次級(jí)t細(xì)胞依賴抗體反應(yīng)檢測(cè)外源性化合物免疫抑制方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種次級(jí)T細(xì)胞依賴抗體反應(yīng)檢測(cè)外源性化合物免疫抑制的方法，包括以下步驟：(1)將動(dòng)物注射T細(xì)胞依賴性抗原；(2)在步驟(1)所述的注射后第15～25天再次注射相同的T細(xì)胞依賴性抗原激發(fā)次級(jí)免疫應(yīng)答，同時(shí)開始連續(xù)2～5天經(jīng)口給予外源性化合物；(3)步驟(2)完成6～10天后，采集外周血，分離血清，檢測(cè)步驟(1)所述的抗原的特異性抗體。該方法免疫應(yīng)答時(shí)間更短，應(yīng)答程度更強(qiáng)，所需的外源性化合物用量更少，并且可以應(yīng)用于早期藥物篩選。
【專利說明】次級(jí)T細(xì)胞依賴抗體反應(yīng)檢測(cè)外源性化合物免疫抑制方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種次級(jí)Τ細(xì)胞依賴抗體反應(yīng)檢測(cè)外源性化 合物免疫抑制的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 免疫毒性是外源物質(zhì)使免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)或功能出現(xiàn)任何持久或可逆改變的毒性反 應(yīng)。免疫毒性作用主要分為5種：免疫抑制、免疫增強(qiáng)、超敏反應(yīng)、自身免疫、免疫原性。其 中免疫抑制最為常見，在免疫毒性中研究較多。
[0003] Τ 細(xì)胞依賴性抗體反應(yīng)（T cell-dependent antibody response, TDAR)是目前用 于檢測(cè)外源性化合物免疫抑制的金標(biāo)準(zhǔn)。TDAR是動(dòng)物在給予外源性化合物時(shí)，同時(shí)采用T 細(xì)胞依賴性抗原攻擊，繼續(xù)給予外源性化合物一定時(shí)間后，采集血清檢測(cè)針對(duì)該抗原的特 異性抗體含量，從而判斷動(dòng)物的免疫系統(tǒng)是否受到抑制。隨著TDAR應(yīng)用的推廣，TDAR的缺 陷也逐漸暴露出來，如部分動(dòng)物對(duì)特定T細(xì)胞依賴性抗原不敏感，個(gè)體差異較大，實(shí)驗(yàn)周期 較長(zhǎng)，受試外源性化合物用量較大而難以用于早期藥物篩選。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的以技術(shù)問題是克服現(xiàn)有TDAR技術(shù)對(duì)特定T細(xì)胞依賴性抗原不敏 感，實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，受試外源性化合物用量較大而難以用于早期藥物篩選的缺陷，提供一種 次級(jí)T細(xì)胞依賴抗體反應(yīng)檢測(cè)外源性化合物免疫抑制的方法。本發(fā)明所述的方法，免疫應(yīng) 答時(shí)間更短、強(qiáng)度更大，所需外源性化合物用量更少，更為迅速、靈敏，同時(shí)能夠考察對(duì)免疫 記憶系統(tǒng)的影響，并且可以應(yīng)用于早期藥物篩選。
[0005] 本發(fā)明采用以下技術(shù)方案來解決上述技術(shù)問題：
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0007] -種次級(jí)T細(xì)胞依賴抗體反應(yīng)檢測(cè)外源性化合物免疫抑制的方法，包括以下步 驟：
[0008] (1)將動(dòng)物注射τ細(xì)胞依賴性抗原；
[0009] (2)在步驟（1)所述的注射后第15?25天再次注射相同的T細(xì)胞依賴性抗原激 發(fā)次級(jí)免疫應(yīng)答，同時(shí)開始連續(xù)2?5天給外源性化合物；
[0010] ⑶步驟（2)完成后第6?10天，采集外周血，分離血清，檢測(cè)步驟（1)所述的T 細(xì)胞依賴性抗原的特異性抗體。
[0011] 本發(fā)明所述的步驟（2)中，較佳的，所述的再次注射相同的T細(xì)胞依賴性抗原的時(shí) 間為在步驟（1)所述的注射后第20天。
[0012] 本發(fā)明所述的步驟（2)中，較佳的，所述的連續(xù)經(jīng)口給予外源性化合物的時(shí)間是3 天。
[0013] 本發(fā)明所述的步驟（3)中，較佳的，所述的采集外周血的時(shí)間為步驟（2)完成后第 8天。
[0014] 本發(fā)明所述的步驟（1)中，所述的T細(xì)胞依賴性抗原為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳的是鑰孔 戚血藍(lán)素（KLH);本發(fā)明所述的步驟（3)中，所述的特異性抗體為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳的是抗 鑰孔戚血藍(lán)素 IgG抗體（anti-KLH IgG抗體）。較佳的，本發(fā)明步驟（1)所述的Τ細(xì)胞依賴 性抗原的用量與步驟（2)所述的T細(xì)胞依賴性抗原的用量相等。
[0015] 本發(fā)明步驟（1)所述的T細(xì)胞依賴性抗原的用量為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳的是200? 400 μ g/kg，更佳的是 300 μ g/kg。
[0016] 本發(fā)明所述的外源性化合物為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳的是環(huán)孢素或環(huán)磷酰胺。較佳的， 本發(fā)明步驟（2)所述的外源性化合物為環(huán)孢素，所述的外源性化合物的用量為7. 5?30mg/ Kg。
[0017] 較佳的，本發(fā)明步驟（2)所述的外源性化合物為環(huán)磷酰胺，所述的外源性化合物 濃度為5?20mg/Kg。
[0018] 本發(fā)明所述的動(dòng)物為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳的是大鼠。
[0019] 本發(fā)明所述的注射為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳的是靜脈注射。
[0020] 本發(fā)明步驟（3)所述的檢測(cè)步驟（1)所述的抗原的特異性抗體的方法為本領(lǐng)域常 規(guī)，較佳的是采集外周血，分離血清，檢測(cè)針對(duì)該抗原的特異性抗體；更佳的是采集外周血， 分離血清，檢測(cè)針對(duì)該抗原的特異性抗體、計(jì)數(shù)外周血白細(xì)胞和解剖取臟器做組織病理學(xué) 檢查。
[0021] 本發(fā)明所述的采集外周血檢測(cè)針對(duì)該抗原的特異性抗體，具體的操作步驟是：尾 靜脈采血,離心分離血清，在96孔板上包被KLH，ELISA方法檢測(cè)血清中anti-KLH IgG抗體 的滴度或濃度。
[0022] 在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí) 例。
[0023] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0024] 本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：本發(fā)明在給予T細(xì)胞依賴性抗原后，經(jīng)過一定時(shí)間， 再給予外源性化合物以及T細(xì)胞依賴性抗原，造成次級(jí)免疫應(yīng)答，采集血清檢測(cè)針對(duì)該抗 原的特異性抗體含量，以評(píng)價(jià)動(dòng)物免疫系統(tǒng)的抑制情況。本發(fā)明所述的方法為次級(jí)TDAR，免 疫應(yīng)答時(shí)間更短，應(yīng)答程度更強(qiáng)，所需的外源性化合物用量更少，個(gè)體間差異較小，同時(shí)考 察了對(duì)免疫記憶系統(tǒng)的影響。并且可以應(yīng)用于早期藥物篩選。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1為次級(jí)TDAR檢測(cè)不同濃度的環(huán)孢素對(duì)SD大鼠免疫抑制影響。
[0026] 圖2為次級(jí)TDAR檢測(cè)不同濃度的環(huán)磷酰胺對(duì)SD大鼠免疫抑制影響。
[0027] 圖3為初級(jí)TDAR檢測(cè)不同濃度的環(huán)孢素對(duì)SD大鼠免疫抑制影響。
[0028] 圖4為正常SD雌性大鼠胸腺的病理組織學(xué)檢查圖。
[0029] 圖5為初次免疫應(yīng)答30mg/kg環(huán)孢素的SD雌性大鼠胸腺的病理組織學(xué)檢查圖。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí) 施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商 品說明書選擇。
[0031] 實(shí)施例1
[0032] 實(shí)驗(yàn)方法：選取生長(zhǎng)情況良好，大小一致的SD雌性大鼠20只，尾靜脈注射 300 μ g/kg的KLH ;在第一次注射KLH第21天后，再次靜脈注射300 μ g/kg的KLH進(jìn)行激發(fā) 次級(jí)免疫應(yīng)答，將被實(shí)驗(yàn)的大鼠平均分為4組：
[0033] 在第二次注射KLH的同時(shí)，分別經(jīng)口給予去離子水、7. 5、15、30mg/kg的環(huán)孢素1 次；采集外周血，分離血清，采用ELISA方法檢測(cè)anti-KLH IgG、外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)，末次經(jīng) 口給予去離子水及不同濃度的環(huán)孢素后第10天解剖取臟器做組織病理學(xué)檢查。
[0034] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示次級(jí)免疫15、30mg/kg環(huán)孢素組出現(xiàn)免疫功能 抑制如表1所示；
[0035] 不同用量的環(huán)孢素對(duì)anti-KLH的次級(jí)TDAR免疫抑制影響如圖1所示，其中：橫坐 標(biāo)為采血時(shí)間，縱坐標(biāo)為各時(shí)間點(diǎn)anti-KLH IgG滴度相對(duì)于D21 (第二次注射KLH和經(jīng)口 給予環(huán)孢素的前一天，作為基礎(chǔ)水平）變化值的對(duì)數(shù)。
[0036] 實(shí)施例2
[0037] 實(shí)驗(yàn)方法：選取生長(zhǎng)情況良好，大小一致的SD雌性大鼠15只，尾靜脈注射 300 μ g/kg的KLH ;在第一次注射KLH第21天后，再次靜脈注射300 μ g/kg的KLH進(jìn)行激發(fā) 次級(jí)免疫應(yīng)答，將被實(shí)驗(yàn)的大鼠平均分為3組：
[0038] 在第二次注射KLH的同時(shí)，分別經(jīng)口給予去離子水、5、20mg/kg的環(huán)磷酰胺1次； 采集外周血，分離血清，采用ELISA方法檢測(cè)anti-KLH IgG、外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)，末次經(jīng)口 給予去離子水及不同濃度的環(huán)磷酰胺后第10天解剖取臟器做組織病理學(xué)檢查。
[0039] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示次級(jí)免疫20mg/kg環(huán)磷酰胺疫功能抑制如表1 所示；可以看出，給藥3天后僅20mg/kg環(huán)磷酰胺組白細(xì)胞明顯降低，其余各組均無白細(xì)胞 計(jì)數(shù)變化和組織病理學(xué)改變。
[0040] 不同用量的環(huán)磷酰胺對(duì)anti-KLH的次級(jí)TDAR免疫抑制影響如圖2所示，其中：橫 坐標(biāo)為采血時(shí)間，縱坐標(biāo)為各時(shí)間點(diǎn)anti-KLH IgG滴度相對(duì)于D21 (第二次注射KLH和經(jīng) 口給予環(huán)磷酰胺的前一天，作為基礎(chǔ)水平）變化值的對(duì)數(shù)。
[0041] 表1次級(jí)免疫應(yīng)答白細(xì)胞計(jì)數(shù)
[0042]

【權(quán)利要求】
1. 一種次級(jí)T細(xì)胞依賴抗體反應(yīng)檢測(cè)外源性化合物免疫抑制的方法，包括以下步驟： (1) 將動(dòng)物注射Τ細(xì)胞依賴性抗原； (2) 在步驟（1)所述的注射后第15?25天再次注射相同的Τ細(xì)胞依賴性抗原激發(fā)次 級(jí)免疫應(yīng)答，同時(shí)開始連續(xù)2?5天經(jīng)口給予外源性化合物； ⑶步驟⑵完成后第6?10天，采集外周血，分離血清，檢測(cè)步驟⑴所述的Τ細(xì)胞 依賴性抗原的特異性抗體。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2)所述的再次注射相同的Τ細(xì)胞依賴 性抗原的時(shí)間為在步驟（1)所述的注射后第20天。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2)所述的連續(xù)經(jīng)口給予外源性化合物 的時(shí)間是3天。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（3)所述的采集外周血的時(shí)間為步驟 (2)完成后第8天。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟⑴所述的Τ細(xì)胞依賴性抗原為鑰孔戚 血藍(lán)素；步驟（3)所述的特異性抗體為抗鑰孔戚血藍(lán)素IgG抗體。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1)所述的T細(xì)胞依賴性抗原的用量是 200 ?400 μ g/kg，較佳的是 300 μ g/kg。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2)所述的外源性化合物為環(huán)孢素或環(huán) 磷酰胺。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的外源性化合物為環(huán)孢素，所述的外源 性化合物的用量為7. 5?30mg/Kg。
9. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的外源性化合物為環(huán)磷酰胺，所述的外 源性化合物的用量為5?20mg/Kg。
10. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的動(dòng)物為大鼠；所述的注射為靜脈注 射。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104090115SQ201410328523
【公開日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2014年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月10日
【發(fā)明者】馬璟, 洪敏 , 李華, 周國(guó)民, 程一帆, 林曼 申請(qǐng)人:上海益諾思生物技術(shù)有限公司