一種人抗凝血酶Ⅲ的生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物制品和血液制品生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，主要設(shè)及血液制品生產(chǎn)中人抗凝 血酶III分離純化方法。
【背景技術(shù)】
[000引人抗凝血酶III為a 2球蛋白，分子量介于58000~65000化之間，是人體內(nèi)重要的抗 凝物質(zhì)，可W在沒(méi)有肝素的條件下發(fā)揮抗凝血作用?？鼓窱II在健康成年人血漿中濃度 為100~300 y g/ml，人體內(nèi)抗凝血酶III水平低于正常水平的70%時(shí)，會(huì)使血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)升 高。人抗凝血酶III產(chǎn)品適用于治療抗凝血酶缺乏的病人，如先天遺傳性及獲得性抗凝血酶 缺乏、彌散性血管內(nèi)出血（DIC )、敗血癥、外傷、腫瘤、血栓性栓塞、并發(fā)性妊娠等。
[0003] 1975年化aler使用肝素親和層析和聚己二醇（陽(yáng)G)沉淀進(jìn)行血漿純化、再加入 硫酸錠沉淀除去PEG ;但經(jīng)由該方法純化的抗凝血酶III中還含有雜蛋白肝素輔助因子的活 性。1981年Mckay用硫酸葡聚糖除去血漿中大部分與肝素結(jié)合的非特異性蛋白，再用肝素 親和層析分離抗凝血酶III，但比活只能達(dá)到4IU/mg。上述兩種工藝均W血漿為起始原料，通 過(guò)加入蛋白沉淀劑去除血漿中的雜蛋白，操作步驟繁瑣，雜蛋白去除效果不好，導(dǎo)致產(chǎn)品純 度低、比活低，而且影響血漿中其他蛋白的提取，不利于血漿的綜合利用。
[0004] 1989年化ffman W Cohn FIV-1沉淀為原料，將沉淀復(fù)溶澄清后的上清液經(jīng)過(guò) 兩次肝素親和層析，抗凝血酶III比活達(dá)到了 6. 4IU/mg。在國(guó)內(nèi)現(xiàn)有已公開(kāi)和授權(quán)的專利 (CN201210544111X，CN2013100304464, CN2013106047238)生產(chǎn)工藝中，無(wú)論是W F IV為原 料的工藝路線，還是W血漿為原料的工藝路線，均采用兩次或兩次W上肝素親和層析制備 抗凝血酶III，W達(dá)到最終制品抗凝血酶III的高純度和高比活標(biāo)準(zhǔn)。由于上述工藝中均未對(duì) 起始料液進(jìn)行澄清預(yù)處理，因此必須使用兩次親和層析進(jìn)行純化，才能保證產(chǎn)品有較高的 純度和比活。但親和層析的凝膠一般價(jià)格昂貴，生產(chǎn)成本高，并且增加一步親和層析的同時(shí) 也提高了親和配基脫落的風(fēng)險(xiǎn)，給產(chǎn)品質(zhì)量帶來(lái)隱患。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)目前人抗凝血酶III生產(chǎn)工藝中存在的不足，提供一種僅需 一步親和層析即可獲得高比活抗凝血酶III的工藝方法。
[0006] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下： (1)新鮮冰凍人血漿離屯、去除冷沉淀，DEAE Se地adex-A50凝膠吸附；（2)血漿上清沉 淀雜質(zhì)蛋白，深層過(guò)濾；（3)濾過(guò)液Capto舶parin親和層析；（4)S/D試劑病毒滅活，Capto Q離子交換層析去除S/D試劑；（5)納米膜過(guò)濾去除病毒，配制、凍干、干熱。
[0007] 本發(fā)明中所述的步驟（1)新鮮冰凍人血漿離屯、去除冷沉淀，DEAE Se地adex-A50 凝膠吸附；具體的步驟如下： 將新鮮冰凍人血漿融化混勻后，經(jīng)連續(xù)流離屯、機(jī)去除血漿中的冷沉淀，得到離屯、后的 血漿上清液； 血漿上清采用1~10 ym的濾巧過(guò)濾，調(diào)節(jié)血漿抑至6. 80~7. 20 ;加入平衡好的DEAE Se地adex-A50凝膠攬拌吸附30~60分鐘，吸附溫度《15°C ;采用0. 2~1 ym微孔濾巧過(guò) 濾，濾除凝膠獲得吸附處理后的血漿上清；DEAE Se地adex-A50干膠量1. 0~2. Og/kg血漿； 0. 05~0.1mol/L氯化鋼溶液融脹> 8小時(shí)；平衡3~5次；再生用1. 0~2. Omol/L氯化鋼溶 液處理，20%己醇保存；再生次數(shù)不超過(guò)10次；所述的平衡液；0. 015~0. 025mol/L構(gòu)檢酸 鋼，0. 14~0. 20mol/L 氯化鋼，pH 6. 8~7. 2,溫度 2~8°C ; 加入1~2倍凝膠體積的洗漆液，攬拌洗漆1~3次，將洗漆液采用0. 2~1 ym微孔濾巧過(guò) 濾后，與濾除凝膠后的血漿上清合并，得到處理后的血漿上清；洗漆液；〇. 015~0. 025mol/L 構(gòu)檢酸鋼，0. 14~0. 20mol/L氯化鋼，pH 6. 80~7. 20,溫度2~8°C。
[000引本發(fā)明中所述的步驟（2)血漿上清沉淀雜質(zhì)蛋白，深層過(guò)濾；具體步驟如下： 血漿上清沉淀雜質(zhì)蛋白 將處理后的血漿上清首先升溫至8~10°C，添加化C1至血漿上清中總化C1濃度 為60~lOOmmol/L，攬拌均勻，用0. 1~0. 3mol/L的鹽酸或氨氧化鋼調(diào)整血漿上清抑為 6. 80~7. 00 ;降溫至4~6°C，補(bǔ)加添加化C1至血漿上清中總化C1濃度為120~200mmol/L，攬 拌均勻，用0. 1~0. 3mol/L的鹽酸或氨氧化鋼調(diào)整血漿上清抑為7. 40~7. 50 ;降溫至0~2°C， 攬拌10~30min后靜置30~60min ; 深層過(guò)濾 所采用的過(guò)濾材質(zhì)為藥用級(jí)別纖維素濾板，可W為一種規(guī)格的單層濾板或幾種規(guī)格 的濾板串聯(lián)疊加使用；濾板型號(hào)選擇如PA化的陽(yáng)K1、P邸S、PDH4、PDE2、PDE1，3M的30SP、 60SP、90SP、30LA、60 LA、90 LA，W及類似效果的其他型號(hào)的濾板，或者其組合； 使用含有0. 1%~10%邸TA的溶液對(duì)過(guò)濾材質(zhì)進(jìn)行清洗，用量為100~30化/m2;再用 0. 1%~10%的構(gòu)檢酸鋼溶液對(duì)過(guò)濾材質(zhì)進(jìn)行清洗，并洗去殘留的邸TA，用量為100~30化/m 2; 沖洗完成后排干設(shè)備內(nèi)的溶液，用于血漿過(guò)濾。
[0009] 過(guò)濾后的血漿上清在進(jìn)行柱層析的同時(shí)，使用0. 2 ym的濾巧進(jìn)行在線的膜過(guò)濾。
[0010] 其中，步驟（3)濾過(guò)液進(jìn)行Capto舶par in親和層析具體為； 深層過(guò)濾后的濾過(guò)液，通過(guò)裝填有Capto舶parin的肝素親和凝膠的層析柱進(jìn)行固 定床親和層析，凝膠中結(jié)合在瓊脂糖基架上的肝素配基將捕獲血漿中的抗凝血酶III;用 平衡液將層析柱中未吸附的其他血漿成分洗漆干凈，用洗脫液洗脫被吸附的抗凝血酶 III ;每次上樣量控制為20-30個(gè)柱床體積；所述的平衡液；含磯酸氨二鋼10~30mmol/L、 氯化鋼0. 3~0. 6mol/L，P冊(cè).50~7. 50 ;所述的洗脫液；含磯酸氨二鋼10~30mmol/L、氯化鋼 1. 5~2. 5mol/L，P冊(cè).50~7. 50 ;平衡、上樣和洗脫線流速180cm/h~300cm/h ;柱再生；分別用 0.1mol/L氨氧化鋼、洗脫液、注射用水進(jìn)行處理；柱保存；20%己醇溶液保存。
[0011] 本發(fā)明中所述的步驟（4)S/D試劑病毒滅活，Capto Q離子交換層析去除S/D試劑； 具體步驟如下： 收集從Capto Heparin肝素層析柱上洗脫得到的制品，進(jìn)行超濾、脫鹽和濃縮，超濾 膜孔徑lOKDa，所述的超濾稀釋液；含磯酸氨二鋼10~30mmol/L，P冊(cè).50~7. 50 ;超濾后制 品電導(dǎo)率值不高于5mS/cm，制品蛋白質(zhì)濃度《20.0 mg/ml ;超濾后的抗凝血酶III溶液用 精度不低于1 ym濾巧過(guò)濾，進(jìn)行S/D法病毒滅活處理，方法為：聚山梨醋80含量應(yīng)為 1. 0 + 0. 3%(g/ml)，磯酸S了醋含量應(yīng)為0. 3 + 0. l%(g/ml)，制品蛋白質(zhì)濃度《20.0 mg/ml， 滅活溫度24± rc，維持6小時(shí)； S/D滅活后的制品通過(guò)平衡好的Capto Q陰離子交換層析柱，制品被吸附在層析柱上， 而加入的S/D試劑流穿出層析柱，用平衡液沖洗層析柱，洗漆殘留的S/D試劑，再用洗脫 液將吸附的制品洗脫下來(lái)；平衡液；含磯酸氨二鋼10~30mmol/L，P冊(cè).50~7. 50 ;洗脫液：含 磯酸氨二鋼10~30mmol/L、氯化鋼0. 4~1. Omol/L，P冊(cè).50~7. 50 ;平衡、上樣和洗脫線流速 180cm/h~300cm/h ;柱再生；分別用0. 3mol/L氨氧化鋼、洗脫液、注射用水進(jìn)行處理；柱保 存；20%己醇溶液或0.0 lmol/L化0H保存。
[0012] 本發(fā)明所述的步驟（5)納米膜過(guò)濾去除病毒，配制、凍干、干熱；具體步驟如下： 收集從離子交換層析柱上洗脫的制品，進(jìn)行超濾脫鹽和濃縮，超濾膜孔徑lOKDa，制品 蛋白質(zhì)含量10. 0~20.0 mg/ml，超濾后制品用0. 1 ym的濾膜進(jìn)行預(yù)過(guò)濾，然后用20皿的納 米膜進(jìn)行除病毒過(guò)濾；按出品規(guī)格配制、凍干、制品進(jìn)行l(wèi)〇〇°C，30min干熱滅活病毒處理。
[0013] 本發(fā)明的有益效果是： (1) W DEAE Se地adex-A50凝膠吸附后的血漿為原料，不影響血漿生產(chǎn)線中冷沉淀和 人凝血酶原復(fù)合物的生產(chǎn)，也不影響后續(xù)人白和免疫球蛋白等其他產(chǎn)品的生產(chǎn)。并且DEAE Se地adex-A50凝膠吸附后的血漿中凝血因子II、W、IX、X因子的含量極低，可避免肝素親 和凝膠對(duì)上述凝血因子的非特異性吸附，提高目的蛋白抗凝血酶III的純度和凝膠的載量。
[0014] (2)血漿澄清處理不使用聚己二醇（PEG)、硫酸錠、硫酸葡聚糖等蛋白沉淀劑，不引 入外源性雜質(zhì)。通過(guò)調(diào)整鹽濃度、抑值、溫度等條件，再經(jīng)過(guò)深層過(guò)濾和0. 2 y m的膜過(guò)濾， 就可W去除血漿中大部分與肝素親和層析凝膠結(jié)合的雜質(zhì)蛋白，使血漿料液達(dá)到固定床柱 層析所要求的接近0. 2 y m的過(guò)濾精度和澄清度，不僅能有效提高上樣過(guò)程中的線速度，還 可進(jìn)一步提升產(chǎn)品的比活和凝膠載量，同時(shí)可進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對(duì)凝膠填料的保護(hù)，確保昂貴的 Capto H巧arin肝素親和凝膠的重復(fù)使用次數(shù)達(dá)到200次W上。
[0015] (3)血漿經(jīng)過(guò)去除冷沉淀、DEAE Sephadex-A50凝膠吸附、雜質(zhì)蛋白沉淀及深層過(guò) 濾等澄清處理后，僅需一步Capto化parin凝膠肝素親和層析，即可實(shí)現(xiàn)洗脫液中抗凝血酶 III比活達(dá)到8~lOIU/mg，純度接近100%。
[0016] (4乂apto Q凝膠用于去除抗凝血酶III中間品中的S/D試劑。該凝膠載量大，處理 方便，操作簡(jiǎn)單，且單步回收率達(dá)95% W上，不影響中間品的純度和比活。
[0017] (5)經(jīng)過(guò)該工藝制備的抗凝血酶III成品，總回收率可達(dá)40% W上，比活可達(dá) 8~lOIU/mg，純度接近100%。
[0018] (6)工藝過(guò)程中加入S/D試劑、納米膜過(guò)濾和干熱S種不同機(jī)制的病毒滅活/去除 步驟，可W充分滅活/去除制品中可能出現(xiàn)的脂包膜和非脂包膜病毒，確保了制品的安全 性。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 為了更好地理解本發(fā)明，下面用具體實(shí)例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，但是本 發(fā)明并不局限于此。
[0020] 實(shí)施例1 1新鮮冰凍人血漿離屯、去除冷沉淀，DEAE Se地adex-A50凝膠吸附； 1. 1血漿去除冷沉淀 新鮮冰凍血漿經(jīng)過(guò)投料、融漿、離屯、分離冷沉淀，收集離屯、后的血漿。過(guò)程中血漿溫度 不超過(guò)4°C，離屯、機(jī)出液速度不超過(guò)化/min。
[0021] 1. 2 血漿 DEAE Se地adex-A50 凝膠吸附 去除冷沉淀的血漿采用1 ym的濾巧過(guò)濾。調(diào)節(jié)血漿抑至7. 00 ;加入平衡好的A-50凝 膠攬拌吸附45min，吸附溫度4°C ;濾除凝膠。平衡液；0.0 lmol/L構(gòu)檢酸鋼，0. 20mol/L氯 化鋼，pH 7. 00,4°C。
[0022] 加入1倍凝膠體積的洗漆液，攬拌洗漆2次，將洗漆液采用1 ym微孔濾巧過(guò)濾后， 與濾除凝膠后的血漿上清合并，得到處理后的血漿上清。洗漆液；〇.〇lmol/L構(gòu)檢酸鋼， 0. 20mol/L 氯化鋼，pH 7. 00,4