專利名稱：：一種集胞藻pcc6803表達(dá)外源基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種藍(lán)細(xì)菌集胞藻PCC6803高效表達(dá)外源基因的方法。
背景技術(shù)：
：藍(lán)細(xì)菌，又稱藍(lán)藻，是一種可以進(jìn)行光合作用的原核微生物，可以直接利用太陽(yáng)能、二氧化碳和水進(jìn)行生長(zhǎng)，具有生長(zhǎng)速度快、光合作用效率高等優(yōu)點(diǎn)。因此，藍(lán)細(xì)菌作為一種基因工程的模式宿主微生物，在生物能源和生物制藥領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。藍(lán)細(xì)菌具有特殊的遺傳操作背景，國(guó)內(nèi)外許多科研團(tuán)隊(duì)對(duì)藍(lán)細(xì)菌的外源基因表達(dá)進(jìn)行了研究，但是和傳統(tǒng)的基因工程宿主大腸桿菌相比，藍(lán)細(xì)菌對(duì)外源基因的表達(dá)效率仍然非常低。如何使目的基因在藍(lán)藻中得到高效表達(dá)仍然是一個(gè)難題。因此，開發(fā)在藍(lán)細(xì)菌中高效表達(dá)外源基因的平臺(tái)技術(shù)非常重要。藍(lán)細(xì)菌中的基因表達(dá)平臺(tái)是指一種表達(dá)載體，按照載體在藍(lán)細(xì)菌體內(nèi)的存在形式，又分為穿梭質(zhì)粒載體和基因組整合質(zhì)粒載體兩種。兩種類型的表達(dá)載體都可以主要借助于自然轉(zhuǎn)化(主要是單細(xì)胞藍(lán)藻)或者接合轉(zhuǎn)移的方法將目的基因?qū)胨{(lán)細(xì)菌體內(nèi)。穿梭質(zhì)粒載體可以通過接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入藍(lán)細(xì)菌，在細(xì)胞質(zhì)中自主復(fù)制?；蚪M整合載體可以將目的基因乃至整個(gè)操縱子通過同源整合的方式整合到藍(lán)藻基因組中，它的優(yōu)點(diǎn)是表達(dá)穩(wěn)定，可以克服自主復(fù)制質(zhì)粒不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。啟動(dòng)子的選擇對(duì)于基因表達(dá)至關(guān)重要。rbc(ribul0Se-l，5-bisphosphatecarboxylase/oxygenasegene)啟云力子細(xì)lifi本內(nèi)的強(qiáng)啟云力子，^zfe物1，5-二磷酸核酮糖縮化酶/氧化酶(RuBisCO)是藍(lán)細(xì)菌體內(nèi)主要的可溶性蛋白，在光合作用中起重要作用。rbc啟動(dòng)子具備在藍(lán)細(xì)菌體內(nèi)高效表達(dá)基因的能力，被成功應(yīng)用在多種藍(lán)細(xì)菌菌株中表達(dá)基因，其中包括聚球藻6301(SynechococcusPCC6301)，魚腥藻7120(Anabaenasp.strainPCC7120)，聚球藻7002(SynechococcusPCC7002)，聚球藻7942(Synechococcussp.strainPCC7942)等。集胞藻6803(SynechocystisPCC680;3)是藍(lán)細(xì)菌中的模式菌株，其基因組序列已經(jīng)于1996年被測(cè)定，并且遺傳操作方法相對(duì)成熟，適合作為一株模式藻株進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究。集胞藻6803是單細(xì)胞藍(lán)藻，可以利用自然轉(zhuǎn)化接受外源DNA，也可通過接合轉(zhuǎn)移的方法進(jìn)行遺傳操作。在集胞藻6803(SynechocystisPCC6803)中，DoronAmichay和RuthLevitz等的研究中提到rbc啟動(dòng)子并且推斷出了集胞藻6803中rbc啟動(dòng)子的具體信息，rbc操縱子中包括啟動(dòng)子元件和rbcL、rbcX和rbcS基因，整個(gè)操縱子在rbcL基因上游250bp處開始，并且推斷在rbcS終止密碼子下游有一段40bp反向互補(bǔ)序列為終止序列，Amichay等通過測(cè)序和分析認(rèn)為在rbcL上游-15-10區(qū)有類似SD序列，并且在翻譯起始密碼子上游60bp處發(fā)現(xiàn)兩處類似-10區(qū)和-35區(qū)的序列[參見(ConstructionofaSynechocystisPCC6803mutantsuitableforthestudyofvarianthexadecamericribulosebisphosphatecarboxylase/oxygenaseenzymes,DoronAmichay,RuthLevitzandMichaelGurevitz,PlantMolecularBiology23:465-476,1993.)]。日本的YasunobuTakeshima等人在聚球藻6301(也稱做巢狀倒囊藍(lán)細(xì)菌Anacystisnidulans6301)中利用本身rbc啟動(dòng)子表達(dá)人類超氧化物歧化酶基因hSOD，最終在突變?cè)逯曛腥祟惓趸锲缁傅暮窟_(dá)到可溶性蛋白總量的3%。在該實(shí)驗(yàn)中，啟動(dòng)子長(zhǎng)度為rbc基因上游343bp的序列，并在hSOD基因下游添加了294bp的rbc終止序列。YasunobuTakeshima等人同時(shí)研究了聚球藻6301rbc啟動(dòng)子元件中SD序列和ATG之間的距離對(duì)基因的表達(dá)效率的影響，證明通過改變SD序列以及其與ATG之間的距離都會(huì)使表達(dá)產(chǎn)物hSOD的酶活性發(fā)生變動(dòng)。其成果發(fā)表在美國(guó)科學(xué)院院刊上(High-levelexpressionofhumansuperoxidedismutaseinthecyanobacteriumAnacystisnidulans6301，YASUNOBUTAKESHIMA*,NOBORUTAKATSU⑶*，Proc.Nadl.Acad.Sci.USA,Vol.91，pp.9685-9689，1994)。加拿大多倫多大學(xué)的Ming-deDeng和JohnR.Coleman在聚球藻7942(Synechococcussp.strainPCC7942)中利用自身的rbc啟動(dòng)子表達(dá)pdc和adh兩個(gè)基因產(chǎn)生乙醇。其采用的啟動(dòng)子長(zhǎng)度在361bp，在目的基因pdc的下游同樣添加了pdc自身27bp的終止序列。并且在他們的研究中，應(yīng)用了一種翻譯融合策略，該策略可以使得ATG和SD序列之間的距離保持不變，使得pdc基因的表達(dá)量提高了近2倍[(EthanolSynthesisbyGeneticEngineeringinCyanobacteria,MING-DEDENGANDJOHNR.COLEMAN,APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY,p.523-528，Vol.65，No.2，1999)]。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種集胞藻PCC6803表達(dá)外源基因的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的集胞藻PCC6803表達(dá)外源基因的方法，主要過程包括1)分別將集胞藻6803的rbcL啟動(dòng)子(Prbc，1.3kb)和終止序列rbcterminator(Trbc,0.2kb)，2kb的壯觀霉素抗性標(biāo)記基因Ω，以及報(bào)告基因IacZ構(gòu)建于一個(gè)集胞藻6803基因組整合質(zhì)粒平臺(tái)，得到已經(jīng)包含報(bào)告基因的用于集胞藻6803表達(dá)外源基因并可以基因組整合的平臺(tái)質(zhì)粒PFQ20；2)PFQ20轉(zhuǎn)化集胞藻6803藻株，經(jīng)壯觀霉素抗性篩選得到轉(zhuǎn)化子，用特異引物PCR鑒定基因型后，測(cè)定轉(zhuǎn)化了表達(dá)平臺(tái)和外源基因的基因工程集胞藻6803藻株的β-半乳糖苷酶酶活，以驗(yàn)證集胞藻6803外源基因表達(dá)平臺(tái)的表達(dá)效率。所述的方法中，集胞藻6803的rbcL啟動(dòng)子(Prbc，1.3kb)和終止序列rbcterminator(Trbc，0.2kb)，2kb的壯觀霉素抗性標(biāo)記基因Ω，以及報(bào)告基因IacZ是通過克隆獲得。所述的方法中，集胞藻6803基因組整合質(zhì)粒平臺(tái)是利用EcoRI酶切pKWl188，去除C.K2片段后自連，得到pKW1188SL。本發(fā)明建立了一種運(yùn)用集胞藻6803自身rbc強(qiáng)啟動(dòng)子、SD序列、rbc終止子的外源基因高效表達(dá)方法。通過參考不同藻株來源的啟動(dòng)子的克隆實(shí)驗(yàn)，比對(duì)其他藻種中rbcL強(qiáng)啟動(dòng)子元件序列，最終克隆該基因上游1300bp作為啟動(dòng)子，克隆rbcS終止密碼子TAA下游200bp作為終止序列，并且保證了SD序列以及SD序列和ATG之間的距離與野生型相同。本發(fā)明中同時(shí)提供了一種在單細(xì)胞藍(lán)細(xì)菌集胞藻6803中高效表達(dá)外源基因平臺(tái)的基因組整合載體。本發(fā)明的構(gòu)建策略，不僅適用于rbc啟動(dòng)子，同樣適用于其他類型的啟動(dòng)子，完成對(duì)目的基因在藍(lán)細(xì)菌中的高效表達(dá)。本發(fā)明的構(gòu)建策略，不僅可以用來表達(dá)IacZ基因，同樣可以表達(dá)其他外源基因。本發(fā)明中提出的構(gòu)建策略，不僅可以應(yīng)用于集胞藻，同樣適用于其他類型的藍(lán)藻。本發(fā)明中構(gòu)建的基因表達(dá)元件，可以應(yīng)用于其他任何類型的藍(lán)藻表達(dá)載體，包括其他穿梭表達(dá)載體和其他基因組整合載體。本發(fā)明通過IacZ基因作為報(bào)告基因檢測(cè)了外源基因的表達(dá)效率。圖1為質(zhì)粒pFQl的基本結(jié)構(gòu)，Prbc(0.3kb)克隆于pMD18T載體，基因片段兩端帶有SalI和XbaI位點(diǎn)；圖2為質(zhì)粒pFQ2的基本結(jié)構(gòu)，Trbc克隆于pMD18T載體，基因片段兩端帶有SmaI禾口SacI位點(diǎn)；圖3為質(zhì)粒pQL4的基本結(jié)構(gòu)，壯觀抗性基因Ω克隆于pMD18T載體，基因兩端含有SphI和MlI酶切位點(diǎn)；圖4為質(zhì)粒pFQ6的基本結(jié)構(gòu)，Prbc和1Trbc串聯(lián)克隆于pMD18T載體，基因片段兩端帶有Mil和Mel位點(diǎn)；圖5為質(zhì)粒pKW1188SL的基本結(jié)構(gòu)，內(nèi)含slr0168Nterminal禾Πslr0168Cterminal，是slr0168基因的N端和C端，兩者之間酶切位點(diǎn)是EcoRI；圖6為質(zhì)粒pFQ15的基本結(jié)構(gòu)，包含插入位點(diǎn)EcoRI，該質(zhì)粒中的SmaI位點(diǎn)已經(jīng)去除；圖7為質(zhì)粒pFQ9R)rward的基本結(jié)構(gòu)，Ω、Prbc和Trbc串聯(lián)克隆于pFQ15載體，XbaI和SmaI位點(diǎn)為外源基因插入位點(diǎn)；圖8為質(zhì)粒pQL12的基本結(jié)構(gòu)，IacZ基因克隆于pMD18T載體，基因兩端為)(bal和SmaI位點(diǎn)；圖9為質(zhì)粒pFQ19的基本結(jié)構(gòu)，IacZ基因克隆于載體pFQ9R)rward，基因兩端為XbaI禾口SmaI位點(diǎn)；圖10為質(zhì)粒pFQ20的基本結(jié)構(gòu)，Prbc(l.3kb)替換載體pFQ19內(nèi)的Prbc(0.3kb)，兩端帶有Mil和)(bal酶切位點(diǎn)；圖11為質(zhì)粒pLY2的基本結(jié)構(gòu)，壯觀抗性基因Ω片段克隆于pKW1188SL質(zhì)粒；圖12為質(zhì)粒pHB1567的基本結(jié)構(gòu)，Ω片段、PpetE和IacZ基因反向插入到克隆于PKW1188SL質(zhì)粒。具體實(shí)施例方式本發(fā)明的目的是通過如下措施來達(dá)到1)分別將克隆所獲得的集胞藻6803的rbcL啟動(dòng)子(Prbc，1.3kb)和終止序列rbcterminator(Trbc，0.2kb)，2kb的壯觀霉素抗性標(biāo)記基因Ω，以及報(bào)告基因lacZ，構(gòu)建于一個(gè)集胞藻6803基因組整合質(zhì)粒平臺(tái)(利用EcoRI酶切pKW1188，去除C.K2片段后自連，得到PKW1188SL)，得到已經(jīng)包含報(bào)告基因的用于集胞藻6803表達(dá)外源基因并可以基因組整合的平臺(tái)質(zhì)粒PFQ20。2)pFQ20轉(zhuǎn)化集胞藻6803藻株，經(jīng)壯觀霉素抗性篩選得到轉(zhuǎn)化子，用特異引物PCR鑒定基因型無誤后，測(cè)定轉(zhuǎn)化了高效表達(dá)平臺(tái)和外源基因的基因工程集胞藻6803藻株的β-半乳糖苷酶酶活，進(jìn)而驗(yàn)證了本發(fā)明所構(gòu)建的集胞藻6803外源基因表達(dá)平臺(tái)的表達(dá)效率。下面以具體實(shí)例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。實(shí)施例1分別將IacZ基因、Prbc、Trbc克隆于pMD18T載體上1)從集胞藻6803中PCR克隆I^rbc和Trbc片段；質(zhì)粒pFQl是I^rbc連接到到PMD18T載體而得到的；質(zhì)粒pFQ2是Trbc連接到到pMD18T載體而得到的。從大腸桿菌E.coli(BL21DE3)的克隆IacZ基因(3.Ikb)，插入到pUC19質(zhì)粒中。得到質(zhì)粒pQL12。2)所有的質(zhì)粒都經(jīng)測(cè)序鑒定目的片段的核苷酸序列無誤。實(shí)施例2將壯觀抗性基因Ω、和Prbc、Trbc分別串聯(lián)克隆于同一個(gè)pMD18T載體上l)pQL4是含有壯觀抗性基因Ω的以pMD18T為來源構(gòu)建的載體。以)(baI和Mil酶切質(zhì)粒PQL4，回收線性片段PQL4EH；同樣以)(baI和MlI酶切質(zhì)粒pFQl，回收線性DNA片段；將pQL4EH片段和片段用T4連接酶相連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用壯觀霉素和氨芐霉素雙抗篩選轉(zhuǎn)化子，再通過提質(zhì)粒酶切篩選鑒定無誤后，即得到質(zhì)粒PFQ5；2)同樣方法，以SmaI-McI酶切pFQ2，膠回收200bp的Trbc片段；同時(shí)以SmaI-SacI酶切pFQ5，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后得到雙酶切片段pFQ5EH；利用T4連接酶將Trbc插入到pFQ5的下游，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用壯觀霉素和氨芐霉素雙抗篩選轉(zhuǎn)化子，再通過提質(zhì)粒酶切篩選鑒定無誤后，即得到質(zhì)粒PFQ6；pFQ6中包含了Ω、和ft~bC、TrbC片段；實(shí)施例3將壯觀抗性基因Ω、和Prbc、Trbc和IacZ基因串聯(lián)到藍(lán)藻表達(dá)載體上1)表達(dá)載體的構(gòu)建和處理過程PKW1188是一個(gè)用于集胞藻6803基因組整合的質(zhì)粒平臺(tái)。利用EcoRI酶切pKW1188，去除CK2片段后自連，得到pKW1188SL。pKW1188SL去除SmaI位點(diǎn)后得到質(zhì)粒pFQ15。2)目的基因的處理用HindIIHacI酶切pFQ6膠回收獲得Ω、和Prbc、Trbc片段，利用T4聚合酶37°C補(bǔ)平30min，得到補(bǔ)平后的片段用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化；表達(dá)載體PFQ15用EcoRI切開后用同樣方法補(bǔ)平并且純化；補(bǔ)平后的Ω、和Prbc、Trbc片段和補(bǔ)平后的PFQ15片段用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到的轉(zhuǎn)化子利用特異引物PCR鑒定串聯(lián)片段的插入方向，篩選到目的片段正向插入的克隆，最后提取質(zhì)粒酶切鑒定無誤后命名為pFQ9Forward。3)將用XbaI和SmaI酶切pQL12，膠回收IacZ基因片段，插入到pFQ9R)rward中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得轉(zhuǎn)化子用特異引物PCR鑒定IacZ片段，最后提取質(zhì)粒酶切鑒定無誤后命名為PFQ19。PCR擴(kuò)增1.3kb的Prbc，利用相同位點(diǎn)SalI和XbaI^f0.3kb的Prbc替換掉，得到PFQ20。實(shí)施例4:表達(dá)載體向集胞藻6803的轉(zhuǎn)化、基因型鑒定以及檢測(cè)基因表達(dá)產(chǎn)物半乳糖苷酶的活性。1)將pFQ20利用自然轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化集胞藻6803野生型細(xì)胞。大約1周后轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出，將轉(zhuǎn)化子在具有壯觀霉素的BGll液體中擴(kuò)大培養(yǎng)1周后收獲藻液，提取基因組。利用特異引物PCR鑒定轉(zhuǎn)化子中是否含有目的基因lacZ。鑒定無誤后的突變?cè)逯昝麨镾ynechocystisPCC6803(FQ20)。2)待SynechocystisPCC6803(FQ20)在液體中培養(yǎng)至生長(zhǎng)期后，收獲藻液并測(cè)定β半乳糖苷酶活性。以SynechocystisPCC6803野生型作為陰性對(duì)照1，以SynechocystisPCC6803(LY2)作為陰性對(duì)照2，以SynechocystisPCC6803(QL15)作為陰性對(duì)照2。以被報(bào)道有半乳糖苷酶表達(dá)活性的一株藻株SynechocystisPCC6803(HB1567)作為陽(yáng)性對(duì)照。其中SynechocystisPCC6803(LY》系基因組整合有抗性基因Ω的藻株。3)結(jié)果表明，本發(fā)明所構(gòu)建的基因工程集胞藻6803FQ20的半乳糖苷酶活性，在相同條件下，超過已報(bào)道陽(yáng)性對(duì)照，而所有陰性對(duì)照都未能檢測(cè)到活性。生物材料樣品保藏信息本發(fā)明涉及的生物材料樣品為所構(gòu)建的1個(gè)質(zhì)粒(pFQ20；圖10)和對(duì)應(yīng)的1株大腸桿菌菌株(EscherichiacoliDH5α)FQ20及1株集胞藻(SynechocystisPCC6803)FQ20；以上菌株和藻株均保藏在中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。保藏編號(hào)(以下格式為“CGMCC編號(hào)菌株號(hào)宿主菌拉丁文(質(zhì)粒號(hào))”)3458FQ20EscherichiacoliDH5α(pFQ20)3462FQ20SynechocystisPCC6803(pFQ20)權(quán)利要求1.一種集胞藻PCC6803表達(dá)外源基因的方法，主要過程包括1)分別將集胞藻6803的rbcL啟動(dòng)子(Prbc，1.3kb)和終止序列rbcterminator(Trbc，0.2kb)，2kb的壯觀霉素抗性標(biāo)記基因Ω，以及報(bào)告基因IacZ構(gòu)建于一個(gè)集胞藻6803基因組整合質(zhì)粒平臺(tái)，得到已經(jīng)包含報(bào)告基因的用于集胞藻6803表達(dá)外源基因并可以基因組整合的平臺(tái)質(zhì)粒PFQ20；2)pFQ20轉(zhuǎn)化集胞藻6803藻株，經(jīng)壯觀霉素抗性篩選得到轉(zhuǎn)化子，用特異引物PCR鑒定基因型后，測(cè)定轉(zhuǎn)化了表達(dá)平臺(tái)和外源基因的基因工程集胞藻6803藻株的β-半乳糖苷酶酶活，以驗(yàn)證集胞藻6803外源基因表達(dá)平臺(tái)的表達(dá)效率。2.2、如權(quán)利要求1所述的方法，其中，集胞藻6803的rbcL啟動(dòng)子O^rbc，1.31Λ)和終止序列rbcterminator(Trbc，0.2kb)，2kb的壯觀霉素抗性標(biāo)記基因Ω，以及報(bào)告基因IacZ是通過克隆獲得。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，集胞藻6803基因組整合質(zhì)粒平臺(tái)是利用EcoRI酶切pKW1188，去除C.Κ2片段后自連，得至IJpKW1188SL。全文摘要一種集胞藻PCC6803表達(dá)外源基因的方法，包括1)分別將集胞藻6803的rbcL啟動(dòng)子(Prbc，1.3kb)和終止序列rbcterminator(Trbc，0.2kb)，2kb的壯觀霉素抗性標(biāo)記基因Ω，以及報(bào)告基因lacZ構(gòu)建于一個(gè)集胞藻6803基因組整合質(zhì)粒平臺(tái)，得到已經(jīng)包含報(bào)告基因的用于集胞藻6803表達(dá)外源基因并可以基因組整合的平臺(tái)質(zhì)粒pFQ20；2)pFQ20轉(zhuǎn)化集胞藻6803藻株，經(jīng)壯觀霉素抗性篩選得到轉(zhuǎn)化子，用特異引物PCR鑒定基因型后，測(cè)定轉(zhuǎn)化了表達(dá)平臺(tái)和外源基因的基因工程集胞藻6803藻株的β-半乳糖苷酶酶活，以驗(yàn)證集胞藻6803外源基因表達(dá)平臺(tái)的表達(dá)效率。文檔編號(hào)C12R1/89GK102127563SQ20101003440公開日2011年7月20日申請(qǐng)日期2010年1月15日優(yōu)先權(quán)日2010年1月15日發(fā)明者呂雪峰,羅全,談曉明,齊鳳霞申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過程研究所