前列腺癌分類的制作方法
【專利摘要】提供了用于表征和/或預后受試者中的前列腺癌的方法，其包括測定來自所述受試者的樣品中的CREM、ERRFI1、SRSF5、PDK4、HJURP、PDRG1、TRPM3、PDE4D、F12、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、DKK1、EMP1、F3、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、OAT、PI15、PTGS2、RHOBTB3、RIN2、RNFT2、SELE、SLC15A2、SOCS2、SOCS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36中的至少一種的表達水平。所述方法可用于預測轉(zhuǎn)移的可能性。還公開了用于診斷和選擇用于前列腺癌的治療的方法，連同相應的治療方法。還提供了用于執(zhí)行所述方法的系統(tǒng)、試劑盒和計算機程序。
【專利說明】前列腺癌分類 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及前列腺癌。提供了依賴于生物標志物的用于表征和預后前列腺癌的方 法。還描述了可用于所述方法中的抗體、試劑盒和系統(tǒng)。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 前列腺癌是具有15.3%的終生發(fā)病率的男性中最常見的惡性腫瘤(Howlader 2012)。 基于1999-2006的數(shù)據(jù)，約80%的前列腺癌患者呈現(xiàn)臨床上限于前列腺的早期疾病(Altekruse 等人2010)，其中約65%通過手術(shù)切除或放射療法治愈(Kattan等人1999，?〇1111(1等人1999)。35% 將發(fā)展PSA復發(fā)，其中約35 %將發(fā)展局部或轉(zhuǎn)移性復發(fā)，這是不可治愈的。目前，不清楚哪些具 有早期前列腺癌的患者可能發(fā)展復發(fā)，并且可能得益于更強烈的療法。目前的預后因素諸如通 過Gleason評分測量的腫瘤分期具有預后價值，但顯著數(shù)目的被認為是較低分期(7或更小)的那 些仍然復發(fā)，并且一定比例的更高分期腫瘤則沒有。此外，在Gleason 7腫瘤的預后中存在顯著 異質(zhì)性(Makarov等人2002, Rasiah等人，2003)。此外，已經(jīng)變得明顯的是，Gleason評分的分期已 經(jīng)改變，導致Gleason評分的分布隨著時間變化(Albertsen等人2005, Smith等人，2002) 〇
[0004] 現(xiàn)在清楚的是，源自同一解剖部位的大多數(shù)實體瘤代表許多在分子水平不同的實 體(Perou等人2000) ANA微陣列平臺允許從存檔的石蠟包埋組織同時分析數(shù)以萬計的轉(zhuǎn)錄 物，并且理想地適合于鑒定分子亞組。這種方法已經(jīng)鑒定了實體瘤諸如乳腺癌(van ' t Veer 等人2002)和結(jié)腸癌(Bertucci等人2004)中的具有轉(zhuǎn)移潛能的原發(fā)性癌癥。
[0005] 發(fā)明描述
[0006] 本發(fā)明基于前列腺癌生物標志物的鑒定和驗證。
[0007] 本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了在分子水平類似于轉(zhuǎn)移性疾病的一組原發(fā)性前列腺癌。這些腫瘤 通過幾個基因和限定途徑的表達損失來定義;此外，該組通過導致參與有絲分裂的基因表達增加的 原癌基因 F0XM1的活化來定義。已經(jīng)定義了該亞組內(nèi)可以鑒定腫瘤的一系列生物標志物，其具有 多變量預后能力，并且可以用于前瞻性if價腫瘤是否處于增加的復發(fā)和/或轉(zhuǎn)移發(fā)展的可能性中。
[0008] 因此，在第一個方面，本發(fā)明提供用于表征和/或預后受試者中的前列腺癌的方 法，其包括：
[0009] 測定來自所述受試者的樣品中以下中的至少一種的表達水平：
[0010] F0XM1、TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、 CEBPD、CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、 LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、 RNFT2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36
[0011] 其中測定的表達水平用于提供所述前列腺癌的表征和/或預后。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的所有方面，所述前列腺癌可以是原發(fā)性前列腺癌。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的一個進一步方面，提供了用于診斷受試者中的具有增加的轉(zhuǎn)移潛能 的前列腺癌的方法，其包括：
[0014] 測定來自所述受試者的樣品中以下中的至少一種的表達水平：
[0015] F0XM1、TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、 CEBPD、CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、 LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、 RNFT2、SELE、SLC15A2、SOCS2、SOCS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36
[0016] 其中測定的表達水平用于鑒定受試者是否患有具有增加的轉(zhuǎn)移潛能的前列腺癌。
[0017] 在又一個進一步方面，本發(fā)明涉及用于診斷受試者中的具有增加的轉(zhuǎn)移潛能的前 列腺癌的方法，其包括：
[0018] 測定來自所述受試者的樣品中以下中的至少一種的表達水平：
[0019] TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12和PDK4
[0020] 其中測定的表達水平用于鑒定受試者是否患有具有增加的轉(zhuǎn)移潛能的前列腺癌。
[0021] 本發(fā)明還涉及用于表征和/或預后受試者中的前列腺癌的方法，其包括：
[0022] 測定來自所述受試者的樣品中以下中的至少一種的表達水平：
[0023 ] F0XM1、TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、 CEBPD、CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、 LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、 RNFT2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36
[0024] 以鑒定特征在于復發(fā)和/或轉(zhuǎn)移的增加可能性的細胞的存在或不存在，其中測定 的所述細胞的存在或不存在用于提供所述前列腺癌的表征/或預后。
[0025] 在一個進一步方面，本發(fā)明涉及用于表征和/或預后受試者中的前列腺癌的方法， 其包括：
[0026] a)從所述受試者獲得樣品
[0027] b)將對于以下中的至少一種的蛋白產(chǎn)物特異性的抗體應用于來自所述受試者的樣品：
[0028] F0XM1、TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、 CEBPD、CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、 LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、 RNFT2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36
[0029] c)應用檢測抗體-蛋白復合物的檢測試劑 [0030] d)使用所述檢測試劑以測定所述蛋白的水平
[0031] d)其中測定的蛋白的水平用于提供所述前列腺癌的表征和/或預后。
[0032] 前列腺癌的表征、預后或診斷也可用于指導治療。
[0033] 因此，在一個進一步方面，本發(fā)明涉及用于選擇受試者中的前列腺癌的治療的方 法，其包括：
[0034] (a)測定來自所述受試者的樣品中以下中的至少一種的表達水平：
[0035] F0XM1、TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、 CEBPD、CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、 LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、 RNFT2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36
[0036] 其中測定的表達水平用于提供所述前列腺癌的表征和/或預后，和
[0037] (b)選擇對于所述前列腺癌的表征和/或預后適當?shù)闹委煛?br>[0038] 在又一個進一步方面，本發(fā)明涉及用于選擇受試者中的前列腺癌的治療的方法， 其包括：
[0039] (a)測定來自所述受試者的樣品中以下中的至少一種的表達水平：
[0040] F0XM1、TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、 CEBPD、CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、 LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、 RNFT2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36
[0041 ]其中測定的表達水平用于提供所述前列腺癌的表征和/或預后
[0042] (b)選擇對于所述前列腺癌的表征和/或預后適當?shù)闹委?，?[0043] (c)用選擇的治療治療所述受試者。
[0044] 本發(fā)明還涉及治療前列腺癌的方法，其包括向受試者施用化療劑或放射療法，任 選擴大的放射療法，優(yōu)選擴野放射療法(extended-field radiotherapy)，或者對受試者實 施手術(shù)，其中基于本文所述的方法選擇所述受試者用于治療。
[0045] 在一個進一步方面，本發(fā)明涉及用于治療受試者中的前列腺癌的化療劑，其中基 于本文所述的方法選擇所述受試者用于治療。
[0046] 在又一個進一步方面，本發(fā)明涉及治療前列腺癌的方法，其包括向受試者施用化療 劑或放射療法，任選擴大的放射療法，優(yōu)選擴野放射療法(extended-field radiotherapy)， 或者對受試者實施手術(shù)，其中所述受試者具有HJURP、H)RG 1、TRPM3、FI 2、CENPF、RNFT2和 SSTR1中的至少一種的增加的表達水平和/或CREM、ERRFIl、SRSF5、PDK4、roE4D、ADAMTSl、 ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBPD、DKK1、EMP1、F3、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、SELE、 51^：1542、5(^52、5(^53、5了6641^1、了502201、乂8?1和2??36中的至少一種的降低的表達水平。
[0047] 本發(fā)明還涉及用于治療受試者中的前列腺癌的化療劑，其中所述受試者具有 HJURP、PDRGl、TRPM3、F12、CENPF、RNFT2和SSTRl中的至少一種的增加的表達水平和/或 CREM、ERRFI1、SRSF5、PDK4、PDE4D、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBPD、DKK1、EMP1、F3、 IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS 3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、 OAT、P115、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和 ZFP36中的至少一種的降低的表達水平。
[0048] 在某些實施方案中，所述化療劑包含以下，基本上由以下組成或由以下組成：
[0049] a)抗激素治療劑，優(yōu)選比卡魯胺和/或阿比特龍
[0050] b)細胞毒性劑
[0051 ] c)生物制品，優(yōu)選抗體和/或疫苗，更優(yōu)選Sipuleucel-T和/或 [0052] d)靶向的治療劑。
[0053] 本文進一步詳細地討論合適的療法和治療劑。
[0054] 下表A進一步詳細地描述和定義基因 F0XM1、TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、 PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRFI1、F3、HJURP、 IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS 3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、 0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、 TSC22D1、XBP1和ZFP36以及它們的蛋白產(chǎn)物。所述基因也可以被互換地稱為生物標志物。
[0055]
[0064] 在某些實施方案中，測定以下中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、 41、42、43、44、45或46種的表達水平：
[0065] TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBPD、 CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、 SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和 ZFP36。在一些實施方案中，可以將 F0XM1添加至實驗對象組。
[0066] 或者，測定以下中的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45或46種 的組群中的至少一種的表達水平：
[0067] TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBPD、 CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、 SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP 1 和 ZFP36。在一些實施方案中，該組群 中可以包括F0XM1。
[0068] 在某些實施方案中，測定以下中的至少一種的表達水平：
[0069] TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、PDK4、F12、F3、HJURP、CENPF、MYBPC1、SELE、CEBro和 XBPlo
[0070] 在某些實施方案中，測定以下中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13種的表達 水平：
[0071 ] TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、PDK4、F12、F3、HJURP、CENPF、MYBPC1、SELE、CEBro和 XBPlo
[0072] 表征意指前列腺癌的分類和/或評估。預后是指預測受試者的前列腺癌的可能后 果。診斷意指鑒定前列腺癌的存在。
[0073] 根據(jù)本發(fā)明的所有方面，前列腺癌的表征和/或預后可以包括預測復發(fā)的增加可 能性，基本上由其組成，或由其組成。前列腺癌的表征和/或預后可以包括預測減少的復發(fā) 時間，基本上由其組成，或由其組成。復發(fā)可以是臨床復發(fā)或生物化學復發(fā)。生物化學復發(fā) 意指在治療前列腺癌之后受試者中PSA的水平的上升。生物化學復發(fā)可以表明前列腺癌沒 有得到有效治療或已經(jīng)復發(fā)。
[0074] 前列腺癌的表征和/或預后可以包括預測轉(zhuǎn)移的增加可能性，基本上由其組成，或 由其組成。
[0075] 轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)移性疾病，是癌癥從一個器官或部分擴散到另一個不相鄰的器官或部 分。因此生成的疾病的新的發(fā)生被稱為轉(zhuǎn)移。
[0076] 前列腺癌的表征和/或預后也可以包括確定前列腺癌是否具有不良預后，基本上 由其組成，或由其組成。不良預后可以是原因特異性（即癌癥特異性)或長期存活的降低可 能性。原因或癌癥特異性存活是代表在沒有其它死亡原因的情況下的癌癥存活的凈存活量 度。癌癥存活可以持續(xù)6、7、8、9、10、11、12個月或1、2、3、4、5等年。長期存活可以是診斷后存 活1年、5年、10年或20年。具有不良預后的前列腺癌可以是侵襲性的，快速生長的，和/或顯 示對治療的耐受性。
[0077] 在某些實施方案中，TRPM3、PDRG1、F12、CENPF、HJURP、RNFT2和SSTR1中的至少一種 或F0XM1的增加的表達水平表明復發(fā)和/或轉(zhuǎn)移和/或不良預后的增加可能性。在進一步實 施方案中，SRSF5、PDE4D、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBPD、CREM、DKK1、EMP1、 ERRFI1、F3、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、 NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、ST6GAL1、 TSC22D1、XBP1和ZFP36中的至少一種的降低的表達水平表明復發(fā)和/或轉(zhuǎn)移和/或不良預后 的增加可能性。
[0078] 在某些實施方案中，本文描述的方法可以包括測定TRPM3、PDRG1、F12、CENPF、 HJURP、RNFT2 和 SSTR1 中的至少一種或 F0XM1 和 SRSF5、PDE4D、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、 B3GNT5、CD38、CEBPD、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、IL1Rl、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、 LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、 SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、ST6GAL1、TSC22D1、XBP 1 和 ZFP36 中的至少一種的表達水平。因 此，所述方法可以依賴于上調(diào)的標志物和下調(diào)的標志物的組合。
[0079] 在某些實施方案中，本文描述的方法包括將所述表達水平與參考值或與一種或多 種對照樣品中的表達水平或相同樣品中的一種或多種對照細胞中的表達水平進行比較。對 照細胞可以是正常細胞（即，通過獨立方法表征為非癌性的細胞）。一種或多種對照樣品可 以由非癌細胞組成，或者可以包括前列腺癌細胞和非癌細胞的混合物?？梢詫⑺霰磉_水 平與一種或多種對照樣品或?qū)φ占毎械南嗤虻谋磉_水平進行比較。
[0080] 參考值可以是通過測定來自有和沒有前列腺癌的受試者的一定范圍的樣品中的 水平而設置的至少一種基因的表達的閾值水平。前列腺癌可以是有或沒有復發(fā)和/或轉(zhuǎn)移 和/或不良預后的增加可能性的前列腺癌。用于設置閾值的合適方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾 所周知的。所述閾值可以從患者數(shù)據(jù)的訓練集數(shù)學推導。評分閾值因此根據(jù)特定條件的存 在或不存在分離測試樣品。可以在開發(fā)或訓練階段從具有已知后果的患者集合推導出該量 (即，截止閾值）的解釋。因此可以在通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法從訓練數(shù)據(jù)進行請求 保護的方法之前固定所述閾值。
[0081] 參考值也可以是通過測定在第一時間點來自受試者的樣品中的至少一種基因的 表達水平而設置的至少一種基因的表達的閾值水平。然后將測定的相同受試者在隨后時間 點的表達水平與閾值水平進行比較。因此，可以使用本發(fā)明的方法以監(jiān)測受試者中的疾病 的進展，即提供受試者中的疾病的持續(xù)表征和/或預后。例如，可以使用所述方法以鑒定已 經(jīng)發(fā)展為侵襲性更強或潛在的轉(zhuǎn)移性形式的前列腺癌。這可以用于指導治療決定，如本文 進一步詳細討論。
[0082]對于表達水平在正常細胞和來自不具有復發(fā)和/或轉(zhuǎn)移和/或不良預后的增加可 能性的前列腺癌的細胞之間沒有差異的基因，相同樣品中的正常細胞中的相同基因的表達 水平可以用作對照。
[0083]因此，在具體實施方案中，將樣品中的前列腺癌細胞中的TRPM3、PDRG1、SRSF5、 PDE4D、F12和TOK4中的至少一種的表達水平與相同樣品中的正常細胞中的相同基因的表達 水平進行比較。
[0084] 在具體實施方案中，如果測定的樣品中的前列腺癌細胞中的TRPM3、TORG1、SRSF5、 PDE4D、F12和PDK4中的至少一種的表達水平與相同樣品中的正常細胞相比沒有不同，則所 述前列腺癌不具有復發(fā)和/或轉(zhuǎn)移和/或不良預后的增加可能性。
[0085]不同可以是統(tǒng)計學顯著性不同的。統(tǒng)計學顯著意指不可能僅僅偶然發(fā)生。合適的 統(tǒng)計學評價可以根據(jù)任何合適的方法進行。
[0086] 在具體實施方案中，如果所述基因是TRPM3JDRG1或F12且表達水平在樣品中的前 列腺癌細胞中相對于相同樣品中的正常細胞增加，則所述前列腺癌具有復發(fā)和/或轉(zhuǎn)移和/ 或不良預后的增加可能性。
[0087] 在具體實施方案中，如果所述基因是SRSF5、PDE4D或PDK4且表達水平在樣品中的 前列腺癌細胞中相對于樣品中的正常細胞降低，則所述前列腺癌具有復發(fā)和/或轉(zhuǎn)移和/或 不良預后的增加可能性。
[0088] 本文描述的方法可以進一步包括測定參考基因的表達水平。如果目標基因表達水 平在正常細胞和來自不具有復發(fā)和/或轉(zhuǎn)移和/或不良預后的增加可能性的前列腺癌的細 胞之間不同，則可以需要參考基因。
[0089] 在某些實施方案中，將ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBro、CENPF、CREM、DKK1、 EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、LPAR1、MALAT1、 MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、SLC15A2、 50〇52、5(^53、55了1?1、5了66六1^1、了502201、乂8?1和2??36中的至少一種的表達水平與參考基因 的表達水平進行比較。
[0090] 所述參考基因可以是在所有前列腺癌樣品中具有最小表達方差的任何基因。因 此，所述參考基因可以表達水平不會隨著復發(fā)和/或轉(zhuǎn)移和/或不良預后的可能性變化的任 何基因。技術(shù)人員能夠很好地基于這些標準鑒定合適的參考基因。具體而言，所述參考基因 可以是TPT1、RPS14或RPL37A?？梢栽谂c以下中的至少一種的表達水平相同的樣品中測定所 述參考基因的表達水平：
[0091] ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRFI1、F3、 HJURP、IL1Rl、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、 NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、 ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36。
[0092] 可以在不同的樣品中測定所述參考基因的表達水平。不同的樣品可以是如上所述 的對照樣品?？梢栽跇悠分械恼：?或前列腺癌細胞中測定所述參考基因的表達水平。
[0093] 可以使用統(tǒng)計學模型分析來自受試者的樣品中的至少一種基因的表達水平。在其 中測量至少2種基因的表達水平的具體實施方案中，所述基因可以被加權(quán)。如本文所使用， 術(shù)語"權(quán)重"是指統(tǒng)計學計算中項目的相對重要性。每種基因的權(quán)重可以使用本領(lǐng)域中已知 的分析方法在患者樣品的數(shù)據(jù)集上來確定?？梢杂嬎憧傇u分并將其用于提供前列腺癌的表 征和/或預后。
[0094] 本文更詳細描述用于測定標志物的表達水平的方法。典型地，所述方法可以涉及 使獲得自受試者的樣品與檢測試劑諸如對于標志物特異性的引物/探針/抗體(如本文詳細 討論)接觸并檢測表達產(chǎn)物。針對對照樣品中測定的表達水平進行比較以提供前列腺癌的 表征和/或預后。
[0095] 根據(jù)本發(fā)明的所有方面，可以通過任何合適的方法測量一種或多種基因的表達水 平。在某些實施方案中，在蛋白、RNA或表觀遺傳修飾的水平測定表達水平。表觀遺傳修飾可 以是DNA甲基化。
[0096] 可以通過免疫組織化學測定表達水平。免疫組織化學意指通過使用特異性結(jié)合至 蛋白的結(jié)合劑諸如抗體或適配子而檢測組織樣品的細胞中的蛋白。因此，如通過免疫組織 化學測定的表達水平是蛋白水平。所述樣品可以是前列腺組織樣品，并且可以包含前列腺 癌（腫瘤)細胞，前列腺上皮內(nèi)腫瘤(PIN)細胞，正常前列腺上皮，基質(zhì)和任選的浸潤性免疫 細胞。在一些實施方案中，將樣品中的前列腺癌（腫瘤)細胞中的至少一種基因的表達水平 與相同樣品中的正常細胞中的相同基因（和/或參考基因）的表達水平進行比較。在一些實 施方案中，將樣品中的前列腺癌(腫瘤)細胞中的至少一種基因的表達水平與對照樣品中的 正常細胞中的相同基因（和/或參考基因）的表達水平進行比較。正常細胞可以包含正常(非 癌）前列腺上皮細胞，基本上由其組成，或由其組成。在某些實施方案中，正常細胞不包含 PIN細胞和/或基質(zhì)細胞。在某些實施方案中，前列腺癌(腫瘤)細胞不包含PIN細胞和/或基 質(zhì)細胞。在進一步實施方案中，將樣品中的前列腺癌（腫瘤)細胞中的至少一種基因的表達 水平(額外地)與對照樣品中的相同細胞或前列腺癌細胞中的參考基因的表達水平進行比 較。所述參考基因可以是TPTURPS14或RPL37A。在又進一步實施方案中，使用基于前列腺癌 (腫瘤)細胞(不與正常細胞相比）中的表達的強度、比例和/或定位的方法對樣品中的前列 腺癌(腫瘤)細胞中的至少一種基因的表達水平進行評分?？梢栽陂_發(fā)或訓練階段從具有已 知后果的患者集合推導出評分方法。
[0097]因此，在一個進一步方面，本發(fā)明涉及特異性結(jié)合至以下中的至少一種的蛋白產(chǎn) 物的抗體或適配子：
[0098] F0XM1、TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、 CEBPD、CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、 LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、 RNFT2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36。
[0099] 所述抗體可以是單克隆或多克隆來源的。也可以利用片段和衍生物抗體，包括但 不限于Fab片段、ScFv、單結(jié)構(gòu)域抗體、納米抗體、重鏈抗體，適配子等，其保留肽特異性結(jié)合 功能，并且這些都包括在"抗體"的定義中。這樣的抗體可用于本發(fā)明的方法中。它們可以用 于測量特定蛋白、或在一些情況下蛋白的一種或多種特定同種型的水平。技術(shù)人員完全能 夠鑒定允許將特定同種型與彼此區(qū)分的表位。
[0100] 用于生成特異性抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。抗體可以是人或非人來源 的（例如嚙齒動物，諸如大鼠或小鼠），并且可以根據(jù)已知技術(shù)進行人源化等(Jones等人， Nature(1986)May 29-Jun · 4; 321 (6069): 522-5 ; Roguska等人，Protein Engineering， 1996,9(10) :895_904;和Studnicka等人，Humanizing Mouse Antibody Frameworks While Preserving 3-D Structure.Protein Engineering,1994,Vo1.7,pg 805)。
[0101] 在某些實施方案中，使用與標記綴合的抗體或適配子測定表達水平。標記意指允 許直接或間接檢測的組分。例如，所述標記可以是酶，任選過氧化物酶，或熒光團。
[0102] 標記是檢測試劑的實例。檢測試劑意指可以用于協(xié)助檢測抗體-蛋白復合物的試 劑。當抗體與酶綴合時，檢測試劑可以包含化學組成，使得所述酶催化化學反應以產(chǎn)生可檢 測的產(chǎn)物。由適當?shù)拿复呋姆磻漠a(chǎn)物可以是，但不限于，熒光產(chǎn)物、發(fā)光產(chǎn)物或放射活 性產(chǎn)物，或者它們可吸收可見光或紫外線。適用于檢測這樣的可檢測的標記的檢測儀的實 例包括，但不限于，X-射線膜、放射性計數(shù)器、閃爍計數(shù)器、分光光度計、比色計、熒光光度 計、光度計和光密度計。在某些實施方案中，所述檢測試劑可以包含二抗。然后使用未標記 的結(jié)合至目標蛋白的一抗和與標記綴合的二抗測定表達水平，其中所述第二抗體結(jié)合至所 述一抗。
[0103] 本發(fā)明還涉及如上所述的抗體用于表征和/或預后受試者中的前列腺癌的用途。
[0104] 用于在蛋白水平測定表達水平的額外技術(shù)包括，例如，Western印跡、免疫沉淀、免 疫細胞化學法、質(zhì)譜、ELISA和其它(參見ImmunoAssay:A Practical Guide,由Brian Law編 輯，由1371<^&?瓜11(^8，1^(1.出版，2005版）。為了改進基于免疫反應性的測定方法的特異性 和靈敏度，單克隆抗體因為其特異性表位識別而經(jīng)常得到使用。多克隆抗體因為它們與單 克隆抗體相比對于目標的增加親和力而也已成功地用于許多免疫測定中。
[0105] 本發(fā)明的方法中可以使用或本發(fā)明的試劑盒中可以包括的合適的抗體列于下表B 中：
[0106]表B-結(jié)合至本發(fā)明的標志物的抗體的實例
[0111] 測量生物樣品中的mRNA可用作檢測生物樣品中的相應蛋白水平的替代方案。因 此，本文描述的任何基因的表達水平還可通過檢測適當?shù)腞NA來檢測。
[0112] 因此，在具體實施方案中，通過微陣列、northern印跡、RNA_seq(RNA測序）、原位 RNA檢測或核酸擴增測定表達水平。核酸擴增包括PCR及其所有變體諸如實時和終點方法和 qPCR。其它核酸擴增技術(shù)是本領(lǐng)域中眾所周知的，并且包括方法諸如NASBA、3SR和轉(zhuǎn)錄介導 的擴增(TMA)。其它合適的擴增方法包括連接酶鏈式反應(LCR)、目標多核苷酸序列的選擇 性擴增（美國專利號6,410,276)、共有序列引發(fā)的聚合酶鏈式反應（美國專利號4,437， 975)、任意引發(fā)的聚合酶鏈式反應(W0 90/06995)、侵入者技術(shù)、鏈置換技術(shù)和缺口置換擴 增(W0 2004/067726)。該列表并不意欲是窮盡的；可以使用任何核酸擴增技術(shù)，條件是特異 性擴增適當?shù)暮怂岙a(chǎn)物。合適的引物和/或探針的設計在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)?？梢?免費得到各種引物設計工具以協(xié)助該過程，諸如NCBI Primer-BLAST工具。引物和/或探針 可以是至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個(或更多個)核苷酸的長度。可以通過 逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR，隨后qPCR)測量mRNA的表達水平。RT-PCR用于從mRNA 生成cDNA^DNA可用于qPCR測定中以便隨著DNA擴增過程進行而產(chǎn)生熒光。通過與標準曲線 比較，qPCR可以產(chǎn)生絕對測量值，諸如每個細胞的mRNA的拷貝數(shù)。Northern印跡、微陣列、侵 入測定和與毛細管電泳組合的RT-PCR均已用于測量樣品中的mRNA的表達水平。參見Gene Expression Prof iling:Methods and Protocols ,Richard A. Shimkets，編輯，Humana Press,2004〇
[0113] RNA-seq使用下一代測序以測量基因表達的改變。RNA可以轉(zhuǎn)化為cDNA或直接測 序。下一代測序技術(shù)包括焦磷酸測序、SOLiD測序、IonTorrent半導體測序、Illumina測序染 料、單分子實時測序或DNA納米球測序。
[0114] 原位RNA檢測涉及在不從組織和細胞提取的情況下檢測RNA。原位RNA檢測包括原 位雜交（ISH)，其使用標記的（例如，放射標記的，抗原標記的或焚光標記的）探針(互補DNA 或RNA鏈），以便將特定RNA序列定位于組織的部分或區(qū)域中，或者整個組織（整個包封的 ISH)中，或細胞中?？梢苑謩e使用放射自顯影、熒光顯微鏡或免疫組織化學在組織中定位和 定量用放射、熒光或抗原標記的基質(zhì)（例如，地高辛）標記的探針。ISH也可以使用兩種或更 多種探針同時檢測兩種或更多種轉(zhuǎn)錄物。分支DNA測定也可用于具有單分子靈敏度的RNA原 位雜交測定。該方法包括ViewRNA測定。將樣品（細胞，組織)是固定，然后處理，以允許RNA目 標可及(RNA未掩蔽）。目標特異性探針雜交至各目標RNA。隨后的信號擴增基于相鄰探針（即 在RNA目標上并排結(jié)合的個體寡核苷酸)的特異性雜交。典型的目標特異性探針將含有40個 寡核苷酸。經(jīng)由一系列相繼雜交步驟實現(xiàn)信號擴增。預擴增分子雜交至目標特異性RNA上的 各寡核苷酸對，然后多個擴增分子雜交至各預擴增分子。接下來，多個標記探針寡核苷酸 (綴合至酶諸如堿性磷酸酶或直接綴合至熒光團）雜交至各擴增分子。分開但相容的信號擴 增系統(tǒng)能夠進行多重測定?？梢酝ㄟ^測量根據(jù)所用的檢測系統(tǒng)發(fā)射的熒光或光顯現(xiàn)信號。 在一些實施方案中，檢測可以涉及使用高含量成像系統(tǒng)，或熒光或明場顯微鏡。
[0115] 因此，在一個進一步方面，本發(fā)明涉及用于(原位)表征和/或預后受試者中的前列 腺癌的試劑盒，其包含對于以下中的至少一種的RNA產(chǎn)物特異性的一種或多種寡核苷酸探 針：F0XM1、TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBPD、 CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、 SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36。
[0116] 所述試劑盒可以進一步包含以下組分中的一種或多種：
[0117] a)阻斷探針 [0118] b)預擴增分子
[0119] c)擴增分子和/或
[0120] d)標記分子
[0121 ] 所述試劑盒的組分可以適合于進行viewRNA測定（https ://www.panomics · com/ products/rna-in-situ-analysis/view_rna-〇verview)〇
[0122] 所述試劑盒的組分可以是基于核酸的分子，任選DNA(或RNA)。阻斷探針是起作用 以通過結(jié)合至目標上不被目標特異性探針(對于本發(fā)明的至少一種基因的RNA產(chǎn)物特異性 的探針）結(jié)合的位點而減少背景信號的分子。預擴增分子是當目標結(jié)合時能夠結(jié)合至（一 對）目標特異性探針的分子。擴增分子是能夠結(jié)合至預擴增分子的分子?；蛘?，預擴增分子 當目標結(jié)合時能夠直接結(jié)合至(一對）目標特異性探針。擴增分子具有用于多個標記分子的 結(jié)合位點（其可以是標記探針）。
[0123] 本發(fā)明還涉及所述試劑盒用于表征和/或預后前列腺癌的用途。
[0124] 可以通過RNA與一組探針的雜交測定RNA表達。該探針可以排列于陣列中。微陣列 平臺包括由公司諸如4€€}〇1161：1^1、11111111；[仙和48；[16111:制造的平臺。由4€€501161：1^1制造的微 陣列平臺的實例包括U133Plus2陣列、Almac專有Xcel?陣列和Almac專有癌癥DSAs? ,包 括前列腺癌DSA?。
[0125] 在具體實施方案中，可以使用選自下表C中的探針的一種或多種探針來測定至少 一種基因的表達：
[0126] 表C-用于測量陣列上的基因的表達水平的探針列表。
[0132] 這些探針還可以并入本發(fā)明的試劑盒。還可以使用探針序列，以便設計用于例如 通過RT-PCR檢測表達的引物。這樣的引物也可包括于本發(fā)明的試劑盒中。
[0133] 已經(jīng)顯示啟動子處或附近的DNA甲基化的增加率與降低的基因表達水平相關(guān)。DNA 甲基化是人中的主要表觀遺傳修飾。它是由被稱為甲基轉(zhuǎn)移酶的酶進行的DNA的化學修飾， 其中將甲基(m)添加至DNA中的特定胞嘧啶(C)殘基。在哺乳動物中，甲基化僅在鄰近于鳥苷 殘基的胞嘧啶殘基處，即，在序列CG處或在CpG二核苷酸處，發(fā)生。
[0134] 因此，在又一個進一步方面，本發(fā)明涉及用于表征和/或預后受試者中的前列腺癌 的方法，其包括：
[0135] 測定來自所述受試者的樣品中以下中的至少一種的甲基化狀態(tài)：
[0136] ADAMTS9、EMP1、F3、LDLR、LGALS3、MALAT1、MTUS1、NR4A3、PTGS2、RIN2、SLC15A2、 S0CS3和TSC22D1
[0137] 其中測定的甲基化狀態(tài)用于提供所述前列腺癌的表征和/或預后。
[0138] 在某些實施方案中，如果ADAMTS9、EMP1、F3、LDLR、LGALS3、MALAT1、MTUS1、NR4A3、 PTGS2、RIN2、SLC15A2、S0CS3和TSC22D1中的至少一種被(過度）甲基化，則復發(fā)和/或轉(zhuǎn)移的 可能性增加。
[0139] 可以通過任何合適的方式來實現(xiàn)甲基化狀態(tài)的測定。合適的實例包括亞硫酸氫鹽 基因組測序和/或通過甲基化特異性PCR。用于評價甲基化狀態(tài)的各種技術(shù)是本領(lǐng)域中已知 的，并且可以與本發(fā)明結(jié)合使用:測序，甲基化特異性PCR(MS-PCR)，熔解曲線甲基化特異性 PCR(McMS-PCR)，有或沒有亞硫酸氫鹽處理的MLPA，QAMA(Zeschnigk等人，2004)，MSRE-PCR (]\^1]1丨1?)￥等人，2005)，]\^1:1171^8111:化&(18等人，2000)，&3111^8111：-]\^?(1^11(1等人，2002)，亞 硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化特異性的甲基化特異性PCR(BS-MSP)( Sasaki等人，2003)，COBRA(依賴于使用 限制性酶以揭示亞硫酸氫鈉-處理的DNA的PCR產(chǎn)物的甲基化依賴性序列差異），甲基化敏感 的單核苷酸引物延伸驗證(MS-SNuPE)，甲基化敏感的單鏈驗證分析(MS-SSCA)，熔解曲線組 合的亞硫酸氫鹽限制性分析（McCOBRA) (Akey等人，2002)，PyroMethA，HeavyMethyl (Cottrell等人2004)，MALDI-TOF，MassARRAY，甲基化的等位基因的定量分析(QAMA)，酶促 區(qū)域甲基化檢測(ERMA)，QBSUPT，MethylQuant，定量PCR測序和基于寡核苷酸的微陣列系 統(tǒng)，焦磷酸測序，Me th-DOP-PCR。一些可用于DNA甲基化分析的技術(shù)的綜述提供于Nuc 1 e i c acids research,1998,Vol.26,No.10,2255-2264,Nature Reviews,2003,Vol.3,253-266； Oral Oncology,2006,Vol.42,5-13〇
[0140] 用于評價甲基化狀態(tài)的技術(shù)基于不同的方法。一些包括使用核酸內(nèi)切酶。這樣的 內(nèi)切核酸酶可以相對于未甲基化的識別位點優(yōu)先切割甲基化的識別位點，或者相對于甲基 化的識別位點優(yōu)先切割未甲基化的識別位點。前者的一些實例是Acc III、Ban I、BstN I、 Msp I和Xma I。后者的實例是Acc II、Ava I、BssH II、BstU I、Hpa II和Not I。切割模式的 差異表明甲基化的CpG二核苷酸的存在或不存在。切割模式可以直接檢測，或者在生成可容 易區(qū)分的產(chǎn)物的進一步反應之后進行檢測。檢測改變的大小和/或電荷的方式可以用于檢 測修飾的產(chǎn)物，包括但不限于電泳、色譜和質(zhì)譜。
[0141] 或者，甲基化的CpG二核苷酸的鑒定可以利用MeCP2蛋白的甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域(MBD) 選擇性結(jié)合至甲基化DNA序列的能力（Cross等人，1994;Shiraishi等人，1999) JBD還可以 從1??、冊?2、1??4、聚-1?0(加找61^11等人，2006)或試劑諸如結(jié)合至甲基化核酸的抗體獲 得?？梢詫BD固定至固相基質(zhì)，且用于制備型柱層析來分離高度甲基化的DNA序列。變體形 式諸如表達的His標記的甲基化-CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以用來選擇性結(jié)合至甲基化的DNA序列。 最終，使限制性內(nèi)切核酸酶消化的基因組DNA與表達的His標記的甲基-CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域接 觸。其它方法是本領(lǐng)域中眾所周知的，且尤其包括甲基化的CpG島回收測定(MIRA)。另一種 方法，MB-PCR，使用固定化于PCR容器的壁上以捕獲甲基化的DNA的重組的二價甲基-CpG-結(jié) 合多肽和隨后通過PCR檢測結(jié)合的甲基化DNA。
[0142] 用于檢測甲基化的CpG二核苷酸基序的進一步方法使用選擇性修飾CpG二核苷酸 基序的甲基化或未甲基化的形式的化學試劑。合適的化學試劑包括肼和亞硫酸氫根離子。 在某些實施方案中，本發(fā)明的方法可以使用亞硫酸氫根離子。亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化依賴于用亞 硫酸氫鈉處理DNA樣品，其將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶得到保持 (Furuichi等人，1970)。該轉(zhuǎn)化最終導致初始DNA的序列的變化。眾所周知，所得尿嘧啶具有 胸腺嘧啶的堿基配對行為，這不同于胞嘧啶堿基配對行為。這使得甲基化和未甲基化的胞 嘧啶之間的區(qū)分變得可能。用于評價序列差異的分子生物學和核酸化學的有用常規(guī)技術(shù)是 本領(lǐng)域中眾所周知的并在文獻中解釋。參見，例如，Sambrook，J .，等人，Molecular cloning:A laboratory Manual ,(2001)第3版，Cold Spring Harbor,NY;Gait，M.J.(編 輯），01igonucleotide Synthesis , A Practical Approach,IRL Press(1984)；Hames B.D.，和Higgins,S.J.(編輯），Nucleic Acid Hybridization,A Practical Approach,IRL Press(1985);和系列，Methods in Enzymology,Academic Press,Inc〇
[0143] -些技術(shù)使用用于評價在CpG二核苷酸的甲基化狀態(tài)的引物。兩種引物設計的方 法是可能的。首先，可以設計本身不覆蓋DNA甲基化的任何潛在位點的引物。在差異甲基化 位點處的序列變異位于兩個引物之間，并且序列變異的顯現(xiàn)需要進一步的測定步驟。這樣 的引物用于亞硫酸氫鹽基因組測序、C0BRA、Ms-SnuPE和幾種其他技術(shù)中。其次，可以設計與 初始處理的序列的甲基化或未甲基化版本特異性雜交的引物。雜交之后，可進行擴增反應， 使用本領(lǐng)域已知的任何檢測系統(tǒng)測定擴增產(chǎn)物。擴增產(chǎn)物的存在表明所述樣品與引物雜 交。所述引物的特異性表明DNA是否已經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾，其進而表明DNA是否已被甲基化。 如果與目標具有足夠的互補區(qū)域，例如12、15、18或20個核苷酸，則所述引物還可含有不干 擾雜交但可用于其它操作的額外核苷酸殘基。這樣的其它殘基的實例可以是限制性內(nèi)切核 酸酶切割位點，配體結(jié)合位點或者因子結(jié)合或接頭或重復。寡核苷酸引物可以使得或者可 以不使得它們對于修飾的甲基化殘基是特異性的。
[0144] 區(qū)分修飾和未修飾的核酸的進一步方式是使用寡核苷酸探針。這樣的探針可以直 接雜交至修飾的核酸或修飾的核酸的進一步產(chǎn)物，諸如通過擴增獲得的產(chǎn)物。基于探針的 測定利用寡核苷酸與特異性序列的雜交以及隨后對該雜交物的檢測。也可以在檢測擴增產(chǎn) 物之前存在進一步的純化步驟，例如沉淀步驟?？梢允褂萌魏伪绢I(lǐng)域中已知的檢測系統(tǒng)標 記寡核苷酸探針。這些包括但不限于:熒光部分、放射性同位素標記部分、生物發(fā)光部分、發(fā) 光部分、化學發(fā)光部分、酶、底物、受體或配體。
[0145] 在MSP方法中，可以使用引物對擴增DNA，所述引物對經(jīng)設計通過利用由于鈉亞硫 酸氫處理導致的序列差異來區(qū)分甲基化DNA與未甲基化DNA(W0 97/46705)。例如，亞硫酸氫 根離子修飾未甲基化的胞嘧啶堿基，將它們變?yōu)槟蜞奏A基。在雜交條件下，尿嘧啶堿基與 腺嘌呤堿基雜交。因此，包含替代鳥嘌呤堿基的腺嘌呤堿基的寡核苷酸引物會與亞硫酸氫 根修飾的DNA雜交，而含有鳥嘌呤堿基的寡核苷酸引物會與DNA中未修飾的（甲基化的)胞嘧 啶殘基雜交。使用DNA聚合酶和第二引物的擴增得到擴增產(chǎn)物，所述擴增產(chǎn)物可以容易觀察 到，這進而表明DNA是否已經(jīng)被甲基化。盡管PCR是優(yōu)選的擴增方法，本發(fā)明的范圍內(nèi)也包括 該基本技術(shù)的變體，諸如巢式PCR和多重PCR。
[0146] 如前所提及，用于評價相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)的一個實施方案需要擴增以產(chǎn)生擴 增產(chǎn)物。擴增產(chǎn)物的存在可以使用本領(lǐng)域中眾所周知的方法直接評價。它們可以簡單地在 合適的凝膠諸如瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠上顯現(xiàn)。檢測可以涉及，例如，特定染料(諸如插 入雙鏈DNA的溴化乙錠）的結(jié)合和在UV照射器下DNA條帶的顯現(xiàn)。用于檢測擴增產(chǎn)物的另一 種方式包含與寡核苷酸探針雜交?；蛘撸梢詼y量熒光或能量轉(zhuǎn)移以測定甲基化DNA的存 在。
[0147] MSP技術(shù)的一個特定實例被稱為實時定量MSP(QMSP)，并且允許實時或在端點可靠 定量甲基化的DNA。實時方法一般是基于連續(xù)光學監(jiān)測擴增程序，并且利用熒光標記的試 劑，所述試劑在產(chǎn)物中的摻入可以進行定量，并且其定量表明模板中該序列的拷貝數(shù)。一種 這樣的試劑是熒光染料，被稱為SYBR Green I，其優(yōu)先結(jié)合雙鏈DNA，且雙鏈DNA的結(jié)合大大 增強了其熒光?；蛘?，標記的引物和/或標記的探針可用于定量。它們代表了眾所周知的市 售實時擴增技術(shù)的具體應用，諸如TACJMAN?、molecularBEACONS?、 AMPLIFLUOR?和 SCORPION?、DzyNA?、pi exorTM 等。在實時pcr系統(tǒng)中，可 以在指數(shù)期過程中監(jiān)測PCR反應，在所述指數(shù)期過程中，PCR產(chǎn)物的量的首先顯著增加與目 標模板的初始量相關(guān)。
[0148] 實時PCR檢測反應過程中擴增子的積累。然而，不需要利用實時方法。許多應用不 需要定量，且實時PCR技術(shù)僅用作獲得便利的結(jié)果呈現(xiàn)和儲存且同時避免PCR后處理的工 具。因此，可以僅進行分析以證實目標DNA是否存在于樣品中。在擴增反應已經(jīng)完成之后進 行這樣的終點驗證。
[0149] 根據(jù)本發(fā)明的所有方面，測定以下中的至少一種的表達水平
[0150] F0XM1、TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、 CEBPD、CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、 LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、 RNFT2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36
[0151] 可以涉及測定從所述基因產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物和/或蛋白同種型的所有或選擇物的水 平。對于各基因可以檢測的轉(zhuǎn)錄物和相應的蛋白同種型的實例顯示于下表D:
[0152] 表D-本發(fā)明中可以檢測的代表性轉(zhuǎn)錄物和相應的蛋白同種型
[0161] 本文所述的方法可以進一步包括從樣品提取總核酸或RNA。合適的方法是本領(lǐng)域 中已知的，并且包括使用商業(yè)可得的試劑盒諸如Rneasy和GeneJET RNA純化試劑盒。
[0162] 在某些實施方案中，所述方法可以進一步包括從受試者獲得樣品。典型地，所述方 法是在分離的樣品上進行的體外方法。
[0163] 根據(jù)本發(fā)明的所有方面，樣品可以是任何合適的形式。所述樣品可以包含前列腺 細胞，基本上由其組成，或由其組成，且經(jīng)常是前列腺組織樣品。前列腺細胞或組織可以包 含前列腺癌細胞。在具體實施方案中，所述樣品包含福爾馬林固定的石蠟包埋的活檢樣品， 基本上由其組成，或由其組成。組織樣品可以通過任何合適的技術(shù)獲得。實例包括活檢程 序，任選細針抽吸活檢程序。也可以利用體液樣品。合適的樣品類型包括血液，以涵蓋全血、 血清和血漿樣品、尿液和精液。
[0164] 本發(fā)明的方法可以包括選擇受試者中的前列腺癌的治療和任選進行所述治療。在 某些實施方案中，如果前列腺癌的表征和/或預后結(jié)果是復發(fā)和/或轉(zhuǎn)移和/或不良預后的 增加可能性，則選擇的治療是以下中的一種或多種：
[0165] a)抗激素治療
[0166] b)細胞毒性劑
[0167] c)生物制品
[0168] d)放射療法
[0169] e)靶向療法
[0170] f)手術(shù)
[0171] 抗激素治療(或激素療法)意指降低選擇的激素(特別是睪酮)的水平和/或活性的 治療形式。所述激素可以促進腫瘤生長和/或轉(zhuǎn)移。抗激素治療可以包含促黃體激素阻斷 劑，諸如戈舍瑞林（也稱為Zoladex)、布舍瑞林、亮丙瑞林（也稱為Pros tap)、組氨瑞林 (Vantas)和曲普瑞林(也稱為Decapeptyl)。所述抗激素治療可以包含促性腺激素釋放激素 (GnRH)阻滯劑，諸如地加瑞克(Firmagon)，或抗雄激素諸如氟他胺(也稱為Drogenil)和比 卡魯胺(也稱為Casodex)。在具體實施方案中，所述抗激素治療可以是比卡魯胺和/或阿比 特龍。
[0172]所述細胞毒性劑可以是基于鉑的藥劑和/或紫杉烷。在具體實施方案中，所述基于 鉑的藥劑選自順鉑、卡鉑和奧沙利鉑。所述紫杉烷可以是紫杉醇、卡巴他賽或多西他賽。所 述細胞毒性劑也可以是長春花生物堿，諸如長春瑞濱或長春花堿。所述細胞毒性劑可以是 拓撲異構(gòu)酶抑制劑，諸如依托泊苷或蒽環(huán)霉素(抗生素），諸如阿霉素。所述細胞毒性劑可以 是烷基化劑，諸如雌莫司汀。
[0173] 生物制品意指由生物過程生成的醫(yī)藥產(chǎn)品。生物制品可以是，例如，疫苗、血液或 血液組分、細胞、基因療法、組織或重組治療性蛋白。任選地，所述生物制品是抗體和/或疫 苗。所述生物制品可以是Sipuleucel-T。
[0174] 在某些實施方案中，所述放射療法是擴大的放射療法，優(yōu)選擴野放射療法 (extended-field radiotherapy)。
[0175] 手術(shù)可以包括根治性前列腺切除術(shù)。根治性前列腺切除術(shù)意指去除整個前列腺、 精囊和輸精管。在進一步實施方案中，手術(shù)包括腫瘤切除，即去除所有或部分腫瘤。
[0176] 靶向療法意指使用針對特定藥物目標的靶向治療劑用于治療前列腺癌的治療。在 具體實施方案中，這可意指針對目標諸如PARP、AKT、MET、VEGFR等的抑制劑。PARP抑制劑是 酶聚ADP核糖聚合酶(PARP)的一組藥理學抑制劑。幾種形式的癌癥比普通細胞更依賴于 PARP，使得PARP成為癌癥療法的有吸引力的目標。（臨床試驗中的)實例包括iniparib、奧拉 帕尼、rucaparib、veliparib、CEP 9722、MK 4827、BMN-673和3-氨基苯甲酰胺。AKT，也稱為 蛋白激酶B(PKB)，是絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，其在多種細胞過程諸如葡萄糖代謝、 凋亡、細胞增殖、轉(zhuǎn)錄和細胞迀移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。AKT與腫瘤細胞存活、增殖和侵襲相關(guān)。 AKT抑制劑的實例包括VQD-002、哌立福辛、米替福新和AZD5363JET是原癌基因，其編碼肝 細胞生長因子受體(HGFR)。所述肝細胞生長因子受體蛋白具有酪氨酸-激酶活性。用于抑制 MET的激酶抑制劑的實例包括1(2523、51]11274、？似-66752、41^197、？〇代衍11丨13、56乂523和 MP470。也可以通過抑制與HGF的相互作用來阻斷MET活性。許多合適的拮抗劑，包括截短的 HGF，抗HGF抗體和不可切割的HGF，是已知的。VEGF受體是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的受體。 各種抑制劑是已知的，諸如1 envat i n i b、莫替沙尼、帕唑帕尼和瑞格非尼。
[0177] 本發(fā)明的方法可以指導療法選擇，以及新穎治療劑的臨床試驗評估過程中選擇患 者群體用于富集策略。例如，當評估推定的抗癌劑或治療方案時，本文公開的方法可用于選 擇個體用于臨床試驗，其具有被表征為具有復發(fā)和/或轉(zhuǎn)移和/或不良預后的增加可能性的 前列腺癌。
[0178] 本發(fā)明還涉及用于執(zhí)行如本文所述的方法的系統(tǒng)或裝置。
[0179] 在一個進一步方面，本發(fā)明涉及用于表征和/或預后受試者中的前列腺癌的系統(tǒng) 或測試試劑盒，其包含：
[0180] a)-種或多種測試裝置，其用于測定來自所述受試者的樣品中以下中的至少一種 的表達水平：
[0181] F0XM1、TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、 CEBPD、CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、 LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、 RNFT2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36
[0182] b)處理器;和
[0183] c)包含計算機應用的存儲介質(zhì)，當由所述處理器執(zhí)行時，所述計算機應用被配置 為：
[0184] (i)在一種或多種測試裝置上訪問和/或計算所述樣品中以下中的至少一種的測 定的表達水平：
[0185] F0XM1、TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、 CEBPD、CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、 LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、 RNFT2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36
[0186] (ii)計算所述樣品中以下中的至少一種的水平是增加還是降低：
[0187] F0XM1、TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、 CEBPD、CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、 LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、 RNFT2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36;和
[0188] (iii)從所述處理器輸出前列腺癌的表征和/或預后。
[0189] 測試裝置意指允許測定基因的表達水平的組分(件）的組合。所述組分(件)可以包 括上面關(guān)于在蛋白、RNA或表觀遺傳修飾的水平測定表達水平的方法描述的任何組件。例 如，所述組分可以是抗體、引物、檢測劑等等。組分(件)還可以包括以下中的一種或多種：顯 微鏡、顯微鏡載片、X-光片、放射性計數(shù)器、閃爍計數(shù)器、分光光度計、色度計、熒光計、光度 計和密度計。
[0190] 在某些實施方案中，所述系統(tǒng)或測試試劑盒進一步包含用于從所述處理器輸出的 顯示器。
[0191] 本發(fā)明還涉及計算機應用或包含如上定義的計算機應用的存儲介質(zhì)。
[0192] 在某些示例性實施方案中，提供了用于根據(jù)本文描述的方法表征和/或預后受試 者中的前列腺癌的計算機執(zhí)行的方法、系統(tǒng)和計算機程序產(chǎn)品。例如，所述計算機程序產(chǎn)品 可以包含具有在其上實施的計算機可讀程序指令的非臨時性計算機可讀存儲裝置，當由計 算機執(zhí)行時，其引起所述計算機如本文所述表征和/或預后受試者中的前列腺癌。例如，計 算機可執(zhí)行指令可以引起所述計算機：
[0193] (i)在一種或多種測試裝置上訪問和/或計算所述樣品中以下中的至少一種的測 定的表達水平：F0XM1、TRPM3、PDRG 1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS 1、ADAMTS9、B3GNT5、 CD3 8、CEBPD、CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、 LDLR、LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、 RIN2、RNFT2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36;
[0194] (ii)計算所述樣品中以下中的至少一種的水平是增加還是降低:F0XM1、TRPM3、 PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、CREM、DKK1、 EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、LPAR1、MALAT1、 MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、SLC15A2、 S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36;和，
[0195] (iii)提供關(guān)于所述前列腺癌的表征和/或預后的輸出。
[0196] 在某些示例性實施方案中，所述計算機執(zhí)行的方法、系統(tǒng)和計算機程序產(chǎn)品可以 在計算機應用中實施，所述計算機應用，例如，在計算機器和模塊上操作和執(zhí)行。當執(zhí)行時， 所述應用可以根據(jù)本文所述的示例性實施方案表征和/或預后受試者中的前列腺癌。
[0197] 如本文所使用，計算機器可以對應于任何計算機、服務器、嵌入式系統(tǒng)或計算系 統(tǒng)。模塊可以包含一個或多個硬件或軟件元件，其被配置為便于計算機器執(zhí)行本文呈現(xiàn)的 各種方法和處理功能。計算機器可以包括各種內(nèi)部或所附組件，諸如處理器、系統(tǒng)總線、系 統(tǒng)存儲器、存儲介質(zhì)、輸入/輸出接口和用于與例如網(wǎng)絡通信的網(wǎng)絡接口。
[0198] 計算機器可以被實現(xiàn)為常規(guī)計算機系統(tǒng)、嵌入式控制器、膝上型計算機、服務器、 定制機器、任何其它硬件平臺、諸如例如實驗室計算機或裝置或其任何組合。計算機器可以 是被配置成使用例如經(jīng)由數(shù)據(jù)網(wǎng)絡或總線系統(tǒng)互連的多個計算機器工作的分布式系統(tǒng)。
[0199] 處理器可以被配置成執(zhí)行代碼或指令以執(zhí)行本文所述的操作和功能，管理請求流 和地址映射，和執(zhí)行計算和生成命令。處理器可以被配置成監(jiān)視和控制計算機器中的組件 的操作。處理器可以是通用處理器、處理器核心、多處理器、可再配置處理器、微控制器、數(shù) 字信號處理器（"DSP"）、專用集成電路（"ASIO、圖形處理單元（"GPU"）、現(xiàn)場可編程門陣列 ("FPGA"）、可編程邏輯器件（"PLD"）、控制器、狀態(tài)機、門控邏輯、離散硬件組件、任何其它處 理單元、或者其任何組合或多樣性。處理器可以是單個處理單元、多個處理單元、單個處理 核心、多個處理核心、專用處理核心、協(xié)同處理器、或者其任何組合。根據(jù)特定實例實施方 案，處理器連同計算機器的其它組件可以是在一個或多個計算機器內(nèi)執(zhí)行的虛擬化的計算 機器。
[0200] 系統(tǒng)存儲器可以包括非易失性存儲器，諸如只讀存儲器（"ROM"）、可編程只讀存儲 器（"PR0M"）、可擦除可編程只讀存儲器（"EPROM"）、閃存、或能夠在有或沒有施加的電力的 情況下存儲程序指令或數(shù)據(jù)的任何其它設備。系統(tǒng)存儲器還可以包括易失性存儲器，諸如 隨機存取存儲器（"RAM"）、靜態(tài)隨機存取存儲器（"SRAM"）、動態(tài)隨機存取存儲器（"DRAM"）和 同步動態(tài)隨機存取存儲器（"SDRAM"）。其它類型的RAM還可以用于實現(xiàn)系統(tǒng)存儲器。系統(tǒng)存 儲器可以使用單個存儲器模塊或多個存儲器模塊來實現(xiàn)。盡管系統(tǒng)存儲器可以是計算機器 的一部分，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，系統(tǒng)存儲器可以與計算機器分離而不偏離主題技 術(shù)的范圍。還應該認識到，系統(tǒng)存儲器可以包括非易失性存儲設備諸如存儲介質(zhì)，或者與其 結(jié)合操作。
[0201] 存儲介質(zhì)可以包括硬盤、軟盤、壓縮盤只讀存儲器（"CD-ROM"）、數(shù)字通用盤 ("DVD"）、藍光盤、磁帶、閃存、其它非易失性存儲設備、固態(tài)驅(qū)動器（"SSD"）、任何磁存儲設 備、任何光存儲設備、任何電存儲設備、任何半導體存儲設備、任何基于實體的存儲設備、任 何其它數(shù)據(jù)存儲設備、或者其任何組合或多樣性。存儲介質(zhì)可以存儲一個或多個操作系統(tǒng)、 應用程序和程序模塊諸如模塊、數(shù)據(jù)或任何其它信息。存儲介質(zhì)可以是計算機器的一部分 或連接到計算機器。存儲介質(zhì)還可以是與計算機器諸如服務器、數(shù)據(jù)庫服務器、云存儲、連 接網(wǎng)絡的存儲器等等通信的一個或多個其它計算機器的一部分。
[0202]模塊可以包含一個或多個硬件或軟件元件，其被配置成便于計算機器來執(zhí)行本文 呈現(xiàn)的各種方法和處理功能。模塊可以包括與系統(tǒng)存儲器、存儲介質(zhì)或兩者相關(guān)的存儲為 軟件或固件的一個或多個指令序列。存儲介質(zhì)可以因此代表機器或計算機可讀介質(zhì)的實 例，在其上可以存儲指令或代碼用于由處理器執(zhí)行。機器或計算機可讀介質(zhì)可以通常是指 用于提供指令給處理器的任何一種或多種介質(zhì)。這樣的與模塊相關(guān)的機器或計算機可讀介 質(zhì)可以包含計算機軟件產(chǎn)品。應該認識到，包含模塊的計算機軟件產(chǎn)品還可以與經(jīng)由網(wǎng)絡、 任何信號承載介質(zhì)、或任何其它通信或遞送技術(shù)來遞送模塊給計算機器的一個或多個處理 或方法相關(guān)。模塊還可以包含硬件電路或用于配置硬件電路的信息，諸如微代碼或用于 FPGA或其它PLD的配置信息。
[0203]輸入/輸出（"I/O"）接口可以被配置為耦合至一個或多個外部設備，以從一個或多 個外部設備接收數(shù)據(jù)，以及發(fā)送數(shù)據(jù)到一個或多個外部設備。這樣的外部設備連同各種內(nèi) 部設備一起還被稱為外圍設備。I/O接口可以包括電和物理連接，用于可操作地將各種外圍 設備耦合至計算機器或處理器。I/O接口可以被配置成在外圍設備、計算機器或處理器之間 傳送數(shù)據(jù)、地址和控制信號。I/O接口可以被配置成實現(xiàn)任何標準接口，諸如小型計算機系 統(tǒng)接口（ "SCSI"）、串行附連的SCSI ( "SAS"）、光纖通道、外圍組件互連（"PCI"）、PCI express (PCIe)、串行總線、并行總線、先進技術(shù)連接（"ATA"）、串行ATA( "SATA"）、通用串行總線 ("USB"）、Thunderbolt、FireWire、各種視頻總線等。I/O接口可以被配置成僅實現(xiàn)一個接口 或總線技術(shù)。
[0204]或者，I/O接口可以被配置成實現(xiàn)多個接口或總線技術(shù)。I/O接口可以被配置成系 統(tǒng)總線的一部分、全部，或與其結(jié)合操作。I/O接口可以包括一個或多個緩沖器，用于緩沖一 個或多個外部設備、內(nèi)部設備、計算機器或處理器之間的傳輸。
[0205] I/O接口可以將計算機器2000耦合到各種輸入設備，包括鼠標、觸摸屏、掃描儀、電 子數(shù)字轉(zhuǎn)換器、傳感器、接收機、觸摸板、軌跡球、相機、麥克風、鍵盤、任何其它指示設備、或 者其任何組合。I/O接口可以將計算機器耦合至各種輸出設備，包括視頻顯示器、揚聲器、打 印機、投影儀、觸覺反饋設備、自動控制、機器人組件、致動器、電機、風扇、螺線管、閥門、栗、 發(fā)射器、信號發(fā)射器、光源等等。
[0206] 計算機器可以使用通過網(wǎng)絡接口到跨越網(wǎng)絡的一個或多個其它系統(tǒng)或計算機器 的邏輯連接而在聯(lián)網(wǎng)環(huán)境中操作。網(wǎng)絡可以包括廣域網(wǎng)（WAN)、局域網(wǎng)（LAN)、內(nèi)聯(lián)網(wǎng)、互聯(lián) 網(wǎng)、無線接入網(wǎng)絡、有線網(wǎng)絡、移動網(wǎng)絡、電話網(wǎng)絡、光學網(wǎng)絡、或其組合。網(wǎng)絡可以是任何拓 撲的分組交換、電路交換、并且可以使用任何通信協(xié)議。網(wǎng)絡內(nèi)的通信鏈路可以包括各種數(shù) 字或模擬通信介質(zhì)，諸如光纖電纜、自由空間光學、波導、電導器、無線鏈接、天線、射頻通信 等等。
[0207] 處理器可以通過系統(tǒng)總線連接到計算機器的其它元件或本文討論的各種外圍設 備。應該認識到，系統(tǒng)總線可以在處理器內(nèi)部，在處理器外部，或兩者都有。根據(jù)一些實施方 案，處理器、計算機器的其它元件或本文討論的各種外圍中的任一個可以被集成到單個設 備諸如芯片上系統(tǒng)（"S0C")、封裝上系統(tǒng)（"S0P"）或者ASIC設備中。
[0208] 實施方案可以包括計算機程序，其實現(xiàn)本文描述和說明的功能，其中計算機程序 在包含存儲在機器可讀媒介的指令和執(zhí)行指令的處理器的計算機系統(tǒng)中實現(xiàn)。然而，應該 顯然的是，可以存在許多不同的在計算機編程中實現(xiàn)實施方案的方式，且所述實施方案不 應該理解為限定為任何一組計算機程序指令。進一步，本領(lǐng)域編程人員將能夠?qū)懗鲞@樣的 計算機程序來實現(xiàn)所公開的本文所述的實施方案。因此，不考慮充分理解如何做出和使用 實施方案所必需的特定程序代碼指令集合的公開。進一步，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，本文描 述的實施方案的一個或多個方面可以由硬件、軟件或其組合來執(zhí)行，如可以在一個或多個 計算系統(tǒng)中實現(xiàn)的那樣。而且，對由計算機執(zhí)行的動作的任何引用不應該被理解為由單個 計算機執(zhí)行，因為多于一個計算機可以執(zhí)行該動作。
[0209] 本文描述的實例實施方案可以通過執(zhí)行先前所述的方法和處理功能的計算機硬 件和軟件來使用。本文所述的系統(tǒng)、方法和程序可以在可編程計算機、計算機可執(zhí)行軟件、 或數(shù)字電路中實現(xiàn)。軟件可以存儲在計算機可讀介質(zhì)上。例如，計算機可讀介質(zhì)可以包括軟 盤、RAM、R0M、硬盤、可移動介質(zhì)、閃存、記憶棒、光介質(zhì)、磁光介質(zhì)、CD-ROM等等。數(shù)字電路可 以包括集成電路、門陣列、構(gòu)造模塊邏輯、現(xiàn)場可編程門陣列(FPGA)等等。
[0210] 試劑盒中可以提供用于執(zhí)行本文所述的方法的試劑、工具和/或指令。這樣的試劑 盒可以包括用于從患者(諸如通過活檢）收集組織樣品的試劑，和用于處理該組織的試劑。 該試劑盒還可包括用于進行表達水平分析的一種或多種試劑，例如用于進行核酸擴增，包 括RT-PCR和qPCR、NGS、northern印跡、蛋白質(zhì)組分析或免疫組織化學以測定患者的樣品中 的生物標志物的表達水平的試劑。例如，這樣的試劑盒中可包括用于進行RT-PCR的引物，用 于進行northern印跡分析的探針，和/或如本文討論用于進行蛋白質(zhì)組分析諸如Western印 跡、免疫組織化學和ELISA分析的抗體或適配子。還可包括用于測定的適當?shù)木彌_液。還可 包括這些測定中的任一種所需的檢測試劑。所述試劑盒可以是例如基于陣列或PCR的試劑 盒，并且可以包括例如額外的試劑，諸如聚合酶和/或dNTP。本文特征的試劑盒還可以包括 描述如何執(zhí)行用于測量表達水平的測定的說明單。
[0211 ]所述試劑盒可以包括與以下中的至少一種互補的一種或多種引物對：
[0212] TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBPD、 CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、 SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36。
[0213]所述試劑盒還可以包括與參考基因互補的一種或多種引物對，例如與TPT1、RPS14 或RPL37A中的至少一種互補的引物。
[0214] 這樣的試劑盒還可以包括與以下中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、 40、41、42、43、44、45或46互補的引物對：
[0215] TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBPD、 CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、 SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36。
[0216] 所述試劑盒可以包括與TRPM3、roRGl、F12、CENPF、HJURP、RNFT2和SSTRl中的至少 一種互補的一種或多種引物對和與 SRSF5、roE4D、roK4、ADAMTSl、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、 CEBPD、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、LPAR1、 MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、SELE、SLC15A2、 50〇52、50053、5了66六1^1、了502201、乂8?1和2??36中的至少一種互補的一種或多種引物對。
[0217] 用于表征和/或預后受試者中的前列腺癌的試劑盒可以允許測定ADAMTS9、EMP1、 F3、LDLR、LGALS3、MALAT 1、MTUS 1、NR4A3、PTGS2、RIN2、SLC15A2、S0CS3 和 TSC22D1 中的至少一 種的甲基化狀態(tài)。測定的甲基化狀態(tài)，其可以是過度甲基化，用于提供所述前列腺癌的表征 和/或預后。這樣的試劑盒可以包括用于直接測定一種或多種基因的甲基化狀態(tài)的引物和/ 或探針。因此，它們可以包含通過雜交區(qū)分DNA的甲基化和未甲基化形式的甲基化特異性引 物和/或探針。這樣的試劑盒通常還含有選擇性修飾CpG二核苷酸基序的甲基化或未甲基化 形式的試劑。合適的化學試劑包含肼和亞硫酸氫根離子。實例是亞硫酸氫鈉。然而，所述試 劑盒可以含有如上文所討論測定甲基化狀態(tài)的其它試劑，諸如限制性內(nèi)切酶。
[0218] 因此，本發(fā)明還涉及用于表征和/或預后受試者中的前列腺癌的試劑盒，其包含如 上所述的一種或多種抗體或適配子。
[0219] 如上所討論，在某些實施方案中，TRPM3、PDRG1、F12、CENPF、HJURP、RNFT2和SSTR1 中的至少一種或F0XM1的增加的表達水平表明復發(fā)和/或轉(zhuǎn)移和/或不良預后的增加可能 性。在進一步實施方案中，SRSF5、PDE4D、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBPD、 CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、LPAR1、MALAT1、 MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、SELE、SLC15A2、S0CS2、 30〇33、3了66六1^1、了302201、乂8?1和2??36中的至少一種的降低的表達水平表明復發(fā)和/或轉(zhuǎn) 移和/或不良預后的增加可能性。
[0220] 因此，本文所述的試劑盒可以包含用于測定TRPM3、PDRG1、F12、CENPF、HJURP、 1?^12、和55了1?1中的至少一種或卩(^]\11和51?卩5、^^40、？01(4、厶0厶1?'51、厶0厶1?'59、836階5、 CD3 8、CEBPD、CREM、DKK1、EMP1、ERRFI1、F3、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、SELE、 51^：15厶2、5(^52、5(^53、5了66厶1^1、了502201、父8?1和2卩?36中的至少一種的表達水平的引物、 探針或抗體/適配子。因此，所述試劑盒可以并入測定上調(diào)的標志物和下調(diào)的標志物的組合 的表達水平的試劑。合適的抗體和/或引物/探針可以源自本文的表B、C和D。
[0221] 試劑盒中包括的信息材料可以是涉及本文描述的方法和/或用于本文描述的方法 的試劑的用途的描述性的、指導性的、銷售的或其它的材料。例如，試劑盒的信息材料可含 有聯(lián)系信息，例如，物理地址、電子郵件地址、網(wǎng)站或電話號碼，其中試劑盒的用戶可獲得關(guān) 于進行基因表達分析和解析結(jié)果的大量信息。
[0222] 所述試劑盒可以進一步包含如上所述的計算機應用或存儲介質(zhì)。
[0223] 先前呈現(xiàn)的實施方案中所述的實例系統(tǒng)、方法和動作是說明性的，并且，在替代實 施方案中，某些動作可以以不同次序、相互并行、整體忽略和/或在不同實例實施方案之間 組合來執(zhí)行，和/或可以執(zhí)行某些額外動作，而不偏離各個實施方案的范圍和精神。因此，這 樣的替代實施方案包括于本文所述的實例中。
[0224] 盡管上面已經(jīng)詳細描述了特定實施方案，但該描述僅僅用于說明目的。因此，應該 理解，上述許多方面不意欲作為必需或重要元素，除非另有明確陳述。
[0225] 實例實施方案的公開方面的修改或與之對應的等效組分或動作，除了上述那些之 外，可以由受益于本公開內(nèi)容的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員做出，而不偏離以下權(quán)利要求中限定 的實施方案的精神和范圍，其范圍應符合最寬泛的解釋，從而涵蓋這樣的修改和等效結(jié)構(gòu)。
[0226] 附圖描述
[0227] 圖 1
[0228] 包含70個原發(fā)性前列腺癌、20個具有伴隨轉(zhuǎn)移性疾病的原發(fā)性癌癥、11個轉(zhuǎn)移性 疾病和25個正常前列腺樣品FFPE的FFPE前列腺癌樣品集合的無監(jiān)督的分層聚類分析。
[0229] A.使用數(shù)據(jù)集間變化最大的基因鑒定了與轉(zhuǎn)移性疾病應用聚類的原發(fā)性腫瘤的 子集(卡方 2.77xl〇-1〇)。
[0230] Β.使用從Taylor和同事公開的數(shù)據(jù)集的內(nèi)部數(shù)據(jù)集的鑒定的1083個差異表達的 基因的半監(jiān)督的分層聚類分析鑒定了與轉(zhuǎn)移性疾病應用聚類的原發(fā)性腫瘤的類似亞簇(卡 方2.78x10- 6)。
[0231] C.如果患者是或不是轉(zhuǎn)移性生物學組的一部分，他們在手術(shù)之后保持無病的概率 的Kaplan-Meier分析，風險比通過對數(shù)秩檢驗進行測定。
[0232] 圖2
[0233] A.83個過表達的基因與來自出版物的F0XM1CHIP-Seq命中重疊，重疊 p-值 9.269x10-5的超幾何檢驗。
[0234] B ·與FOXMlCHIP-seq命中重疊且仍然是過表達目標的39個過表達目標的Pearson 相關(guān)性評分的盒形圖。T-檢驗(p-值〈0.0001)。
[0235] 圖3
[0236] A. GREAT (http://be jerano.stanford.edu/great/public/html/)功能分析，其中 甲基化探針位于的基因組區(qū)域的分子功能。
[0237] B.表明低表達基因與EZH2和H3K27me3的CHIP-SEQ鑒定的目標重疊的維恩圖，重疊 的超幾何檢驗。
[0238] C.表明低表達基因與過度甲基化的且H3K27me 3修飾重疊的維恩圖。
[0239] 圖 4
[0240] 顯示在排序靠前的10,000個探針組之間的重疊，包括至少在轉(zhuǎn)移性生物學亞組和 非轉(zhuǎn)移性生物學亞組之間相關(guān)的重疊（"列表1和2"）和在非轉(zhuǎn)移性生物學亞組和良性組之 間高度相關(guān)的重疊（"表3"），的維恩圖。
[0241] 圖5
[0242] 內(nèi)部數(shù)據(jù)集中鑒定的樣品簇的GAP分析。
[0243] 圖 6
[0244] 使用Toppfun(http: //toppgene · cchmc · org/)差異表達的1182個獨特基因的功能 分析。
[0245] A.低表達的基因的重要分子過程
[0246] B.過表達的基因的重要分子過程。
[0247] 圖7
[0248] 篩選潛在IHC抗體的研究概述 實施例
[0249] 通過引用以下實驗實施例將進一步理解本發(fā)明。
[0250] 結(jié)果
[0251] 無監(jiān)督分層聚類分析鑒定通過轉(zhuǎn)移性生物學定義的前列腺癌中的不同分子亞型
[0252] 我們假設，具有轉(zhuǎn)移潛能的原發(fā)性前列腺癌與轉(zhuǎn)移性疾病和具有已知伴隨轉(zhuǎn)移的 原發(fā)性疾病在轉(zhuǎn)錄上是類似的。為了鑒定該轉(zhuǎn)移性亞組，我們采取無監(jiān)督分層聚類分析方 法，其使用70個切割的臨床上限于前列腺的原發(fā)性前列腺癌、20個具有已知伴隨轉(zhuǎn)移性疾 病的原發(fā)性前列腺癌、11個具有轉(zhuǎn)移性疾病的淋巴結(jié)和25個正常前列腺樣品。使用整個數(shù) 據(jù)集中的最可變的探針組進行聚類分析。GAP統(tǒng)計學檢驗(Tibshirani等人，2001)鑒定了 2 個具有統(tǒng)計學意義的主要樣品簇(圖1A，圖5)。
[0253]這些分子亞組之一對于轉(zhuǎn)移性疾病和具有已知伴隨轉(zhuǎn)移的原發(fā)性腫瘤具有顯著 富集(卡方P = 2.77xl(T1())。重要的是，在該組中還發(fā)現(xiàn)29個原發(fā)性前列腺樣品，其沒有呈現(xiàn) 轉(zhuǎn)移性疾病，但共享類似的轉(zhuǎn)錄生物學。該組腫瘤在此被稱為"轉(zhuǎn)移性生物學亞組"，且第二 亞組被稱為"非轉(zhuǎn)移性亞組"。
[0254] 接下來，我們在轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性亞組中的原發(fā)性腫瘤之間進行基因表達分析， 并且鑒定了 1182個差異表達的轉(zhuǎn)錄物。這些轉(zhuǎn)錄物中的大多數(shù)在轉(zhuǎn)移性亞組中低表達 (1099個低表達相比于83個過表達）。
[0255] 為了鑒定1182個差異表達的基因在第二數(shù)據(jù)集中是否是預后的，我們使用所述基 因以聚類分析由Taylor和同事(Taylor等人，2010)公開的前列腺癌數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集表示 PSA隨訪可用的由手術(shù)管理的前列腺癌。與我們的內(nèi)部培訓集合一致，我們發(fā)現(xiàn)2個穩(wěn)健的 樣品簇，其中一個表明對于轉(zhuǎn)移性樣品的富集(卡方P = 2.78xl(T6(圖1B)。重要的是，該組還 含有63個在呈現(xiàn)時無已知轉(zhuǎn)移性疾病的原發(fā)性腫瘤樣品。Kaplan Meier分析表明，轉(zhuǎn)移性 生物學組內(nèi)的原發(fā)腫瘤在手術(shù)后具有較短的疾病復發(fā)時間（圖1C)(風險比(HR)2.377和p值 0.0351)。樣品簇的臨床和病理特征詳述于表1中。重要的是，在其它預后臨床因素諸如治療 前的分期、分級或PSA水平中沒有差異。
[0256] 作為轉(zhuǎn)移性生物學組基礎的分子途徑
[0257] 為了確定哪些分子途徑導致轉(zhuǎn)移性表型和不良預后，我們使用1182個在轉(zhuǎn)移性和 非轉(zhuǎn)移性亞組之間差異表達的基因進行途徑分析。這在轉(zhuǎn)移性亞組中鑒定了 10個顯著過表 達的途徑和20個低表達的途徑(表2i和2ii)。有趣的是，轉(zhuǎn)移性亞組中過表達的大多數(shù)途徑 與有絲分裂進程相關(guān)(表2i)，而低表達的分子途徑參與細胞粘附、形態(tài)學、ATF2和p53轉(zhuǎn)錄。
[0258] 為了確定這些分子途徑中的哪些負責不良預后，我們使用代表每個途徑的基因來 聚類分析Taylor數(shù)據(jù)集以及Sun和同事(Sun等人，2009)公開的第二數(shù)據(jù)集。該后面的數(shù)據(jù) 集代表具有PSA隨訪的用手術(shù)管理的原發(fā)性前列腺癌。復發(fā)時間的Kaplan Meier分析用于 每個觀察簇(表2i和2ii)。
[0259] 在過表達的分子途徑中，只有F0XM1轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡在Taylor數(shù)據(jù)集中是顯著預后 的(HR 2.755p = 0.0134)。此外，F(xiàn)0XM1本身在我們的內(nèi)部訓練數(shù)據(jù)集中的轉(zhuǎn)移性生物亞組 中是過表達的(FC 2.13)。為了確定增加的F0XM1是否負責有絲分裂基因在轉(zhuǎn)移生物學組中 的過表達，我們研究了 Sander和同事以及Chen和同事(Chen等人2013，Sander等人2013)公 開的2個公共FoxMl CHIP-Seq數(shù)據(jù)。我們重疊了鑒定的F0XM1 CHIP-Seq目標與轉(zhuǎn)移生物學 組中過表達的基因。明顯地，轉(zhuǎn)移性亞組中的83個過表達的基因中的39個被任一數(shù)據(jù)集中 的F0XM1結(jié)合，其中20個是兩者共同的。該重疊是高度顯著的（9.269xl〇- 5)。此外，我們進行 了內(nèi)部數(shù)據(jù)集中所有過表達轉(zhuǎn)錄物針對F0XM1水平的相關(guān)性分析(補充表3)。通過CHIP-Seq 數(shù)據(jù)的分析鑒定的39個F0XM1與非CHIP目標的相關(guān)性的比較表明，與CHIP-Seq目標的F0XM1 不結(jié)合的那些相比，對于F0XM1目標的相關(guān)性評分高度顯著增加（t檢驗p-值〈0.0001)(圖 2B)?？傊?，該數(shù)據(jù)強烈地表明，F(xiàn)oxMl過表達負責轉(zhuǎn)移性亞組中被檢測為過表達的83個基因 的大子集的轉(zhuǎn)錄活化。
[0260]在Taylor和Sun兩者的數(shù)據(jù)集中顯著預后的低表達分子途徑是肌肉收縮、脂肪形 成和ATF2轉(zhuǎn)錄目標。地爾硫卓途徑在Taylor數(shù)據(jù)集中是顯著預后的，而整聯(lián)蛋白信號傳導 和P53的轉(zhuǎn)錄目標(盡管在Taylor數(shù)據(jù)集中損失)僅在Sun數(shù)據(jù)集中達到預后意義。
[0261 ]基因表達的表觀遺傳沉默發(fā)生于轉(zhuǎn)移性生物學亞組中
[0262] 轉(zhuǎn)移性生物學亞組中的大多數(shù)差異表達的基因下調(diào)。接下來，我們詢問哪些潛在 機制可以負責轉(zhuǎn)移性生物學組中的基因表達的該顯著損失。分子過程的分析鑒定了參與染 色質(zhì)結(jié)合的基因過表達（圖6)，重要的是，我們注意到，已知參與表觀遺傳基因調(diào)控的幾個 基因上調(diào)，包括AR、EZH2、HELLS和UHRF1)(表3)。
[0263] UHRF1在轉(zhuǎn)移性生物學亞組中過表達(2.375倍）。該蛋白近來已顯示促進并維持前 列腺癌中的表觀遺傳沉默(Babbio等人2012)。1]!11^1可以結(jié)合至半甲基化的CpG，并且可以 招募DNMT1以維持DNA甲基化模式(Bostick等人2007，Sharif等人2007)。啟動子處或附近的 DNA甲基化的增加率已經(jīng)顯示與降低的基因表達相關(guān)，這最可能與轉(zhuǎn)錄因子對基因啟動子 的可及性相關(guān)。
[0264] 因此，我們使用高含量DNA甲基化陣列(樣品詳見補充表3中）測量來自我們的臨時 訓練集(每個亞組11個）的22個腫瘤的子集中的DNA甲基化水平。轉(zhuǎn)移性亞組中的1098個低 表達基因的整體分析表明，418個具有增加率的DNA甲基化(重疊的p值1.546xl(T 34)(表4)。 此外，過表達的基因集的分析顯示沒有顯著的超或低甲基化狀態(tài)，由此表明改變的甲基化 狀態(tài)在過表達基因集中是不重要的。
[0265] 超甲基化的基因組區(qū)域的GREAT (http : //be jerano .stanford.edu/great/ public/html/)分析表明許多富集的分子過程（圖3A)，特別是DNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄因子功能。這 表明甲基化不僅直接沉默轉(zhuǎn)移性生物學組中的基因，而且可負責參與轉(zhuǎn)錄的基因的損失， 引起基因表達的進一步損失。
[0266] 參與表觀遺傳沉默的另一種基因 EZH2在轉(zhuǎn)移性生物學組中超過2倍過表達(表3)。 EZH2是PRC2 (多梳抑制復合物2)(兩類多梳家族蛋白或(PcG)之一）的組分。該復合物具有組 蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性，且EZH2是催化亞基。事實上，EZH2表達是組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性的關(guān) 鍵決定因素。PRC2復合物在賴氨酸27上使組蛋白H3三甲基化（即H3K27me3)，該位點是轉(zhuǎn)錄 沉默染色質(zhì)的標志。為了確定EZH2功能是否可以負責轉(zhuǎn)移性亞組中的基因表達的至少部分 損失，我們使用了公共CHIP-Seq(W U等人2012)前列腺癌細胞系數(shù)據(jù)集。具體地，我們將已知 結(jié)合EZH2和H3K27me3的基因與轉(zhuǎn)移性生物學亞組中被抑制的基因進行比較（圖3B)。顯著數(shù) 目的低表達基因被EZH2、H3K27me3或兩者結(jié)合(p-值2.597xl0- 12)，由此強烈暗示經(jīng)由EZH2 介導的組蛋白修飾的染色質(zhì)沉默為轉(zhuǎn)移性亞組內(nèi)的基因子集沉默的關(guān)鍵機制。
[0267] 有趣的是，只有一定比例的表觀遺傳沉默的目標（123/602)具有增加率的超甲基 化（圖3C)，并且被預測具有H3K27me3相關(guān)的組蛋白修飾，由此表明兩種機制可能在很大程 度上獨立地工作以沉默基因表達。
[0268] 用于檢測轉(zhuǎn)移性生物學亞組的方法
[0269] 分層聚類分析是來自許多樣品的基因表達數(shù)據(jù)的有用分析方法，然而它不能用于 前瞻性分類個別腫瘤。此外，在先前研究中，我們已經(jīng)表明，前列腺癌中的腫瘤異質(zhì)性引起 腫瘤活檢樣品和從同一患者切割的腫瘤的概況之間顯著不一致。因此，我們決定開發(fā)適合 于免疫組織化學(IHC)的標志物，其將前瞻性分類腫瘤與轉(zhuǎn)移性生物學亞組是否是類似的。
[0270] 為了實現(xiàn)這一點，我們采用2種方法，首先我們鑒定在轉(zhuǎn)移性生物學亞組和非轉(zhuǎn)移 性生物學亞組之間差異表達、但在非轉(zhuǎn)移性生物學亞組和正常之間幾乎沒有表達差異的轉(zhuǎn) 錄物。該方法使用2-樣品t檢驗法鑒定了 393個探針組，這些探針組中的~75%在非轉(zhuǎn)移性 生物學亞組中與轉(zhuǎn)移性生物學亞組中相比過表達。我們將該方法稱為靶向性的，因為測試 例內(nèi)的正常前列腺可以用作參考。
[0271] 對于第二種方法，我們評價了 1182個在轉(zhuǎn)移性生物學亞組和非轉(zhuǎn)移性亞組之間差 異表達的基因，在該情況下，因為非轉(zhuǎn)移性生物學組和良性/正常之間可能存在表達差異， 要求參考目標，為了鑒定合適的參考，我們鑒定了無論亞組而在所有前列腺癌樣品中具有 最小表達方差的基因（最好的3個基因概述于表7中）。
[0272] IHC目標的預后效用
[0273] 對于第一種方法，將393個探針組映射至基因水平，以協(xié)助外部數(shù)據(jù)集(Taylor等 人2010)的獨立評估。在該數(shù)據(jù)集中，檢測總共349個基因。我們使用生物化學復發(fā)時間以針 對年齡、分級和分期校正的Cox比例風險在Taylor中進行這些349個基因的多變量分析，這 導致產(chǎn)生7個具有顯著多變量預測功能(p-值〈0.05.)的基因，這些是TRPM3、PDRG1、SRSF5、 PDE4D、CNPY4、F12和PDK4。（表5)還進行單變量存活分析，其中52個基因是顯著的，？-值〈 0.05。在這些排序靠前的探針組中存在3個基因的重疊;這些是SRSF5、TOE4D和TOK4。還使用 anova檢驗評價393個探針組，以確定它們與臨床因素、即病理學Gleason評分(和Gleason評 分1和2)是否是顯著相關(guān)的。
[0274] 對于第二種方法，在相同的多變量分析中測試1182個差異表達的基因，這鑒定了 56個具有顯著多變量預后功能(p-值〈0.05 .)的基因，（表6)。還進行單變量存活分析，其中 304個獨特基因是顯著的，p-值〈0.05。在這些排序靠前的探針組中存在41個基因的重疊。具 有顯著多變量預后功能的目標的數(shù)目在驗證的范圍之外，因此，我們通過交叉參考預后途 徑(表2i和2ii)、F0XMlCHIP-Seq命中和選擇的文獻綜述而進一步改善列表。來自聚焦、途徑 和文獻比較的最佳14個基因概述于表7中。F0XM1本身和表明顯著多變量預后能力的差異表 達的F0XM1CHIP-Seq目標概述于表9中。
[0275] 討論
[0276] 由于大多數(shù)發(fā)展早期前列腺癌的男性不會死于該疾病，所以明確要求更好地理解 作為轉(zhuǎn)移擴散的基礎的生物學。這可允許適當選擇高風險患者用于侵襲性更強的主要療 法，且使低風險患者免去不必要的副作用。
[0277] 在本研究中，我們已經(jīng)鑒定了在分子水平類似于轉(zhuǎn)移性疾病的一組原發(fā)性前列腺 癌。這些腫瘤通過幾個基因和限定途徑的表達損失來定義;此外，該組通過導致參與有絲分 裂的基因表達增加的原癌基因 F0XM1的活化來定義。
[0278]我們已經(jīng)定義了一系列具有多變量預后能力且高度適合于IHC開發(fā)的標志物，以 前瞻性評價腫瘤是否具有復發(fā)和轉(zhuǎn)移發(fā)展的增加可能性。
[0279]表 1
[0281] Taylor數(shù)據(jù)集中的轉(zhuǎn)移性生物學腫瘤和非轉(zhuǎn)移性生物學組的臨床和病理標準。
[0282] 表2i
[0285] 如使用Toppfun檢測的顯著過表達的途徑，指明途徑p-值，Kaplan meier存活分析 結(jié)果使用途徑來聚類分析和定義類別標記iTaylor和Sun數(shù)據(jù)集。
[0286]表2ii
[0289] 如使用Toppfun檢測的顯著低表達的途徑，指明途徑p-值，Kaplan meier存活分析 結(jié)果使用途徑來聚類分析和定義類別標記i Taylor和Sun數(shù)據(jù)集。
[0290] 表 3
[0292] 注釋為染色質(zhì)結(jié)合的基因，轉(zhuǎn)移性生物學組相比于未校正和FDR校正的p-值的倍 數(shù)變化表達。注明公開的轉(zhuǎn)錄抑制中的作用。
[0293] 表 4
[0295] 轉(zhuǎn)移性生物學組中具有增加的過度甲基化的過表達或低表達的基因，檢驗重疊的 顯著性的超幾何檢驗。
[0296] 表 5
[0298] 基于Taylor數(shù)據(jù)集中的多變量存活分析的排序靠前的預后標志物。[0299] 表 6
[0303] 基于在轉(zhuǎn)移性生物學亞組和非轉(zhuǎn)移性生物學亞組之間差異表達的基因的Taylor 數(shù)據(jù)集中的多變量存活分析的排序靠前的預后標志物。
[0306] 概述的IHC目標與參考基因。
[0307]表 8
[0309] 具有增加的過度甲基化水平的最佳低表達標志物。
[0310] 表9
[0314] 在轉(zhuǎn)移性生物學組中差異表達的F0XM1和FOXMICHIP-Seq目標。
[0315] 方法 [0316]患者樣品
[0317] Addenbrookes醫(yī)院和Karolinska研究所遵循當?shù)貍惱砼鷾侍峁?26個樣品（70個 切割的臨床上限于前列腺的原發(fā)性前列腺癌、20個具有已知伴隨轉(zhuǎn)移性疾病的原發(fā)性前列 腺癌、11個具有轉(zhuǎn)移性疾病的淋巴結(jié)和25個正常前列腺）。
[0318] 在Taylor等人公開的含有179個樣品（131個原發(fā)性腫瘤、29個正常和19個轉(zhuǎn)移性 疾?。┑臄?shù)據(jù)集中驗證和測試亞組和預后意義。手術(shù)后的生物化學復發(fā)時間和復發(fā)狀態(tài)用 于測試預后意義，5個樣品因為（手術(shù)類型PCA0056,和新輔助治療，PCA0050、PCA0103、 PCA119和PCA0176)而從分析中排除。
[0319] Sun等人(79個腫瘤樣品），樣品為手術(shù)后，79例，其中39例被分類為具有疾病復發(fā)。
[0320] 基因表達譜分析
[0321] 使用如前所述（Kennedy RD，Bylesjo M, Kerr P 等人.Development and independent validation of a prognostic assay for stage II colon cancer using formalin-fixed paraffin-embedded tissue .J Clin Oncol 2011;29:4620-4626)的 Roche高純RNA石錯試劑盒(Roche Diagnostics Ltd.)從肉眼切割的FFPE腫瘤樣品提取總 RNA。如前所述，使用NuGEN WT-〇vation?FFPE系統(tǒng)（NuGEN)擴增總RNA，并且使其與Almac前 列腺癌
[0322]統(tǒng)計學分析方法
[0323]單因素 AN0VA分析使用abs(FC)>2的倍數(shù)變化(FC)閾值和針對錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)調(diào) 整的顯著性P-值閾值(P-值roR〈0.05)鑒定29個原發(fā)性轉(zhuǎn)移性生物學組腫瘤和41個原發(fā)性 非轉(zhuǎn)移性生物學腫瘤組對照之間差異表達的探針組。獨特基因被確定為與比對的至少6探 針處于有義方向的基因。
[0324] 將組合的背景和方差過濾器應用于數(shù)據(jù)矩陣，以便使用內(nèi)部開發(fā)的特征選擇程序 鑒定最可變的基因。首先，應用背景過濾器以去除表達值太低而無法與背景噪聲區(qū)分的基 因。高閾值用于去除大量探針，并確保這些探針高表達（閾值:〈=1〇_ 16)。其次，將強度依賴 性方差過濾器應用于數(shù)據(jù)矩陣，以去除在所有樣品間具有低方差的探針組（閾值:〈=5.10 1)。特征選擇導致產(chǎn)生1651個變化最大的探針。
[0325] 將分層聚類分析(Pearson相關(guān)距離和Ward氏聯(lián)系）分別應用于來自每個數(shù)據(jù)集的 探針和樣品。使用缺口統(tǒng)計學確定子簇的數(shù)目。
[0326] IHC目標鑒定
[0327] 感興趣的IHC目標是至少在轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性組之間相關(guān)的那些(列表1和2)和在 非轉(zhuǎn)移性和良性組之間高度相關(guān)的那些(表3)。
[0328] 根據(jù)這些標準將三個列表各自中的探針組的相關(guān)性p-值進行排序。每個列表中排 序靠前的10,000個探針組中觀察到的口-值的范圍，對于列表1為[0-6.62 6-05]，對于列表2 為[1 · 03e-19-6 · 17e-04]，且對于列表3為[0 · 99-0 · 82]。
[0329] 三個列表中的排序靠前的10,000個探針組的交叉點揭示512個共同探針（圖4)。去 除反義探針組和少于6個探針與探針組比對的那些，留下393個。Partek?基因組 Suite?6.6版用于生成倍數(shù)變化值。
[0330] 甲基化
[0331] 對于22個患者，11個轉(zhuǎn)移性生物學亞組和11個非轉(zhuǎn)移性生物學亞組，使用 Recoverall(Life technologies)提取DNA。使用Zymo EZ DNA甲基化試劑盒TM(Zymo Research,Orange，CA,USA)，根據(jù)制造商的程序，用當使用IIlumina Infinium甲基化測定 時推薦的替代孵育條件，用亞硫酸氫鈉處理基因組DNA(800ng)。根據(jù)Infinium HD甲基化測 定方案以50ngAU對4μ1亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的基因組DNA進行甲基化測定。根據(jù)制造商的程序 將樣品處理至Illumina 450k陣列上。用相同軟件提取未校正的b-值。使用微陣列的顯著性 分析（SAM) (Tusher等人2001)評價具有統(tǒng)計學顯著的雙值(bi values)變化的探針組。使用 〇. 05的錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)，在陣列上的235，526個探針組中，32，286個被低甲基化(相當于7， 222個獨特的基因）且9，184個探針組(4003個獨特的基因）。
[0332] 參考文獻
[0333] Albertsen PC，Hanley JA，Barrows GH，Penson DF，Kowalczyk PD，Sanders MM等 人（2005).Prostate cancer and the Will Rogers phenomenon.J Natl Cancer Inst 97:1248-1253.
[0334] Altekruse SF，Huang L，Cucinelli JE，McNeel TS，Wells KM，01iver MN(2010) .Spatial patterns of localized-stage prostate cancer incidence among white and black men in the southeastern United States，1999-2001·Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 19:1460-1467.
[0335] Babbio F，Pistore C，Curti L，Castiglioni I，Kunderfranco P，Brino L等人 (2012).The SRA protein UHRF1 promotes epigenetic crosstalks and is involved in prostate cancer progression.Oncogene.
[0336] Bertucci F, Salas S,Eysteries S，Nasser V，F(xiàn)inetti P，Ginestier C， Charafe-Jauffret E,Loriod B，Bachelart L，Montfort J,Victorero G,Viret F， Ollendorff V，F(xiàn)ert V,Giovaninni M，Delpero JR，Nguyen C,Viens P，Monges G， Birnbaum D，Houlgatte R.Gene expression profiling of colon cancer by DNA microarrays and correlation with histoclinical parameters . Oncogene .2004Feb 19；23(7):1377-91.PubMed PMID:14973550.
[0337] Bostick M，Kim JK，Esteve P0，Clark A，Pradhan S，Jacobsen SE(2007).UHRF1 plays a role in maintaining DNA methylation in mammalian cells. Science 317: 1760-1764.
[0338] Chen X，Muller GA，Quaas M，F(xiàn)ischer M，Han N，Stutchbury B等人（2013) .The forkhead transcription factor F0XM1 controls cell cycle-dependent gene expression through an atypical chromatin binding mechanism.Mol Cell Biol 33: 227-236.
[0339] Howlader A(2012).SEER Cancer Statistics Review,1978-2009.
[0340] Kattan MW，Wheeler TM，Scardino PT(1999)·Postoperative nomogram for disease recurrence after radical prostatectomy for prostate cancer.J Clin Oncol 17:1499-1507.
[0341] Makarov DV，Sanderson H，Partin AW，Epstein JI(2002)·Gleason score 7prostate cancer on needle biopsy: is the prognostic difference in Gleason scores 4+3and 3+4independent of the number of involved cores?J Urol 167:2440-2442.
[0342] Perou CM，Sorlie T，Eisen MB，van de Rijn M，Jeffrey SS，Rees CA等人 (2000).Molecular portraits of human breast tumours.Nature 406:747-752.
[0343] Pound CR,Partin Aff,Eisenberger MA,Chan Dff,Pearson JD,ffalsh PC(1999) .Natural history of progression after PSA elevation following radical prostatectomy.JAMA 281:1591-1597.
[0344] Rasiah KK，Stricker PD，Haynes AM，Delprado W，Turner JJ，Golovsky D等人 (2003).Prognostic significance of Gleason pattern in patients with Gleason score 7prostate carcinoma.Cancer 98:2560-2565.
[0345] Sanders DA，Ross-Innes CS,Beraldi D,Carroll JS，Balasubramanian S (2013).Genome-wide mapping of F0XM1 binding reveals co-binding with estrogen receptor alpha in breast cancer cells.Genome Biol 14:R6.
[0346] Sharif J，Muto M，Takebayashi S，Suetake I，Iwamatsu A，Endo TA等人（2007) .The SRA protein Np95 mediates epigenetic inheritance by recruiting Dnmtl to methylated DNA.Nature 450:908-912.
[0347] Smith EB，F(xiàn)rierson HF，Jr·，Mills SE，Boyd JC，Theodorescu D(2002).Gleason scores of prostate biopsy and radical prostatectomy specimens over the past lOyears: is there evidence for systematic upgrading?Cancer 94:2282-2287.
[0348] Sun Y,Goodison S. Optimizing molecular signatures for predicting prostate cancer recurrence.Prostate .2009Jul 1;69(10):1119-27·doi:10·1002/ pros.20961.
[0349] Tibshirani R，Walther G，Hastie T(2001)·Estimating the number of clusters in a data set via the gap statistic.Journal of the Royal Statistical Society:Series B(Statistical Methodology)63:411-423.
[0350] Tusher VG,Tibshirani R,Chu G(2001 ). Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response.Proc Natl Acad Sci US A 98:5116-5121.
[0351] Taylor BS,Schultz N,Hieronymus H,Gopalan A,Xiao Y,Carver BS,Arora VK, Kaushik P，Cerami E，Reva B，Antipin Y，Mitsiades N,Landers T，Dolgalev I，Major JE,ffilson M,Socci ND，Lash AE，Heguy A，Eastham JA，Scher HI，Reuter VE，Scardino PT，Sander C, Sawyers CL·，Gerald ffL··Integrative genomic profiling of human prostate cancer . Cancer Cell.2010Jul 13； 18(1):11-22.doi:10.1016/ j.ccr.2010.05.026.Epub 2010 Jun 24.
[0352] Unoki M，Kelly JD，Neal DE，Ponder BA，Nakamura Y，Hamamoto R(2009).UHRF1 is a novel molecular marker for diagnosis and the prognosis of bladder cancer.Br J Cancer 101:98-105.
[0353] van't Veer LJ，Dai H，van de Vijver MJ，He YD，Hart AA，Mao M等人（2002) .Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer.Nature 415:530-536.
[0354] Xu K，Wu ZJ，Groner AC，He HH，Cai C，Lis RT，Wu X，Stack EC，Loda M，Liu T，Xu H，Cato L,Thornton JE，Gregory RI，Morrissey C,Vessella RL，Montironi R，Magi_ Galluzzi C，Kantoff Pff,Balk SP,Liu XS,Brown M.EZH2 oncogenic activity in castration-resistant prostate cancer cells is Polycomb-independent.Science.2012 Dec 14；338(6113):1465-9.doi:10.1126/ science.1227604.PubMed PMID:23239736；PubMed Central PMCID:PMC3625962.
[0355] 補充表1
[0357] 內(nèi)部樣品集的患者特征。
[0358] 補充表2F0XM1相關(guān)性
[0370] 整個內(nèi)部數(shù)據(jù)集中的過表達的目標與F0XM1水平的Pearson相關(guān)性。
[0371] 補充表3
[0372]用于甲基化分析的樣品
[0375] 前列腺IHC開發(fā)
[0376] 越
[0377] 為了鑒定合適的抗體，我們針對來自生物標志物陽性(通過微陣列概況分析證實） 前列腺癌樣品的4uM全斷面切片對于選擇的目標進行每個目標3種抗體的分析。使用3種抗 原修復方法使用3種稀釋度測試每種抗體(圖7)。
[0378] 每個全斷面切片含有腫瘤、前列腺上皮內(nèi)瘤(PIN)、正常前列腺上皮、基質(zhì)和在一 些切片中浸潤性免疫細胞的區(qū)域。
[0379] 該方法允許鑒定檢測感興趣的目標的抗體、抗原修復方案和稀釋度。
[0380]
[0381] 使用前列腺腫瘤的全斷面FFPE切片(4μπι)。
[0382] 測試樣品：
[0383] 前列腺腫瘤(DI 20052):年齡58:男性。病理-前列腺的腺癌。腫瘤分期:3+4 = 7。
[0384] 前列腺腫瘤(DI 20054):年齡70:男性:病理-前列腺的腺癌。腫瘤分期:3+4 = 7。
[0385] JIM
[0386] 除非另有說明，所有孵育都在室溫實施。
[0387] 1.目標修復(FFPE):
[0388] 抗原修復 1-Dako PT Link和3-in_lpH6· 1 目標修復(TR)溶液。
[0389] · _在自動加熱和冷卻下，97°C20min。
[0390] 抗原修復2-Dako PT Link和3-in_lpH9目標修復（TR)溶液。
[0391] · _在自動加熱和冷卻下，97°C20min。
[0392] 抗原修復3-Microwave Vector朽1檬酸鹽ρΗ6 · 1熱誘導的抗原修復(HIER) 〇
[0393] ?將載片脫石蠟和水化，然后用設置為全功率的微波煮沸(3X5min)。
[0394] 所有載片用PBS清洗-lOmin
[0395] 2.測定步驟(DAKO Envision Flex plus)
[0396] · _EnVision過氧化物酶封閉_5min
[0397] · j青洗
[0398] · _Dako CSAII無血清蛋白封閉-lOmin
[0399] ?-空氣去除
[0400] · _-抗-30min
[0401 ] · _清洗X2
[0402] · _EnVision Flex/HRP_20min
[0403] · j青洗X2
[0404] · _DAB-10min
[0405] 3.復染和蓋片
[0406] Mayer的蘇木精復染
[0407] 在遞呈系列的乙醇中脫水
[0408] ?在二甲苯中澄清(x3)
[0409] ?在DePeX下的蓋片
[0410] 試劑-一抗
[0411] CREM-抗cAMP響應性元件調(diào)節(jié)劑
[0412] 1 )Abcam 目錄號:AB64832，以4、2和lμg/ml測試
[0413] 2)Novus biomedical 目錄號:NBP1_81760，以4、2和lμg/ml測試
[0414] 3)Sigma Aldrich 目錄號：HPA001818-100UL，以0·8、0·4和0.2μg/ml測試（推薦濃 度0·16μg/ml)
[0415] · R-IgG-兔多克隆IgG(兔同種型對照)Alere目錄號:X0936
[0416] ERRFI1 -抗-ERBB受體反饋抑制劑1
[0417] 1 )Abcam 目錄號：ab50272，以4、2和lμg/ml測試
[0418] 2) Insight biotechnology 目錄號：SC-137154，以4、2和lμg/ml測試（Santa Cruz Biotechnology, Inc.)
[0419] 3)Sigma Aldrich 目錄號：HPA027206-100UL，以4、2和lμg/ml測試
[0420] · M-IgGl-小鼠單克隆IgGl(小鼠同種型對照)Alere目錄號:X0931
[0421] · R-IgGl-兔多克隆IgG(兔同種型對照)Alere目錄號:X0936
[0422] HJURP抗-Hoi 1 iday連結(jié)體識別蛋白
[0423] 1 )Abcam目錄號:AB100800，以4、2和lμg/ml測試，兔多克隆
[0424] 2)Abcam目錄號:AB175577,以4、2和lμg/ml測試，小鼠單克隆
[0425] 3)Biorbyt 目錄號:0RB140157,以4、2和lμg/ml測試兔多克隆
[0426] ?兔同種型對照Alere目錄號:X0936
[0427] ?小鼠 IgGl對照Alere 目錄號:X0931
[0428] PDK4-抗丙酮酸脫氫酶激酶，同工酶4
[0429] l)Sigma Aldrich 目錄號：HPA056731-100UL，以4、2和lμg/ml測試
[0430] 2)LifeSpan BioSciences 目錄號：LS_B3459，以4、2和lμg/ml測試
[0431] 3)Thermo scientific 目錄號：PA5_13778，以4、2和lμg/ml測試
[0432] · R-IgG-兔多克隆IgG(兔同種型對照)Alere目錄號:X0936
[0433] · SRSF5-抗-富含絲氨酸/精氨酸的剪接因子5
[0434] l)Novus Biomedical 目錄號：H00006430-B01P，以4、2和lμg/ml測試
[0435] 2)Sigma Aldrich 目錄號：HPA043484-100UL，以4、2和lμg/ml測試
[0436] 3)LifeSpan BioSciences 目錄號：LS_B3091，以4、2和lμg/ml測試
[0437] · R-IgGl-兔多克隆IgG(兔同種型對照)Alere目錄號:X0936
[0438] · Sigma Aldrich目錄號：F3520-1ML
[0439] ?多小鼠 IgG(M_IgGl、2a、2b)
[0440] · M-IgGl-Alere 目錄號：X0931
[0441] · M-IgG2a_Alere 目錄號：X0943
[0442] · M-IgG2b_Alere 目錄號：X0944
[0443] PDRG1-抗-p53和DNA損傷-調(diào)節(jié)的蛋白1
[0444] 1 )Abcam 目錄號:AB175965，以4、2和lμg/ml測試
[0445] 2)Biorbyt 目錄號：0RB162334,以4、2和lμg/ml測試
[0446] 3)Novus Biomedical 目錄號:NBP2_01854,以4、2和lμg/ml測試
[0447] · Μ-IgGl-小鼠單克隆IgGl(小鼠同種型對照)Alere目錄號:X0931
[0448] · R-IgGl-兔多克隆IgG(兔同種型對照)Alere目錄號:X0936
[0449] 結(jié)果
[0450]在概覽所有數(shù)據(jù)之后，以下目標已經(jīng)表明特定性且靈敏的IHC測定法，并且可用于 前列腺癌分類或預后。
[0453] 本發(fā)明的范圍不限于本文描述的具體實施方案。事實上，除了本文描述的那些以 外，本發(fā)明的各種改變對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，從前面的描述和附圖將是顯而易見的。這 樣的改變意欲落入所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。此外，本文描述的所有實施方案都被認為是 廣泛適用的且適當時可以與任何和所有其它一致實施方案組合。
[0454] 本文引用各種出版物，其公開內(nèi)容以其整體通過引用并入。
【主權(quán)項】
1. 用于表征和/或預后受試者中的前列腺癌的方法，其包括:測定來自所述受試者的樣 品中以下中的至少一種的表達水平： CREM、ERRFI1、SRSF5、PDK4、HJURP、PDRG1、TRPM3、PDE4D、F12、ADAMTS1、ADAMTS9、 B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、DKK1、EMP1、F3、ILIRl、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、 SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36 其中測定的表達水平用于提供所述前列腺癌的表征和/或預后。2. 權(quán)利要求1的方法，其包括測定以下中的至少一種的表達水平： SRSF5、PDK4、HJURP、PDRG1、TRPM3、PDE4D、F12、F3、CENPF、MYBPC1、SELE、CEBPD和XBP1。3. 權(quán)利要求1或2的方法，其中所述前列腺癌的表征和/或預后包括預測復發(fā)的增加可 能性和/或預測轉(zhuǎn)移的增加可能性，基本上由其組成，或由其組成。4. 權(quán)利要求1或2的方法，其中所述前列腺癌的表征和/或預后包括確定所述前列腺癌 是否具有不良預后，基本上由其組成，或由其組成。5. 任一前述權(quán)利要求的方法，其包括將所述表達水平與參考值或一個或多個對照樣品 中的表達水平進行比較。6. 任一前述權(quán)利要求的方法，其中將所述表達水平與一個或多個對照樣品中的相同基 因的表達水平進行比較。7. 任一前述權(quán)利要求的方法，其中將樣品中的前列腺癌細胞中的SRSF5、PDK4、PDRG1、 TRPM3、PDE4D和F12中的至少一種的表達水平與相同樣品中的正常細胞中的相同基因的表 達水平進行比較。8. 任一前述權(quán)利要求的方法，其進一步包括測定參考基因的表達水平。9. 任一前述權(quán)利要求的方法，其中將以下中的至少一種的表達水平與參考基因的表達 水平進行比較： CREM、ERRFI1、HJURP、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、DKK1、EMP1、F3、 IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS 3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、 0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、 TSC22D1、XBP1和ZFP36。10. 權(quán)利要求8或權(quán)利要求9的方法，其中所述參考基因是TPT1、RPS14或RPL37A。11. 任一前述權(quán)利要求的方法，其中HJURP、PDRG1、TRPM3、F12、CENPF、RNFT2 和 SSTR1 中 的至少一種的增加的表達水平表明復發(fā)和/或轉(zhuǎn)移和/或不良預后的增加可能性，和/或 CREM、ERRFI1、SRSF5、PDK4、PDE4D、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBPD、DKK1、EMP1、F3、 IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS 3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、 OAT、P115、PTGS2、RHOBTB3、RIN2、SELE、SLC15A2、SOCS2、SOCS3、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和 ZFP36中的至少一種的降低的表達水平表明復發(fā)和/或轉(zhuǎn)移和/或不良預后的降低可能性。12. 任一前述權(quán)利要求的方法，其中在蛋白質(zhì)、RNA或表觀遺傳修飾的水平測定所述表 達水平。13. 權(quán)利要求12的方法，其中所述表觀遺傳修飾是DNA甲基化。14. 任一前述權(quán)利要求的方法，其中通過免疫組織化學測定所述表達水平。15. 任一前述權(quán)利要求的方法，其中使用與標記綴合的抗體測定所述表達水平。16. 任一前述權(quán)利要求的方法，其中通過微陣列、northern印跡、RNA-seq(RNA測序）、原 位RNA檢測或核酸擴增測定所述表達水平。17. 任一前述權(quán)利要求的方法，其進一步包括從所述樣品提取總RNA。18. 任一前述權(quán)利要求的方法，其進一步包括從所述受試者獲得樣品。19. 任一前述權(quán)利要求的方法，其中所述樣品包含前列腺組織，基本上由其組成，或由 其組成。20. 任一前述權(quán)利要求的方法，其中所述樣品包含福爾馬林固定的石蠟包埋的活檢樣 品，基本上由其組成，或由其組成。21. 任一前述權(quán)利要求的方法，其包括測定HJURP、roRGl、TRPM3、F12、CENPF、RNFT2、和 SSTR1和CREM、ERRFI1、SRSF5、PDK4、PDE4D、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBPD、DKK1、 EMP1、F3、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、 NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、ST6GAL1、 TSC22D1、XBP1和ZFP36中的至少一種的表達水平。22. 用于選擇受試者中的前列腺癌的治療的方法，其包括： (a) 測定來自所述受試者的樣品中以下中的至少一種的表達水平： CREM、ERRFI1、SRSF5、PDK4、HJURP、PDRG1、TRPM3、PDE4D、F12、、ADAMTS1、ADAMTS9、 B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、DKK1、EMP1、F3、ILIRl、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、 SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36 其中測定的表達水平用于提供所述前列腺癌的表征和/或預后，和 (b) 選擇對于所述前列腺癌的表征和/或預后適當?shù)闹委煛?3. 用于選擇受試者中的前列腺癌的治療的方法，其包括： (a) 測定來自所述受試者的樣品中以下中的至少一種的表達水平： CREM、ERRFI1、SRSF5、PDK4、HJURP、PDRG1、TRPM3、PDE4D、F12、ADAMTS1、ADAMTS9、 B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、DKK1、EMP1、F3、ILIRl、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、 SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36 其中測定的表達水平用于提供所述前列腺癌的表征和/或預后 (b) 選擇對于所述前列腺癌的表征和/或預后適當?shù)闹委?，? (c) 用選擇的治療來治療所述受試者。24. 權(quán)利要求22或23的方法，其中如果所述前列腺癌的表征和/或預后結(jié)果是復發(fā)和/ 或轉(zhuǎn)移和/或不良預后的增加可能性，則選擇的治療是以下中的一種或多種： a) 抗激素治療劑，優(yōu)選比卡魯胺和/或阿比特龍 b) 細胞毒性劑 c) 生物制品，優(yōu)選抗體和/或疫苗，更優(yōu)選Sipuleucel-T d) 放射療法，任選擴大的放射療法，優(yōu)選擴野放射療法 e) 靶向療法 f) 手術(shù)。25. 治療前列腺癌的方法，其包括向受試者施用化療劑或放射療法，任選擴大的放射療 法，優(yōu)選擴野放射療法，或者對受試者實施手術(shù)，其中基于如權(quán)利要求22至24中任一項中請 求保護的方法選擇所述受試者用于治療。26. 用于治療受試者中的前列腺癌的化療劑， 其中基于如權(quán)利要求22至24中任一項中請求保護的方法選擇所述受試者用于治療。27. 治療前列腺癌的方法，其包括： 向受試者施用化療劑或放射療法，任選擴大的放射療法，優(yōu)選擴野放射療法，或者對受 試者實施手術(shù)，其中所述受試者具有HJURP、roRGl、TRPM3、F12、CENPF、RNFT2和SSTRl中的至 少一種的增加的表達水平和 / 或 CREM、ERRFI1、SRSF5、PDK4、PDE4D、ADAMTS1、ADAMTS9、 B3GNT5、CD38、CEBPD、DKK1、EMP1、F3、IL1Rl、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、LPAR1、 MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、SELE、SLC15A2、 S0CS2、S0CS3、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36中的至少一種的降低的表達水平。28. 用于治療受試者中的前列腺癌的化療劑， 其中所述受試者具有HJURP、PDRG1、TRPM3、F12、CENPF、RNFT2和SSTR1中的至少一種的 增加的表達水平和 / 或 CREM、ERRFI1、SRSF5、PDK4、PDE4D、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、 CEBPD、DKK1、EMP1、F3、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、 MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、 ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36中的至少一種的降低的表達水平。29. 權(quán)利要求25或27的方法，或權(quán)利要求26或28的用于治療受試者中的前列腺癌的化 療劑， 其中所述化療劑包含以下，基本上由以下組成，或由以下組成： a) 抗激素治療劑，優(yōu)選比卡魯胺和/或阿比特龍 b) 細胞毒性劑 c) 生物制品，優(yōu)選抗體和/或疫苗，更優(yōu)選Sipuleucel-T和/或 d) 靶向的治療劑。30. 權(quán)利要求24或29的方法，其中所述細胞毒性劑是基于鉑的藥劑和/或紫杉烷。31. 權(quán)利要求30的方法，其中所述基于鉑的藥劑選自順鉑、卡鉑和奧沙利鉑。32. 權(quán)利要求30的方法，其中所述紫杉烷是紫杉醇或多西他賽。33. 抗體，其特異性結(jié)合至以下中的至少一種的蛋白質(zhì)產(chǎn)物： CREM、ERRFI1、SRSF5、PDK4、HJURP、PDRG1、TRPM3、PDE4D、F12、ADAMTS1、ADAMTS9、 B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、DKK1、EMP1、F3、ILIRl、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、 SLC15A2、SOCS2、SOCS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36。34. 權(quán)利要求33的抗體，其與標記綴合。35. 權(quán)利要求33或34的抗體用于表征和/或預后受試者中的前列腺癌的用途。36. 用于診斷受試者中的具有增加的轉(zhuǎn)移潛能的前列腺癌的方法，其包括： 測定來自所述受試者的樣品中以下中的至少一種的表達水平： CREM、ERRFI1、SRSF5、PDK4、HJURP、PDRG1、TRPM3、PDE4D、F12、ADAMTS1、ADAMTS9、 B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、DKK1、EMP1、F3、ILIRl、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、 SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36 其中測定的表達水平用于鑒定受試者是否患有具有增加的轉(zhuǎn)移潛能的前列腺癌。37. 用于診斷受試者中的具有增加的轉(zhuǎn)移潛能的前列腺癌的方法，其包括： 測定來自所述受試者的樣品中以下中的至少一種的表達水平： SRSF5、PDK4、TRPM3、PDRG1、PDE4D和F12 其中測定的表達水平用于鑒定受試者是否患有具有增加的轉(zhuǎn)移潛能的前列腺癌。38. 用于表征和/或預后受試者中的前列腺癌的方法，其包括:測定來自所述受試者的 樣品中以下中的至少一種的表達水平： CREM、ERRFI1、SRSF5、PDK4、HJURP、PDRG1、TRPM3、PDE4D、F12、ADAMTS1、ADAMTS9、 B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、DKK1、EMP1、F3、ILIRl、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、 SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36或 以鑒定特征在于復發(fā)和/或轉(zhuǎn)移的增加可能性的細胞的存在或不存在，其中測定的所 述細胞的存在或不存在用于提供所述前列腺癌的表征/或預后。39. 用于表征和/或預后受試者中的前列腺癌的方法，其包括： a) 從所述受試者獲得樣品 b) 將對于以下中的至少一種的蛋白質(zhì)產(chǎn)物特異性的抗體應用于來自所述受試者的樣 品： CREM、ERRFI1、SRSF5、PDK4、HJURP、PDRG1、TRPM3、PDE4D、F12、ADAMTS1、ADAMTS9、 B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、DKK1、EMP1、F3、ILIRl、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、 SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36 c) 應用檢測抗體-蛋白質(zhì)復合物的檢測試劑 d) 使用所述檢測試劑以測定所述蛋白質(zhì)的水平 d)其中測定的蛋白質(zhì)的水平用于提供所述前列腺癌的表征和/或預后。40. 用于執(zhí)行任一前述權(quán)利要求的方法的系統(tǒng)或裝置。41. 用于表征和/或預后受試者中的前列腺癌的系統(tǒng)或測試試劑盒，其包含： a) -種或多種測試裝置，其用于測定來自所述受試者的樣品中以下中的至少一種的表 達水平： CREM、ERRFI1、SRSF5、PDK4、HJURP、PDRG1、TRPM3、PDE4D、F12、ADAMTS1、ADAMTS9、 B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、DKK1、EMP1、F3、ILIRl、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、 SLC15A2、SOCS2、SOCS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36 b) 處理器;和 c) 包含計算機應用的存儲介質(zhì)，當由所述處理器執(zhí)行時，所述計算機應用被配置為： (i)在一種或多種測試裝置上訪問和/或計算所述樣品中以下中的至少一種的測定的 表達水平： CREM、ERRFI1、SRSF5、PDK4、HJURP、PDRG1、TRPM3、PDE4D、F12、ADAMTS1、ADAMTS9、 B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、DKK1、EMP1、F3、ILIRl、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、 SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36 (ii) 計算所述樣品中以下中的至少一種的水平是增加還是降低： CREM、ERRFI1、SRSF5、PDK4、HJURP、PDRG1、TRPM3、PDE4D、F12、ADAMTS1、ADAMTS9、 B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、DKK1、EMP1、F3、ILIRl、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、 SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36;和 (iii) 從所述處理器輸出所述前列腺癌的表征和/或預后。42. 權(quán)利要求41的系統(tǒng)或測試試劑盒，其進一步包含用于從所述處理器輸出的顯示器。43. 計算機應用或包含如權(quán)利要求41或42中定義的計算機應用的存儲介質(zhì)。44. 用于表征和/或預后受試者中的前列腺癌的方法，其包括： 測定來自所述受試者的樣品中以下中的至少一種的甲基化狀態(tài)： ADAMTS9、EMP1、F3、LDLR、LGALS3、MALAT1、MTUS1、NR4A3、PTGS2、RIN2、SLC15A2、S0CS3和 TSC22D1 其中測定的甲基化狀態(tài)用于提供所述前列腺癌的表征和/或預后。45. 權(quán)利要求44的方法，其中如果八0厶10^94]\031、卩3、1^1^、0^1^3、]\^1^1!、]\0'1]51、 NR4A3、PTGS2、RIN2、SLC15A2、S0CS3和TSC22D1中的至少一種被過度甲基化，則復發(fā)和/或轉(zhuǎn) 移的可能性增加。46. 用于表征和/或預后受試者中的前列腺癌的試劑盒，其包含一種或多種權(quán)利要求33 或34的抗體。47. 權(quán)利要求46的試劑盒，其進一步包含權(quán)利要求43的計算機應用或存儲介質(zhì)。48. 用于表征和/或預后受試者中的前列腺癌的計算機程序產(chǎn)品，其包含具有在其上實 施的計算機可讀程序指令的非臨時性計算機可讀存儲裝置，所述計算機可讀程序指令引起 所述計算機： (i) 在一種或多種測試裝置上訪問和/或計算樣品中以下中的至少一種的測定的表達 水平：CREM、ERRF11、SRSF5、PDK4、H JURP、PDRG1、TRPM3、PDE4D、F12、ADAMTS1、ADAMTS9、 B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、DKK1、EMP1、F3、ILIRl、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、 SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36; (ii) 計算所述樣品中以下中的至少一種的水平是增加還是降低:CREM、ERRFI 1、SRSF5、 PDK4、HJURP、PDRG1、TRPM3、PDE4D、FI2、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、 DKK1、EMP1、F3、IL1Rl、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、 NFIL3、NR4A3、OAT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RlN2、RNFT2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、 ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36;和 (iii) 提供關(guān)于所述前列腺癌的表征和/或預后的輸出。49. 用于表征和/或預后受試者中的前列腺癌的試劑盒，其包含一種或多種對于以下中 的至少一種的RNA產(chǎn)物特異性的寡核苷酸探針： CREM、ERRFI1、SRSF5、PDK4、HJURP、PDRG1、TRPM3、PDE4D、F12、ADAMTS1、ADAMTS9、 B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、DKK1、EMP1、F3、ILIRl、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、 SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36 且進一步包含以下組分中的一種或多種： a) 阻斷探針 b) 預擴增分子 c) 擴增分子和/或 d) 標記分子。
【文檔編號】G01N33/574GK105940117SQ201480074318
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2014年12月12日
【發(fā)明人】S·沃克爾, A·麥卡維干, T·達維森, R·肯尼迪, P·哈金, L·希爾
【申請人】阿爾瑪克診斷有限公司