惡性瘧原蟲青蒿素耐藥性的分子標(biāo)記物的制作方法
【專利摘要】K13?推進(jìn)器多態(tài)性是用于追蹤耐受ART的惡性瘧原蟲(P.falciparum)的出現(xiàn)和擴(kuò)散的有用的分子標(biāo)記物。本發(fā)明包括用于檢測瘧原蟲(Plasmodium)(例如惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum))并對瘧原蟲進(jìn)行基因分型的方法、組合物和試劑盒。該方法、組合物和試劑盒可以被用于檢測樣品中突變的K?13推進(jìn)器核酸或蛋白的存在與否。
【專利說明】惡性瘧原蟲青蒿素耐藥性的分子標(biāo)記物
[0001]發(fā)明背景
[0002] 在柬埔寨出現(xiàn)的惡性皰原蟲(Plasmodium falciparum)對青蒿素衍生物(ART)的 耐藥性威脅到全世界防治和消除瘧疾的努力1>2。如之前已發(fā)生的耐受氯喹和耐受磺胺多 辛/乙胺嘧啶的寄生蟲那樣 34,耐受ART的寄生蟲從柬埔寨西部向大湄公河次區(qū)域以及向非 洲傳播的風(fēng)險是極其令人擔(dān)憂的。臨床上ART耐藥性被定義為降低的寄生蟲清除率m 0，被 表示為增加的寄生蟲清除半衰期n，12,或者在基于青蒿素的組合治療(ACT) 2的第三天顯微 鏡下可檢測的寄生蟲的殘留率(persistence)。半衰期參數(shù)與體外環(huán)狀體期存活測定(RSA 0 _3h)和離體RSA13的結(jié)果強(qiáng)烈相關(guān)，它們測量環(huán)狀體期幼小的寄生蟲在藥理學(xué)相關(guān)暴露 (700nM暴露6h)于雙氫青蒿素(DHA)(所有ART的主要代謝物)下的存活率。但是，目前缺乏分 子標(biāo)記物阻礙了在已記錄耐受ART的寄生蟲的區(qū)域中對這些寄生蟲的重點(diǎn)遏制，并且妨礙 了在ACT仍然是價格最實惠、最有效的抗瘧藥的其他地方中對這些寄生蟲的快速檢測。為了 檢測和監(jiān)測ART耐藥性的擴(kuò)散，需要廣泛使用的分子標(biāo)記物。
[0003] 最近惡性瘧原蟲分離物的全基因組分析已經(jīng)提供了在ART耐藥性的地理區(qū)域中陽 性選擇的最新證據(jù)9，^ 16。盡管該臨床表型的寄生蟲遺傳率大于50%，仍然沒有鑒定出可靠 的分子標(biāo)記物。一個可能的解釋是，寄生蟲清除半衰期不僅由分離寄生蟲對ART的固有敏感 性確定，而且由其ART治療時的發(fā)育階段和宿主相關(guān)參數(shù)(諸如藥動力學(xué)和免疫力）確定 17。 最近在體內(nèi)寄生蟲清除半衰期和體外RSA^h存活率之間呈現(xiàn)失調(diào)數(shù)據(jù)的患者中強(qiáng)調(diào)了該 問題 13。此外，全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)受到與寄生蟲群體結(jié)構(gòu)有關(guān)的不確定性的困擾。最 近柬埔寨西部針對耐受ART的寄生蟲的幾個高度分化亞群的證據(jù) 15表明可能發(fā)生獨(dú)特的緊 急事件。發(fā)現(xiàn)分子標(biāo)記物的可選策略是分析由體外高劑量ART篩選存活的、適應(yīng)實驗室的寄 生蟲克隆特異性獲得的突變，并使用該信息引導(dǎo)分析來自以下區(qū)域的臨床寄生蟲分離物中 的多態(tài)性:在時間水平和地理水平充分記載ART耐藥性的區(qū)域。在此，我們使用該策略探索 柬埔寨的臨床ART耐藥性的分子特征(mo 1 ecu 1 ar s ignature)，該表型首次在柬埔寨得到報 道1'8。
[0004] 基于青蒿素的組合治療(ACT)是全球瘧疾防治努力的關(guān)鍵方面。Nkhoma等人，JID 208:346-349(2013)。但是，耐受青蒿素的瘧疾的出現(xiàn)已經(jīng)威脅到這些努力。同上。目前沒有 用于可靠測量ART耐藥性的體外測試。同上。因此，已經(jīng)測量了 ART治療之后血液寄生蟲下降 的患者中ART的敏感性。同上。該方法昂貴、費(fèi)力又費(fèi)時。同上。
[0005] 目前缺乏分子標(biāo)記物阻礙了在已有耐藥性記錄的疫源地中的遏制努力，并且妨礙 了在ART仍然是價格最實惠和最有效的抗瘧藥的其他地方病區(qū)域中對ART耐藥性的快速檢 測。為了大范圍監(jiān)測ART耐藥性，迫切需要與ART耐藥性相關(guān)的分子標(biāo)記物。本發(fā)明滿足了本 領(lǐng)域的這一需要。
[0006] 發(fā)明概述
[0007] 本發(fā)明包括用于檢測瘧原蟲(Plasmodium)并對瘧原蟲進(jìn)行基因分型的方法、組合 物和試劑盒。在一個實施方案中，該方法包括提供含有瘧原蟲的樣品；以及檢測樣品中突變 的K-13推進(jìn)器(propeller)核酸或蛋白的存在。優(yōu)選地，皰原蟲是惡性皰原蟲(Plasmodium falciparum)〇
[0008] 在一個實施方案中，通過測序檢測樣品中突變的K-13推進(jìn)器核酸的存在。在一個 實施方案中，通過PCR檢測樣品中突變的Κ-13推進(jìn)器核酸的存在。
[0009] 本發(fā)明包括用于檢測感染患者中瘧原蟲感染的方法、組合物和試劑盒。在一個實 施方案中，該方法包括提供患者的血液樣品并檢測血液樣品中野生型或突變的Κ-13推進(jìn)器 核酸或蛋白的存在與否。該方法可以包括確定瘧原蟲是否具有野生型或突變Κ-13推進(jìn)器核 酸或蛋白序列。
[0010] 優(yōu)選地，瘧原蟲是惡性瘧原蟲。
[0011] 在一個實施方案中，通過測序檢測樣品中突變的κ-13推進(jìn)器核酸的存在。在一個 實施方案中，通過PCR檢測樣品中野生型或突變的Κ-13推進(jìn)器核酸的存在與否。
[0012] 在一個實施方案中，用于檢測瘧原蟲感染的試劑盒包含用于擴(kuò)增Κ-13推進(jìn)器核酸 的引物和用于檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的試劑。
[0013] 在一個實施方案中，試劑盒含有用于檢測突變Κ-13推進(jìn)器核酸的探針。優(yōu)選地，探 針以熒光標(biāo)記或酶標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。
[0014] 在各種實施方案中，試劑盒檢測編碼Y493H、R539T、I543T和C580Y等位基因的突變 K-13推進(jìn)器核酸。
[0015] 在一個實施方案中，試劑盒檢測編碼Y493H、R539T、I543T或C580Y等位基因的突變 K-13推進(jìn)器核酸。
[0016] 在各種實施方案中，試劑盒包含以下引物中的至少一種：
[0021]或者試劑盒包含以下引物中的至少一種：
[0028] 在各種實施方案中，試劑盒檢測編碼F446I、N458Y、C469Y、Y493H、K503N、R539T、 15431'、？5531^、？57乩^5785丄580￥和0584￥等位基因的突變1(13推進(jìn)器核酸。
[0029] 在各種實施方案中，試劑盒檢測編碼？4461、64494、財58￥、0469￥、1470終止、 A481V、Y493H、K503N、S522C、V534A、R539T、I543T、G548D、P553L、V555A、A557S、R561H、 K563R、V568G、P574L、A578S、C580Y、F583L、D584V、V589I、Q613E和D641G等位基因的突變K13 推進(jìn)器核酸。
[0030] 在各種實施方案中，試劑盒包含以下引物對中的至少一種：
[0031] PCR 引物對 1
[0049]在各種實施方案中，試劑盒包含與以下SNP之一雜交的至少一種探針：
[0052] 本發(fā)明包括用于檢測含有瘧原蟲的生物樣品中野生型K13推進(jìn)器核酸或突變K13 推進(jìn)器核酸的存在的方法，該方法包括：
[0053] 提供含有癥原蟲DNA的生物樣品；
[0054] 任選地從生物樣品提取DNA;
[0055]使瘧原蟲DNA與至少一種引物對接觸，所述引物對與K13推進(jìn)器核酸在100-300bp 的長度范圍特異性雜交，以及在嵌入式染料的存在下進(jìn)行PCR反應(yīng)；
[0056]使擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)歷解鏈步驟；
[0057]通過分析擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈曲線確定突變等位基因或野生型等位基因的存在。
[0058] 在一些實施方案中，該方法包括檢測編碼？4461、6449六、財58￥、0469￥、1470終止、 A481V、Y493H、K503N、S522C、V534A、R539T、I543T、G548D、P553L、V555A、A557S、R561H、 K563R、V568G、P574L、A578S、C580Y、F583L、D584V、V589I、Q613E和D641G等位基因的突變K13 推進(jìn)器核酸。
[0059] 本發(fā)明包括用于檢測含有瘧原蟲的生物樣品中突變K13推進(jìn)器核酸的存在的方 法，該方法包括通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增突變K13推進(jìn)器核酸，以及使擴(kuò)增的核酸與特異性針對突 變K13推進(jìn)器核酸的探針接觸。
[0060] 在一些實施方案中，探針與熒光珠或生物素結(jié)合。
[0061] 在一些實施方案中，該方法包括使探針與突變K13推進(jìn)器域核酸結(jié)合，以及用與結(jié) 合的K13推進(jìn)器域核酸結(jié)合的第二探針檢測結(jié)合的K13推進(jìn)器域核酸。
[0062] 在一些實施方案中，突變的K13推進(jìn)器核酸或蛋白的存在表示患者感染了耐受青 蒿素衍生物的皰原蟲。
[0063] 在一些實施方案中，該方法包括向感染了耐受青蒿素衍生物的瘧原蟲的所述患者 給予比常規(guī)方案更持久的基于青蒿素衍生物的治療，和/或給予基于另一種抗瘧藥的治療， 優(yōu)選奎寧、氯喹或甲氟喹。
[0064] 在一些實施方案中，該方法包括向感染了耐受青蒿素衍生物的瘧原蟲的所述患者 給予基于新的抗瘧藥的治療，并在給予所述治療之后重復(fù)步驟a)和b)，其中突變的K13推進(jìn) 器核酸或蛋白的不存在表示該患者不再感染耐受青蒿素衍生物的瘧原蟲并且所述治療對 于耐受青蒿素衍生物的瘧原蟲是有效的。
[0065]附圖的簡要說明
[0066]圖1-F32-ART5中突變的時間獲取。通過全基因組測序在五個時間點(diǎn)（灰色箭頭)對 連續(xù)120個循環(huán)暴露于增加的青蒿素濃度的F32-坦桑尼亞寄生蟲18進(jìn)行了分析。顯示了給定 數(shù)量的藥物壓力循環(huán)之后突變的位置(方框）。示出了通過PCR檢測的三個突變的最早時間 點(diǎn)（黑色箭頭），0表示PF3D7_1343700，*表示PF3D7_021340(^P#表示PF3D7_1115700。圓圈 分別表示F32-ART5和F32-TEM寄生蟲的RSA^h#活率。
[0067]圖2-通過K13-推進(jìn)器等位基因分層（stratified)的RSA*3^1中柬埔寨分離寄生蟲 的存活率。通過挖掘全基因組序列數(shù)據(jù)(n = 21)或?qū)CR產(chǎn)物進(jìn)行測序(n = 28)獲得基因型。 突變寄生蟲具有顯著高于野生型寄生蟲的RSA*^311存活率:野生型（n= 17,中位值0.16%， IQR0 · 09-0 · 24，范圍0 · 04-0 · 51); C580Y(n = 26，中位值 14 · 1 %，IQR 11 · 3-19 · 6，范圍3 · 8-27.3，野生型對0580￥的？〈10-6，]^1111-而1加67 1]檢驗）；1?5391'(11 = 5，中位值24.2%，1〇1? 12.6-29.5，范圍5.8-31.3，野生型對1?5391'的？〈10-3);￥493!1(51.4%) ;以及15431'(58.0%)。 星號表示的是對照3D7寄生蟲的RSA~3h存活率(0.04% )。
[0068]圖3-2001-2012年中在六個柬埔寨省里886份寄生蟲分離物中K13-推進(jìn)器等位基 因頻率。從存檔血液樣品通過對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序獲得基因型。所有突變等位基因攜帶單個 非同義SNP(顏色編碼，野生型、C580Y、R539T、Y493H和I543T的顏色編碼與圖2中相同）。在拜 林市、馬德望省、菩薩省和桔井省中觀察到野生型等位基因頻率隨著時間顯著降低(Fisher 精確檢驗）（參見實施例）。
[0069]圖4-A、2009-2010年中菩薩省和臘塔納基里省中寄生蟲分離物的寄生蟲清除半衰 期與K13-推進(jìn)器等位基因的相關(guān)性。野生型寄生蟲比C580Y(7.19h，6.47-8.31，n = 51，P〈 10-6，Mann-Whitney U檢驗）、R539T(6 · 64h，6 · 00-6 · 72，n = 6，P〈10-6)SY493H(6.28h，5.37-7·14，η = 21，Ρ〈10-6)寄生蟲具有更短的半衰期（中位值3.30h，IQR 2·59-3·95，η = 72)。 C580Y寄生蟲的半衰期顯著長于Υ493Η寄生蟲的半衰期0 = 〇.〇〇7)。8、相同的150份寄生蟲 分離物的寄生蟲清除半衰期、ΚΗ亞群15和Κ13-推進(jìn)器等位基因的相關(guān)性。顯示了通過ΚΗ分組 和Κ13-推進(jìn)器等位基因分層的菩薩省(方塊)和臘塔納基里省(三角）的半衰期（如上圖Α中 進(jìn)行顏色編碼）。通過K13-推進(jìn)器等位基因分層的中位半衰期是：[KH1:野生型（2.88)和 丫493!1(6.77) ;1012:0580￥(7.13)和￥493!1(4.71);1(!13 :野生型（3.65)、0580￥(8.73)和1?539丁 (6.65);1014:￥493!1(6.37) ;以及1(說：野生型（4.01)、0580￥(7.09)、￥493!1(6.18)和1?539丁 (5.73)]。
[0070] 圖5-比較F32-ART5和F32-TEM的全基因組序列的SNP讀出（calling)算法(a)，以及 在F32-TEM和F-32ART5中7個候選基因中SNP的序列和覆蓋度的不同（b)。
[0071] 圖6-2011-2012年中柬埔寨K13-推進(jìn)器等位基因的地理分布。
[0072]餅狀圖顯示柬埔寨十個省的300份寄生蟲分離物中的K13-推進(jìn)器等位基因頻率。 餅的大小與分離物的數(shù)量成比例，并且如圖3中對不同等位基因進(jìn)行顏色編碼。突變K13-推 進(jìn)器等位基因的頻率（95 %CI)為：拜林市（Pail in) (95 % ,88-99，n = 84)、馬德望省 (13已1^&11^&1^)(93%，87-99，11 = 71)、菩薩?。ǎ?^8&1:)(89%，67-99，11=19)、貢布省 (Kampot)(83%，52-98，n = 12)、西哈努克市（Kampong Som)(71%，29-96，n = 7)、奧多棉吉 省（Oddar Meanchey) (76%，58-89，n = 33)、柏威夏?。≒reah Vihear) (16%，3-40，n = 19)、 桔井省(Kratie) (71% ,44-90，n= 17)、蒙多基里省(Mondulkiri )(67% ,9-99，n = 3)和臘塔 納基里?。≧atanakiri) (6%，1-19，n = 35) 〇
[0073] 圖7-在柬埔寨八個省中野生型K13-推進(jìn)器等位基因頻率與ACT治療后第3天陽性 患病率之間的相關(guān)性。
[0074] 針對野生型K13-推進(jìn)器等位基因的頻率繪制第3天陽性頻率。數(shù)據(jù)源自在柬埔寨 八個省中在2010-2012年中針對惡性瘧原蟲瘧疾用ACT進(jìn)行治療的患者（圖4):拜林市(n = 86,2011年WHO療效研究，青蒿琥酯-甲氟喹）；菩薩省(n = 32,2012年WHO療效研究，雙氫青蒿 素-哌喹）；奧多棉吉省(n = 32,2010年NAMRU-2療效研究，青蒿琥酯-甲氟喹）；西哈努克市/ 鎊士卑省(Kampong 3〇111/3?611)(11 = 7,2012年1!10療效研究，雙氫青蒿素-哌喹）；馬德望省(11 =18，2012年WHO療效研究，雙氫青蒿素-哌喹）；桔井省(n= 15，2011年WHO療效研究，雙氫青 蒿素-哌喹）；柏威夏省(n=19,2011年WHO療效研究，雙氫青蒿素-哌喹）；臘塔納基里省(n = 32,2010年而0療效研究，雙氫青蒿素-哌喹）。5?的^1&11的秩相關(guān)性系數(shù)（8個位置）7 =-0.99,95 % CI-0.99t〇-0.96,P<0.0001〇
[0075] 圖8-惡性瘧原蟲K13和人KEAP1蛋白質(zhì)之間同源性(A)和K13-推進(jìn)器域的三維結(jié)構(gòu) 模型(B)的示意圖。
[0076] A、預(yù)測的PF3D7_1343700蛋白與人Keapl同源性的示意圖。與Keapl類似，PF3D7_ 1343700含有ΒΤΒ/Ρ0Ζ域和C-末端6-葉片推進(jìn)器，其組裝成由四個反平行β片層組成的kelch 模體。B、K13-推進(jìn)器域的三維結(jié)構(gòu)模型，其顯示從N-末端至C-末端編號1-6的六個kelch葉 片。
[0077]蛋白的K13-推進(jìn)器和kelch域與經(jīng)解析的三維結(jié)構(gòu)(包括人Keapl46'47)之間的氨基 酸同一性水平使得我們能夠?qū)13-推進(jìn)器的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模并對在ART壓力下選擇的突 變進(jìn)行作圖（表4)。由建模器特異性模型/折疊標(biāo)準(zhǔn)的可靠性確認(rèn)K13-推進(jìn)器三維模型的準(zhǔn) 確性(參見實施例）。我們預(yù)測，K13-推進(jìn)器折疊成由C-末端β-片層和N-末端葉片之間的相 互作用封閉 46,48形成的六葉片推進(jìn)器結(jié)構(gòu)48。在圖9中，第一域具有三個β-片層，第四個片 層(the 4th one)由額外的稱為β'1的C-末端β-片層貢獻(xiàn)。
[0078] 在人肺癌46和高血壓47中影響葉片內(nèi)部和葉片之間相互作用的各種突變使得人 Keaplkelch推進(jìn)器支架變得不穩(wěn)定。通過球表示各種突變的位置。以深灰色表示F32-ART5 中突變的M476殘基。如同在人Keapl中所觀察到的突變一樣 46'47,預(yù)測許多K13-推進(jìn)器突變 改變推進(jìn)器的結(jié)構(gòu)或改變表面電荷，并且因此改變該蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。重要的是，在柬 埔寨觀察到的兩個主要突變C580Y和R539T均為非保守的并分別位于有組織的二級結(jié)構(gòu)中： 位于葉片4的β-片層(經(jīng)預(yù)測在此改變該支架的完整性)和位于葉片3的表面。
[0079] Keapl的kelch推進(jìn)器域涉及如同大多數(shù)含有kelch的模塊一樣的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì) 相互作用43 leapl是誘導(dǎo)型Nrf2依賴的細(xì)胞保護(hù)性應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)子，其在穩(wěn)定狀態(tài)下螯合 細(xì)胞質(zhì)中的Nrf2。一旦發(fā)生氧化應(yīng)激，Nrf2/Keapl復(fù)合物被破壞，Nrf2易位至細(xì)胞核，在那 里它誘導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)性ARE依賴基因的轉(zhuǎn)錄 49'5Q。我們推斷惡性瘧原蟲中的PF3D7_1343700可 能具有類似功能，使得K13-推進(jìn)器的突變損害它與未知蛋白質(zhì)伴侶的相互作用，從而產(chǎn)生 去調(diào)控的抗氧化/細(xì)胞保護(hù)性應(yīng)答。當(dāng)血紅蛋白的消化和代謝最高時，惡性瘧原蟲的抗氧化 應(yīng)答在裂殖體晚期過程中最大。它的調(diào)控仍然知之甚少，并且在瘧原蟲基因組中沒有能夠 鑒定出Nrf2的直系同源物。
[0080] 圖9A和B-PF3D7_1343700的參考核酸（SEQ ID N0:1)和氨基酸（SEQ ID N0:2)編碼 序列（3D7-型)和突變位置。
[0081 ] 圖94顏色編碼：深灰色，皰原蟲特異性（1-225)和頂復(fù)門（六口;[(301]^1613)特異性 (225-345)位置；淺灰色，ΒΤΒ/Ρ0Ζ域。在圖9B中以黑色方塊框住在9.3版的PlasmoDB (http: //www. plasmodb. org/plasmo/)中報道的多態(tài)性密碼子的位置和在本研究中觀察到 的那些。注意，大多數(shù)報道的多態(tài)性位于與來自閃比亞的一份分離物中觀察到的E621D隔開 的N-末端域中（參考文獻(xiàn)44)。六個單個kelch域分別位于第443-473、474-526、527-573、 574-614、615-666 和667-726位殘基。
[0082]圖10A-C-來自七個瘧原蟲種的PF3D7_1343700直系同源物的蛋白序列的 ClustalW-比對。
[0083] 代碼：
[0084] F-XP_001350158惡性瘧原蟲（PF3D7_1343700)(SEQ ID N0:2)
[0085] V-XP_〇〇1614215間日瘧原蟲（P.vivax)Sall(SEQ ID N0:3)
[0086] C-XP_004223579食蟹猴瘧原蟲（P·cynomolgi)(SEQIDN0:4)
[0087] K-XP_002259918諾氏瘧原蟲（P.knowlesi)(SEQ ID N0:5)
[0088] B-XP_674094柏氏瘧原蟲（P.berghei)(SEQ ID N0:6)
[0089] Y-XP_730901 約氏瘧原蟲（P.yoelii)(SEQ ID N0:7)
[0090] PCHAS_136130夏氏瘧原蟲（P.chabaudi)(SEQ ID N0:8)
[0091 ]惡性瘧原蟲多態(tài)性殘基有灰色陰影。
[0092] 圖11-實時PCR-HRM:檢測突變的K13推進(jìn)器等位基因?qū)σ吧蚄13推進(jìn)器等位基 因。核酸序列是SEQ ID NO: 1的第1261-2181位nt。氨基酸序列是SEQ ID N0:2的第421-726 位aa〇
[0093]就K13基因的推進(jìn)器域的序列設(shè)計了六對引物以擴(kuò)增所有域并通過箭頭標(biāo)出。 [0094] 圖12A-B-A)通過實時PCR-HRM檢測突變的K13推進(jìn)器等位基因?qū)σ吧蚄13推進(jìn)器 等位基因 （SEQ ID NO: 1 的第 1279-2127位nt)。
[0095] B)六個引物對的序列，它們在K13推進(jìn)器域的核酸序列上的位置和擴(kuò)增產(chǎn)物的大 小。（SEQ ID N0:27-38)。
[0096] 圖13-通過Luminex?多重測定(多重連接酶檢測反應(yīng)-焚光微球測定)通過pcr 反應(yīng)和探針雜交檢測突變的K13推進(jìn)器等位基因中20個。核酸序列是SEQ ID NO: 1的第 1261-2181 位nt。氨基酸序列是SEQ ID NO:2的第421-726位aa。
[0097] 黑色箭頭顯示用于PCR反應(yīng)的引物，
[0098] 引物F 5'gccttgttgaaagaagcaga 3'（SEQ ID N0:14)
[0099] 引物R 5，_gccaagctgccattcatttg_3'（SEQ ID NO: 13)
[0100] 設(shè)計特異性引物（淺灰色和深灰色）以檢測K13推進(jìn)器域中的單核苷酸多態(tài)性 (SNP)。淺灰色探針是等位基因特異性的并與熒光珠結(jié)合。對于每個淺灰色位置，有兩個探 針，一個在3'端具有突變的核苷酸，一個在3'端具有野生型核苷酸。在保守序列區(qū)域中設(shè)計 深灰色探針并將其與生物素結(jié)合。
[0101] SNP 列表：
[0104] 表1-用于擴(kuò)增F32-ART5中含有非同義單核苷酸多態(tài)性的基因的引物的序列。顯示 了正向引物（SEQ ID N0 39-45)和反向引物（SEQ ID N0 46-52)。
[0105] 表2-在5年非連續(xù)有效暴露于增加濃度的青蒿素過程中與F32-TEM譜系相比在 F32-ART5中獲得的八個非同義單核苷酸多態(tài)性的說明。
[0106] #3D7-型序列;在親本F32-坦桑尼亞系中也觀察到相同的密碼子序列。
[0107] $用于相應(yīng)的藥物壓力循環(huán)過程中的青蒿素(ART)劑量。
[0108] 等人16的選擇中排在前列的特征的染色體位置中發(fā)現(xiàn)的基 因。
[0109] 表3-在F32-ART5寄生蟲中突變基因已報道的特征。
[0110]表4-用于研究K13-推進(jìn)器多態(tài)性的存檔血液樣品收集的地理起源和年份。
[0111] 表5-在2001-2012年收集的柬埔寨惡性瘧原蟲分離物中和在閃比亞(參考文獻(xiàn)42) 中的K13-推進(jìn)器中觀察到的多態(tài)性。
[0112] *在F32-ART中觀察到，而在柬埔寨中未觀察到。
[0113] **在閃比亞中報道過(參考文獻(xiàn)42)，而在柬埔寨在未觀察到。
[0114] 表6-在K13-推進(jìn)器和KH亞群(參考文獻(xiàn)15)中觀察到的多態(tài)性之間的相關(guān)性，其觀 察于在柬埔寨菩薩省(n=103)和臘塔納基里省(n = 47)中于2009-2010年收集的150份惡性 瘧原蟲分離物中。
[0115] 表7 -在亞洲和非洲的K13推進(jìn)器域中鑒定的最頻繁的突變列表。
[0116] 表8-如Witkowski等人45所述將來自柬埔寨(于2010年和2011年收集）的五十份臨 床惡性瘧原蟲分離物適應(yīng)于體外培養(yǎng)。顯示了RSA和多態(tài)性。
[0117] 發(fā)明詳述
[0118] 惡性瘧原蟲在東南亞對青蒿素衍生物的耐藥性威脅全世界的瘧疾控制和清除活 動。為了監(jiān)測青蒿素耐藥性的擴(kuò)散，迫切需要分子標(biāo)記物。在此，我們對來自非洲的耐受青 蒿素的寄生蟲和來自柬埔寨的臨床分離寄生蟲使用全基因組測序，將PF3D7_1343700kelch 推進(jìn)器域（'K13-推進(jìn)器'）中的突變與青蒿素耐藥性在體外和體內(nèi)相關(guān)聯(lián)。耐藥性流行的柬 埔寨省份中突變K13-推進(jìn)器等位基因簇和顯性突變K13-推進(jìn)器等位基因的增加的頻率與 柬埔寨西部最近耐藥性的擴(kuò)散相關(guān)。突變等位基因存在、體外寄生蟲存活率和體內(nèi)寄生蟲 清除率之間強(qiáng)烈的相關(guān)性表明，K13-推進(jìn)器突變是青蒿素耐藥性的重要決定因素。K13-推 進(jìn)器多態(tài)性構(gòu)成有效用于大范圍監(jiān)控努力的分子標(biāo)記物，所述努力是在大湄公河次區(qū)域中 遏制青蒿素耐藥性并阻止其全球擴(kuò)散。
[0119] 鑒定ART耐藥性的候選分子標(biāo)記物
[0120] 耐受ART的F32-ART5寄生蟲系是通過以下方法被選擇出來的:在青蒿素劑量增加、 125個循環(huán)的方案下培養(yǎng)ART敏感性F32-坦桑尼亞克隆5年 18。以分別為460x和500x的平均核 苷酸覆蓋度獲得F32-ART5和F32-TEM(在沒有青蒿素的情況下培養(yǎng)的同胞克?。┑娜蚪M 序列。與F32-TEM相比，在F32-ART5中沒有鑒定出缺失的基因。在排除以下內(nèi)容后比較了 F32-ART5和F32-TEM的外顯子組：（i)來自高度可變的、多基因家族的基因（var、rifin和 steV〇r)，（ii)具有寄生蟲系的平均覆蓋度低于25%的覆蓋度的位置，（iii)被發(fā)現(xiàn)在F32-ART5中混合的單核苷酸多態(tài)性（SNP)，只要能夠預(yù)期所獲得的ART耐藥性突變在5年的連續(xù) 壓力之后被固定于樣品中，（iv)在F32-ART5和ART敏感的3D7寄生蟲株之間共享的SNP以及 (v)同義 SNP(圖 5)。
[0121 ]該分析在七個基因中鑒定出八個突變，其隨后通過對PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測序得 到確認(rèn)(表1)。與F32-TEM、F32-坦桑尼亞或3D7相比，每個基因在F32-ART5中帶有一個突變 密碼子(表2)。表3列出了關(guān)于基因表達(dá)和蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的信息。據(jù)之前的報道，這些基 因中僅有一個基因半胱氨酸蛋白酶falcipain 2a(PF3D7_1115700)與體外對ART的應(yīng)答相 關(guān)19。為了確定每個突變何時出現(xiàn)在F32-ART5譜系中，我們分析了處于各種藥物壓力循環(huán)中 的寄生蟲的全基因組序列（圖1)。該分析顯示，在ART耐藥性急劇增加的過程中，首先獲得 PF3D7_0110400D56V和PF3D7_1343700M476I突變，并在此后保持穩(wěn)定。重要的是，這兩個突 變的出現(xiàn)與環(huán)狀體期存活測定(RSA^ 3h)的存活率從小于0.01%至12.8%的增加相關(guān)。隨后 對PF3D7_1343700基因座的PCR分析檢測到在30個藥物壓力循環(huán)后的M476I突變，這與此后 觀察到RSA^ 3h存活率的激增一致。在選擇的較后的階段逐步出現(xiàn)的其他SNP:PF3D7_ 0213400(68個循環(huán)）；PF3D7_1115700(98個循環(huán)）；PF3D7_1302100、PF3D7_1459600 和 PF3D7_ 1464500(120個循環(huán)）（表2)。這些數(shù)據(jù)表明，在RSAQ-3h*PF3D7_1343700M476I突變增加了 F32-坦桑尼亞對DHA的耐藥性。
[0122] 為了探索這些突變是否與柬埔寨的ART耐藥性相關(guān)，我們通過挖掘在2010-2011年 收集的49份適應(yīng)培養(yǎng)的寄生蟲分離物的全基因組或Sanger序列研究了所有七個基因中的 序列多態(tài)性(參見實施例）。我們基于它們差異RSA^ 3h存活率(表8)選擇這些分離物并將它 們的序列與對照寄生蟲系3D7、89F52()和K1992的序列進(jìn)行比較(參見實施例）。對于所有寄生 蟲分離物，三個基因（？？307_0110400、？？307_0213400和?？307_1302100)編碼野生型序列。 其他四個基因顯示群體內(nèi)多樣性，具有之前報道過的或新的SNP(表8)。？?307_1115700具有 11 個SNP，它們與 RSA°-3h 存活率不相關(guān)(？ = 0.06，&1181?11-^11丨8檢驗）。？？307_1459600具 有6個SNP，它們與存活率不相關(guān)0 = 〇.65)。？?3〇7_14645〇〇具有之前在來自東南亞的更早 的分離物(包括ART-敏感性Dd2系21)中的12個SNP，可能反映了地理特征。這些SNP也顯示與 存活率沒有顯著相關(guān)性(P = 0.42)。因此，沒有進(jìn)一步研究這六個基因。
[0123] 相反，PF3D7_1343700多態(tài)性顯示與RSAQ_3h存活率具有顯著相關(guān)性（圖2)。實際上， RSA^311存活率在具有野生型（中位值0.17%，范圍0.06-0.51 %，n= 16)或突變（18.8%， 3.8-58%，n = 33)K13-推進(jìn)器等位基因的寄生蟲分離物之間實質(zhì)上不同（P〈10_4，Mann-Whi tney U檢驗）（表8)。觀察到四個突變等位基因，每個等位基因在C-末端K13-推進(jìn)器域的 kelch重復(fù)內(nèi)帶有單個非同義SNP，即分別位于重復(fù)#2、#3、#3和#4內(nèi)的Y493H、R539T、I543T 和C580YH992和ART敏感性89F5系二者均攜帶野生型K13-推進(jìn)器。在K-13推進(jìn)器多態(tài)性和 其他候選基因中的多態(tài)性之間沒有相關(guān)性(表8)?；谶@些觀察結(jié)果和F32-ART5在kelch重 復(fù)#2中獲得的M476I，我們研究了在柬埔寨K13-推進(jìn)器多態(tài)性是否是ART耐藥性的分子特 征。
[0124] 突變K13-推進(jìn)器等位基因在柬埔寨的出現(xiàn)和擴(kuò)散
[0125] 在過去十年，ART耐藥性的流行已經(jīng)在柬埔寨西部省份穩(wěn)定增加，但在該國的其他 地方還沒有2。為了測試K13-推進(jìn)器突變的時空分布是否與ART耐藥性的時空分布相關(guān)，我 們對2001-2012年患有瘧疾的柬埔寨患者的存檔寄生蟲分離物的K13-推進(jìn)器進(jìn)行測序(表 4)。比較了來自六個省份的數(shù)據(jù)(η = 886):在西部的拜林市、馬德望省和菩薩省，ART耐藥性 已經(jīng)建立1，6,8,22，在東南部的桔井省，最近幾年4打耐藥性已經(jīng)增加 2，在北部的柏威夏省和 東北部的臘塔納基里省，在該時間段期間實際上沒有ART耐藥性的證據(jù)2。該分析總共揭示 了 17個突變等位基因，包括三個高頻（多5% )等位基因（C580Y、R539T和Y493H)。在所有三個 西部省份中野生型序列的頻率隨時間顯著降低，但在柏威夏省和臘塔納基里省中則沒有。 在拜林市和馬德望省中，C580Y等位基因的頻率從2001-2002年至2011-2012年顯著增加，表 明其快速侵入群體并在這些區(qū)域接近固定(圖3)。
[0126] 為了進(jìn)一步研究K13-推進(jìn)器多態(tài)性在柬埔寨的地理多樣性，我們擴(kuò)展了我們的序 列分析以包括來自2011 -2012年的另外四個省份的數(shù)據(jù)(n = 55,西哈努克市、貢布省、蒙多 基里省和奧多棉吉?。ū?)。盡管觀察到大量突變（圖9和表5)，C580Y等位基因占在2011-2012年中觀察到的所有突變等位基因的85% (189/222)(圖6)。這個地圖概括了帶有K13-推 進(jìn)器中的單個非同義突變的寄生蟲的升高的頻率(74%，222/300)及其分布的地理差異。重 要的是，不同省中突變等位基因的分布頻率與用ACT治療瘧疾的患者中第3天陽性的分布頻 率匹配（Spearman's r = 0.99,95%CI 0·96-0·99，P〈0·0001)--被認(rèn)為是暗示臨床ART耐 藥性的標(biāo)志（圖7)。
[0127] K13-推進(jìn)器多態(tài)性、耐受ART的亞群和臨床ART耐藥性之間的關(guān)系
[0128] 為了確認(rèn)K13-推進(jìn)器多態(tài)性是臨床ART耐藥性的分子標(biāo)記物，我們首先鑒定了來 自菩薩省和臘塔納基里省的163個患者，其中我們測量了2009-2010年中寄生蟲清除半衰期 (范圍1.58-11.53h) 6,并且之前基于全基因組序列數(shù)據(jù)的起源分析(ancestry analysis) 將寄生蟲分配到KH亞群(1?1、1(!12、1(!13、1014或1(擬)15。排除了具有混合基因型（野生型和一個 或多個突變K13-推進(jìn)器等位基因）的十三個患者。在剩下的150個患者中，72個患者攜帶具 有野生型等位基因的寄生蟲，其他患者攜帶在K13-推進(jìn)器中僅具有單個非同義SNP的寄生 蟲:0580￥(11 = 51)、1?5391'(11 = 6)以及￥493!1(11 = 21)(表6)。具有野生型寄生蟲的患者的寄生 蟲清除半衰期（中位值3 · 30h，IQR 2 · 59-3 · 95)顯著短于具有C580Y(7 · 19h，6 · 47-8 · 31，P〈 10-6，Mann-Whitney U檢驗）、R539T(6 · 64h，6 · 00-6 · 72，P〈10-4)或Y493H(6 · 28h，5 · 37-7 · 14， P〈10_6)寄生蟲的患者（圖4A)。而且，攜帶C580Y寄生蟲的患者的寄生蟲清除半衰期顯著長于 具有￥493!1寄生蟲的患者(？ = 0.007，1&11111-11^1^1]檢驗）。這些數(shù)據(jù)表明，在用41?1'治療的 瘧疾患者中，C580Y、R539T和Y493H鑒定清除慢的寄生蟲。
[0129] 由于KH2、KH3、KH4和KHA寄生蟲比KH1寄生蟲具有更長的半衰期15,我們推測K13-推 進(jìn)器中的等位基因變異解釋這些差異。在150份寄生蟲中，55、26、14、12和43個分別被分類 為KH1、KH2、KH3、KH4和KHA。三個K13-推進(jìn)器等位基因與KH分組強(qiáng)烈相關(guān):KH1的96 % (53/ 55)、KH2的96%(25/26)和1?4的100%(12/12)的寄生蟲分別攜帶野生型、0580￥和￥493!1等 位基因（表6)。盡管KH3寄生蟲（n= 14)攜帶野生型、C580Y和R539T等位基因，在KH1、KH2或 KH4寄生蟲中沒有觀察到R539T。與預(yù)期的一樣，KHA寄生蟲具有混合的等位基因組成。重要 的是，K13-推進(jìn)器突變比KH分組更精確地鑒定清除慢的寄生蟲（圖4B)，這證實了在柬埔寨 中K13-推進(jìn)器多態(tài)性與臨床ART耐藥性的相關(guān)性部分獨(dú)立于KH亞群的遺傳背景。在KH1組(η =55)內(nèi)，具有野生型寄生蟲的患者的寄生蟲清除半衰期(η = 53，中位值2.88h，IQR 2.52-3.79)顯著短于具有Y493H寄生蟲的患者(n = 2，中位值6.77h，P = 0.02，Mann-Whitney U檢 驗）。在KH3亞群內(nèi)（n = 14)，具有野生型寄生蟲的患者中的半衰期(n = 3,中位值3.65h)短于 具有C580Y(n = 7,中位值8.73h，IQR 7·35-9·06，P = 0·02)或者R539T(n = 4,6·65h，6·29-6.80，P=0.03)寄生蟲的患者。
[0130] 如F32-ART5譜系在RSAh3h中存活于藥理學(xué)相關(guān)暴露于DHA的能力所示，隨著F32-ART5譜系產(chǎn)生ART耐藥性，它獲得了 K13-推進(jìn)器突變。在F32-ART5的5年選擇期間，推斷與 ART耐藥性相關(guān)的基因（？&忖23'24，？代(^口25' 26少伽辦18'27'28，？伽印127- 29和八8(：轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3()) 或編碼推斷的六1^目標(biāo)的基因（？€六了？386631' 32和？作13(^11-?.(31^匕311(1丨詘？1的直系同源 物33'34)沒有突變，并且沒有觀察到Pfmdrl擴(kuò)增 354Q。另外，除了由Takala-Harrison等人鑒 定的、位于連鎖不平衡窗口的PF3D7_1343700和PF3D7_1459600之外 16,使用群體遺傳學(xué)方法 最近鑒定的所有候選ART耐藥性基因14'4()' 41在F32-ART5譜系中均保持不變。這些發(fā)現(xiàn)使我們 在柬埔寨自然循環(huán)的寄生蟲中鑒定了另外17個單獨(dú)的K13-推進(jìn)器突變。這些突變中的幾個 突變與柬埔寨ART耐藥性的時空分布強(qiáng)烈相關(guān)，體外對DHA應(yīng)答的寄生蟲存活率增加，并且 體內(nèi)對ART治療的寄生蟲清除半衰期長。F32-ART5中突變的其他六個基因中沒有一個與柬 埔寨寄生蟲分離物的RSA~ 3h存活率相關(guān)。
[0131] K13-推進(jìn)器多態(tài)性滿足ART耐藥性的分子標(biāo)記物的定義，有以下幾個原因：（i)在 柬埔寨西部出現(xiàn)ART耐藥性的十年期間在該區(qū)域已經(jīng)有野生型寄生蟲的漸進(jìn)性喪失；（ii) 在已充分建立ART耐藥性的柬埔寨省份中突變寄生蟲聚集，而在罕見ART耐藥性的省份中則 不太普遍；（iii )PF3D7_1343700位于由Cheeseman等人14作為在最近陽性選擇之下鑒定的 35-kb基因座上游5.9kb，并且在由Takala-Harr i son等人16概括的選擇中排在前列的特征區(qū) 域內(nèi)；（iv)多個突變(均為非同義突變)存在于K13-推進(jìn)器中，反映這是陽性選擇而不是搭 便車效應(yīng)或者遺傳漂變；（v)突變發(fā)生在惡性瘧原蟲的高度保守的域中，只有一個非同義 SNP記載于來自非洲的單獨(dú)的寄生蟲分離物中42;(vi)在柬埔寨觀察到的所有多態(tài)性均是新 的，并且除了一個(V568G)之外所有的均發(fā)生于在瘧原蟲種之間嚴(yán)格保守的位置上（圖9和 圖10)，表明對該蛋白質(zhì)強(qiáng)烈的結(jié)構(gòu)和功能約束；（vii)三個最流行的K13-推進(jìn)器突變分別 在個別寄生蟲分離物和瘧疾患者水平上與體外RSA^ 3h存活率和體內(nèi)寄生蟲清除半衰期強(qiáng) 烈相關(guān)；以及(viii)突變等位基因頻率與ACT治療后第3天陽性患病率在柬埔寨人群體水平 上強(qiáng)烈相關(guān)。
[0132] 基于與其他kelch推進(jìn)器域的同源性，我們預(yù)期所觀察到的K13-推進(jìn)器突變使得 域支架不穩(wěn)定并改變其功能。PF3D7_1343700的C-末端部分編碼六個kelch模體，其見于大 量具有各種各樣的細(xì)胞功能的蛋白質(zhì) 43,44。鑒于ART衍生物的毒性主要基于它們的氧化促進(jìn) 劑(pro-oxidant)活性，所報道的一些含有kelch的蛋白質(zhì)在調(diào)控對外部應(yīng)激的細(xì)胞保護(hù)和 蛋白質(zhì)降解應(yīng)答中的作用特別吸引人。K13-推進(jìn)器顯示與涉及基于泛素的蛋白質(zhì)降解的人 KLHL12和KLHL2以及涉及細(xì)胞對氧化應(yīng)激的適應(yīng)的KEAP1具有同源性（圖8)。顯然，未來需要 進(jìn)行工作以描繪K13的正常功能和各種突變的影響。突變體和野生型寄生蟲中等位基因的 交換研究可以幫助定義不同遺傳背景下K13-推進(jìn)器多態(tài)性對RSA^ 3h存活率的貢獻(xiàn)。實際 上，特別令人擔(dān)憂的是，少至兩個突變（即K13-推進(jìn)器M476I和PF3D7_0110400D56V)就足以 賦予F32-坦桑尼亞（其具有典型的非洲遺傳背景)ART耐藥性。由于具有突變K13-推進(jìn)器的 柬埔寨寄生蟲表現(xiàn)出寬范圍的RSA^ 3h存活率（3.8%-58 % )和寄生蟲清除半衰期（4.5-11.5h)，需要進(jìn)一步研究以鑒定ART耐藥性另外的遺傳決定因素，其可能位于最近所鑒定的 被強(qiáng)烈選擇的區(qū)域 16'14。在這種情形下，在帶有相同K13-推進(jìn)器突變的寄生蟲中，分析作為 數(shù)量性狀的RSA~ 3h存活率可以幫助鑒定涉及ART耐藥性的另外的遺傳基因座。
[0133] 總之，K13-推進(jìn)器多態(tài)性是用于追蹤耐受ART惡性瘧原蟲的出現(xiàn)和擴(kuò)散的有用的 分子標(biāo)記物。
[0134] 對瘧原蟲進(jìn)行基因分型的方法
[0135] 本發(fā)明包括用于對瘧原蟲(特別是惡性瘧原蟲)進(jìn)行基因分型的方法。在體外進(jìn)行 的該方法包括檢測生物樣品中野生型或突變的K-13推進(jìn)器核酸或蛋白的存在與否的步驟。 之前已經(jīng)從患者獲得所述樣品，并且其特別是血液樣品。在一個優(yōu)選的實施方案中，該方法 包括提供含有瘧原蟲的生物學(xué)樣品并檢測該樣品中野生型或突變的K-13推進(jìn)器核酸或蛋 白的存在與否。通過本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)檢測野生型或突變的K-13推進(jìn)器核酸或蛋白。例如， 可以使用實施例中或本文其他地方所描述的技術(shù)。
[0136] 生物學(xué)樣品有利地為血液樣品。
[0137] 可以通過本領(lǐng)域已知的許多技術(shù)檢測野生型或突變的K-13推進(jìn)器核酸，諸如測 序、雜交或擴(kuò)增測定。
[0138] 在本發(fā)明的情形中，"野生型惡性瘧原蟲K-13推進(jìn)器核酸"是指具有SEQ ID NO: 1 的序列的核酸或者編碼SEQ ID N0:2的氨基酸序列的變體核酸序列。在本發(fā)明的情形中， "野生型惡性瘧原蟲K-13推進(jìn)器蛋白"是指具有SEQ ID N0:2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。其他 野生型瘧原蟲K-13推進(jìn)器蛋白示于圖10中。
[0139]在本發(fā)明的情形中，"突變惡性瘧原蟲K-13推進(jìn)器核酸"與"突變的惡性瘧原蟲K-13推進(jìn)器核酸"同義并且是指與SEQ ID NO: 1的核酸序列具有一個或多個差異的核酸序列， 其導(dǎo)致與SEQ ID N0:2的氨基酸序列具有至少一個氨基酸的差異。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的突 變惡性瘧原蟲K-13推進(jìn)器核酸在羧基-末端的K13-推進(jìn)器域的kelch重復(fù)內(nèi)帶有單個非同 義單核苷酸多態(tài)性(SNP)。更優(yōu)選地，單個非同義SNP是以下SNP之一：
[0142] 在本發(fā)明的情形中，"突變惡性瘧原蟲K-13推進(jìn)器蛋白"與"突變的惡性瘧原蟲K-13推進(jìn)器蛋白"同義并且是指與SEQ ID NO: 2的氨基酸序列具有一個或多個差異的氨基酸 序列。與SEQ ID N0:2的氨基酸序列具有的一個或多個差異是惡性瘧原蟲K-13推進(jìn)器蛋白 的羧基-末端的K13-推進(jìn)器域的kelch重復(fù)內(nèi)一個或多個突變氨基酸。
[0143] 優(yōu)選的突變惡性瘧原蟲K-13推進(jìn)器蛋白具有圖9或13中所示的突變中的一個或多 個突變。
[0144] 更優(yōu)選的突變惡性瘧原蟲K-13推進(jìn)器蛋白具有選自圖9或13中所示的突變中的單 個突變。
[0145] 還根據(jù)上文提供的SNP列表定義這些突變。
[0146] 在各種實施方案中，該方法包括檢測生物學(xué)樣品中野生型或突變的K-13推進(jìn)器蛋 白的存在與否。這可以通過使用在野生型和突變K-13推進(jìn)器蛋白之間區(qū)分的特異性抗體來 進(jìn)行?？梢詫⑦@些抗體與患者的樣品接觸，可以通過檢測免疫反應(yīng)的存在與否確定野生型 或突變的κ-l3推進(jìn)器蛋白的存在與否。優(yōu)選地，該方法包括ELISA測定。
[0147] 在一個優(yōu)選的實施方案中，該方法包括提供含有瘧原蟲的樣品；并檢測樣品中突 變的K-13推進(jìn)器核酸或蛋白的存在。優(yōu)選地，通過測序或通過PCR檢測樣品中突變的K-13推 進(jìn)器核酸的存在。
[0148] 優(yōu)選地，皰原蟲選自惡性皰原蟲，間日皰原蟲（Plasmodium vivax)，Plasmodium ovale curtisi，Plasmodium ovale wallikeri，三日癥原蟲（Plasmodium malariae)，諾氏 癥原蟲（Plasmodium knowlesi),巴西癥原蟲（Plasmodium brasilianum),食蟹猴癥原蟲 (Plasmodium cynomolgi) ,Plasmodium cynomolgi bastianel 1 i i，豬尾猴癥原蟲 (Plasmodium inui),Plasmodium rhodiani,Plasmodium schweitzi,Plasmodium semiovale, Plasmodium simium，伯氏癥原蟲（Plasmodium berghe i )，約氏癥原蟲 (Plasmodium yoelii)和夏氏癥原蟲（Plasmodium chabaudi)。
[0149] 本發(fā)明包括用于對瘧原蟲進(jìn)行基因分型的方法。優(yōu)選地，該方法區(qū)分青蒿素敏感 的瘧原蟲(具有野生型K13等位基因）和耐受青蒿素的瘧原蟲(具有突變K13等位基因）。
[0150] 本發(fā)明包括用于檢測K13推進(jìn)器域核酸序列中至少一個突變的體外方法。本發(fā)明 包括用于檢測含有瘧原蟲的生物學(xué)樣品中存在突變K13推進(jìn)器核酸的方法，其包括將K13推 進(jìn)器核酸與特異性針對突變K13推進(jìn)器的探針接觸并檢測探針與K13推進(jìn)器核酸的結(jié)合。可 以通過本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)檢測探針與K13推進(jìn)器核酸的結(jié)合。例如，可以使用本文所描述的任 何技術(shù)。示例性突變體和探針被描繪于實施例15和圖13中。優(yōu)選地，探針大小為至少15、20、 25 或 30bp。更優(yōu)選地，它們大小為 15-20、15-25、15-30、20-25或 25-30nt。
[0151 ]在一些實施方案中，探針與熒光珠結(jié)合。在一些實施方案中，該方法包括使探針與 突變K13推進(jìn)器域核酸結(jié)合并檢測結(jié)合的K13推進(jìn)器域核酸具有與結(jié)合的K13推進(jìn)器域核酸 結(jié)合的探針。在一些實施方案中，在檢測之前擴(kuò)增K13推進(jìn)器核酸。
[0152] 在一個實施方案，瘧原蟲的核酸經(jīng)歷K13推進(jìn)器域核酸序列的擴(kuò)增。在各種實施方 案中，擴(kuò)增K13推進(jìn)器域核酸序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個片段。所擴(kuò)增片段的 大小可為至少 50、75、100、125、150、175或2001^到至少75、100、125、150、175、200、250或 300nt。用于該擴(kuò)增的引物可以是本文所列的任意引物。
[0153] 優(yōu)選地，擴(kuò)增方法是PCR，更優(yōu)選為實時PCR、PCR-HRM(高分辨率DNA解鏈）（參見 Andriantsoanirina等人Journal of Microbiological Methods，78:165(2009))或與基于 熒光微球（Luminex?微球）的連接酶檢測反應(yīng)偶聯(lián)的pcr。這最后一種方法允許進(jìn)行多 重測定以同時檢測幾個突變的K13推進(jìn)器等位基因。
[0154] 其他優(yōu)選的擴(kuò)增方法包括連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)(例如Wu和Wallace，Genomics 4， 560(1989)、Landegren等人，Science 241,1077( 1988)和Barringer等人，Gene 89 :117 (1990))、轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增（Kwoh等人，Proc.Natl .Acad. Sci.USA 86，1173( 1989)和W088/10315)、 自主序列復(fù)制（6皿七611丨等人，？1〇(：.恥1厶〇3(1.5(^.1]5厶，87，1874(1990)和恥90/06995)、目 標(biāo)多核苷酸序列的選擇性擴(kuò)增(美國專利號6,410,276)和基于核酸的序列擴(kuò)增(NABSA)(美 國專利號5，130,238、5,409,818、5,554,517和6,063,603)?？梢允褂玫钠渌麛U(kuò)增方法被描 述于美國專利號5,242,794、5,494,810、4,988,617和6,582,938中。上述關(guān)于核酸擴(kuò)增的參 考文獻(xiàn)通過引用就其中用于每個擴(kuò)增方法中的擴(kuò)增的具體反應(yīng)條件的公開內(nèi)容而具體并 入。
[0155] 在一個實施方案中，該方法包括提供瘧原蟲核酸，PCR擴(kuò)增瘧原蟲核酸中K13推進(jìn) 器域核酸序列的至少一個片段，并檢測K13推進(jìn)器域核酸序列中的至少一個突變。本發(fā)明包 括用于檢測含有瘧原蟲的生物樣品中突變K13推進(jìn)器核酸的存在的方法，其包括通過PCR反 應(yīng)擴(kuò)增突變K13推進(jìn)器核酸，并使擴(kuò)增的核酸與特異性針對突變K13推進(jìn)器的探針接觸。示 例性突變體和探針被描繪于實施例15和圖13中。優(yōu)選地，探針大小為至少15、20、25或30bp。
[0156] 在一個實施方案中通過高分辨率DNA解鏈檢測突變。在各種實施方案中，擴(kuò)增K13 推進(jìn)器域核酸序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個片段并通過高分辨率DNA解鏈評估 突變的存在。更優(yōu)選地，擴(kuò)增K13推進(jìn)器域核酸序列的6個片段并通過高分辨率DNA解鏈評估 突變的存在。
[0157] 在一個實施方案中，該方法包括提供含有瘧原蟲的DNA的生物學(xué)樣品;任選地從生 物學(xué)樣品提取DNA;將瘧原蟲的DNA與至少一對引物接觸，所述引物與K13推進(jìn)器核酸特異性 雜交，優(yōu)選在100-300bp范圍的距離上，并進(jìn)行PCR反應(yīng)，優(yōu)選在嵌入式染料的存在下進(jìn)行。 優(yōu)選地，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)歷解鏈步驟并產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈曲線。解鏈步驟可以允許通過分析 擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈曲線確定突變等位基因或野生型等位基因的存在。
[0158] 在一個實施方案中，通過特異性探針檢測突變，設(shè)計該特異性探針以檢測K13推進(jìn) 器域中的單核苷酸多態(tài)性（SNP)。在一個實施方案中，等位基因特異性探針與固相基質(zhì)結(jié) 合，優(yōu)選珠，最優(yōu)選熒光珠。探針可以特異性針對K13推進(jìn)器域中的突變或者特異性針對野 生型K13推進(jìn)器域。探針可以結(jié)合（即捕獲）突變或野生型K13推進(jìn)器域核酸。然后可以用探 針檢測結(jié)合的（即捕獲的)K13推進(jìn)器域核酸，該探針與結(jié)合的（即捕獲的)K13推進(jìn)器域核酸 結(jié)合。優(yōu)選地，測定是基于焚光微球(Ltuniiiex?微球）。示例性突變體和探針被描繪于實 施例15和圖13中。優(yōu)選地，探針大小為至少15、20、25或30bp。優(yōu)選地，探針包括實施例15和 圖13中列出的突變之一。
[0159] 在各種實施方案中，使用至少一種具有選自SEQ ID N0 15-26的核苷酸序列的引 物擴(kuò)增K13推進(jìn)器域核酸的至少一個片段。優(yōu)選地，用于擴(kuò)增的一個或多個引物組選自以下 引物對：
[0178]在各種實施方案中，擴(kuò)增K13推進(jìn)器域核酸序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更 多個片段并評估突變的存在。更優(yōu)選地，擴(kuò)增K13推進(jìn)器域核酸序列的6個片段并通過高分 辨率DNA解鏈評估突變的存在。優(yōu)選地，所檢測的突變選自以下突變(從/至）：
[0181] 最優(yōu)選地，所檢測的突變是以下突變中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14個 或所有的突變：
[0183] 監(jiān)測ART耐藥性的方法
[0184] 本發(fā)明包括用于監(jiān)測瘧原蟲的ART耐藥性的方法。在一個優(yōu)選的實施方案中，該方 法包括生長瘧原蟲，將瘧原蟲與青蒿素接觸，以及檢測K-13推進(jìn)器核酸或蛋白中的突變。優(yōu) 選地，將皰原蟲在體外生長，優(yōu)選地如van Schalkwyk等人，Malaria Journal 2013,12:320 中所述，其通過引用并入本文。
[0185] 在一個實施方案中，該方法包括生長瘧原蟲，將瘧原蟲與青蒿素接觸，以及在多個 時間點(diǎn)對K-13推進(jìn)器核酸或蛋白進(jìn)行測序。
[0186] 在一個實施方案中，該方法包括提供瘧原蟲的多個樣品（來自單個或多個地理區(qū) 域），以及檢測K-13推進(jìn)器核酸或蛋白中的突變。
[0187] 檢測瘧原蟲感染的方法
[0188] 本發(fā)明包括用于檢測瘧原蟲感染和診斷感染的患者中的感染的方法?？梢酝ㄟ^提 供患者的細(xì)胞樣品對患者進(jìn)行診斷。在一個優(yōu)選的實施方案中，該方法包括提供患者的細(xì) 胞樣品并檢測細(xì)胞樣品中野生型或突變的K-13推進(jìn)器核酸或蛋白的存在與否。
[0189] 通過本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)檢測野生型或突變的K-13推進(jìn)器核酸或蛋白。例如，可以 使用本文所描述的任何技術(shù)。
[0190] 細(xì)胞樣品可以是從含有瘧原蟲的患者獲得的任何細(xì)胞樣品。優(yōu)選地，通過抽血產(chǎn) 生細(xì)胞樣品。細(xì)胞樣品優(yōu)選為血液樣品。可以進(jìn)一步處理血液樣品以在體外培養(yǎng)樣品中的 皰原蟲。例如，可以使用van Schalkwyk等人，Malaria Journal 2013,12:320中所描述的技 術(shù)。
[0191] 在一個實施方案中，該方法包括提供患者的血液樣品；任選地在體外培養(yǎng)樣品中 的瘧原蟲，以及檢測細(xì)胞樣品中野生型或突變的K-13推進(jìn)器核酸或蛋白的存在與否。
[0192] 在一個實施方案中，該方法包括提供患者的血液樣品并檢測樣品中野生型或突變 的K-13推進(jìn)器核酸或蛋白的存在與否。優(yōu)選地，通過測序或通過PCR檢測樣品中突變的K-13 推進(jìn)器核酸的存在。
[0193] 優(yōu)選地，核酸測序被用于檢測細(xì)胞樣品中野生型或突變的K-13推進(jìn)器核酸的存在 與否。可以采用本領(lǐng)域已知的任何測序方法。本文使用的術(shù)語"測序"被廣義使用并且是指 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)，包括但不限于Sanger雙脫氧終止法測序、全基因組測序、 通過雜交測序、焦磷酸測序、毛細(xì)管電泳、循環(huán)測序、單堿基延伸測序、固相測序、高通量測 序、大規(guī)模平行特征測序(MPSS)、通過可逆染料終止子測序、雙向（paired-end)測序、near-term測序 、外切核酸酶測序、 通過連接測序 、短讀數(shù)測序 、單分子測序 、合成測序 、實時 測序、 反向終止子測序、納米孔測序、454測序、Solexa基因組分析儀測序、SOLiD(R)測序、MS-PET 測序、質(zhì)譜及其組合。在具體的實施方案中，本發(fā)明的方法適于運(yùn)行在ABI PRISM(R)377DNA 測序儀、ABI PRISM(R)310,3100,3100-Avant,3730或3730x1 基因分析儀、ABI PRISM(R) 3700DNA 分析儀，或 Applied Biosystems 的 SOLiD(TM)系統(tǒng)（所有均來自 Applied Biosystems)、基因組測序儀20系統(tǒng)（Roche Applied Science)上。
[0194] 優(yōu)選地，細(xì)胞樣品的瘧原蟲中的K-13推進(jìn)器具有圖9或13或表7中所示的突變中的 一個或多個突變。
[0195] 在一個實施方案中，該方法包括檢測編碼圖9或13或表7中所示的任意突變的任意 核酸序列?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的許多技術(shù)具體檢測這些序列，諸如測序、雜交或擴(kuò)增測 定。
[0196] 例如，擴(kuò)增方法可以是扣六、]\?^、嫩384、了]\^、304、1^〇?、13-0財、？〇?(所有形式包括 RT-PCR)、RAM、LAMP、ICAN、SPIA、QB-復(fù)制酶、或Invader。優(yōu)選的擴(kuò)增方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)擴(kuò)增。參見例如PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification(Ed.H.A.Erlich,Freeman Press,NY,N.Y.,1992)；PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Eds . I inis^A, Academic Press , San Diego ,Calif., 1990) ;Mattila等人，Nucleic Acids Res. 19,4967(1991) ;Eckert等人，PCR Methods and Applications 1，17( 1991 )PCR(Eds.McPherson等人，IRL Press，0xford);以及美國專利號 4,683，202、4,683,195,4,800，159、4,965,188和 5,333,675。更優(yōu)選的 PCR 方法是實時 PCR、 PCR-HRM(高分辨率DNA解鏈）（參見Andriantsoanirina等人Journal of Microbiological Methods ,78:165(2009))以及與基于熒光微球(_LU.minex?微球)的連接酶檢測反應(yīng)偶聯(lián) 的PCR。這最后一種方法允許進(jìn)行多重測定以同時檢測幾個突變的K13推進(jìn)器等位基因。
[0197] 其他優(yōu)選的擴(kuò)增方法包括連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)(例如Wu和Wallace,Genomics 4， 560(1989)、Landegren等人，Science 241,1077( 1988)和Barringer等人，Gene 89 :117 (1990))、轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增（Kwoh等人，Proc.Natl .Acad. Sci.USA 86，1173( 1989)和W088/10315)、 自主序列復(fù)制（6皿七611丨等人，？1〇(：.恥1厶〇3(1.5(^.1]5厶，87，1874(1990)和恥90/06995)、目 標(biāo)多核苷酸序列的選擇性擴(kuò)增(美國專利號6,410,276)和基于核酸的序列擴(kuò)增(NABSA)(美 國專利號5，130,238、5,409,818、5,554,517和6,063,603)?？梢允褂玫钠渌麛U(kuò)增方法被描 述于美國專利號5,242,794、5,494,810、4,988,617和6,582,938中。上述關(guān)于核酸擴(kuò)增的參 考文獻(xiàn)通過引用就其中用于每個擴(kuò)增方法中的擴(kuò)增的具體反應(yīng)條件的公開內(nèi)容而具體并 入。
[0198] 在一個優(yōu)選的實施方案中，以下引物的至少一個被用于擴(kuò)增：
[0205] 核酸可以是RNA或DNA。在一個實施方案中，提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后對cDNA 進(jìn)行擴(kuò)增或測序。
[0206] 因此，該方法可以包括從患者樣品分離RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，對cDNA進(jìn)行擴(kuò)增 或測序，以及確定野生型或突變的K-13推進(jìn)器核酸的存在與否。
[0207] 在各種實施方案中，該方法包括檢測細(xì)胞樣品中野生型或突變的K-13推進(jìn)器蛋白 的存在與否。這可以通過使用在野生型和突變K-13推進(jìn)器蛋白之間區(qū)分的特異性抗體來進(jìn) 行?？梢詫⑦@些抗體與患者的樣品接觸，可以通過檢測免疫反應(yīng)的存在與否確定野生型或 突變的K-13推進(jìn)器蛋白的存在與否。優(yōu)選地，該方法包括ELISA測定。
[0208] 抗體可以是合成的、單克隆的或多克隆的，并且可以通過本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù) 進(jìn)行制備。這樣的抗體特異性經(jīng)抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合(而不是非特異性結(jié)合）?？?以將K-13推進(jìn)器多肽、片段、變體、融合蛋白等作為免疫原用于生產(chǎn)與其發(fā)生免疫反應(yīng)的抗 體。更具體地，多肽、片段、變體、融合蛋白等含有誘發(fā)抗體形成的抗原決定簇或表位。
[0209] 這些抗原決定簇或表位可以是線性的或者構(gòu)象的（非連續(xù)的）。線性表位由組成多 肽單個氨基酸部分(section)組成，而構(gòu)象或非連續(xù)表位由來自多肽鏈的不同區(qū)域的氨基 酸部分組成，蛋白折疊時使它們緊密靠近（C.A. Janeway，Jr .and P. Travers，Immuno Biology 3:9(Garland Publishing Inc.，2nd ed. 1996))。因為折疊蛋白質(zhì)具有復(fù)雜表面， 可用表位的數(shù)量非常多；但是由于蛋白質(zhì)的構(gòu)象和空間位阻，實際上結(jié)合表位的抗體的數(shù) 量小于可用表位的數(shù)量（0.4.如116￥&7，]1'.&11(1?.1'瓜￥618，11111]11111〇13;[01087 2:14(6&1'1已11(1 Publishing Inc.，2nd ed. 1996))?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方法鑒定表位。可以通過常 規(guī)技術(shù)制備多克隆和單克隆抗體。
[0210] 可以利用基于野生型和突變K-13推進(jìn)器蛋白的氨基酸序列的K-13推進(jìn)器肽制備 特異性結(jié)合野生型和/或突變K-13推進(jìn)器的抗體。術(shù)語"抗體"旨在包括多克隆抗體、單克隆 抗體及其片段，諸如F(ab'）2和Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、單域抗體片段(VHH或納米抗 體）、雙價抗體片段(雙價抗體(diabody))以及任何重組和合成生產(chǎn)的結(jié)合伴侶。
[0211] 如果抗體以大于或等于大約107M-1的Ka結(jié)合野生型和/或突變K-13推進(jìn)器多肽， 則抗體被定義為特異性結(jié)合?？梢允褂贸Ｒ?guī)技術(shù)容易地確定結(jié)合伴侶或抗體的親和力，例 如由Scatchard等人,Αηη.Ν. Y.Acad. Sci ·，51:660( 1949)所述的那些。
[0212] 可以使用本領(lǐng)域眾所周知的方法從各種來源容易地產(chǎn)生多克隆抗體，例如馬、牛、 山羊、綿羊、狗、雞、兔、小鼠或大鼠。一般而言，通常通過腸胃外注射將純化的K-13推進(jìn)器或 者基于適當(dāng)綴合的K-13推進(jìn)器的氨基酸序列的肽給予宿主動物?？梢酝ㄟ^使用佐劑(例如 弗氏完全或不完全佐劑)增強(qiáng)K-13推進(jìn)器的免疫原性。加強(qiáng)免疫之后，收集少量血清樣品并 測試其對K-1 3推進(jìn)器多肽的反應(yīng)性。用于這樣的確定的各種測定的實例包括在 Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow and Lane(eds.),Cold Spring Harbor Laboratory Press , 1988中所描述的那些，以及以下方法，諸如對流免疫電泳(CIEP)、放射 免疫測定、放射免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、斑點(diǎn)印跡測定和夾心法測定。參見美 國專利號4，376，110和 4，486，530。
[0213] 可以使用眾所周知的方法容易地制備單克隆抗體。參見例如在美國專利號RE 32， 011、4,902,614、4,543,439和4,411，993;Monoclonal Antibodies，Hybridomas:A New Dimension in Biological Analyses，Plenum Press，Kennett，McKeam和Bechtol(eds·)， 1980中所描述的方法。
[0214] 例如可以任選在佐劑的存在下，采用分離并純化的野生型或突變K-13推進(jìn)器蛋白 或綴合的K-13推進(jìn)器肽，以大約3周間隔腹膜內(nèi)注射宿主動物(諸如小鼠）至少一次和優(yōu)選 至少兩次。然后通過常規(guī)斑點(diǎn)印跡技術(shù)或抗體捕獲(ABC)測定小鼠血清以確定哪只動物最 適合進(jìn)行融合。大約兩到三周后，給予小鼠蛋白質(zhì)或肽的靜脈內(nèi)加強(qiáng)。后來處死小鼠，并且 按照建立的操作步驟將脾細(xì)胞與市售可得的骨髓瘤細(xì)胞(諸如Ag8.653(ATCC))融合。簡而 言之，在培養(yǎng)基中洗滌骨髓瘤細(xì)胞幾次，并以大約三個脾細(xì)胞比一個骨髓瘤細(xì)胞的比例與 小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合。融合劑可以是本領(lǐng)域使用的任何合適的藥劑，例如聚乙二醇(PEG)。 將融合均鋪到含有允許融合細(xì)胞的選擇性生長的培養(yǎng)基的板中。然后使融合細(xì)胞生長大約 八天。收集所得雜交瘤的上清并將其加至先包被了山羊抗小鼠 Ig的板中。洗滌之后，將標(biāo)記 (諸如標(biāo)記的K-13推進(jìn)器多肽)加至每個孔，接著孵育。隨后可以檢測陽性細(xì)胞。可以大量培 養(yǎng)生長陽性克隆，隨后在蛋白A柱(Pharmacia)上純化上清。
[0215] 可以使用替代的技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的單克隆抗體，諸如由Alting-Mees等人，〃 Monoclonal Antibody Expression Libraries:A Rapid Alternative to Hybridomas"， Strategies in Molecular Biology 3:1-9(1990)所描述的那些，將其通過引用并入本文。 類似地，可以使用重組DNA技術(shù)構(gòu)建結(jié)合伴侶以引入編碼特異性結(jié)合抗體的基因的可變區(qū)。 這樣的技術(shù)被描述于Larrick等人，Biotechnology，7:394( 1989)中。
[0216] 本發(fā)明還包括這樣的抗體的抗原結(jié)合片段，其可以通過常規(guī)技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)。這樣 的片段的實例包括、但不限于Fab和F(ab'）2片段。本發(fā)明還提供了通過基因工程技術(shù)生產(chǎn) 的抗體片段和衍生物。
[0217] 本發(fā)明的單克隆抗體包括嵌合抗體，例如人源化形式的鼠單克隆抗體?？梢酝ㄟ^ 已知技術(shù)制備這樣的人源化抗體，并當(dāng)將這樣的抗體施用于人時其提供降低的免疫原性的 優(yōu)點(diǎn)。在一個實施方案中，人源化的單克隆抗體包含鼠抗體的可變區(qū)（或僅僅包含其抗原結(jié) 合部位)和源自人抗體的恒定區(qū)?；蛘?，人源化的抗體片段可以包含鼠單克隆抗體的抗原結(jié) 合部位和源自人抗體的可變區(qū)片段(缺少抗原結(jié)合部位）。用于生成嵌合和進(jìn)一步工程化的 單克隆抗體的方法包括以下文獻(xiàn)中所描述的那些：Riechmann等人（Nature 332 : 323， 1988)、Liu等人（PNAS 84:3439,1987)、Larrick等人（Bio/Technology 7:934,1989)以及 Winter和Harris(TIPS 14:139，May, 1993)。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生抗體的方法可見于GB 2,272,440、 美國專利號5,569,825和5,545,806。
[0218] 可以使用通過基因工程方法生產(chǎn)的抗體，諸如嵌合和人源化的單克隆抗體，包含 人和非人兩部分，其可以使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)進(jìn)行制備。可以使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)DNA 技術(shù)通過基因工程生產(chǎn)這樣的嵌合和人源化的單克隆抗體，例如使用以下文獻(xiàn)中所描述的 方法：Robinson等人，國際公開號W0 87/02671; Akira等人，歐洲專利申請?zhí)?184187; Taniguchi，M.，歐洲專利申請?zhí)?171496;Morrison等人，歐洲專利申請?zhí)?173494; 如1^6以61等人，？0'國際公開號10 86/01533;0&1^117等人，美國專利號4,816,567; Cabilly等人，歐洲專利申請?zhí)?125023;Better等人，Science 240:1041 1043,1988;Liu等 人，PNAS 84:3439 3443，1987;Liu等人，J.Immunol.l39:3521 3526，1987;Sun等人，PNAS 84:214 218，1987;Nishimura等人，Canc.Res.47:999 1005，1987;Wood等人，Nature 314: 446 449,1985;和Shaw等人，J.Natl.Cancer Inst.80:1553 1559，1988);Morrison，S.L·， Science229:1202 1207,1985;Oi等人，BioTechniques 4:214,1986;Winter美國專利號5， 225,539;Jones等人，Nature 321:552 525，1986;Verhoeyan等人，Science 239:1534， 1988;和Beidler等人，J · Immunol · 141:40534060，1988〇
[0219] 關(guān)于合成和半合成抗體，這樣的術(shù)語旨在涵蓋但不限于抗體片段、同種型轉(zhuǎn)換的 抗體、人源化抗體(例如小鼠-人、人-小鼠）、雜交體、具有多種特異性的抗體和完全合成抗 體樣分子。
[0220]對于治療應(yīng)用，具有人恒定區(qū)和可變區(qū)的"人"單克隆抗體常常是優(yōu)選的，以使得 患者對抗抗體的免疫應(yīng)答最小化?？梢酝ㄟ^免疫含有人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)生 這樣的抗體。參見Jakobovits等人，Ann NY Acad Sci 764:525-535(1995)。
[0221] 也可以使用由源自受試者淋巴細(xì)胞的mRNA制備的免疫球蛋白輕鏈和重鏈cDNA，通 過構(gòu)建組合免疫球蛋白文庫(諸如Fab噬菌體展示文庫或scFv噬菌體展示文庫），制備抗Κ-? 3 推進(jìn)器多肽的 人單克 隆抗體 。參見例如 McCafferty 等人， PCT 公開號 W0 92/01047; Marks 等人，（1991)J.Mol.Biol.222:581 597;和 Griffths 等人，（1993)EMB0 J 12:725 734。此 外，可以通過突變已知的人抗體產(chǎn)生抗體可變區(qū)組合文庫。例如可以通過例如使用隨機(jī)改 變的、誘變的寡核苷酸突變已知結(jié)合K-13推進(jìn)器的人抗體的可變區(qū)，以產(chǎn)生突變的可變區(qū) 文庫，其然后可以被篩選以結(jié)合K-13推進(jìn)器。在免疫球蛋白重鏈和/或輕鏈的CDR區(qū)內(nèi)誘導(dǎo) 隨機(jī)誘變的方法、雜交隨機(jī)化的重鏈和輕鏈以形成配對的方法和篩選方法可見于，例如 Barbas 等人，PCT 公開號 WO 96/07754;Barbas 等人，（1992)Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 89: 4457 4461〇
[0222] 可以通過一群展示包（優(yōu)選源自絲狀噬菌體)表達(dá)免疫球蛋白文庫以形成抗體展 示文庫。特別適用于產(chǎn)生抗體展示文庫的方法和試劑的實例可見于，例如Ladner等人，美國 專利號5,223,409;Kang等人，PCT公開號WO 92/18619;Dower等人，PCT公開號W0 91/17271; Winter等人，PCT公開號WO 92/20791 ;Markland等人，PCT公開號WO 92/15679;Breitling等 人，PCT公開號WO 93/01288;McCafferty等人，PCT公開號WO 92/01047;Garrard等人，PCT公 開號WO 92/09690;Ladner等人，PCT公開號WO 90/02809;Fuchs等人，（1991)Bio/ Technology 9:1370 1372;Hay等人，（1992)Hum Antibod Hybridomas 3:81 85;Huse等人， (1989)Science 246:1275 1281;Griffths等人，（1993)同上；Hawkins等人，（1992)J Mol Biol 226:889 896;Clackson等人，（1991 )Nature 352:624 628 ;Gram等人，（1992)PNAS89: 3576 3580;Garrad等人，（1991)Bio/Technology 9:1373 1377;Hoogenboom等人，（1991) Nuc Acid Res 19:4133 4137;和Barbas等人，（1991)PNAS 88:7978 7982。一旦抗體文庫展 示于展示包(例如絲狀噬菌體)表面，篩選抗體文庫以鑒定和分離表達(dá)結(jié)合K-13推進(jìn)器多肽 的抗體的包。在一個優(yōu)選的實施方案中，主要的文庫篩選涉及用固定化的Κ-13推進(jìn)器多肽 進(jìn)行淘洗(panning)并選擇表達(dá)結(jié)合固定化的Κ-13推進(jìn)器多肽的抗體的展示包。
[0223] 在一個優(yōu)選的實施方案中，該方法包括檢測瘧原蟲感染。該方法可以進(jìn)一步包括 確定瘧原蟲是否具有野生型或突變的K-13推進(jìn)器核酸或蛋白序列。
[0224] 治療瘧原蟲感染的方法
[0225] 本發(fā)明包括用于治療瘧原蟲感染的方法。在一個實施方案中，該方法包括確定患 者是否被含有野生型或突變K-13推進(jìn)器核酸的瘧原蟲感染并基于患者是否被含有野生型 或突變K-13推進(jìn)器的瘧原蟲感染調(diào)整抗寄生蟲治療。
[0226] 在一個優(yōu)選的實施方案中，如果患者被含有野生型K-13推進(jìn)器的瘧原蟲感染，那 么用青蒿素衍生物對患者進(jìn)行治療。
[0227] 在一個優(yōu)選的實施方案中，如果患者被含有突變K-13推進(jìn)器的瘧原蟲感染，那么 用不含有青蒿素的抗寄生蟲治療對患者進(jìn)行治療，優(yōu)選用選自奎寧、氯喹和甲氟喹的瘧疾 藥物。
[0228] 在另一個實施方案中，如果患者被含有突變K-13推進(jìn)器的瘧原蟲感染，那么用青 蒿素衍生物對患者進(jìn)行比常規(guī)使用的時間段更持久的時間段的治療。
[0229] 本發(fā)明還涉及用于治療感染了瘧原蟲的患者的青蒿素衍生物，所述瘧原蟲具有野 生型K-13推進(jìn)器，其中對之前從所述患者獲得的生物學(xué)樣品進(jìn)行體外檢測瘧原蟲是否含有 野生型K-13推進(jìn)器的步驟。
[0230] 本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于治療感染了瘧原蟲的患者的青蒿素衍生物，所述瘧原蟲具 有突變的K-13推進(jìn)器，其中對之前從所述患者獲得的生物學(xué)樣品進(jìn)行體外檢測瘧原蟲是否 含有突變的K-13推進(jìn)器的步驟，并且其中青蒿素的施用方案和/或施用劑量隨時間延長和/ 或劑量比獨(dú)自施加于由含有野生型K-13推進(jìn)器帶來的感染的劑量方案更高。
[0231] 本發(fā)明還涉及用于治療感染了瘧原蟲的患者的奎寧、氯喹或甲氟喹，所述瘧原蟲 具有突變的K-13推進(jìn)器，其中對之前從所述患者獲得的生物學(xué)樣品進(jìn)行體外檢測瘧原蟲是 否含有突變的K-13推進(jìn)器的步驟。
[0232] 因此，根據(jù)感染譜使用所述藥物首先包括如根據(jù)各種實施方案的本發(fā)明所提供的 檢測并對瘧原蟲感染進(jìn)行基因分型的步驟，以確定瘧原蟲攜帶的是野生型Κ-13推進(jìn)器還是 突變的Κ-13推進(jìn)器。
[0233] 用于對瘧原蟲進(jìn)行基因分型的試劑盒
[0234] 本發(fā)明包括用于對瘧原蟲進(jìn)行基因分型或用于檢測瘧原蟲感染的試劑盒。優(yōu)選 地，試劑盒含有用于擴(kuò)增Κ-13推進(jìn)器核酸的引物。試劑盒可以含有用于檢測擴(kuò)增的產(chǎn)物的 試劑。試劑盒可以含有本文所列出的引物中的任意引物或任意組合。試劑盒可以含有本文 所列出的引物中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12種或更多種引物。在一個實施方案中， 試劑盒包含至少一對引物，其與Κ13推進(jìn)器核酸在100-300bp的長度范圍特異性雜交。在試 劑盒的一個優(yōu)選的實施方案中，該至少一對引物(其與K13推進(jìn)器核酸在100-300bp的長度 范圍特異性雜交)包圍至少一個單核苷酸多態(tài)性(SNP)。
[0235] 優(yōu)選地，試劑盒含有用于檢測K-13推進(jìn)器核酸的探針，特別是經(jīng)擴(kuò)增的K-13推進(jìn) 器核酸。優(yōu)選地，探針以熒光標(biāo)記或酶標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。
[0236]在一個實施方案中，試劑盒特異性檢測突變K-13推進(jìn)器核酸，特別是編碼Y493H、 R539T、I543T或C580Y等位基因的核酸。在一個實施方案中，試劑盒特異性檢測野生型K-13 推進(jìn)器核酸。
[0237]在一個優(yōu)選的實施方案中，試劑盒包含以下引物中的至少一種：
[0244] 在一些實施方案中，試劑盒檢測編碼F446I、N458Y、C469Y、Y493H、K503N、R539T、 15431'、？5531^、？57乩^5785丄580￥和0584￥等位基因的突變1(13推進(jìn)器核酸。
[0245] 在一些實施方案中，試劑盒檢測編碼？4461、64494、財58￥、0469￥、1470終止、 A481V、Y493H、K503N、S522C、V534A、R539T、I543T、G548D、P553L、V555A、A557S、R561H、 K563R、V568G、P574L、A578S、C580Y、F583L、D584V、V589I、Q613E和D641G等位基因的突變K13 推進(jìn)器核酸。
[0246] 在一些實施方案中，試劑盒包含以下引物對中的至少一種：
[0264] 5'ATTCAATACAGCACTTCCAAAATAA3'（反向）（SEQIDN0:26)。在各種實施方案中， 試劑盒包含與以下SNP之一雜交的至少一種探針：
[0267] 篩選新瘧疾藥的方法
[0268] 本發(fā)明包括用于篩選新瘧疾藥的方法，所述新瘧疾藥有效用于治療感染了耐受 ART的瘧原蟲的患者。在一個實施方案中，該方法包括以下步驟：
[0269] ?對感染了根據(jù)本發(fā)明的瘧原蟲的患者的生物學(xué)樣品中的瘧原蟲進(jìn)行基因分型；
[0270] ?如果瘧原蟲感染的患者具有突變K13-推進(jìn)器等位基因，則測量寄生蟲清除半衰 期和/或瘧原蟲的存活率；
[0271] ?如果瘧原蟲感染的患者具有突變K13-推進(jìn)器等位基因，則將待測新藥與生物學(xué) 樣品接觸；
[0272] ?測量施用該藥之后測量寄生蟲清除半衰期和/或RSAQ-3h中的瘧原蟲的存活率；
[0273] 如果施用該藥之后寄生蟲清除半衰期和/或瘧原蟲的存活率減小，則選擇該藥作 為有效用于治療感染了耐受ART的瘧原蟲的患者的瘧疾藥。
[0274]在另一個實施方案中，該方法進(jìn)一步包括如果瘧原蟲感染的患者具有突變K13-推 進(jìn)器等位基因，則將待測新藥施用于該患者。
[0286]
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[0344] 57.P.S. Si jwali et al., Plasmodium falciparum cysteine protease falcipain-1 is not essential in erythrocytic stage malaria parasites.Proc Natl Acad Sci U S A 101,8721(2004).
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[0347] 60.C.A.Lobo,H.Fujioka,M.Aikawa,N.Kumar,Disruption of the Pfg27 locus by homologous recombination leads to loss of the sexual phenotype in P.falciparum.Mol Cell 3,793(1999).
[0348] 61. Olivieri et al., The Plasmodium falciparum protein Pf g27 is dispensable for gametocyte and gamete production,but contributes to cell integrity during gametocytogenesis.Mol Microbiol 73,180(2009).
[0349] 62.Sharma,I .Sharma,D.Kogkasuriyachai,N.Kumar , Structure of a gametocyte protein essential for sexual development in Plasmodium falciparum.Nat Struct Biol 10,197(2003). 實施例
[0350] 實施例1.青蒿素加壓和模擬加壓的惡性瘧原蟲F32譜系
[0351] 耐受ART的F32-ART5寄生蟲系是通過以下方法被選擇出來的：在青蒿素劑量增加 的方案下培養(yǎng)ART敏感性F32-坦桑尼亞克隆5年。通過在沒有青蒿素暴露的情況下平行培養(yǎng) F32-坦桑尼亞獲得F32-TEM。從惡性瘧原蟲系3D7、89F5Palo Alto Uganda和K1992提取參考 DNA。按照13所述進(jìn)行環(huán)狀體期存活測定(RSA^h)。使用IIlumina雙向測序(paired-reads sequencing)技術(shù)對F32-坦桑尼亞、F32-TEM、F32-ART5(4個時間點(diǎn)）、三個參考株（3D7、89F5 和K1992)和21份柬埔寨寄生蟲分離物進(jìn)行全基因組測序。從2001-2012年參與ACT效力研究 的患者收集一組1091份臨床惡性瘧原蟲分離物。使用巢式PCR擴(kuò)增K1 3-推進(jìn)器。由 Macrogen，Korea進(jìn)行PCR產(chǎn)物的雙鏈測序。用MEGA 5軟件(版本5.10)分析序列以鑒定特異 性SNP組合。用Microsoft Excel和MedCalc(版本 12，Mariakerke，Belgium)分析數(shù)據(jù)。當(dāng)P值 小于0.05時認(rèn)為差異是統(tǒng)計學(xué)上顯著的。從柬埔寨國立健康研究倫理委員會、海軍醫(yī)學(xué)研 究中心倫理審查委員會（Institutional Review Board)、WHO西太平洋區(qū)辦公室技術(shù)審查 小組和國立變態(tài)反應(yīng)和傳染病研究所倫理審查委員會獲得寄生蟲分離物收集的倫理許可。
[0352] 在稀釋至2.5%的血細(xì)胞比容的人0型紅細(xì)胞（1^〇^七3131丨888611161^?『&1^3隻8 (1113&即)并補(bǔ)充有5%人血清的1^^〇-1640培養(yǎng)基（111￥；[1：1'08611，33110丨680,04)中培養(yǎng)無支 原體的F32-坦桑尼亞寄生蟲。在5%C0 2的氣氛中、在37°C下培養(yǎng)寄生蟲培養(yǎng)物。每天檢查血 液寄生蟲并保持其低于10%。對于耐受ART的寄生蟲選擇，將非同步的培養(yǎng)物調(diào)整至5-7% 的血液寄生蟲并在增加劑量的青蒿素（10ηΜ-9μΜ)的存在下生長24h以用于頭3年的藥物壓 力 18。在隨后2年中，以9μΜ-18μΜ的劑量范圍完成每個藥物48h的壓力循環(huán)。藥物暴露之后，棄 去培養(yǎng)基并用補(bǔ)充人血清（20%)的無藥物培養(yǎng)基代替。每天監(jiān)測血液寄生蟲直到其達(dá)到 5%。此時，重新施加藥物壓力。將5年非連續(xù)有效ART壓力后獲得的寄生蟲系命名為F32-ART5。在相同的時間、相同的條件（即RBC、血清和培養(yǎng)基)下但沒有青蒿素處理，將親本F32-坦桑尼亞系平行保持為連續(xù)培養(yǎng)中的對照。將得到的對照系稱為F32-TEM。
[0353] 實施例2.實驗室適應(yīng)的惡性瘧原蟲系
[0354] 參考DNA提取自實驗室適應(yīng)的惡性瘧原蟲系3D7(MR4,Manassas,VA)，89F5Palo Alto Uganda(來自Palo Alto系的克隆，1978年起源于烏干達(dá)，其在松鼠猴（Saimiri sciureus)實驗宿主中對蒿甲釀表現(xiàn)出高敏感性[O.Mercereau-Pui jalon，H. Contamin，and J. C. Barale，未公開數(shù)據(jù)])和K1992(1992年在拜林在該區(qū)域大規(guī)模部署ART之前收集的分 離物（由法國國家瘧疾參考中心提供））。使用迷你血液試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)根據(jù) 制造商的說明書從冰凍血液等分試樣(200μ1)提取寄生蟲DNA。
[0355] 實施例3.培養(yǎng)適應(yīng)的柬埔寨惡性瘧原蟲分離物
[0356] 如Witkowski等人45所述將來自柬埔寨（于2010年和2011年收集）的五十份臨床惡 性瘧原蟲分離物適應(yīng)于體外培養(yǎng)。它們的地理起源示于表8中。沒有確定這些患者分離物的 寄生蟲清除率，因為這些分離物是在現(xiàn)場試驗(field trial)期間收集的，其沒有包括這樣 的測量。使用迷你血液試劑盒(Qiagen)從冰凍血液等分試樣(200μ 1)提取寄生蟲DNA。
[0357] 實施例4.環(huán)狀體期存活測定
[0358]如Witkowski等人13所述使用高度同步的寄生蟲培養(yǎng)物進(jìn)行環(huán)狀體期存活測定 (RSAh3h)。簡而言之，將0-3h侵入后環(huán)狀體期寄生蟲暴露于700nM DHA[雙氫青蒿素，獲得自 WWARN( www · wwarn · org/research/tool s/qaqc)]或其溶劑 DMS0 中 6h，洗滌，然后在沒有藥的 情況下接著培養(yǎng)66h。通過顯微鏡對Giemsa染色的薄涂片中活的寄生蟲的比例進(jìn)行計數(shù)來 評估存活率，所述寄生蟲發(fā)育成第二代環(huán)狀體或具有正常形態(tài)的營養(yǎng)子。
[0359]實施例5.時間和地理樣品收集
[0360]從參與作為2001-2012年柬埔寨國家瘧疾控制計劃的常規(guī)抗瘧藥效力檢測的一部 分進(jìn)行的ACT治療效力研究的患者和從NAMRU-2進(jìn)行的研究收集一組941份臨床惡性瘧原蟲 分離物(表4)。將收集在EDTA或ACD中的靜脈血液樣品（5ml)在收集的48h內(nèi)于4°C下運(yùn)輸至 金邊的柬埔寨巴斯德研究所，然后保存于_20°C下直至DNA提取。使用迷你血液試劑盒 (Qiagen)從冰凍血液等分試樣(200μ1)提取寄生蟲DNA。
[0361] 實施例6.測量寄生蟲清除半衰期
[0362] 如6'13所述，2009年和2010年在菩薩省和臘塔納基里省對患有輕癥或重癥惡性瘧 原蟲瘧疾且初始寄生蟲密度多10, OOO/μΙ的患者進(jìn)行登記。用ART對患者進(jìn)行治療，每6h從 厚血液膜測量他們的寄生蟲密度直到血液寄生蟲檢測不到。使用WWARN的在線寄生蟲清除 估計法（http : //www · wwarn · org/toolkit/data-management/parasite-clearance-e stimator)從這些寄生蟲計數(shù)衍生出163個患者中的寄生蟲清除半衰期。該研究登記于 ClinicalTrials · gov(編號NCT00341003)。
[0363] 實施例7.寄生蟲DNA的全基因組測序
[0364] 使用Illumina雙向測序技術(shù)對F32-坦桑尼亞、F32-TEM、F32-ART5譜系（4個時間 點(diǎn)）、三個參考株(3D7、89F5和K1992)和21份柬埔寨寄生蟲分離物進(jìn)行全基因組測序。按照 供應(yīng)商開發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)操作步驟進(jìn)行Illumina文庫制備和測序。簡而言之，通過噴霧剪切基因 組DNA，并將所剪切的片段進(jìn)行末端修復(fù)和磷酸化。將平端片段進(jìn)行A尾化，并將測序接頭連 接至片段。使用Agencourt AMPure XP珠（±500bp;Beckman Coulter Genomics,Danvers, MA)將插入物按大小排列并在文庫定量和驗證之前使用10個循環(huán)的PCR進(jìn)行富集。進(jìn)行文庫 與流動槽（flow cell)的雜交和橋式擴(kuò)增以產(chǎn)生簇，并在HiSeq 2000儀（Illumina, San Diego，CA)上收集100個循環(huán)的雙向讀出數(shù)。測序完成之后，使用Illumina分析流水線(版本 1.7)進(jìn)行圖像分析、堿基讀出(base calling)和錯誤估計。
[0365]使用Fqquality工具過濾原始序列文件，F(xiàn)qquality工具是由N.Joly(Biology IT Center，Institut Pasteur,Paris)開發(fā)的讀出質(zhì)量過濾軟件，其能夠修剪讀出中第一和最 后的低質(zhì)量堿基。將來自受控的Fastq文件的修剪的讀出用Burrows-Wheeler Alignment (BWA)映射到參考基因組（惡性瘧原蟲3D7)，產(chǎn)生BAM文件（標(biāo)簽區(qū)分格式SAM的二進(jìn)制文 件）。接下來，我們使用Samtools來準(zhǔn)備pileup文件，其被使用內(nèi)部開發(fā)的軟件格式化以實 現(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)入全基因組數(shù)據(jù)管理器(WDM)數(shù)據(jù)庫(Beghain等人，準(zhǔn)備中hWDM軟件被設(shè)計成用 來比較和/或比對部分或全部惡性瘧原蟲基因組。
[0366] 實施例8.對F32-ART5中含有非同義SNP的基因進(jìn)行測序
[0367] 使用表1中列出的引物進(jìn)行選定基因的PCR擴(kuò)增。用ΙμΜ的每種引物、0.2mM dNTP (Solis Biodyne，Tartu，Estonia)、3mM MgCl2和2U Taq DNA聚合酶（Solis Biodyne)使用 以下循環(huán)程序?qū)?μ1 DNA進(jìn)行擴(kuò)增：94°C5min，然后40個循環(huán)的94°C30sec、60°C90sec、72°C 90sec，以及72°C最后延伸10min。通過2%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色檢測PCR產(chǎn)物。由 Beckman Coulter Genomics,France進(jìn)行PCR產(chǎn)物的雙鏈測序。用MEGA 5軟件(版本5.10)列 以鑒定特異性SNP組合。
[0368] 實施例9.對K13-推進(jìn)器域進(jìn)行測序
[0369] 使用以下引物擴(kuò)增K13-推進(jìn)器域：對于主要？01?(1(13-15'-cggagtgaccaaatctggga_3'（SEQ ID N0:9)和K13-4 5'-gggaatctggtggtaacagc_3'（SEQ ID N0:10))，以及對于巢式PCR(K13-2 5'-gccaagctgccattcatttg-3'（SEQ ID N0:13)和K13-3 5'-gccttgttgaaagaagcaga_3'（SEQ ID N0:14))。用ΙμΜ的每種引物、0.2mM dNTP(Solis Biodyne)、3mM MgCl2和2U Taq DNA聚合酶（Solis Biodyne)使用以下循環(huán)程序?qū)Ζ│蘈 DNA 進(jìn)行擴(kuò)增：94°C5min，然后 40 個循環(huán)的 94￡€3〇86(：、6〇1€9〇86(3、721€9〇86(3，以及72°(：最后延 伸1 Omin。對于巢式PCR，除了MgCl 2濃度不同（2.5mM)之外，將2μ1的主要PCR產(chǎn)物在相同的條 件下進(jìn)行擴(kuò)增。使用2 %瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色檢測PCR產(chǎn)物。由Macrogen，Korea 進(jìn)行PCR產(chǎn)物的雙鏈測序。用MEGA 5軟件(版本5.10)列以鑒定特異性SNP組合。
[0370] 實施例10.對臨床寄生蟲分離物進(jìn)行深度測序和群體結(jié)構(gòu)分析
[0371] 之前已經(jīng)描述了獲得自柬埔寨的菩薩省和臘塔納基里省的瘧疾患者的臨床寄生 蟲分離的dna提取、Ilhiniina?測序和snp基因分型 15。對這些寄生蟲的群體結(jié)構(gòu)分析鑒定 出四個亞群:ΚΗ1、ΚΗ2、ΚΗ3和KH4。具有〈80%來自這四組的任意祖先的寄生蟲被視為混合型 (ΚΗΑ)〇
[0372] 實施例11.F32-ART5譜系中突變的時間獲取
[0373] 使用在0時（原始F32-坦桑尼亞克隆系）、第196天(0.2-μΜ壓力循環(huán)#23)、第385天 (1·8-μΜ壓力循環(huán)#39)、第618天(9-μΜ壓力循環(huán)#56)和第2250天(9-μΜ壓力循環(huán)#120)收集 的樣品通過全基因組測序探索了F32-ART5譜系。在第2250天收集F32-TEM樣品。通過PCR研 究了在第30、33、34、36、68和98個壓力循環(huán)時收集的另外的樣品。使用高純?0財莫板制備試 劑盒(Roche Diagnostics，Mannheim,Germany)根據(jù)制造商的說明書提取寄生蟲培養(yǎng)物的 DNA〇
[0374] 分別在第17、48和122個壓力循環(huán)(0.04、2.7和9以141^)時收集在環(huán)狀體期存活測 定(RSA^ 3h)中測試的F32-ART5樣品。在最后一個模擬壓力循環(huán)收集F32-TEM樣品。用不同批 的紅細(xì)胞以一式三份實驗的形式確定RSA0-3h存活率，并使用Giemsa染色薄涂片讀出由兩 個獨(dú)立顯微技術(shù)人員（B.W.和F.B.-V.)如上進(jìn)行評估。使用Mann-Whitney U檢驗比較存活 率。F32-ART5樣品的RSA0-3h存活率如下：在藥物壓力循環(huán)：#17(n = 3,中位值0%，101?0-0.07%)，#48(11 = 3，中位值11.7%，101?10.3-14.6;? = 0.04對于#17￥8.#48，]\&11111-他行1167 U檢驗）和#122(n = 3,中位值 12.8%，IQR 10.6-14.5，？ = 0.04和？ = 0.82對于#17￥8.#122 和#48vs.#122)。也以一式三份實驗的形式確定F32-TEM系的RSAQ- 3h存活率(n = 3,中位值 0%，四1?0-0.05，？ = 0.81對于^^]\1￥8.#17，]\&11111-他行1^^1]檢驗）。
[0375] 實施例12.2001-2012年在六個柬埔寨省份中收集的886份臨床寄生蟲分離物中的 K13-推進(jìn)器突變的流行
[0376] 通過對擴(kuò)增自886份存檔的血液樣品的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序來對K13-推進(jìn)器進(jìn)行基 因分型。來自每年每省分析的樣品數(shù)示于圖3中。Fisher精確檢驗被用于比較每個省份中帶 有野生型K13-推進(jìn)器序列的分離物隨時間的頻率。觀察到西部省份在十年期間野生型K13-推進(jìn)器等位基因頻率的顯著降低。在拜林市，它從2001-2002年的30.0% (12/40)降至SOll-SOU 年的4.8% (4/84) ，Ρ=0· 0002 ，F(xiàn)isher 精確檢驗； 馬德望省從 2001-2002 年的71.9% (46/64)降至2011-2012年的7.0% (5/71)，P〈10-6;菩薩省從2003-2004年的50.0% (5/10) 降至2011-2012年的10.5% (2/19)，Ρ = 0· 03;以及在桔井省從2001-2002年的93.3% (14/ 15)降至2011-2012年的29.4% (5/17)，Ρ = 0·0003。在柏威夏省[從2001-2002年的92.6% (25/27)降至2011-2012年的84.2% (16/19)，Ρ = 0.63]或臘塔納基里省[從2001-2002年的 96.4% (54/56)降至2011-2012年的94.3% (33/35)，Ρ = 0.63]中沒有觀察到野生型等位基 因頻率的顯著降低。在拜林市，C580Y的頻率從2001-2002年的45.0% (18/40)增加至SOll-SOW 年的 88.1 % (74/84) (Ρ〈10-6)， 并且在馬德望省從從 2001-2002 年的 7.8% (5/64) 增加 至2011-2012年的87.3%(62/71)(Ρ〈10-6)，表明其快速侵入群體并在這些省中接近固定。
[0377] 實施例13.Κ13-推進(jìn)器的三維結(jié)構(gòu)建模
[0378] 使用建模器(v9.ll)通過滿足空間限制的同源性建模獲得PF3D7_1343700('K13-推進(jìn)器'）的kelch推進(jìn)器域的三維結(jié)構(gòu)模型（Fiser A，Sali A(2003) ."Modeller: generation and refinement of homology-based protein structure models" ? Meth.Enzymol. 374:461-91.)。組成K13-推進(jìn)器的295個氨基酸與人keapl [蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫 (PDB)2FLU]、KLHL12(PDB 2VPJ)和KLHL2(PDB 2XN4)蛋白分別具有22%、25%和25%的同一 性，它們被用作對K13-推進(jìn)器的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模的模板。使用兩個經(jīng)典標(biāo)準(zhǔn)評估所獲得 的模型的可靠性。第一，由建模器使用Built-Prof ile程序計算得到E-值=0確認(rèn)了 K13ke 1 ch域和一個模板之間的序列比對的顯著性。第二，該模型獲得GA341模型得分=1 (得 分彡0 . 7對應(yīng)于高度可靠的模型）。使用PyMOL分子圖形系統(tǒng)（版本1 . 5 . 0.4 )( Schrddinger,Portland, or)準(zhǔn)備K13三維模型中突變的位置。
[0379] 實施例14.統(tǒng)計學(xué)分析
[0380] 用Micro soft Excel和 MedCalc (版本12，Mariakerke，Belgium)分析數(shù)據(jù)。定量數(shù) 據(jù)表示為中位值，四分位數(shù)間距（IQRhMann-Whitney U檢驗(獨(dú)立樣品，雙側(cè)）用于比較兩 個組，Kruskal-Wallis檢驗(H-檢驗，雙側(cè)）用于比較超過兩個組。Spearman的rho秩相關(guān)性 系數(shù)（以及相關(guān)性系數(shù)的95%置信區(qū)間）用于測量野生型K13-推進(jìn)器等位基因的患病率和 第3天陽性頻率(定義為在基于青蒿素的組合治療的第三天顯微鏡下可檢測的寄生蟲的殘 留率）之間關(guān)系的強(qiáng)度\Fisher精確檢驗用于比較頻率數(shù)據(jù)，基于β分布的Clopper-Pearson精確方法用于確定比例的95 %置信區(qū)間。當(dāng)P值小于0.05時認(rèn)為統(tǒng)計學(xué)上具有顯著 差異。
[0381] 實施例15.另外的SNP。在如實施例5中所述從柬埔寨患者第一次收集941例臨床惡 性瘧原蟲之后，在幾個非洲國家(如貝寧、安哥拉和喀麥隆)進(jìn)一步收集了感染惡性瘧原蟲 的患者的血液樣品，并按照與實施例5中相同的實驗方法在南美洲進(jìn)行?？偣彩占?523份 血液樣品。
[0382]
[0385] NI:不可解釋的樣品
[0386] 通過對擴(kuò)增自如實施例9中所述的寄生蟲DNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序來對K13-推進(jìn)器 域進(jìn)行基因分型。
[0387] 在K13推進(jìn)器域中發(fā)現(xiàn)了另外的非同義SNP。最終，發(fā)明人鑒定了下列27個SNP:
[0390] 實施例16:同時檢測K13推進(jìn)器域中所有突變的方法（圖13)
[0391] 本實施例詳細(xì)描述了涉及同時檢測K13推進(jìn)器域中所有突變的方法（圖13)。以下 面的三步進(jìn)行SNP檢測：
[0392] 用擴(kuò)增的DNA與所有探針雜交(第一步）；將保守探針與等位基因特異性探針連接 (第二步）以及讀取生物素發(fā)出的熒光和等位基因特異性熒光(第三步）
[0393] 檢測到的突變的列表
[0396] 具有所有突變的K13推進(jìn)器域的序列
[0398] 第一步:PCR擴(kuò)增K13推進(jìn)器域的序列
[0399] 按照實施例9進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對于主要PCR，引物是：
[0405] 第二步:SNP檢測
[0406] 對于每個SNP，使用一個保守的探針，其與突變的核苷酸下游保守序列雜交。該探 針在5 '末端有一個磷酸[Phos]以允許連接，并在3 '末端有一個生物素標(biāo)簽[BtnTg];對于每 個SNP還使用與野生型密碼子或突變體密碼子雜交的兩個等位基因特異性探針。每個等位 基因特異性探針具有特異性熒光標(biāo)簽(Tag WT是特異性針對野生型密碼子的標(biāo)簽，Tag MT 是特異性針對突變體密碼子的標(biāo)簽）。
[0407] 探針列表：
【主權(quán)項】
1. 用于對追原蟲(Plasmodium)進(jìn)行基因分型的方法，其包括： (a) 提供含有追原蟲的樣品；W及 (b) 檢測所述樣品中突變的K-13推進(jìn)器核酸或蛋白的存在。2. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述追原蟲是惡性追原蟲(Plasmodium falciparum)。3. 權(quán)利要求1或2所述的方法，其中通過測序檢測所述樣品中突變的K-13推進(jìn)器核酸的 存在。4. 權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其中通過PCR檢測所述樣品中突變的K-13推進(jìn)器核 酸的存在。5. 用于檢測患者中追原蟲感染的方法，其包括： (a) 提供患者的血液樣品，W及 (b) 檢測所述血液樣品中野生型或突變的K-13推進(jìn)器核酸或蛋白的存在與否。6. 權(quán)利要求5所述的方法，其中所述追原蟲是惡性追原蟲。7. 權(quán)利要求5或6所述的方法，其中通過測序檢測所述樣品中突變的K-13推進(jìn)器核酸或 野生型K13推進(jìn)器核酸的存在。8. 權(quán)利要求5-7任一項所述的方法，其中通過PCR檢測所述樣品中突變的K-13推進(jìn)器核 酸或野生型K13推進(jìn)器核酸的存在。9. 權(quán)利要求5-8任一項所述的方法，包括確定追原蟲是否具有野生型或突變K-13推進(jìn) 器核酸或蛋白序列。10. 用于檢測追原蟲感染的試劑盒，其包含用于擴(kuò)增K-13推進(jìn)器核酸的引物和用于檢 測擴(kuò)增產(chǎn)物的試劑。11. 權(quán)利要求10所述的試劑盒，其中所述試劑盒含有用于檢測突變K-13推進(jìn)器核酸的 探針。12. 權(quán)利要求11所述的試劑盒，其中所述探針W巧光標(biāo)記、放射性標(biāo)記或酶標(biāo)記進(jìn)行標(biāo) 記。13. 權(quán)利要求10-12任一項所述的試劑盒，其中所述試劑盒檢測編碼Y493H、R539T、 I543T和巧80Y等位基因的突變K-13推進(jìn)器核酸。14. 權(quán)利要求10-13任一項所述的試劑盒，其中試劑盒包含W下引物中的至少一種： 5，-cggagtgaccaaatctggga-3'（沈Q ID N0:9); 5，-gggaatctggtggtaacagc-3'（沈Q ID N0:10); 5，-cgccagcattgttgactaat-3'（沈Q ID 側(cè)：11);[^及 5，-gcggaagtagtagcgagaat-3'（沈Q ID N0:12); 5，-gccaagctgccattcatttg-3'（沈Q ID 側(cè)：13);[^及 5，-gccttgttgaaagaagcaga_3'（沈Q ID N0:14)。15. 權(quán)利要求10-14任一項所述的試劑盒，其中所述試劑盒檢測編碼F446I、N458Y、 C469Y、Y493H、K503N、R539T、I543T、P55：3L、P57化、A578S、C580Y和D584V等位基因的突變K13 推進(jìn)器核酸。16. 權(quán)利要求10-14任一項所述的試劑盒，其中所述試劑盒檢測編碼F446I、G449A、 N458Y、C469Y、W470 終止、A481V、Y493H、K503N、S522C、V534A、R539T、I543T、G548D、P553L、 ￥5554、45575、1?56^、1(5631?、￥5686、口57化^5785、〔580￥、尸5831^、0584￥、￥5891、96136和 D641G等位基因的突變K13推進(jìn)器核酸。17. 權(quán)利要求10-16任一項所述的試劑盒，其中所述試劑盒包含W下引物對中的至少一 種： PCR引物對1: 5'AGGTGGATTTGATGGTGTAGAAT 3'（正向 KSEQ ID NO:15) 5'CATACACCTCAGTTTCAAATAAAGC 3'（反向）（SEQ ID NO:16) PCR引物對2: 5'AATTTCTTATACGTTTTTGGTGGTAA 3'（正向）（沈Q ID NO:17) 5'CTCTACCCATGCTTTCATACGAT 3'（反向）（SEQ ID NO:18) PCR引物對3 5'GGATATGATGGCTCTTCTATTATACCG 3'（正向）（沈Q ID NO:19) 5'ACTTCAATAGAATTTAATCTCTCACCA 3'（反向）（SEQ ID N0:20) PCR引物對4 5'ATGTCATTGGTGGAACTAATGGT 3'（正向）（SEQ ID NO:21) 5'TTAAATGGTTGATATTGTTCAACG 3'（反向）（SEQ ID NO:22) PCR引物對5 5'TTCAGGAGCAGCTTTTAATTACC 3'（正向）（沈Q ID NO:23) 5'CTGGTGAAAAGAAATGACATGAA 3'（反向）（SEQ ID NO:24) PCR引物對6 5'CCTTGTTGAAAGAAGCAGAATTT 3'（正向）（SEQ ID NO:25) 5'ATTCAATACAGCACTTCCAAAATAA 3'（反向）（SEQ ID NO:26)。18. 權(quán)利要求10-17任一項所述的試劑盒，其中所述試劑盒包含與W下SNP之一雜交的 至少一種探針： ? F446I ttt/att ? G449A ggt/gct ? ：N458：￥ aat/tat ? €4 微 Υ tgc/tac ? W470 終止 t雜/tga .· A481V gct/gtt ? Y493H tac/cac ? K503N aag/aat ? S522C agt/tgt ? V534A gtt/gct ? R539T aga/aca ? I543T att/act ? G548D ggc/gac ? P553L ccg/ctg ? V555A gl:a/gca ? A557S gcaZ 化過 ? R561H cgt/cat ? K563R aaa/aga ? V568G 瓣/媒 g ? P574L cct/ctt ? A578S gct/tct ? C580Y tgt/化 t ? F583L ttt/t化/g :· D584V gat/gtt ? V589I gtc/atc ? Q613E eaa/gaa ? D641G gat/ggto19.用于檢測含有追原蟲的生物樣品中野生型K13推進(jìn)器核酸或突變K13推進(jìn)器核酸的 存在的方法，該方法包括： a) 提供含有追原蟲的DNA的生物樣品； b) 任選地從生物樣品提取DNA; C)使追原蟲的DNA與至少一對引物接觸，所述引物與K13推進(jìn)器核酸在100-300bp的長 度范圍特異性雜交，W及在嵌入式染料的存在下進(jìn)行PCR反應(yīng)； d) 使擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)歷解鏈步驟； e) 通過分析擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈曲線確定突變等位基因或野生型等位基因的存在。20. 權(quán)利要求19所述的方法，其進(jìn)一步包括檢測編碼F446I、G449A、N458Y、C469Y、W470 終止、A481V、Y493H、K503N、S522C、V534A、R539T、I543T、G548D、P55：3L、V555A、A557S、R561H、 K563R、V568G、P57 化、45785、〔580￥、尸58化、0584￥、￥5891、96136和06416等位基因的突變1(13 推進(jìn)器核酸。21. 用于檢測含有追原蟲的生物樣品中突變K13推進(jìn)器核酸的存在的方法，該方法包括 通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增突變K13推進(jìn)器核酸，W及使擴(kuò)增的核酸與特異性針對突變K13推進(jìn)器的 探針接觸。22. 權(quán)利要求5所述的方法，其中突變的K13推進(jìn)器核酸或蛋白的存在表示患者感染了 耐受青葛素衍生物的追原蟲。23. 權(quán)利要求22所述的方法，其進(jìn)一步包括向感染了耐受青葛素衍生物的追原蟲的所 述患者給予比常規(guī)方案更持久的基于青葛素衍生物的治療，和/或給予基于另一種抗追藥 的治療，優(yōu)選奎寧、氯哇或甲氣哇。24. 權(quán)利要求22所述的方法，其進(jìn)一步包括向感染了耐受青葛素衍生物的追原蟲的所 述患者給予基于新的抗追藥的治療，并在給予所述治療之后重復(fù)權(quán)利要求5中定義的步驟 a)和b)，其中突變的K13推進(jìn)器核酸或蛋白的不存在表示該患者不再感染耐受青葛素衍生 物的追原蟲并且所述治療對于耐受青葛素衍生物的追原蟲是有效的。25. 權(quán)利要求21所述的方法，其中所述探針與巧光珠結(jié)合。26. 權(quán)利要求25所述的方法，其進(jìn)一步包括使探針與突變K13推進(jìn)器域核酸結(jié)合，W及 用與結(jié)合的K13推進(jìn)器域核酸結(jié)合的第二探針檢測結(jié)合的K13推進(jìn)器域核酸。
【文檔編號】C12Q1/68GK105940115SQ201480062113
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2014年11月14日
【發(fā)明人】F·阿里埃, O·普加朗, D·邁納德, F·貝諾特-維卡爾, J·貝格哈恩, B·維特科斯基, J-C·巴拉勒, C·博契爾, N·基姆
【申請人】巴斯德研究所, 柬埔寨巴斯德研究所, 國家科研中心