本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及綿羊單核苷酸多態(tài)性(SNP)分子標(biāo)記的篩選與檢測(cè)，特別涉及利用PCR-SSCP方法快速檢測(cè)NELF基因組第454位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性。具體來說，就是對(duì)PCR擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物變性之后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后根據(jù)電泳結(jié)果確定其單核苷酸多態(tài)性。

背景技術(shù)：

近20年來，尤其是近10年來，分子遺傳學(xué)和分子生物技術(shù)有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，其中，分子遺傳標(biāo)記是目前在家畜育種中研究得最多的內(nèi)容，也是近期內(nèi)最可能在家畜育種中得到廣泛應(yīng)用的研究項(xiàng)目。遺傳標(biāo)記是指那些可以準(zhǔn)確鑒別的、能反映個(gè)體特異性的遺傳特征。分子遺傳標(biāo)記則是指以個(gè)體遺傳物質(zhì)即核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的DNA分子標(biāo)記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接反映。利用分子標(biāo)記輔助選擇育種，是現(xiàn)代動(dòng)物分子育種的一項(xiàng)主要研究?jī)?nèi)容，其直接在DNA水平上對(duì)性狀的基因型進(jìn)行選擇，因此其選種的準(zhǔn)確性大大提高，克服了傳統(tǒng)動(dòng)物育種方法的缺陷。

單核苷酸多態(tài)性(SNP)是一種重要的分子遺傳標(biāo)記，它是由美國(guó)學(xué)者Lander于1996年提出的第三代DNA遺傳標(biāo)記，是基因組中單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括堿基的轉(zhuǎn)換、插入及缺失等形式。PCR-SSCP技術(shù)的基本原理是PCR擴(kuò)增后的DNA片段經(jīng)變性成單鏈DNA，單鏈DNA在中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)形成不同的立體構(gòu)象，其構(gòu)象直接影響泳動(dòng)速率，相同長(zhǎng)度的DNA單鏈其核苷酸順序僅有單個(gè)堿基的差別，就可以產(chǎn)生立體構(gòu)象的不同，造成泳動(dòng)速率的不同，產(chǎn)生不同的泳動(dòng)帶。因此，可以通過PCR-SSCP技術(shù)檢測(cè)基因組是否存在SNP位點(diǎn)，并且準(zhǔn)確的鑒別SNP位點(diǎn)的基因型。現(xiàn)在已經(jīng)公認(rèn)單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)可作為遺傳標(biāo)記應(yīng)用于育種中。該方法不僅具有DNA測(cè)序法的準(zhǔn)確性，又克服了費(fèi)用昂貴、繁瑣操作、假陽性的缺點(diǎn)，而且檢測(cè)序列位點(diǎn)無特殊要求。

鼻胚胎促黃體激素釋放激素因子(Nasal embryonic LHRH factor，NELF)編碼基因與動(dòng)物的生殖有密切關(guān)系。Samuel D.Quaynor等通過創(chuàng)建純合NELF敲除(KO)小鼠模型，證明雌性小鼠NELF基因敲除將推遲陰道口開放，并沒有延遲第一次發(fā)情的時(shí)間，減少了子宮重量并且減少了GnRH的神經(jīng)元數(shù)目。與此相反，雄性小鼠的青春期表現(xiàn)正常。NELF敲除導(dǎo)致雌雄小鼠都表現(xiàn)為生育能力受損，平均窩產(chǎn)仔數(shù)降低。此外，越來越多的報(bào)道表明，NELF在小鼠的生殖方面有重要作用。綿羊的NELF基因定位在第20號(hào)染色體上，全長(zhǎng)5928bp，編碼區(qū)全長(zhǎng)1112bp。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)NELF基因多態(tài)性的研究主要集中于小鼠等模式動(dòng)物，而對(duì)于家畜NELF基因單核苷酸多態(tài)性的研究尚未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種利用PCR-SSCP快速檢測(cè)綿羊NELF基因單核苷酸多態(tài)性的方法及其應(yīng)用，從而為綿羊的分子標(biāo)記輔助選擇育種提供基礎(chǔ)資料，加快中國(guó)綿羊的種質(zhì)資源改良工作。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

以包含NELF基因的待測(cè)綿羊全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增綿羊NELF基因片段；對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行變性，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；根據(jù)凝膠電泳結(jié)果判定綿羊NELF基因的單核苷酸多態(tài)性；

所述的引物對(duì)P為：

上游引物F：5’-TTGCCCCTTTCGTTGCTC-3’ 18nt；

下游引物R：5’-TTTCTCCACTGTCACCGCC-3’ 19nt。

所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，64℃退火50s，72℃延伸30s，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠凝膠電泳結(jié)果鑒定綿羊NELF基因accession number NC_019477.2：g.454位的T>C突變的多態(tài)性。

根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果鑒定綿羊NELF基因組第454位存在TT、TC、CC三種基因型。

所述的凝膠電泳為10-12％的聚丙烯酰胺凝膠電泳，先在4℃下，200-250V預(yù)電泳20-60min，再在室溫下，120-150V電泳3-4h。

本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：

針對(duì)綿羊NELF基因第454位T>C的突變，本發(fā)明提供了其檢測(cè)方法，通過設(shè)計(jì)特定的引物，PCR擴(kuò)增目的片段，然后變性成單鏈DNA，再進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。該方法能夠簡(jiǎn)單、快速、低成本、精確度高的鑒定基因的單核苷酸多態(tài)性。

本發(fā)明對(duì)突變位點(diǎn)的基因型進(jìn)行了檢測(cè)和基因頻率分析，并將該位點(diǎn)與綿羊的繁殖性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明該位點(diǎn)可作為分子遺傳標(biāo)記進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇育種，以提高綿羊繁殖性狀。

附圖說明

圖1為綿羊NELF基因組第454位(具有深色背景的位點(diǎn))TT基因型個(gè)體的測(cè)序圖。

圖2為綿羊NELF基因組第454位CC基因型個(gè)體的測(cè)序圖。

圖3為綿羊NELF基因組第454位TC基因型個(gè)體的測(cè)序圖。

圖4為綿羊NELF基因組第454位不同基因型PCR產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)的說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。

本發(fā)明根據(jù)綿羊NELF基因組序列設(shè)計(jì)引物，分別以2種綿羊品種的基因組DNA池為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物測(cè)序得到綿羊NELF基因的部分序列。與NCBI上公布的參考序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在綿羊NELF基因組第454位存在T>C的突變，該突變位點(diǎn)位于綿羊NELF基因內(nèi)含子內(nèi)，產(chǎn)生一個(gè)無意突變，并將其與繁殖性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，確定為與綿羊繁殖性狀相關(guān)的分子遺傳標(biāo)記，利用PCR-SSCP方法對(duì)該突變進(jìn)行檢測(cè)。

一、綿羊NELF基因部分序列的克隆及其多態(tài)性檢測(cè)

1.樣本采集及基因組DNA提取

⑴血樣的采集

本發(fā)明采用了2個(gè)綿羊品種，共計(jì)607個(gè)個(gè)體作為檢測(cè)對(duì)象，血液的采集方法為頸靜脈采血。血樣的采集地區(qū)，以及各品種的數(shù)據(jù)資料情況如表1所示：

表1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物情況

⑵血樣DNA的提取

①冷凍血樣(主要為血細(xì)胞)室溫解凍，吸取500μL血液于1.5mL離心管中，加入等體積的磷酸緩沖液(PBS)混勻，溫和搖動(dòng)，4℃，12000r/min離心5min，棄去上清液，重復(fù)上述步驟至上清液透明、沉淀呈透明色。

②在離心管中加入DNA抽提緩沖液500μL，輕輕吹打，使血細(xì)胞沉淀脫離離心管壁，37℃水浴1h。

③加蛋白酶K至3μL(20mg/mL)，并混勻，55℃水浴中消化過夜(16h左右)至絮狀沉淀不見，溶液澄清，尚未澄清的，可補(bǔ)加1μL蛋白酶K混勻繼續(xù)消化直至澄清。

④將反應(yīng)液冷卻至室溫，加入500μL Tris飽和酚，溫和搖動(dòng)15min，使其充分混勻，4℃，12000r/min離心10min，將上層水相轉(zhuǎn)入另一滅菌離心管，重復(fù)上述步驟1次。

⑤加入氯仿500mL，溫和搖動(dòng)20min，使其充分混勻，4℃，12000r/min離心15min，將上層水相轉(zhuǎn)入另一滅菌的1.5mL離心管。

⑥加入氯仿、異戊醇混合液(24:1)500mL，充分混合20min，4℃，12000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入另一1.5mL離心管中。

⑦加入0.1倍體積的NaAc緩沖液及2倍體積的冰冷的無水乙醇，混合轉(zhuǎn)動(dòng)離心管直至白色的絮狀沉淀析出。

⑧4℃，12000r/min離心10min，棄去上清液，用70％的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。

⑨4℃，12000r/min離心10min，棄上清液，室溫下使乙醇揮發(fā)干凈。

⑩干燥后的DNA溶液中加入80～100μL的超純水溶解，4℃保存直至DNA完全溶解，利用紫外分光光度儀檢測(cè)其質(zhì)量，-80℃保存。

2.DNA池的構(gòu)建

用紫外光光度計(jì)測(cè)定DNA樣品在260nm、280nm處的OD值。計(jì)算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值，DNA濃度(ng/μL)＝50×OD₂₆₀值×稀釋倍數(shù)。如果OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，說明樣品中含有較多的蛋白質(zhì)或酚，則應(yīng)進(jìn)行純化；如果比值大于1.8，則應(yīng)該考慮去除RNA純化。DNA檢測(cè)完畢后，取出一定的量稀釋至50ng/μL，然后從2個(gè)綿羊群體中隨機(jī)選擇10個(gè)濃度為50ng/μL DNA樣品中取5μL混合構(gòu)建DNA池。

二、擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)

1.綿羊NELF基因PCR引物的設(shè)計(jì)

以NCBI所公布的綿羊序列(NC_019477.2)為參考，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)能夠擴(kuò)增包含綿羊NELF基因第454位點(diǎn)的PCR引物，其引物序列如下：

上游引物F:5’-TTGCCCCTTTCGTTGCTC-3’ 18nt；

下游引物R:5’-TTTCTCCACTGTCACCGCC-3’ 19nt。

三、PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系如表2所示。

表2 PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，64℃退火50s，72℃延伸30s，34個(gè)循環(huán)；72℃后延伸10min。

四、PCR產(chǎn)物測(cè)序

將用以上混合的DNA池為模板擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送上海生工有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。對(duì)綿羊NELF基因目的片段測(cè)序結(jié)果與參考序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在基因組的第454位存在一個(gè)T>C的突變(參見圖1、圖2以及圖3)。

五、PCR產(chǎn)物變性及SSCP檢測(cè)

對(duì)于PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物首先變性，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)，最終根據(jù)不同的帶型結(jié)果判定其SNP多態(tài)性。具體步驟如下：

(1)根據(jù)不同的擴(kuò)增片段，選擇30％丙烯酰胺(29:1)配成10％～12％的聚丙烯酰胺凝膠(見表3)。

(2)加好上述溶液后，用玻璃棒慢慢攪動(dòng)，使其充分混勻。立即緩慢倒入已準(zhǔn)備好的底部密封的玻璃板之間，注意不要產(chǎn)生氣泡；倒好凝膠后，立即插上梳子，切勿在梳子齒下留有氣泡。

(3)待膠凝固后，拔掉梳子，輕輕的甩干點(diǎn)樣孔中的水分，然后將玻璃板固定到垂直電泳槽上，并往槽中倒入1×TBE緩沖液。

(4)取8μL PCR產(chǎn)物，加入8μL變性緩沖液(95％甲酰胺、10mol/L EDTA、0.05％溴酚蘭、0.05％二甲苯青)，瞬時(shí)離心后在PCR儀中98℃變性10min，取出后立即置于冰上，30min后即可上樣。

(5)4℃、先250V預(yù)電泳20min，然后120V電泳4h(根據(jù)擴(kuò)增片段大小、凝膠濃度以及玻璃板的長(zhǎng)度確定電壓大小和電泳時(shí)間)。

(6)將電泳槽中的1×TBE緩沖液倒出回收，然后從玻璃板中取出凝膠，用蒸餾水漂洗2次后，加入適量的0.1％的硝酸銀溶液，放于搖床避光輕輕搖15min(硝酸銀可回收利用2～3次)。

(7)加入顯色液(2％氫氧化鈉+0.1％甲醛)浸沒凝膠，邊搖邊觀察，直到凝膠上顯現(xiàn)電泳帶。

(8)待條帶清晰后，倒掉顯色液，迅速用去離子水清洗2～3次。銀染后的聚丙烯酰胺凝膠利用凝膠成像系統(tǒng)成像保存，留做后續(xù)的分析統(tǒng)計(jì)。

表3中性聚丙烯酰胺凝膠的組成

PCR-SSCP圖片如圖4所示。不同的帶型表示不同的基因型。從圖中可以看出NELF基因454位點(diǎn)存在三種基因型，即TT、TC、CC，其中，TT基因型和CC基因型均為兩個(gè)條帶，且TT基因型與CC基因型相比，遠(yuǎn)離上樣端的條帶距離上樣端更遠(yuǎn)，TC基因型具有相應(yīng)的三個(gè)條帶。

六、綿羊NELF基因SNP位點(diǎn)的頻率統(tǒng)計(jì)及其與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析

1.基因和基因型頻率

基因型頻率是指一個(gè)群體中某一性狀的各種基因型之間的比率。計(jì)算公式如下：

P_BB＝N_BB/N

其中P_BB代表某一位點(diǎn)的BB基因型頻率；N_BB表示群體中具有BB基因型的個(gè)體數(shù)；N為檢測(cè)群體的總數(shù)量。

基因頻率是指一個(gè)群體中某一基因?qū)ζ涞任换虻南鄬?duì)比率。計(jì)算公式可寫成：

P_B＝(2N_BB+N_Bb1+N_Bb2+N_Bb3+N_Bb4+……+N_Bbn)/2N

式中，P_B表示等位基因B頻率，N_BB表示群體中具有BB基因型的個(gè)體數(shù)量，N_Bbi表示群體中具有Bb_i基因型個(gè)體數(shù)量，b₁～b_n為等位基因B的n個(gè)互不相同的復(fù)等位基因。

各品種中的基因頻率與基因型頻率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表4所示：

表4 2個(gè)綿羊品種中NELF基因的基因型和等位基因頻率

從表3中可以看出等位基因T的頻率變化范圍為0.460～0.506，等位基因C的頻率變化范圍為0.494～0.500，由此可見，在2個(gè)綿羊品種中，對(duì)于等位基因C的選擇具有很大的潛力。

2.相關(guān)分析統(tǒng)計(jì)模型

利用SAS(9.2)軟件分析基因位點(diǎn)與繁殖性狀(產(chǎn)羔數(shù))的相關(guān)性。先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析，確定是否存在離群值，根據(jù)數(shù)據(jù)特征，利用t分析、方差分析或是多元線性模型分析基因型效應(yīng)。在數(shù)據(jù)處理中，根據(jù)影響產(chǎn)羔數(shù)因素不同，考慮到環(huán)境效應(yīng)、年齡、基因型效應(yīng)及相關(guān)的互作效應(yīng)，采用固定模型進(jìn)行分析，同時(shí)，根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行取舍。完整的模型如下：

Y_ijk＝μ+G_j+E_ijk

其中：Y_ijk為個(gè)體表型記錄；μ為群體均值；G_j為各位點(diǎn)的基因型效應(yīng)；E_ijk為隨機(jī)誤差。

表5 NELF基因單核苷酸多態(tài)性與綿羊繁殖性狀之間的方差分析

注：平均值肩標(biāo)上具有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，平均值肩標(biāo)上字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

表6 NELF基因單核苷酸多態(tài)性與湖羊繁殖性狀之間的方差分析

表7 NELF基因單核苷酸多態(tài)性與小尾寒羊繁殖性狀之間的方差分析

參見表5、6、7，結(jié)果表明，在綿羊NELF基因序列的第454位單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)上的不同基因型與綿羊產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析表明，TC基因的個(gè)體的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于TT和CC兩種基因型的個(gè)體。如果分品種來看，對(duì)于湖羊來說TC基因型的個(gè)體的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于TT和CC基因型個(gè)體。但對(duì)于小尾寒羊來說，TC基因型的個(gè)體的產(chǎn)羔數(shù)與TT和CC基因型個(gè)體差異不顯著。從群體來看，TC基因型與TT和CC基因型差異顯著，但在品種上只在湖羊上檢測(cè)到了差異性，而在小尾寒羊上未檢測(cè)到，這可能是品種特異性造成的。因此推測(cè)TC基因型可作為湖羊早期選擇的分子育種基因標(biāo)記。

總之，本發(fā)明所述的方法能夠快速的檢測(cè)綿羊NELF基因的單核苷酸多態(tài)性，為NELF基因的SNP與繁殖性能關(guān)系的建立奠定基礎(chǔ)，以便用于中國(guó)綿羊用繁殖性狀的標(biāo)記輔助選擇(MAS)育種提供基礎(chǔ)資料，快速建立遺傳資源優(yōu)良的綿羊種群。

核苷酸序列表

<110> 蘭州大學(xué)

<120> 利用PCR-SSCP快速檢測(cè)綿羊NELF基因單核苷酸多態(tài)性的方法及其應(yīng)用

<160> 2

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ttgccccttt cgttgctc 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tttctccact gtcaccgcc 19