一種從人血漿中分離純化人抗凝血酶-Ⅲ的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從人去冷沉淀血漿中分離純化人抗凝血酶-Ⅲ的方法，其具體操作步驟如下：去冷沉淀人血漿層析，S/D病毒滅活，第二次親和層析：超濾；除菌過濾；20nm納濾膜過濾去除病毒；分裝；凍干：干熱病毒滅活；從人去冷沉淀血漿中分離純化人抗凝血酶-Ⅲ；經(jīng)過預(yù)過濾處理后，采用親和層析技術(shù)直接將血漿中的抗凝血酶-Ⅲ（AT-Ⅲ）分離純化出來；經(jīng)加入適當(dāng)保護(hù)劑以S/D病毒滅活工藝代替巴氏病毒滅活工藝，既減少了活性損失，又縮短了制備時(shí)間；然后進(jìn)行第二次親和層析進(jìn)一步純化AT-Ⅲ，最后經(jīng)過超濾、20NM納米膜納濾除病毒、凍干等步驟，最終制品純度在95%以上；比活在6IU/mg以上，病毒安全性高，且制備過程中不會(huì)影響血漿用來生產(chǎn)下游產(chǎn)品。
【專利說明】一種從人血漿中分離純化人抗凝血酶-1II的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物制藥領(lǐng)域；涉及一種從人去冷沉淀血漿中分離純化人抗凝血酶-1II的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]人抗凝血酶-1IKAntithrombin-1II,簡稱AT-1II)為單肽鏈α糖蛋白，分子量約58kD (千道爾頓)，由423個(gè)氨基酸組成，是一種多功能絲氨酸蛋白酶抑制劑，在人體血漿中的抗凝作用占整個(gè)抗凝作用的70%左右，其半衰期為2.69天，患病時(shí)半衰期縮短，其主要在肝臟合成，故在各種肝臟疾病發(fā)生時(shí)AT-1II有不同程度的獲得性缺乏。AT-1II制品主要用來治療先天性遺傳性抗凝血酶-1II缺乏，AT-1II缺乏癥為常染色體顯性遺傳，據(jù)統(tǒng)計(jì)，該癥在歐美的發(fā)生率為0.2%~0.5%。AT-1II制品還用來治療獲得性抗凝血酶III缺乏，見于各種肝病，如肝硬化、重癥呷、肝癌晚期等，以及各種病因引起的DIC綜合癥，產(chǎn)科與外科手術(shù)等造成的血檢等。
[0003]上世紀(jì)60~70年代即開始有人報(bào)道純化AT-1II的工藝，但是僅限于實(shí)驗(yàn)室開發(fā)。1972年Heimburger et a7首次分離并鑒定AT-111為a2單鏈糖蛋白，但是其回收率較低，大約在2%左右。1974年Maggie Miller-Andersson et a7使用肝素親和膠從血衆(zhòng)中純化AT-1II，然后經(jīng)過DEAE- Sephadex and Sephadex G200層析處理，其活性回收率為34%，純度在90%以上。1979年，Wicker et 首先敘述了工業(yè)規(guī)模制備臨床用途的AT-1II濃縮物，其原料為工業(yè)生產(chǎn)丟棄的Cohn組分IV`-1沉淀。1989年，Hoffman等報(bào)道了大量制備AT-1II的方法，原料為Cohn氏工藝組分IV-1，通過肝素親和層析與其它蛋白分離，之后，在0.5M枸椽酸鈉溶液中將AT-1II濃縮物于60°C加熱10小時(shí)，以滅活乙肝病毒和其他傳染性病毒，以后，再進(jìn)行二次肝素親和層析，成品比活不低于6.4 IU/ mg，純度大于95%，凍干后4°C存放2年，仍有90%以上的生物學(xué)活性。1994年，W ytold等發(fā)表了以重溶后Cohn氏組分IV-1沉淀為原料，進(jìn)行人血漿AT-1II肝素親和層析的大規(guī)模提純改良法，該工藝包括了病毒滅活的加熱過程和為進(jìn)一步提純目的的第二步肝素親和層析，上述方法可在5小時(shí)內(nèi)在40升柱上通過1800升的原液。AT-1II成品純度達(dá)95%以上，其平均效率為69%，比活性為7.7 IU/mg蛋白，由20 kg FIV-1沉淀獲得30g AT-1II，效果達(dá)15~20%。90年代以后，國外血液制品企業(yè)開始推出新的血漿分離純化工藝，層析技術(shù)被廣泛應(yīng)用，直接以去冷沉淀血漿為原料進(jìn)行親和層析制備AT-1II的技術(shù)得到應(yīng)用和推廣，如法國的FBL公司等都采用此工藝進(jìn)行制備AT-1II制品。另外，為了去除難以采用S/D、加熱等方法滅活的人細(xì)小病毒(B19)，國際上相關(guān)制品都加以納米膜過濾步驟來去除，本步驟采用過濾的方式將制品溶液中可能含有的包括細(xì)小病毒B19在內(nèi)的病毒去除掉，去除能力達(dá)到4個(gè)Log以上，提高了制品的病毒安全性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的是發(fā)明一種以人去冷沉淀血漿為原料分離純化制備人抗凝血酶-1II(AT-1II)的方法，經(jīng)過預(yù)過濾處理后，采用親和層析技術(shù)直接將血漿中的抗凝血酶-1II(AT-1II)分離純化出來；經(jīng)加入適當(dāng)保護(hù)劑以S/D病毒滅活工藝代替巴氏病毒滅活工藝，既減少了活性損失，又縮短了制備時(shí)間；然后進(jìn)行第二次親和層析進(jìn)一步純化AT-1II，最后經(jīng)過超濾、20匪納米膜納濾除病毒、凍干等步驟，最終制品純度在95%以上，；比活在6 IU/mg以上，病毒安全性高，且制備過程中不會(huì)影響血漿用來生產(chǎn)下游產(chǎn)品。:下本發(fā)明的具體操作步驟如下:
(I)、去冷沉淀人血漿層析
先將人去冷沉淀血漿用0.45 μ m膜預(yù)過濾，然后泵入第一根肝素親和層析柱中進(jìn)行第一次親和層析，經(jīng)過平衡、上樣、洗滌、洗脫等步驟得到AT-1II濃縮液，而流穿的血漿將繼續(xù)用于生產(chǎn)其他制品；其中層析溫度范圍為4°C~15°C，各步驟液體流速為每小時(shí)6~9個(gè)柱體積。
[0005]①平衡:用平衡液對(duì)親和膠進(jìn)行平衡，平衡液體積不少于4個(gè)柱體積；
②上樣:將預(yù)處理的人去冷沉淀血漿泵入層析柱中，通過親和膠進(jìn)行吸附；
③洗滌:用洗滌液對(duì)親和膠進(jìn)行洗滌，洗滌液體積不少于8個(gè)柱體積，觀察在線紫外吸收?qǐng)D譜，至圖譜趨于水平時(shí)停止洗滌；
④洗脫:對(duì)親和膠進(jìn)行洗脫，觀察在線紫外吸收?qǐng)D譜，并用潔凈的容器收集吸收峰處的流出液，即為AT-1II濃縮液。
[0006](2)、S/D 病毒滅活
對(duì)步驟(1)中所得AT-1II濃縮液用IOkD孔徑超濾膜超濾除鹽，將鹽濃度降至0.15M~0.25M，體積不變。按步驟(1)最終所得液體體積的10%，加入11% S/D病毒滅活液，在24~25°C攪拌6小時(shí)；
(3)第二次親和層析
對(duì)經(jīng)S/D滅活后的溶液，過0.45 μ m膜預(yù)過濾，然后泵入第二根肝素親和層析柱中進(jìn)行第二次親和層析，經(jīng)過平衡、上樣、洗滌、洗脫等步驟得到AT-1II原液，其中層析溫度范圍為4~25°C，各步驟液體流速為每小時(shí)6~9個(gè)柱體積；
①平衡:用平衡液對(duì)親和膠進(jìn)行平衡，平衡液體積不少于4個(gè)柱體積；
②上樣:將步驟(2)S/D病毒滅活最終所得液體泵入層析柱中，通過親和膠進(jìn)行吸附；
③洗滌:用洗滌液對(duì)親和膠進(jìn)行洗滌，洗滌液體積不少于8個(gè)柱體積，觀察在線紫外吸收?qǐng)D譜，至圖譜趨于水平時(shí)停止洗滌；
④洗脫:對(duì)親和膠進(jìn)行洗脫，觀察在線紫外吸收?qǐng)D譜，并用潔凈的容器收集吸收峰處的流出液，即為AT-1II原液。
[0007](4)、超濾
對(duì)步驟(3)中所得AT-1II原液用IOkD孔徑超濾膜超濾，將鹽濃度降至0.1lM~0.22M，并適當(dāng)濃縮使每毫升溶液中的活性單位大于50IU，添加必要的凍干保護(hù)劑，本保護(hù)劑是指甘氨酸，其最終濃度為0.6%~1.6% ；
(5)除菌過濾；
(6)20N納濾膜過濾去除病毒；
(7)分裝；
(8)凍干:①分裝后的制品常溫入柜；
②將隔板溫度在40分鐘內(nèi)快速降至-40°C，保持3小時(shí)；
③開啟真空泵，真空度控制在7Pa~15Pa；
④2小時(shí)后將隔板溫度升至_30°C，保持3小時(shí)；
⑤4小時(shí)后隔板溫度升至_20°C，保持6小時(shí)；
⑥8小時(shí)后將隔板溫度升至0°C，保持20小時(shí)；
⑦10小時(shí)后將溫度升至30°C，保持6小時(shí)；真空度控制在5Pa以下保持I小時(shí)；
⑧真空壓塞出柜；
(9)干熱病毒滅活,干熱溫度100°C,時(shí)間為30min~60min ；
其中:
平衡液含氯化鈉和檸檬酸鈉，其中氯化鈉濃度為0.09 M~0.15M，檸檬酸鈉濃度為0.015 M ~0.025M, pH 為 6.5 ~7.5，其余為水；
洗滌液中含氯化鈉和檸檬 酸鈉，其中氯化鈉濃度為0.3 M~0.5M，檸檬酸鈉濃度為0.015 M ~0.025M, pH 為 6.5 ~7.5 ;其余為水；
洗脫液中含氯化鈉和檸檬 酸鈉，其中氯化鈉濃度為2 M~3M，檸檬酸鈉濃度為0.015M~0.025M, pH為6.5~7.5 ;其余為水；
11%S/D溶液含吐溫-80和磷酸三丁酯(TNBP)，按每IlOg吐溫-80和33g TNBP 加水至I千克的方法配制；
以上百分比濃度除特別說明外均為質(zhì)量百分比
以上需要調(diào)節(jié)pH的地方，所用酸堿均為0.1M鹽酸和0.2M氫氧化鈉。
[0008]本發(fā)明的有益效果，本發(fā)明的工藝步驟操作簡單，經(jīng)兩步親和層析步驟，直接將去冷沉淀血漿純化得到高純的AT-1II濃縮物，加以兩步必要的病毒滅活/去除步驟，進(jìn)一步提高了制品的病毒安全性。其工藝步驟操作簡單，且制備過程中不會(huì)影響血漿用來生產(chǎn)下游產(chǎn)品，最終所得制品安全可靠。本發(fā)明所得制品主要用來治療各種原因引起的抗凝血酶-1II缺乏患者。
【具體實(shí)施方式】實(shí)施例
[0009]1、基本要求:
在公司中試車間將所需設(shè)備調(diào)試好并標(biāo)為備用狀態(tài)；
將所需容器管線及中試車間清潔干凈并標(biāo)為備用狀態(tài)；
準(zhǔn)備好500L新鮮人去冷沉淀血漿，于O~4°C融漿罐中保存?zhèn)溆谩?br> [0010]2、主要溶液配制方法
抽提緩沖液中含氯化鈉和檸檬酸鈉，其中氯化鈉濃度為0.09~0.15M，檸檬酸鈉濃度為0.015M~0.025M, pH為5.5~11，其余為水；
平衡液含氯化鈉和檸檬酸鈉，其中氯化鈉濃度為0.09M~0.15M，檸檬酸鈉濃度為0.015M ~0.025M, pH 為 6.5 ~7.5，其余為水；
洗滌液中含氯化鈉和檸檬酸鈉，其中氯化鈉濃度為0.3M~0.5M，檸檬酸鈉濃度為0.015M ~0.025M, pH 為 6.5 ~7.5 ;其余為水；
洗脫液中含氯化鈉和檸檬酸鈉，其中氯化鈉濃度為2Μ~3Μ，檸檬酸鈉濃度為0.015Μ~
0.025Μ, pH為6.5~7.5 ;其余為水；
11%S/D溶液含吐溫-80和磷酸三丁酯(TNBP)，按每IlOg吐溫-80和33g TNBP加水至1千克的方法配制。
[0011]以上百分比除特別說明外均為質(zhì)量百分比。
[0012]以上需要調(diào)節(jié)pH的地方，所用酸堿均為0.1M鹽酸和0.2M氫氧化鈉。
[0013]3、本實(shí)施例具體制備過程:
(1)、人去冷沉淀血漿層析
先將約500L人去冷沉淀血漿用0.45 μ m膜預(yù)過濾，然后泵入第一根肝素親和層析柱中進(jìn)行第一次親和層析，經(jīng)過平衡、上樣、洗滌、洗脫等步驟得到AT-III濃縮液，而流穿的血漿將繼續(xù)用于生產(chǎn)其他制品。其中層析溫度范圍為4~15°C，各步驟液體流速為每小時(shí)6~9個(gè)柱體積。
[0014]①平衡:用平衡液對(duì)親和膠進(jìn)行平衡，平衡液體積不少于4個(gè)柱體積；
②上樣:將預(yù)處理的人去冷沉淀血漿泵入層析柱中，通過親和膠進(jìn)行吸附；
③洗滌:用洗滌液對(duì)親和膠進(jìn)行洗滌，洗滌液體積不少于8個(gè)柱體積，觀察在線紫外吸收?qǐng)D譜，至圖譜趨于水平時(shí)停止洗滌；
④洗脫:對(duì)親和膠進(jìn)行洗脫，觀察在線紫外吸收?qǐng)D譜，并用潔凈的容器收集吸收峰處的流出液，即為AT-1II濃縮液。
[0015](2)、S/D 病毒滅活
對(duì)步驟(1)中所得AT-III濃縮液用IOkD孔徑超濾膜超濾除鹽，將鹽濃度降至0.15~
0.25M，體積不變。按步驟(1)最終所得液體體積的10%，加入11% S/D病毒滅活液，在24~25°C攪拌6小時(shí)。
[0016](3)第二次親和層析
對(duì)經(jīng)S/D滅活后的溶液，過0.45 μ m膜預(yù)過濾，然后泵入第二根肝素親和層析柱中進(jìn)行第二次親和層析，經(jīng)過平衡、上樣、洗滌、洗脫等步驟得到AT-1II原液，其中層析溫度范圍為4~25°C，各步驟液體流速為每小時(shí)6~9個(gè)柱體積。
[0017]①平衡:用平衡液對(duì)親和膠進(jìn)行平衡，平衡液體積不少于4個(gè)柱體積；
②上樣:將步驟(2)S/D病毒滅活最終所得液體泵入層析柱中，通過親和膠進(jìn)行吸附；
③洗滌:用洗滌液對(duì)親和膠進(jìn)行洗滌，洗滌液體積不少于8個(gè)柱體積，觀察在線紫外吸收?qǐng)D譜，至圖譜趨于水平時(shí)停止洗滌；
④洗脫:對(duì)親和膠進(jìn)行洗脫，觀察在線紫外吸收?qǐng)D譜，并用潔凈的容器收集吸收峰處的流出液，即為AT-III原液。
[0018](4)、超濾
對(duì)步驟(3)中所得AT-III原液用IOkD孔徑超濾膜超濾，將鹽濃度降至0.1lM~0.22M，并適當(dāng)濃縮使每毫升溶液中的活性單位大于50IU，添加必要的凍干保護(hù)劑，本保護(hù)劑是指甘氨酸，其最終濃度為0.6%~1.6% ;第二次親和層析、超濾濃縮除鹽、除菌過濾得到2.0LAT-III 原液；
(5)除菌過濾；(6)20nm納米膜過濾去除病毒；
(7)分裝；
(8)凍干:
①分裝后的制品常溫入柜；
②將隔板溫度在40分鐘內(nèi)降至-40°C，保持3小時(shí)；
③開啟真空泵，真空度控制在7~15Pa；
④2小時(shí)后將隔板溫度升至_30°C，保持3小時(shí)；
⑤4小時(shí)后隔板溫度升至_20°C，保持6小時(shí)；
⑥8小時(shí)后將隔板溫度升至0°C，保持20小時(shí)；
⑦10小時(shí)后將溫度升至30°C，保持6小時(shí)；真空度控制在5Pa以下保持I小時(shí)；
⑧真空壓塞出柜；
(9)干熱病毒滅活,干熱溫度100°C,時(shí)間為30min~60min。
[0019]最終AT-1II制品各參數(shù)指標(biāo)見表2所示。
[0020]表1 AT-1II制品的參數(shù)指`標(biāo)
【權(quán)利要求】
1.一種從人去冷沉淀血漿中分離純化人抗凝血酶-1II的方法，其特征是它的具體操作步驟如下: (1)、去冷沉淀人血漿層析 先將人去冷沉淀血漿用0.45 μ m膜預(yù)過濾，然后泵入第一根肝素親和層析柱中進(jìn)行第一次親和層析，經(jīng)過平衡、上樣、洗滌、洗脫等步驟得到AT-1II濃縮液，而流穿的血漿將繼續(xù)用于生產(chǎn)其他制品；其中層析溫度范圍為4°C~15°C，各步驟液體流速為每小時(shí)6~9個(gè)柱體積； ①平衡:用平衡液對(duì)親和膠進(jìn)行平衡，平衡液體積不少于4個(gè)柱體積； ②上樣:將預(yù)處理的人去冷沉淀血漿泵入層析柱中，通過親和膠進(jìn)行吸附； ③洗滌:用洗滌液對(duì)親和膠進(jìn)行洗滌，洗滌液體積不少于8個(gè)柱體積，觀察在線紫外吸收?qǐng)D譜，至圖譜趨于水平時(shí)停止洗滌； ④洗脫:對(duì)親和膠進(jìn)行洗脫，觀察在線紫外吸收?qǐng)D譜，并用潔凈的容器收集吸收峰處的流出液，即為AT-1II濃縮液； (2)、S/D病毒滅活 對(duì)步驟(1)中所得AT-1II濃縮液用IOkD孔徑超濾膜超濾除鹽，將鹽濃度降至0.15M~0.25M，體積不變；按步驟(1)最終所得液體體積的10%，加入11% S/D病毒滅活液，在24~25°C攪拌6小時(shí)； (3)第二次親和層析 對(duì)經(jīng)S/D滅活后的溶液，過0.45 μ m膜預(yù)過濾，然后泵入第二根肝素親和層析柱中進(jìn)行第二次親和層析，經(jīng)過平衡、上樣、洗滌、洗脫等步驟得到AT-1II原液，其中層析溫度范圍為4~25°C，各步驟液體流速為每小時(shí)6~9個(gè)柱體積； ①平衡:用平衡液對(duì)親和膠進(jìn)行平衡，平衡液體積不少于4個(gè)柱體積； ②上樣:將步驟(2)S/D病毒滅活最終所得液體泵入層析柱中，通過親和膠進(jìn)行吸附； ③洗滌:用洗滌液對(duì)親和膠進(jìn)行洗滌，洗滌液體積不少于8個(gè)柱體積，觀察在線紫外吸收?qǐng)D譜，至圖譜趨于水平時(shí)停止洗滌； ④洗脫:對(duì)親和膠進(jìn)行洗脫，觀察在線紫外吸收?qǐng)D譜，并用潔凈的容器收集吸收峰處的流出液，即為AT-1II原液； (4)、超濾 對(duì)步驟(3)中所得AT-1II原液用IOkD孔徑超濾膜超濾，將鹽濃度降至0.1lM~0.22M，并適當(dāng)濃縮使每毫升溶液中的活性單位大于50IU，添加必要的凍干保護(hù)劑，本保護(hù)劑是指甘氨酸，其最終濃度為0.6%~1.6% ； (5)除菌過濾； (6)20N納濾膜過濾去除病毒； (7)分裝； (8)凍干: ①分裝后的制品常溫入柜； ②將隔板溫度在40分鐘內(nèi)快速降至-40°C，保持3小時(shí)； ③開啟真空泵，真空度控制在7Pa~15Pa； ④2小時(shí)后將隔板溫度升至_30°C，保持3小時(shí)；⑤4小時(shí)后隔板溫度升至_20°C，保持6小時(shí)； ⑥8小時(shí)后將隔板溫度升至0°C，保持20小時(shí)； ⑦10小時(shí)后將溫度升至30°C，保持6小時(shí)；真空度控制在5Pa以下保持I小時(shí)； ⑧真空壓塞出柜； (9)干熱病毒滅活,干熱溫度100°C,時(shí)間為30min~60min ； 其中: 平衡液含氯化鈉和檸檬酸鈉，其中氯化鈉濃度為0.09 M~0.15M，檸檬酸鈉濃度為.0.015 M ~0.025M, pH 為 6.5 ~7.5，其余為水； 洗滌液中含氯化鈉和檸檬酸鈉，其中氯化鈉濃度為0.3 M~0.5M，檸檬酸鈉濃度為.0.015 M ~0.025M, pH 為 6.5 ~7.5 ;其余為水； 洗脫液中含氯化鈉和檸檬酸鈉，其中氯化鈉濃度為2 M~3M，檸檬酸鈉濃度為0.015M~0.025M, pH為6.5~7.5 ;其余為水； 11%S/D溶液含吐溫-80和磷酸三丁酯(TNBP)，按每IlOg吐溫-80和33g TNBP 加水至I千克的方法配制； 以上百分比濃度除特別說明外均為質(zhì)量百分比 以上需要調(diào)節(jié)pH的地方，所用酸堿均為0.1M鹽酸和0.2M氫氧化鈉。
【文檔編號(hào)】C07K1/22GK103613662SQ201310604723
【公開日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月26日
【發(fā)明者】王宗奎, 杜晞, 李長清, 王玉梅, 袁靖, 陳云華, 劉欣宴, 楊剛 申請(qǐng)人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所, 貴州泰邦生物制品有限公司