組織病理檢查因其創(chuàng)傷性、復(fù)雜性不能作為初篩的手段，但它是前列腺癌確診的金標(biāo)準(zhǔn)，一般與其他方法技術(shù)連用。目前對前列腺癌的篩查診斷主要依靠血清PSA檢測和前列腺穿刺病理活檢相結(jié)合的方法。正常情況下血液中的PSA不高(不高于4ng/ml)，當(dāng)處于前列腺癌及其他前列腺疾病患病狀態(tài)時(shí)，PSA升高成為目前篩查前列腺癌最敏感的瘤標(biāo)，但PSA增高也常見與非前列腺癌疾病，如前列腺炎癥、前列腺增生等多重泌尿系統(tǒng)疾病有關(guān)，因此不易確診，甚至可能導(dǎo)致疾病的誤檢、誤診或者病情的延誤。此外，PSA增高確診前列腺癌時(shí)，往往患者已經(jīng)屬于中后期，達(dá)不到早期診斷的目的。而穿刺活檢的檢出率與活體穿刺的次數(shù)、位置都有較大關(guān)系，不是非常穩(wěn)定的診斷方案。因此，研究更有效的前列腺癌標(biāo)記物對提高前列腺癌的早期診斷及為患者制定合理的個體化治療方案，減少前列腺癌患者死亡率和改善生活質(zhì)量有重要的意義，如果能有一種檢測試劑盒，可以提高前列腺癌的檢出率和準(zhǔn)確率，對于前列腺癌的臨床治療有著重大的意義。LOC730668屬于lncRNA(longnon-codingRNA，長鏈非編碼RNA)，是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200bp核苷酸的非編碼RNA，近年研究發(fā)現(xiàn)它是一類具有重要生物學(xué)功能的RNA，參與基因組印記、染色體沉默、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程，在細(xì)胞分化和發(fā)育、基因轉(zhuǎn)錄和翻譯、遺傳和表觀遺傳等生命活動中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用。越來越多的權(quán)威研究證實(shí)lncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著抑制或促進(jìn)腫瘤的作用，在調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期、侵襲轉(zhuǎn)移能力等方面，均具有十分重要作用。目前己有較多l(xiāng)ncRNAs被證實(shí)在包括乳腺癌、前列腺、黑色素瘤、肝癌、結(jié)腸癌、膀胱癌等在內(nèi)的人類多種腫瘤中存在差異表達(dá)并執(zhí)行重要的調(diào)控功能。早期有效檢測腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及提高抗癌藥物的療效對于癌癥的治療尤為重要，發(fā)明新型腫瘤標(biāo)志物作為診斷與治療的靶點(diǎn)一直是腫瘤研究的熱點(diǎn)。lncRNA與前列腺癌密切相關(guān)，它們可能參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，所以對腫瘤的發(fā)病機(jī)制、早期診斷、個體化治療、轉(zhuǎn)移的檢測和預(yù)后等可能有相應(yīng)的作用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了實(shí)現(xiàn)前列腺癌的早期發(fā)現(xiàn)，早期干預(yù)，本發(fā)明的目的在于提供一種診斷前列腺癌的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品能夠通過檢測被試者血清、尿液和組織樣本中LOC730668的表達(dá)水平來診斷前列腺癌。本發(fā)明的另一目的在于提供所述產(chǎn)品在前列腺癌高危人群篩選、治療、監(jiān)測及預(yù)后中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供一種診斷前列腺癌的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品能夠通過檢測被試者血清、尿液和組織樣本中LOC730668的表達(dá)水平來診斷前列腺癌。更進(jìn)一步地研究發(fā)現(xiàn)，所述LOC730668在前列腺癌組織中表達(dá)下調(diào)，顯示LOC730668與前列腺癌的腫瘤發(fā)生、發(fā)展存在著密切的相關(guān)性。進(jìn)一步地，所述診斷前列腺癌的產(chǎn)品包括基因芯片或前列腺癌診斷試劑盒。優(yōu)選的，所述芯片具有基片和點(diǎn)樣于基片上點(diǎn)樣區(qū)的點(diǎn)樣DNA，所述點(diǎn)樣DNA包括特異性結(jié)合于前列腺癌相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄本的探針，所述基因是LOC730668。優(yōu)選的，所述前列腺癌診斷試劑盒包括定量PCR反應(yīng)體系：(1)特異擴(kuò)增LOC730668和對照GAPDH的兩對引物；檢測LOC730668的引物序列如下：LOC730668上游引物序列：SEQIDNO:2LOC730668下游引物序列：SEQIDNO:3；對照GAPDH的引物序列如下：GAPDH上游引物序列：SEQIDNO:4GAPDH下游引物序列：SEQIDNO:5；(2)SYBRGreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系，包括PCR緩沖液、SYBRGreen熒光染料、dNTPs等。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了所述產(chǎn)品在前列腺癌高危人群篩選、治療、監(jiān)測及預(yù)后中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述應(yīng)用是通過檢測被試者血清、尿液和組織樣本中LOC730668的含量，并與正常水平LOC730668的含量相比較，以進(jìn)行前列腺癌高危人群篩選、診斷、治療、監(jiān)測及預(yù)后。本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明公開了一種診斷前列腺癌的產(chǎn)品及其應(yīng)用，該產(chǎn)品能夠通過檢測被試者組織樣本中LOC730668的表達(dá)水平來診斷前列腺癌，并進(jìn)一步證實(shí)LOC730668在前列腺癌組織中表達(dá)下調(diào)。利用該分子標(biāo)記物檢測前列腺癌不僅能夠快速有效的做到早期檢測，而且為基因治療、藥物治療等臨床應(yīng)用提供了治療靶點(diǎn)和重要依據(jù)。附圖說明圖1本發(fā)明中實(shí)施例2中前列腺癌組織樣本中LOC730668表達(dá)下調(diào)。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用的試劑可以商業(yè)購買得到。本發(fā)明的發(fā)明人對10例前列腺癌組織樣本及對應(yīng)癌旁組織樣本進(jìn)行高通量測序，結(jié)合生物信息學(xué)方法進(jìn)行基因篩選，挑選出候選lncRNALOC730668，現(xiàn)有研究中并沒有LOC730668和前列腺癌相關(guān)的報(bào)道，進(jìn)一步，發(fā)明人進(jìn)行了分子生物學(xué)方法驗(yàn)證，證實(shí)了LOC730668在前列腺癌組織中表達(dá)下調(diào)，其相關(guān)制劑可用于治療前列腺癌。本發(fā)明的LOC730668是在本發(fā)明之前的已知lncRNA，其基本信息如下：Genbank登錄號：GeneID:730668，來源于人類基因組，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本發(fā)明采用RT-PCR方法檢測上述lncRNA在前列腺癌患者和正常人群中的表達(dá)，并驗(yàn)證了該lncRNA在前列腺癌患者中表達(dá)下調(diào)。熒光定量PCR法是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測樣品模板的初始濃度。熒光定量PCR的出現(xiàn)，極大地簡化了定量檢測的過程，而且真正實(shí)現(xiàn)了絕對定量。多種檢測系統(tǒng)的出現(xiàn)，使實(shí)驗(yàn)的選擇性更強(qiáng)。自動化操作提高了工作效率，反應(yīng)快速、重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果清晰?；蛐酒?genechip)(又稱DNA芯片、生物芯片)的原型是80年代中期提出的?；蛐酒臏y序原理是雜交測序方法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進(jìn)行核酸序列測定的方法，在一塊基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探針。當(dāng)溶液中帶有熒光標(biāo)記的核酸序列TATGCAATCTAG，與基因芯片上對應(yīng)位置的核酸探針產(chǎn)生互補(bǔ)匹配時(shí)，通過確定熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的探針位置，獲得一組序列完全互補(bǔ)的探針序列。據(jù)此可重組出靶核酸的序列?；蛐酒址Q為DNA微陣列(DNAmicroarray)，可分為三種主要類型：1)固定在聚合物基片(尼龍膜，硝酸纖維膜等)表面上的核酸探針或cDNA片段，通常用同位素標(biāo)記的靶基因與其雜交，通過放射顯影技術(shù)進(jìn)行檢測。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是所需檢測設(shè)備與目前分子生物學(xué)所用的放射顯影技術(shù)相一致，相對比較成熟。但芯片上探針密度不高，樣品和試劑的需求量大，定量檢測存在較多問題。2)用點(diǎn)樣法固定在玻璃板上的DNA探針陣列，通過與熒光標(biāo)記的靶基因雜交進(jìn)行檢測。這種方法點(diǎn)陣密度可有較大的提高，各個探針在表面上的結(jié)合量也比較一致，但在標(biāo)準(zhǔn)化和批量化生產(chǎn)方面仍有不易克服的困難。3)在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成的寡核苷酸探針陣列,與熒光標(biāo)記的靶基因雜交進(jìn)行檢測。該方法把微電子光刻技術(shù)與DNA化學(xué)合成技術(shù)相結(jié)合，可以使基因芯片的探針密度大大提高，減少試劑的用量，實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化和批量化大規(guī)模生產(chǎn)，有著十分重要的發(fā)展?jié)摿??；蛐酒夹g(shù)主要包括四個基本要點(diǎn)：芯片方陣的構(gòu)建、樣品的制備、生物分子反應(yīng)和信號的檢測。1、芯片制備，先將玻璃片或硅片進(jìn)行表面處理，然后使DNA片段或蛋白質(zhì)分子按順序排列在芯片上。2、樣品制備，生物樣品往往是非常復(fù)雜的生物分子混合體，除少數(shù)特殊樣品外，一般不能直接與芯片反應(yīng)?？蓪悠愤M(jìn)行生物處理，獲取其中的蛋白質(zhì)或DNA、RNA，并且加以標(biāo)記，以提高檢測的靈敏度。3、生物分子反應(yīng)，芯片上的生物分子之間的反應(yīng)是芯片檢測的關(guān)鍵一步。通過選擇合適的反應(yīng)條件使生物分子間反應(yīng)處于最佳狀況中，減少生物分子之間的錯配比率。4、芯片信號檢測，常用的芯片信號檢測方法是將芯片置入芯片掃描儀中，通過掃描以獲得有關(guān)生物信息。本發(fā)明LOC730668的核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)已公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA作為模板，擴(kuò)增而得到有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次擴(kuò)增，然后再將多次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通過先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。實(shí)施例1高通量測序篩選差異表達(dá)基因1、取樣選取10例新鮮前列腺癌組織及對應(yīng)癌旁組織，取樣來源于北京協(xié)和醫(yī)院2012年10月到2015年12月期間行根治性前列腺切除并雙側(cè)盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)的前列腺癌病人，手術(shù)切除前列腺后在病理科醫(yī)生的指導(dǎo)下立即取前列腺癌及癌旁組織放入液氮，編號后置-80℃低溫冰箱保存。2、對組織樣本進(jìn)行總RNA提取采用Reagent(invitrogen，貨號15596-018)進(jìn)行樣本RNA提取，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行，具體操作如下：收集樣本后凍存于液氮，取出后把組織樣本放入已預(yù)冷的研缽中進(jìn)行研磨，待組織樣本成粉末狀后：①入1mLTrizol，室溫保存5分鐘；②加氯仿0.2mL，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫下放置5分鐘-10分鐘；③12000rpm高速離心15分鐘后吸取上層水相(吸70％)到另一新離心管管中，注意不要吸到兩層水相之間的蛋白物質(zhì)。移入新管，加入等體積的-20℃預(yù)冷異丙醇，充分顛倒混勻，置于冰上10分鐘；④12000rpm高速離15分鐘后小心棄掉上清液，按ImL/mLTrizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振蕩混合，4℃下12000rpm高速離心5分鐘；⑤棄去乙醇液體，室溫下放置5分鐘以充分晾干沉淀，加入DEPC處理過的水溶解沉淀；⑥用Nanodrop2000紫外分光光度計(jì)測量RNA純度及濃度，凍存于-80℃。RNA質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)：RNA樣本的OD260/OD280值為1.7-2.2之間；總RNA電泳圖譜有清晰的28S、18S條帶；70℃水浴保溫1小時(shí)后的電泳圖譜與水浴保溫前的圖譜無明顯差異。3、RNA樣品的質(zhì)量分析RNA提取后瓊脂糖凝膠電泳，從電泳結(jié)果可以初步判定提取的RNA樣品質(zhì)量合格與否，是否可以用于進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄組分析。進(jìn)而通過NanoDrop1000分光光度計(jì)檢測RNA樣品的提取情況，RNA-seq測序的樣品要求：OD260/OD280為1.8-2.2。4、高通量測序測序平臺為Illumina公司的HiSeq2500高通量測序平臺，進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組深度測序，測序后我們運(yùn)用Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)軟件對測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行整體評估，包括堿基的質(zhì)量值分布，質(zhì)量值的位置分布，GC含量，PCRduplication含量，kmer的frequency等。在差異基因表達(dá)分析時(shí)，根據(jù)得到的FPKM值，采用國際公認(rèn)算法EBSeq進(jìn)行差異篩選。其中，篩選時(shí)，LOG2FC>1或<-1,FDR<0.05。為了更好的理解差異表達(dá)基因的功能，我們對差異表達(dá)基因進(jìn)行了GeneOntology和信號通路分析，并對差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋，鑒于以上數(shù)據(jù)分析的結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)我們篩選了差異表達(dá)LOC730668，LOC730668在前列腺癌樣本組織中表達(dá)下調(diào)。實(shí)施例2RT-PCR驗(yàn)證前列腺癌組織及對應(yīng)癌旁組織LOC730668表達(dá)情況1、材料選取15例前列腺癌患者，取樣來源于北京協(xié)和醫(yī)院2012年10月到2015年12月期間行根治性前列腺切除并雙側(cè)盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)的前列腺癌病人，手術(shù)切除前列腺后在病理科醫(yī)生的指導(dǎo)下立即取前列腺癌及癌旁組織放入液氮，編號后置-80℃低溫冰箱保存。2、方法2.1對被試者組織樣本進(jìn)行總RNA提取，同實(shí)施例1的提取方法。2.2逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA采用IIIReverseTranscriptase(invitrogen，貨號18080-044)進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行，具體操作如下：使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對lμg總RNA進(jìn)行逆反錄合成cDNA。采用25μL反應(yīng)體系，每個樣品取1μg總RNA作為模板RNA。獲得的cDNA保存放-20℃冰箱備用。2.3、Real-TimePCR2.3.1儀器及分析方法用ABI7500型熒光定量PCR儀，采用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對定量分析。2.3.2引物設(shè)計(jì)采用在線引物設(shè)計(jì)軟件，基因序列參照NCBI:NR_027240.1，內(nèi)參選GAPDH，引物設(shè)計(jì)后由invitrogen公司合成。具體引物序列如表1所示：表1引物序列操作過程如下：(一)反應(yīng)體系：用PowerGreenPCRMasterMix(invitrogen，貨號4367659)進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃5min，(95℃15sec，60℃45sec，72℃35sec)×40個循環(huán)。表2RealTime反應(yīng)體系組分加入量2×mix10μL上游引物(10μM)0.5μL下游引物(10μM)0.5μL模板2μL加入滅菌蒸餾水至25μL(二)引物篩選將各樣本cDNA混合后，以此為模板進(jìn)行5倍梯度稀釋，稀釋后樣品各取2μL作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)在60-95℃進(jìn)行融解曲線分析，根據(jù)擴(kuò)增效率高和溶解曲線單峰原則進(jìn)行引物篩選。(三)樣品RealTime-PCR檢測將各樣品cDNA10倍稀釋后取2μL作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增。同時(shí)在60-95℃進(jìn)行溶解曲線分析。二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線拐點(diǎn)清楚，擴(kuò)增曲線整體平行性好，表明各反應(yīng)管的擴(kuò)增效率相近，極限平而無上揚(yáng)現(xiàn)在，曲線指數(shù)期斜率較大，說明擴(kuò)增效率較高；樣本擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線都是單峰，說明擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條，為特異性擴(kuò)增；根據(jù)qRT-PCR的相對定量公式：2-ΔΔCt×100％，比較LOC730668在前列腺癌組織和對應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)水平(-ΔCt為目標(biāo)lncRNA與對照的Ct值之差)。結(jié)果顯示：qRT-PCR擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定，其中LOC730668在前列腺癌組織中的表達(dá)水平僅為對照組織的25％，如圖1所示。以上結(jié)果驗(yàn)證了高通量轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)的整合分析LOC730668在前列腺癌患者中表達(dá)下調(diào)的結(jié)果。實(shí)施例3基因芯片診斷前列腺癌的應(yīng)用1、材料的取得，同實(shí)施例2。2、總RNA的提取，同實(shí)施例1的方法。3、基因芯片驗(yàn)證總RNA經(jīng)線性化擴(kuò)增后，cy3-UTP標(biāo)記，熒光標(biāo)記后的cRNAs采用RNEASYMiniKit純化，用Amhion的RNAFragmentationReagents對標(biāo)記好的cRNAs進(jìn)行片段化處理。采用美國Agilent公司的人全基因表達(dá)譜芯片(4x44K基因)，在芯片雜交爐中65℃雜交17h，然后洗脫、染色，最后用AgilentDNAMicroarrayScanner掃描儀掃描。雜交后的芯片經(jīng)芯片掃描儀讀取數(shù)據(jù)點(diǎn)后，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入分析軟件，對于兩組比值的自然對數(shù)絕對值大于2.0或小于0.5的基因作為差異表達(dá)基因。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間差異比較采用單因素方差分析法，P<0.05差異有顯著意義。結(jié)果顯示，與正常人相比，前列腺癌患者組織中LOC730668水平僅為21％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)施例4試劑盒的制備基于實(shí)施例2得到的引物組，組裝本發(fā)明所述的用于檢測前列腺癌的試劑盒，所述試劑盒包括特異擴(kuò)增LOC730668的引物對如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示，和特異擴(kuò)增管家基因(GAPDH)的引物對如SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示；還包括SYBRGreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系，如PCR緩沖液、SYBRGreen熒光染料、dNTPs。所述PCR緩沖液的成分為25mMKCl，2.5mMMgCl2，200mM(NH4)2SO4；還包括前列腺正常組織cDNA：采用正常人群中表達(dá)水平位于中位值的人群的總lncRNAsLOC730668的特異性反轉(zhuǎn)錄引物擴(kuò)增反轉(zhuǎn)成cDNA。前列腺正常組織cDNA作為陰性對照與檢測樣本cDNA共同定量PCR檢測。通過對引物濃度和退火溫度的優(yōu)化，最終確定反應(yīng)體系如表3所示：表3PCR反應(yīng)體系組分加入量SYBRGreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系12.5μL上游引物(10μM)0.5μL下游引物(10μM)0.5μL模板cDNA2.0μL加入滅菌蒸餾水至25μL最佳反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，(95℃變性15sec，60℃退火45sec，72℃延伸35sec)×40個循環(huán)，72℃延伸15min。實(shí)施例5本前列腺癌的診斷試劑盒的應(yīng)用1、病例選取20例待篩查的前列腺癌患者，取樣來源于北京協(xié)和醫(yī)院2012年10月到2015年12月期間泌尿科治療的病人。獲取所有研究對象的前列腺癌組織樣本，編號后置-80℃低溫冰箱保存。本研究的所有臨床樣本，均對患者進(jìn)行知情告知并經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會通過。2、方法使用常規(guī)方法或使用特定的試劑盒提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用實(shí)施例4中的試劑盒進(jìn)行檢測反應(yīng)。以試劑盒中前列腺正常組織cDNA作為QPCR定量檢測中的對照cDNA，檢測組織樣本中的LOC730668相對前列腺正常組織表達(dá)量變化。3、結(jié)果通過溶解曲線分析和電泳確定目的條帶，ΔΔCt法進(jìn)行相對定量，樣本和對照間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著。結(jié)果顯示，待篩查的20例前列腺癌患者的組織樣本中有7例患者組織樣本中LOC730668的表達(dá)量和前列腺癌正常組織表達(dá)量無顯著差異；有13例患者組織樣本中LOC730668的表達(dá)量是前列腺癌正常組織表達(dá)量的55％以下，其中有9例患者組織樣本中LOC730668的表達(dá)量是前列腺癌正常組織表達(dá)量的25％以下。經(jīng)臨床進(jìn)一步檢測，20例待篩查的患者中確診9例前列腺癌，這9例前列腺癌患者與本發(fā)明制備的試劑盒檢測結(jié)果一致。據(jù)此推斷，本前列腺癌的診斷試劑盒可以明確區(qū)分出前列腺癌患者，并以此為臨床提供診斷線索。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。序列表<110>邱賓濤<120>一種診斷前列腺癌的產(chǎn)品及其應(yīng)用<130>P1655<160>5<170>PatentInversion3.5<210>1<211>4162<212>DNA<213>基因序列<400>1agaggagtccagactccgatcccagctccactgctgcctcccgcacgcctggagccagcc60cggccctcatctgtgcacgcagggtgtgctgcaccccaccaggcatctccaactcggaga120ttcagctgcagccctggccgtcagacccacgggccctgaagtccagggggccctctcgcc180cgcctcctgtctgcagatggggaaattgaggcccagccagggcaggggatttgccgacgt240ttcgcaacaaattcgagtcagaaataggcccagctgggcctgccggcgcggaggcccgct300cgggacactgctggccaacgcagggcccagcacggtcccagtcacacccacagcagggtc360ctgccagccttctccgctctcccctgggggaagtgaccctcctccacctcccagagccca420cgtgagtccgcaggaggcccccctgggccaggtgccaggtgccgagtggctgcctccaac480tcgggggctgctatgcaaggatgtttccagttctccgggtccttccttccacctgggagg540tccggggctgccgggccatgctggtccctgtggccctagggcccgcccagcgcagggcct600ggcagggagagggggaaacgtgggtgagggaagtgagtcaccccttgggacacttccctg660ctcagttcctgcctctcagcagcttctgcgaggcaggtcacacctgcaggggagcctggc720agcgctaggagaggcaaggggtgggggtgccgccttttcatggggccaagaggggccctg780agagggacaccgggtggacagccccaggggcctccttgctcggccagccggcatctcccc840ctgctcccagcataggagggccggtggcctgagtgctctgctccgtgcccggaaaagact900catgttccaggaaaaagccgcttggcaggtcggagcaagctcatggtgctgttcccagac960ccgatgcgatgcgtgtggagggaggcctgcccttgcccccagggctgcagggcgagaaca1020gaccttgattcctgctataaccctgggcacggcctctgtttctccgcgtgtgcccggggg1080cggcgtgttctcagggcaggggcctctaaggatcagagtgaggctgcaggcccaggctga1140ggcctgcaccacctcggccgggagatgagtaaatgtctgggtccccctggccactccaga1200gtgaggccgccaagcctccggcctgaagtccggctcctgttctcagcctgccaggccctt1260gtgcggtggcgtcgggcaggcagggcagggaggccacggcagccatcttcccggggagct1320ggggcctggccagcagcgtttcccagtggcctcctcctgtgctccgagctgcattacctc1380atcgggaagccattccagaaaggagctgcggagcccctgggagtgggagtggggagagct1440gcgtcagcgccctcctggcagcctcggtgccagacgagggcaggcgtcacgcctccgggt1500gtctgcctgccgagcgactgctgggagagcagctggcttttgtcagcgtttcggggtgac1560cgggctgggctgcagcaggcaggtggcgtggcacggcccatggccggccagctaccaggt1620gggcagaggatctatttcaagagccggaaccaaatggccaggcatgaggggaagccaggt1680gcaaactcagtggcagagaccaagccctgaccccgcagtcccaggcctcagtttcccctc1740aggccagccctcctcccagcacctgtcctctgcttcctatagccacaaagagcaccagac1800acgagtgagcaggtgactacactccctgctgcccgctggtgtaagccagaggccctgcca1860cccacagctggcctccagaggcctttctggaccacagggtcagggctgagaggggtgggg1920gtggcaggggcagctgaggtgctggagagggaggacaagcttcctgcctgtggaggagac1980aagggcagctcccaaccctgctcctagccttcctgccaagtttggattccagaaacacct2040cttggtgcctcagttttctcatctgttttgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtttt2100gtagatagggtctttctctgtcacccaggctggagtgctgtggtgcgatcatggctcact2160gcaacctctacctcctgggctcaagcaatcctcccgcctcagtctctcgagtagctggga2220ccacaggtgcacaccaccatgcctggctaatttttgtttgttggttcatttttgtagcga2280cagggtctccctatgttgcccatactggtctcaaactcagctcaagtgatctgcccgcct2340cagcttcccaaagtgctgggattacaggcatgagccactgcgcccagcccggctttctca2400tctgtaaaatgggttgacaatgcccacccagataatggttgaaaggactcgtgaaaccac2460gtaggaggcacaggcagacaggcacttgtgggggtccatgaatgagcctcagtgccagct2520cccccaggccagcttccagccttcacactgtctgggccagaggagtcttcctaaaacaga2580ggactgtgtggagcacttctccacagagaagcctcttgcctcaagtcagtgacactgtcc2640tccagccccacccaactgtacatgtgcccaagctcatcatacttttcctcaaaccctgtc2700tgtcaggaaaactcctactcaccccgcaaaactccatgtgagatgcccactcgctcatct2760aaaatgcctcacaggattactctaagaaccaaagaagaatatacatgtgtgaacacatgg2820gcatggttgccaagtgaggggcatcacattcatgactgtccccattacttattagagcaa2880ccataaccaagaatgcagcggtgggcaggaagtgttactggggataggaattagcaggaa2940gtttttctggcttggaatttaagcccaactttggcagatggcagaattttcagagaggaa3000aggaggaaattggaggctagtgtggcagtgttaaatatggctgcaaagtccttggtcctt3060ctcccattgaagcgtgggccctatggcctctcctcttgaatccaggtgggcttgtgacta3120cttcagccaagacaatgcggcagaagtgttgttgggtaacttccaaggctcactcataaa3180agaccatatggcttataacttggagtcctaagttgccatctaagaaggaagttcaacaac3240ctgagacttccatgctgtgaggaagcccaagctccatgaggagtcacatgggggtgcact3300ggttgacagttccagccttccagccagcccagcccaggcaccagccatgcgaatgcagaa3360gccatcttggaagtggatccaccagcagcaggtgtcccggcccccagccatttgagttgt3420ctcgggtgagccactgaaccacacagagtagagtggagttgtccctactgtgccctttca3480ggacagaattcctgagcgtaataaagtggctgtagttttagtcactgttttggggctgtt3540tgttatgcagcactaattaactagaacaggtgagaagatcagaacttcctggtgcttaaa3600gccagccacacagcccctcgaagcaagattgtcttaatctggaagtcagtcccaagaaca3660ggttctccccagtgctctcagcattccccaccccagcctggcccataagcagtgcttggg3720gcatgcggggttgctggagcactcccaagccactcccaacacctggaaggagcctcccct3780cctcaggattctcagcggcgtttgcagcttggatgactgtggacccagaagctctgggga3840gttatccaggttctatgtggcatgagtatccctctgtgcctcagttttccacccatggaa3900tagggcacgaaactcataatctctctgatccctctcggctcctaccccaccttcctggag3960gccttgttcattctcatgtgtgtctcccccacatcctcttacccatgtgactctgcctgc4020catgaaagcaggagtcatgactgcagtctcacggttgaatgttctgcacctggcacccag4080cctaggccagaggatggatgccacaccactggtgttttctgaatgaatcaatgagtcagt4140caataaatggagtgaatgaatg4162<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2tggcttttgtcagcgtttcg20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3cactcgtgtctggtgctctt20<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>4ggagcgagatccctccaaaat21<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>5ggctgttgtcatacttctcatgg23當(dāng)前第1頁1 2 3