專利名稱：一種凝血酶原時間測定試劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及臨床血液診斷領(lǐng)域中的凝血酶原時間試驗，具體涉及ー種凝血酶原時間測定試劑的制備方法。
背景技術(shù)：
臨床上進(jìn)行凝血試驗的目的有很多，如確定接受外科手術(shù)的病人的出血傾向，以及對接受抗凝血治療的病人進(jìn)行監(jiān)測以防止血液凝集等?！澳冈瓡r間(PT)”試驗即是凝血試驗中的ー種。PT試驗是通過在需要進(jìn)行PT試驗的血樣中加入凝血活酶，從而激活外源性凝血途徑而進(jìn)行的。凝血活酶也稱作組織因子(TF)，是ー種膜相關(guān)蛋白，它與因子V II a 形成V II a/TF復(fù)合物后，會激活一系列凝血途徑中所涉及的特異性酶，導(dǎo)致凝血酶和纖維蛋白的形成，血小板的激活，最終形成血塊。常規(guī)PT試驗是在體外及可控條件下，利用上述一系列酶反應(yīng)，對病人凝血系統(tǒng)的障礙或缺陷進(jìn)行診斷，血塊形成所用的時間即為凝血酶原時間或PT值。通常所稱的凝血酶原時間測定試劑，即PT試劑，其主要成分就是凝血活酶(即組織因子)。傳統(tǒng)上，PT試劑常用從兔腦、羊腦或牛腦中初歩分離純化的腦組織制成。腦中的組織因子能夠和磷脂協(xié)調(diào)作用完成血液外源性凝固系統(tǒng)的啟動。但是，用初歩分離純化的腦組織制備的PT試劑具有靈敏度差、有可能存在ー些抑制劑及制品穩(wěn)定性差的缺點。國外也有報道應(yīng)用基因工程制備的組織因子，主要是將含有組織因子基因的分子片段提取出并在大腸桿菌、真菌或動物細(xì)胞等中表達(dá)，從而獲得組織因子，這種方法比前述自然取得組織因子的方法更為方便，得到的產(chǎn)品更純并可大量生產(chǎn)。目前PT試劑中用到的這種基于基因工程的方法得到的組織因子，還主要是人組織因子和兔組織因子，但這種PT試劑及其制備方法也有缺陷，或穩(wěn)定性差，或敏感性不高，或制備過程復(fù)雜エ藝難控制等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種改進(jìn)的凝血酶原時間測定試劑的制備方法。為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案 ー種凝血酶原時間測定試劑的制備方法，包括如下步驟
(1)、通過基因工程的方法制備純度在90%以上的牛或羊組織因子，并將所述組織因子溶于水或磷酸緩沖液中形成組織因子溶液；
(2)、將適量磷脂溶于含有表面活性劑的磷酸緩沖液中，攪拌6(Γ120分鐘后，獲得均勻分散的磷脂溶液；所述磷酸緩沖液的PH值在7. 2 7. 6之間，表面活性劑的質(zhì)量含量為1% ；
(3)、將步驟(1)制備得到的組織因子溶液加入步驟(2)所得的磷脂溶液中，使磷脂與組織因子的質(zhì)量比在2. 5Χ IO3^XlO3:1之間，然后繼續(xù)攪拌4(Γ90分鐘，得到磷脂/組織因子溶液；
(4)、向步驟(3)所得的磷脂/組織因子溶液中加入體積為所述磷脂/組織因子溶液體積的1/10的完全溶脹的烷基鍵合硅膠，然后每間隔壙12分鐘，進(jìn)行一次搖勻，搖勻多次后， 得到渾濁液體；
(5)、對步驟(4)所得的渾濁液體進(jìn)行離心分離，濾除沉淀，取上清液凍干，即得所述的凝血酶原時間測定試劑。優(yōu)選地，所述的表面活性劑為聚乙ニ醇對異辛基苯基醚，即曲拉通。優(yōu)選地，步驟(1)和步驟(2)中所述的磷酸緩沖液為PBS緩沖液。優(yōu)選地，所述磷脂為自然磷脂或合成磷脂或兩者的混合物，且合成磷脂可選用磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺中的ー種或多種的混合。優(yōu)選地，所述烷基鍵合硅膠為十八烷基鍵合硅膠，俗稱C18樹脂，常用來制作層析柱，但尚未見此種樹脂應(yīng)用在本發(fā)明所屬領(lǐng)域中。由于以上技術(shù)方案的實施，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點
本發(fā)明將通過基因工程方法制備得到的純度> 90%的?；蜓蚪M織因子與磷脂相結(jié)合， 能夠得到穩(wěn)定性和靈敏性更好的PT試劑；用C18樹脂能夠非常方便和徹底地除去溶解磷脂時所用的表面活性剤，使制得的PT試劑雜質(zhì)更少，質(zhì)量更好；另外本發(fā)明制備方法還具有 エ藝穩(wěn)定，可操作性強(qiáng)的優(yōu)點。
具體實施例方式下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進(jìn)ー步詳細(xì)的說明，但不限于這些實施例。實施例1
本實施例的PT試劑的制備方法，包括如下步驟
(1)、用基因工程的方法在大腸桿菌中表達(dá)羊組織因子，制備純度在90%以上的羊組織因子，將該羊組織因子溶于適量PBS緩沖液中形成Mug/ml的組織因子溶液；
(2)、取磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸各0.3g，倒入ー個2L的玻璃燒杯中， 配制曲拉通質(zhì)量含量為1%、ρΗ值為7. 4、濃度為20mmol的PBS緩沖液800ml，加入上述燒杯中，在15°C 25°C下輕輕攪拌90分鐘后，獲得均勻分散的磷脂溶液；
(3)、取步驟(1)制備得到的組織因子溶液5ml(含羊組織因子約270ug)加入步驟(2) 所得的磷脂溶液中，并再用PBS緩沖液定容至900ml，繼續(xù)輕輕攪拌60分鐘，使磷脂與組織因子充分結(jié)合，得到磷脂/組織因子溶液；
(4)、向步驟(3)所得的磷脂/組織因子溶液中加入90ml完全溶脹的C18樹脂，然后每間隔10分鐘，進(jìn)行一次搖勻操作，搖勻5次后，得到含有沉淀的渾濁液體；
(5)、對步驟(4)所得的渾濁液體進(jìn)行離心分離，用尼龍布濾除沉淀，得到上清液，將該上清液分裝入IOml的血清瓶中，每瓶1ml，再通過常規(guī)技術(shù)凍干，即得PT試劑產(chǎn)品。實施例2
本實施例的PT試劑的制備方法，包括如下步驟
(1)、用基因工程的方法在大腸桿菌中表達(dá)羊組織因子，制備純度在90%以上的羊組織因子，將該羊組織因子溶于適量PBS緩沖液中形成50ug/ml的組織因子溶液；
(2)、取磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸各0.3g，倒入ー個2L的玻璃燒杯中， 配制曲拉通質(zhì)量含量為1%、ρΗ值為7. 4、濃度為20mmol的PBS緩沖液800ml，加入上述燒杯中，在15°C 25°C下輕輕攪拌60分鐘后，獲得均勻分散的磷脂溶液；(3)、取步驟(1)制備得到的組織因子溶液5ml(含羊組織因子約250ug)加入步驟(2) 所得的磷脂溶液中，并再用PBS緩沖液定容至900ml，繼續(xù)輕輕攪拌40分鐘，使磷脂與組織因子充分結(jié)合，得到磷脂/組織因子溶液；
(4)、向步驟(3)所得的磷脂/組織因子溶液中加入90ml完全溶脹的Cw樹脂，然后每間隔10分鐘，進(jìn)行一次搖勻操作，搖勻5次后，得到含有沉淀的渾濁液體；
(5)、對步驟(4)所得的渾濁液體進(jìn)行離心分離，用尼龍布濾除沉淀，得到上清液，將該上清液分裝入IOml的血清瓶中，每瓶1ml，再通過常規(guī)技術(shù)凍干，即得PT試劑產(chǎn)品。實施例3
本實施例的PT試劑的制備方法，包括如下步驟
(1)、用基因工程的方法在大腸桿菌中表達(dá)羊組織因子，制備純度在90%以上的羊組織因子，將該羊組織因子溶于適量PBS緩沖液中形成60ug/ml的組織因子溶液；
(2)、取磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸各0.3g，倒入ー個2L的玻璃燒杯中， 配制曲拉通質(zhì)量含量為1%、ρΗ值為7. 4、濃度為20mmol的PBS緩沖液800ml，加入上述燒杯中，在15°C 25°C下輕輕攪拌120分鐘后，獲得均勻分散的磷脂溶液；
(3)、取步驟(1)制備得到的組織因子溶液5ml(含羊組織因子約300ug)加入步驟(2) 所得的磷脂溶液中，并再用PBS緩沖液定容至900ml，繼續(xù)輕輕攪拌80分鐘，使磷脂與組織因子充分結(jié)合，得到磷脂/組織因子溶液；
(4)、向步驟(3)所得的磷脂/組織因子溶液中加入30ml完全溶脹的C18樹脂，然后每間隔10分鐘，進(jìn)行一次搖勻操作，搖勻5次后，得到含有沉淀的渾濁液體；
(5)、對步驟(4)所得的渾濁液體進(jìn)行離心分離，用尼龍布濾除沉淀，得到上清液，將該上清液分裝入IOml的血清瓶中，每瓶1ml，再通過常規(guī)技術(shù)凍干，即得PT試劑產(chǎn)品。上述實施例中通過基因工程的方法制備?；蜓蚪M織因子，可以制備整個分子，即包括胞外區(qū)域、脂結(jié)合區(qū)域和細(xì)胞內(nèi)區(qū)域，也可以是整個分子的部分片段如胞外區(qū)域等。且基因可以在大腸桿菌中表達(dá)，也可以在動物細(xì)胞或真菌中表達(dá)。因此這種方法制備?；蜓蚪M織因子具有容易實現(xiàn)、操作靈活的優(yōu)點。另外，由于?；蜓蚪M織因子的結(jié)構(gòu)明了，選用?；蜓蚪M織因子可望制備出質(zhì)量更好的PT試劑產(chǎn)品。上述實施例制備而得的PT試劑與市售PT試劑相比，敏感性顯著提高，ISI值為 0. 85 ；穩(wěn)定性也得到顯著改善，凍干品37°C下熱穩(wěn)定時間達(dá)5周，預(yù)計制品在2°C、で的溫度條件下穩(wěn)定時間可達(dá)至少3年。以上對本發(fā)明做了詳盡的描述，其目的在于讓熟悉此領(lǐng)域技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并加以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡根據(jù)本發(fā)明的精神實質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.ー種凝血酶原時間測定試劑的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)、通過基因工程的方法制備純度在90%以上的?；蜓蚪M織因子，并將所述組織因子溶于水或磷酸緩沖液中形成組織因子溶液；(2)、將適量磷脂溶于含有表面活性劑的磷酸緩沖液中，攪拌6(Γ120分鐘后，獲得均勻分散的磷脂溶液；所述磷酸緩沖液的PH值在7. 2 7. 6之間，表面活性劑的質(zhì)量含量為1% ；(3)、將步驟(1)制備得到的組織因子溶液加入步驟(2)所得的磷脂溶液中，使磷脂與組織因子的質(zhì)量比在2. 5Χ IO3^XlO3:1之間，然后繼續(xù)攪拌4(Γ90分鐘，得到磷脂/組織因子溶液；(4)、向步驟(3)所得的磷脂/組織因子溶液中加入體積為所述磷脂/組織因子溶液體積的1/10的完全溶脹的烷基鍵合硅膠，然后每間隔壙12分鐘，進(jìn)行一次搖勻，搖勻多次后， 得到渾濁液體；(5)、對步驟(4)所得的渾濁液體進(jìn)行離心分離，濾除沉淀，取上清液凍干，即得所述的凝血酶原時間測定試劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的表面活性劑為聚乙ニ醇對異辛基苯基醚。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(1)和步驟(2)中所述的磷酸緩沖液為PBS緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述磷脂為自然磷脂或合成磷脂或兩者的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述合成磷脂為磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺中的ー種或多種的混合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述烷基鍵合硅膠為十八烷基鍵合硅膠。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種凝血酶原時間測定試劑(PT試劑)的制備方法，包括如下步驟通過基因工程的方法制備純度在90%以上的?；蜓蚪M織因子，將磷脂分散于含表面活性劑的磷酸緩沖液中，然后將所述組織因子與所述磷脂相混合，使兩者充分結(jié)合，最后用C18樹脂吸附分離出表面活性劑，凍干后制得本發(fā)明PT試劑產(chǎn)品。本發(fā)明制備方法工藝穩(wěn)定，可操作性強(qiáng)，所制得的PT試劑穩(wěn)定性和靈敏性更好，且雜質(zhì)少，質(zhì)量容易保證。
文檔編號G01N33/86GK102565427SQ201110446209
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月28日
發(fā)明者王小良 申請人:蘇州良辰生物醫(yī)藥科技有限公司