本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及以綿羊的功能基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)作為分子遺傳標(biāo)記，特別涉及綿羊KITLG基因的單核苷酸多態(tài)性及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：在動(dòng)物育種中，人們期望通過(guò)對(duì)生長(zhǎng)、繁殖等性狀密切相關(guān)，并且與數(shù)量性狀緊密連鎖的DNA標(biāo)記的選擇，達(dá)到早期選種和提高育種值準(zhǔn)確性的目的，從而在畜禽育種中獲得更大的遺傳進(jìn)展。分子育種，即分子標(biāo)記輔助選擇育種(MolecularMark-AssistSelection,MAS)，該技術(shù)是借助DNA分子標(biāo)記對(duì)遺傳資源或育種材料進(jìn)行選擇，對(duì)畜禽的綜合性狀進(jìn)行品種改良，它是利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和傳統(tǒng)遺傳育種相結(jié)合的方法，進(jìn)行新品種選育?；蚨鄳B(tài)性是指不同物種或者同一物種內(nèi)的不同個(gè)體間基因組序列的差異，這些差異是由于染色體中DNA等位基因中核苷酸改變引起，主要是包括堿基的替換、插入、缺失以及重復(fù)序列拷貝數(shù)的變化。單核苷酸多態(tài)性(SingleNucleotidePolymorphism,SNP)是由美國(guó)麻省理工學(xué)院的人類基因組研究中心的學(xué)者Lander(1996)提出的一類遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，就是指基因組DNA序列中由于單個(gè)核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態(tài)性。SNP作為新的遺傳標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于基因定位、克隆、遺傳育種及多樣性的研究。SNP是基因組中存在的一種數(shù)量非常豐富的變異形式，占人類基因組中遺傳多態(tài)性的90％以上。SNP與罕見(jiàn)的變異不同，通常在種群中頻率等于或小于1％的此種變異被稱為突變，而只有頻率大于1％時(shí)才被稱為單核苷酸多態(tài)性。它的變異形式有：顛換、轉(zhuǎn)換、插入和缺失等，主要由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換或者顛換所引起。具有轉(zhuǎn)換型的堿基變異的SNPs約占2/3。根據(jù)基因組中單核苷酸多態(tài)性產(chǎn)生的位置，可分為以下3類：基因編碼區(qū)單核苷酸多態(tài)性(Coding-regionSNPs,cSNPs)、基因周邊單核苷酸多態(tài)性(PerigenicSNPs,pSNPs)以及基因間單核苷酸多態(tài)性(IntergenicSNPs,iSNPs)。研究表明，位于編碼區(qū)內(nèi)的cSNP比較少。基因編碼區(qū)內(nèi)的cSNP又可分為2種：一種是編碼區(qū)內(nèi)的同義cSNP(SynonymouscSNP)，即SNP所致編碼序列的改變并不會(huì)影響其所翻譯的蛋白質(zhì)中氨基酸序列的改變；另一種是編碼區(qū)內(nèi)的非同義cSNP(Non-SynonymouscSNP)，即堿基序列的改變將導(dǎo)致編碼氨基酸的改變，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)中氨基酸序列的改變，可能最終影響到蛋白質(zhì)的功能。由于SNPs是二等位基因分子標(biāo)記，所以，理論上在一個(gè)二倍體生物群體中，SNPs可能是由2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)等位基因構(gòu)成，但實(shí)際上3個(gè)或4個(gè)等位基因的SNPs很罕見(jiàn)，故SNPs通常被簡(jiǎn)單地稱為二等位基因分子標(biāo)記。目前，主要采用幾種不同的路線來(lái)發(fā)現(xiàn)SNPs：即DNA序列測(cè)定方法、聚合酶鏈反應(yīng)—單鏈構(gòu)象多態(tài)(PolymeraseChainReaction-SingleStrandConformationPolymorphism，PCR-SSCP)與DNA測(cè)序結(jié)合法、等位特異性PCR(AlleleSpecificPCR，AS-PCR)方法、引物延伸法和寡核苷酸連接反應(yīng)等。在這些SNP檢測(cè)技術(shù)中，DNA序列測(cè)定法是最為準(zhǔn)確的SNP檢測(cè)方法，但是，其檢測(cè)費(fèi)用昂貴，且需要有DNA測(cè)序儀等大型儀器，同時(shí)，在測(cè)序過(guò)程中需要非常熟練的技術(shù)人員和經(jīng)驗(yàn)，所以，DNA序列測(cè)定法不是一種應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際的理想SNP檢測(cè)方法；當(dāng)然，利用PCR-SSCP與DNA測(cè)序結(jié)合法檢測(cè)SNP可以適當(dāng)降低檢測(cè)費(fèi)用，但是，PCR-SSCP的實(shí)驗(yàn)過(guò)程比較長(zhǎng)，操作比較繁瑣，且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中存在假陽(yáng)性問(wèn)題，所以，也并非理想的SNP檢測(cè)手段；AS-PCR方法作為一種新型的SNP檢測(cè)方法，在未來(lái)的應(yīng)用領(lǐng)域中具有非常廣闊的前景，但是，該方法需要設(shè)計(jì)特別的引物，且只能針對(duì)特定的基因位點(diǎn)，同時(shí)，檢測(cè)過(guò)程中還存在誤檢的概率，因此，目前不具有普遍應(yīng)用的特點(diǎn)；而引物延伸法和寡核苷酸連接反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)SNP位點(diǎn)，需要平板讀數(shù)儀、基因芯片、微球陣列技術(shù)和質(zhì)譜儀等檢測(cè)平臺(tái)，對(duì)于一般的分子實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)可實(shí)施性不強(qiáng)。限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性-聚合酶鏈反應(yīng)(RestrictionFragmentLengthPolymorphism-PolymeraseChainReaction，RFLP-PCR)方法是一種檢測(cè)SNP的有效技術(shù)，在發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)后設(shè)計(jì)上下游引物用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行切割，然后進(jìn)行瓊脂糖、聚丙烯凝膠電泳分析，就能準(zhǔn)確地鑒別SNP位點(diǎn)。RFLP-PCR方法不僅具有DNA測(cè)序法的準(zhǔn)確性，又克服了費(fèi)用昂貴、繁瑣操作、假陽(yáng)性的缺點(diǎn)，而且所檢測(cè)的序列位點(diǎn)無(wú)特殊性要求。KITLG(KITLigand，KL或KitL)是一種分泌生長(zhǎng)因子，又被稱為干細(xì)胞因子(StemCellFactor，SCF)，肥大細(xì)胞因子(MastStemCellFactor，MCGF)或Steel因子(SteelFactor，SLF)，屬于酪氨酸激酶受體家族。KITLG由MgfcDNA編碼，由284個(gè)氨基酸組成。KITLGmRNA主要在卵泡的顆粒細(xì)胞中表達(dá))。KITLG通過(guò)其受體KIT信號(hào)影響卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞之間的相互作用。顆粒細(xì)胞中的KITLG和卵母細(xì)胞中的KIT之間的互作對(duì)動(dòng)物繁殖是不可或缺的。KITLG在原始生殖細(xì)胞(PrimordialGermCells，PGCs)的生存、增殖、遷移以及卵泡的發(fā)育中發(fā)揮作用。KITLG在卵泡發(fā)育中也起很重要的作用。KITLG結(jié)合KIT誘發(fā)PI3K通路在其它多種信號(hào)通路協(xié)調(diào)下傳導(dǎo)信息，激活卵母細(xì)胞，促進(jìn)卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和分泌作用。雖然有關(guān)KITLG基因在動(dòng)物繁殖方面的作用的研究取得了一些進(jìn)展，但是在綿羊上的研究報(bào)道較少。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)綿羊KITLG基因的單核苷酸多態(tài)性的方法及其應(yīng)用，利用PCR-RFLP方法針對(duì)其基因位點(diǎn)上的突變進(jìn)行檢測(cè)，提前淘汰劣勢(shì)個(gè)體，加快高繁種羊群體的建立。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：綿羊KITLG基因第47569位為T(mén)或C的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法為：以包含KITLG基因的待測(cè)綿羊全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增綿羊KITLG基因；用限制性內(nèi)切酶SspI消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對(duì)酶切后的擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)電泳結(jié)果鑒定綿羊KITLG基因第47569位的單核苷酸多態(tài)性；所述的引物對(duì)P為：上游引物：5’-TTATCTCCAGCTTTAGGG-3’18nt；下游引物：5’-AAGGTGACTTTGGTGAAT-3’18nt。所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。所述的瓊脂糖凝膠電泳為質(zhì)量濃度為1.5-3.0％的瓊脂糖凝膠電泳。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果KITLG基因第47569位堿基多態(tài)性為：TT型表現(xiàn)：358bp和110bp；CT型表現(xiàn)：468bp、358bp和110bp。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：本發(fā)明利用RFLP-PCR方法對(duì)綿羊KITLG基因第47569位點(diǎn)上的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，該位點(diǎn)位于KITLG基因的第五內(nèi)含子，該核苷酸多態(tài)性能夠作為一個(gè)分子遺傳標(biāo)記，利用標(biāo)記位點(diǎn)信息和數(shù)量性狀的表型信息，更準(zhǔn)確估計(jì)動(dòng)物個(gè)體的育種值，提高選擇效率，加快育種進(jìn)展。本發(fā)明通過(guò)設(shè)計(jì)特定的PCR引物擴(kuò)增片段，能夠用RFLP-PCR方法簡(jiǎn)單、快速、成本低、精確的檢測(cè)上述KITLG基因的單核苷酸的多態(tài)性。本發(fā)明對(duì)KITLG基因的SNP進(jìn)行了基因分型和基因頻率分析，以及與綿羊繁殖性狀之間進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析；結(jié)果顯示KITLG基因的核苷酸多態(tài)位點(diǎn)能夠成為分子遺傳輔助育種的標(biāo)記。本發(fā)明提供的檢測(cè)方法為KITLG基因的SNP與生長(zhǎng)性狀關(guān)系的建立奠定了基礎(chǔ)，以便用于中國(guó)綿羊生長(zhǎng)性狀的標(biāo)記輔助選擇，快速建立遺傳資源優(yōu)良的綿羊種群。附圖說(shuō)明圖1為綿羊血樣基因組DNA電泳檢測(cè)圖；圖2為綿羊KITLG基因PCR擴(kuò)增的468bp片段的電泳圖；M為Marker；圖3為綿羊KITLG基因468bpPCR產(chǎn)物的SspI酶切電泳檢測(cè)KITLG基因多態(tài)性的電泳結(jié)果圖；M為Marker；圖4為綿羊KITLG基因47569位SNP的不同基因型個(gè)體的測(cè)序峰圖，其中，A對(duì)應(yīng)TT基因型，B對(duì)應(yīng)CT基因型。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，所述實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的解釋，而不是限定。本發(fā)明以KITLG基因保守序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增KITLG基因第五內(nèi)含子468bp片段，以綿羊基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后尋找該擴(kuò)增片段的單核苷酸多態(tài)；針對(duì)發(fā)現(xiàn)的單核苷酸多態(tài)進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)性分析，并提供其檢測(cè)方法，使得KITLG基因的核苷酸多態(tài)性成為一種能夠快速、方便檢測(cè)的分子遺傳標(biāo)記，為加快建立具有高繁綿羊種群提供依據(jù)。a、綿羊KITLG基因多態(tài)性的檢測(cè)1、綿羊血樣的采集及處理取綿羊血樣10mL，加入0.5mol/L的EDTA500μL抗凝，緩慢顛倒3次后放入冰盒，-80℃保存?zhèn)溆?。本發(fā)明采用綿羊品種，具體如表1所示。表1綿羊樣品來(lái)源表2、血樣基因組DNA的提取(1)將冷凍血樣室溫解凍，轉(zhuǎn)移500μL至1.5mLEppendorf管，加入等體積PBS緩沖液，充分混勻，12000r/min離心10min(4℃)，棄去上清液，重復(fù)上述步驟至上清液透明、沉淀呈淡黃色。(2)在離心管中加入DNA抽提緩沖液500μL，搖動(dòng)，使血細(xì)胞沉淀脫離離心管管壁，37℃水浴1h。DNA抽提緩沖液的配制：0.6057g的Tris、18.612g的EDTA和2.5g的SDS加超純水500mL，滅菌、調(diào)pH至8.0，4℃保存?zhèn)溆谩?3)加蛋白酶K3μL(20mg/mL)并混勻，55℃過(guò)夜至澄清，尚未澄清者，可補(bǔ)加1μL蛋白酶K混勻繼續(xù)消化至澄清。(4)將反應(yīng)液冷卻至室溫，加Tris-飽和酚500μL，溫和搖動(dòng)離心管20min，使其充分混勻；4℃，12000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入另一1.5mL離心管中，重復(fù)一次。(5)加氯仿500μL，充分混勻20min，4℃，12000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入另一1.5mL離心管中。(6)加0.1倍體積的NaAc緩沖液及2倍體積的冰冷的無(wú)水乙醇，混合轉(zhuǎn)動(dòng)離心管直至白色的絮狀沉淀析出，-20℃保存30～60min。(7)4℃，12000r/min離心10min，棄去上清液，用70％的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。(8)4℃，12000r/min離心10min，棄去上清液，室溫下使乙醇揮發(fā)干凈。(9)干燥后的DNA溶于80～100μL的超純水，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量，-20℃保存。3、DNA池的構(gòu)建(1)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)選部分DNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，選擇DNA樣品條帶均一、無(wú)拖尾、無(wú)降解的樣品進(jìn)行DNA池的構(gòu)建。(2)OD值測(cè)定用紫外光光度計(jì)測(cè)定DNA樣品在260nm、280nm處的OD值。計(jì)算DNA含量和OD260/OD280的比值。如OD260/OD280比值小于1.6，說(shuō)明樣品中含有較多的蛋白質(zhì)或酚，則應(yīng)進(jìn)行純化；若比值大于1.8，則應(yīng)該考慮去除RNA純化。DNA濃度(ng/μL)＝50×OD260值×稀釋倍數(shù)(3)品種DNA池的構(gòu)建DNA檢測(cè)完畢后，取出一定的量稀釋至50ng/μL，然后從綿羊20個(gè)濃度為50ng/μLDNA樣品中取10μL混合構(gòu)建成品種DNA池；綿羊血樣基因組DNA的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1，從圖中可以看出綿羊基因組DNA的質(zhì)量非常高。4、PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系采用混合加樣法，即根據(jù)每一個(gè)反應(yīng)體系所需的各種組分的數(shù)量和1次反應(yīng)所需的PCR反應(yīng)的個(gè)數(shù)，算出各種反應(yīng)組分的總量，加入到1個(gè)1.5mL或者2.0mL離心管中，充分混勻后瞬時(shí)離心，再分裝到每個(gè)0.2mLEppendorfPCR管中，然后加入模板DNA，再瞬時(shí)離心后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表2。表2PCR反應(yīng)體系體系成分體積(μL)2*ReactionMix12.5上游引物(10pmol/L)1.0下游引物(10pmol/L)1.0TaqDNA聚合酶(0.5U/μL)0.3DNA模板(50ng/μL)1.0滅菌超純水(H2O)9.2總體積25.0引物對(duì)P：上游引物：5’-TTATCTCCAGCTTTAGGG-3’18nt；下游引物：5’-AAGGTGACTTTGGTGAAT-3’18nt。表3PCR反應(yīng)程序94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min5、PCR產(chǎn)物純化和測(cè)序PCR擴(kuò)增完成之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖2所示，可以清楚看到468bp的條帶；然后進(jìn)行PCR產(chǎn)物的切膠回收及純化：在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5mL離心管中，然后用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒(北京天根生物公司)純化PCR產(chǎn)物，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，具體步驟如下：(1)首先向吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000r/min離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。(2)將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下放入干凈的離心管中，稱取重量。(3)向膠塊中加入等體積溶液PC，60℃水浴放置10min左右，其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。(4)將上一步所得溶液加入一個(gè)吸附柱中，12000r/min離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。(5)向吸附柱中加入700μL漂洗液，12000r/min離心1min，倒掉廢液，將吸附柱重新放入收集管中。(6)向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000r/min離心1min，倒掉廢液，將離心吸附柱放入收集管中，12000r/min離心2min，盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫或50℃溫箱數(shù)分鐘，徹底晾干。(7)將吸附柱放到一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量的洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘。12000r/min離心1min收集DNA溶液。(8)為了提高DNA的回收量，可將離心得到的溶液重新加回離心吸附柱中，重復(fù)步驟7。把以綿羊DNA池為模板的PCR純化產(chǎn)物送上海生物工程有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。綿羊KITLG基因目的片段468bp的測(cè)序結(jié)果如圖4所示。對(duì)測(cè)序峰圖進(jìn)行分析，其中在同一位點(diǎn)有兩個(gè)不同峰的是發(fā)生了單核苷酸突變；位于綿羊KITLG基因的第47569位出現(xiàn)了T、C兩種檢測(cè)結(jié)果，即為篩查到的綿羊KITLG基因的SNP多態(tài)性，該位點(diǎn)是為T(mén)或C的堿基多態(tài)性。b、綿羊KITLG基因T>C突變多態(tài)性的RFLP-PCR檢測(cè)由于篩查到的堿基多態(tài)性為自然酶切位點(diǎn)，能被常用的內(nèi)切酶進(jìn)行PCR-RFLP來(lái)鑒定。當(dāng)綿羊的KITLG基因第47569位未發(fā)生T>C突變時(shí)，即為突變前T，利用引物對(duì)P擴(kuò)增的KITLG基因序列AAT^ATT，為SspI的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)；可直接通過(guò)SspI對(duì)目的片段的酶切進(jìn)行基因分型。1、RFLP-PCR反應(yīng)條件PCR產(chǎn)物擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件分別如表2和表3所述，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的1.5％瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖2所示，可以看到設(shè)計(jì)的引物對(duì)P能夠擴(kuò)增468bp的片段。2、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的SspI酶切(1)10μLSspI酶切反應(yīng)體系：5μLPCR產(chǎn)物，10×buffer(緩沖液)2.0μL，SspI(10U/μL)為0.3μL，2.7μL滅菌純水(H2O)；(2)酶切消化條件：37℃恒溫培養(yǎng)箱中消化12～16h。(3)SspI消化PCR產(chǎn)物后瓊脂糖凝膠電泳分析用3.0％的瓊脂糖凝膠，120V電壓電泳1小時(shí)，核酸染料染色檢測(cè)酶切結(jié)果，用UVP凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc-ItTSImagingSystem)照相分析，并判型、記錄其基因型；由于PCR-RFLP擴(kuò)增的468bp片段中不包含其它的SspI酶切識(shí)別位點(diǎn)，當(dāng)KITLG基因第47569位未發(fā)生T>C突變時(shí)，PCR擴(kuò)增的KITLG基因產(chǎn)物被限制性內(nèi)切酶SspI識(shí)別后，在AAT^ATT對(duì)擴(kuò)增片段酶切，將擴(kuò)增片段切為2段；而當(dāng)KITLG基因第47569位發(fā)生突變，不能形成新的限制性內(nèi)切酶SspI酶切識(shí)別位點(diǎn)，擴(kuò)增片段不能被酶切；綿羊KITLG基因第47569位可形成2種不同的基因型，分別為T(mén)T和CT，其PCR-RFLP檢測(cè)的凝膠結(jié)果如圖3所示：其中，TT基因型為野生型，它的兩條DNA鏈的SNP位點(diǎn)均能被SspI酶切，表現(xiàn)為358bp和110bp條帶；雜合子CT的兩條鏈中的一條的SNP位點(diǎn)能夠被識(shí)別而另一條不能被識(shí)別，表現(xiàn)為468bp，358bp和110bp條帶；在檢測(cè)群體中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)CC基因型；根據(jù)條帶的個(gè)數(shù)和條帶的大小，能夠很清楚的判定是否發(fā)生了點(diǎn)突變，將兩種基因型區(qū)分開(kāi)，從而檢測(cè)其SNP多態(tài)性。(4)不同基因型個(gè)體PCR產(chǎn)物的測(cè)序驗(yàn)證利用ABI3730測(cè)序儀對(duì)不同基因型個(gè)體PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行正反雙向測(cè)序；同時(shí)，進(jìn)行SNP位置分析，結(jié)果表明包含468bp、358bp和110bp條帶的雜合子CT基因型個(gè)體其第47569位的測(cè)序圖的確表示為C或T，如圖4B所示，自左向右第7個(gè)峰為兩個(gè)峰；而TT基因型為T(mén)，如圖4A所示。c、不同綿羊群體中KITLG基因第47569位的SNP作為分子標(biāo)記的應(yīng)用1、群體單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)利用上述的SNP多態(tài)性檢測(cè)方法對(duì)432份小尾寒羊和509份湖羊DNA樣品進(jìn)行SNP多態(tài)性的鑒定；統(tǒng)計(jì)其SNP位點(diǎn)的頻率分布情況。2、SNP位點(diǎn)的頻率統(tǒng)計(jì)分析基因型頻率是指一個(gè)群體中某一性狀的某種基因型個(gè)體數(shù)占總個(gè)體數(shù)的比率。PAA＝NAA/N，其中PAA代表某一位點(diǎn)的AA基因型頻率；NAA表示群體中具有AA基因型的個(gè)體數(shù)；N為檢測(cè)群體的總數(shù)量?；蝾l率是指一個(gè)群體中某一基因數(shù)對(duì)其等位基因總數(shù)的相對(duì)比率。計(jì)算的公式可以寫(xiě)成：PA＝(2NAA+NAa1+NAa2+……+NAan)/2N。式中，PA表示等位基因A頻率，NAA表示群體中具有AA基因型的個(gè)體數(shù)量，NAai表示群體中具有Aai基因型個(gè)體數(shù)量，a1-an為等位基因A的n個(gè)不同的復(fù)等位基因；統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表4。表4綿羊KITLG基因第47569位SNP基因頻率分布表3、基因效應(yīng)的關(guān)聯(lián)分析基因型數(shù)據(jù)：SspI識(shí)別的基因型(TT和CT)生長(zhǎng)性狀數(shù)據(jù)：湖羊和小尾寒羊第一胎產(chǎn)羔數(shù)利用SAS(9.2)軟件分析基因位點(diǎn)與繁殖性狀(產(chǎn)羔數(shù))的相關(guān)性。先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析，確定是否存在離群值，根據(jù)數(shù)據(jù)特征，利用t分析、方差分析或是多元線性模型分析基因型效應(yīng)。在數(shù)據(jù)處理中，根據(jù)影響產(chǎn)羔數(shù)因素不同，考慮到環(huán)境效應(yīng)、年齡、基因型效應(yīng)及相關(guān)的互作效應(yīng)，采用固定模型進(jìn)行分析，同時(shí)，根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行取舍。完整的模型如下：Yijk＝μ+Gj+Eijk其中：Yijk為個(gè)體表型記錄；μ為群體均值；Gj為各位點(diǎn)的基因型效應(yīng)；Eijk為隨機(jī)誤差。結(jié)果表明(見(jiàn)表5)：對(duì)于SspI可識(shí)別的第47569位的SNP位點(diǎn)，CT基因型為優(yōu)勢(shì)基因型；性狀關(guān)聯(lián)分析表明，在小尾寒羊群體中，CT基因型個(gè)體的產(chǎn)羔數(shù)顯著的高于TT基因型，而在湖羊群體中各基因型個(gè)體差異不顯著。結(jié)果說(shuō)明CT基因型可以成為一個(gè)提高小尾寒羊產(chǎn)羔性狀育種速度的分子遺傳標(biāo)記。根據(jù)這個(gè)研究結(jié)果，可以通過(guò)選擇，建立基因型為CT雜合子小尾寒羊群體，提高其產(chǎn)羔率。表5KITLG基因單核苷酸多態(tài)性與綿羊繁殖性狀之間的關(guān)聯(lián)分析注：具有相同字母肩標(biāo)的平均值間差異不顯著(P>0.05)，具有不同字母肩標(biāo)的平均值間差異顯著(P<0.05)。核苷酸序列表<110>蘭州大學(xué)<120>一種檢測(cè)綿羊KITLG基因的單核苷酸多態(tài)性的方法及其應(yīng)用<160>2<210>1<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>1ttatctccagctttaggg18<210>2<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>2aaggtgactttggtgaat18當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3