本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢測試劑技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種用于預(yù)測早期可手術(shù)食管鱗癌患者復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒及32個(gè)基因的擴(kuò)增引物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
食管癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其中約有95％為鱗狀細(xì)胞癌。NCCN指南早期食管鱗癌(T1-2N0M0)的標(biāo)準(zhǔn)治療手段為手術(shù)切除。雖然早期食管鱗癌手術(shù)治療后5年生存率可達(dá)90％以上，但仍有部分患者出現(xiàn)早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)，顯示出較差的預(yù)后。因此，預(yù)測早期食管鱗癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，食管癌與預(yù)后相關(guān)聯(lián)的研究近年大量涌現(xiàn)，己探索了許多與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子標(biāo)記物。然而腫瘤的生物學(xué)特性有多組基因參與調(diào)控，目前大多研究專注于單因素研究模式，僅探索一個(gè)或某幾個(gè)基因與預(yù)后的相關(guān)性，不能全面地反映早期食管鱗癌準(zhǔn)確的分子生物學(xué)特征，難以反映復(fù)雜轉(zhuǎn)移過程。因此，國內(nèi)外至今沒有一個(gè)指標(biāo)能在臨床上用作早期已手術(shù)食管鱗癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的預(yù)測、診斷。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
鑒于早期準(zhǔn)確預(yù)測癌癥轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)是及時(shí)有效防治的前提，也是進(jìn)一步延長病人生存的保證，因此本發(fā)明的目的在于提供一種快速有效的食管鱗癌32個(gè)基因聯(lián)合檢測試劑盒，用于對食管鱗癌術(shù)后患者轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行準(zhǔn)確的預(yù)測和評估，對高風(fēng)險(xiǎn)患者進(jìn)行重點(diǎn)監(jiān)測和有效干預(yù)，進(jìn)一步降低術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率，改善患者預(yù)后。
為達(dá)到本發(fā)明的上述目的，發(fā)明人通過大量試驗(yàn)研究并不懈努力，最終獲得了如下技術(shù)方案，一種預(yù)測早期可手術(shù)食管鱗癌患者復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，該試劑盒包括BCL2、Survivin、STAT3、cIAP1、cIAP2、β-catenin、Cyclin D1、CDKN2A、TCF4、EGFR、HER-2、AREG、EREG、TFPI-2、WNT1、BMI-1、MTOR、ATM、ATR、XRCC1、XRCC2、XRCC3、XRCC4、XRCC5、HIF-1α、HIF-2α、VEGF、RAD51、β-actin、GAPDH、GUS和TFRC共32個(gè)基因的擴(kuò)增引物，其核苷酸序列如下所示：
本發(fā)明還提供了上述試劑盒的制作方法，具體步驟為：
(1)32對基因引物的設(shè)計(jì)：按本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)設(shè)計(jì)如下引物：
腫瘤相關(guān)基因【BCL-2，BIRC5(survivin)，STAT3，IAP1，IAP2，CTNNB1(β-catenin)，CCND1(Cyclin D1)，CDKN2A，NTCF4，EGFR，HER-2，AREG，EREG，TFPI-2，WNT1，BMI-1，MTOR(Mtor)】
治療相關(guān)基因【ATM，ATR，XRCC1，XRCC2，XRCC3，XRCC4，XRCC5，HIF-1α，HIF-2α，VEGF，RAD51】
參考基因【β-actin，GAPDH，GUS，TFRC】
(2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液的配制：
按照下表體系進(jìn)行加樣操作：
于離心管中制成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，并貼上標(biāo)簽，另單獨(dú)配有一管RNase FREE dH2O120μL，于-20℃低溫保存，以保證產(chǎn)品穩(wěn)定性。
(3)PCR反應(yīng)液的配制：
按照下表體系進(jìn)行加樣操作：
于棕色離心管中制成每個(gè)基因各自的PCR反應(yīng)液，并貼上標(biāo)簽，于-20℃低溫保存，以保證產(chǎn)品穩(wěn)定性。
本發(fā)明結(jié)合試驗(yàn)并利用32個(gè)基因表達(dá)差異與患者預(yù)后指標(biāo)進(jìn)行預(yù)測分析，利用相關(guān)性分析、鞅殘差分析、時(shí)序檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，得出了多基因預(yù)后預(yù)測模型及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的公式，預(yù)測患者5年復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，以評估患者預(yù)后及決策是否加用放化療。構(gòu)建的預(yù)后評分模型如下：
評分＝0.03×BCL2+0.052×Survivin+0.037×STAT3+0.023×cIAP1+0.025×cIAP2+0.026×β-catenin-0.042×Cyclin D1-0.047×CDKN2A-0.035×TCF4+0.041×EGFR+0.016×HER-2+0.025×AREG+0.033×EREG+0.02×TFPI-2+0.016×WNT1+0.01×BMI-1+0.03×MTOR-0.042×ATM-0.039×ATR-0.013×XRCC1-0.011×XRCC2-0.01×XRCC3-0.011×XRCC4-0.013×XRCC5+0.035×HIF-1α+0.032×HIF-2α+0.04×VEGF+0.028×RAD51
依據(jù)低風(fēng)險(xiǎn)：評分＜22；中風(fēng)險(xiǎn)：22≤評分≤42；高風(fēng)險(xiǎn)：評分＞42，評估該患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)級別。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的聯(lián)合基因試劑盒提供了較特異、敏感的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)預(yù)測指標(biāo)及預(yù)測模型，對早期食管鱗癌轉(zhuǎn)移潛能進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測，從而能對根治術(shù)后食管鱗癌患者轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行準(zhǔn)確的預(yù)測和評估，對高風(fēng)險(xiǎn)患者進(jìn)行重點(diǎn)監(jiān)測和有效干預(yù)，減少食管鱗癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步改善患者預(yù)后。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神下可以對技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
一種用于預(yù)測和評估食管鱗癌術(shù)后患者轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)試劑盒，共有32管不同基因的反應(yīng)液，每管包括除cDNA以外的其他所需熒光定量PCR反應(yīng)體系。
患者蔣某，男，36歲，因患食管鱗癌于2010年7月20日在江蘇省人民醫(yī)院行“食管癌根治性切除術(shù)”，術(shù)后病理分期為pT1N0M0，我們使用患者手術(shù)石蠟標(biāo)本，采用本發(fā)明試劑盒按下述方法進(jìn)行檢測。具體步驟如下：
1.食管鱗癌患者石蠟標(biāo)本總RNA的提取
(1)將食管鱗癌組織石蠟標(biāo)本于石蠟切片機(jī)上切片，取5-10張于EP管中。
(2)加入至少1mL TRIzol，勻漿器勻漿處理后，將液體倒入EP管中。
(3)將勻漿樣品在室溫放置5分鐘，以充分分離核酸蛋白復(fù)合物。
(4)加入0.2mL氯仿至EP管中(試劑體積比為)，蓋好管蓋，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。
(5)于低溫離心機(jī)4℃12000×g條件下，離心15分鐘。離心后樣品分為三層：RNA主要在上層無色水相中，中間為白色蛋白層，底層為黃色有機(jī)相。
(6)將上層水相小心轉(zhuǎn)移到新EP管中，注意不要吸到中間或底層物質(zhì)。吸取與上層水相等體積的異丙醇，加入到該EP管中，以沉淀RNA。混勻后，室溫靜置20-30分鐘。
(7)4℃12000×g的條件低溫離心10分鐘，離心后可在管底見到白色的RNA沉淀。小心移去上清后，用1mL 75％乙醇洗滌RNA沉淀(每使用1mL TRIzol至少加1mL75％乙醇)。
(8)4℃5000×g離心3-5分鐘，小心棄去上清。
(9)用槍頭將EP管中殘存的上清液吸干凈，根據(jù)RNA沉淀的多少，加入適量(25-200μL)DEPC水，用槍頭吹打混勻后，進(jìn)行濃度和純度檢測。OD260/OD280值為1.825；RNA濃度為403.75ng/μL。
2.將食管鱗癌組織提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA
取出逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，向其中加入8μg提取的總RNA(本例計(jì)算后為19.8μL)，再向其中加入RNase FREE dH2O至反應(yīng)體系總量為160μL(本例計(jì)算后為92.2μL)。輕彈管底將溶液混勻。反應(yīng)條件為37℃15min、85℃5s，完成后得到cDNA，以-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR
取出32管PCR反應(yīng)液，分別向每管加入5μL逆轉(zhuǎn)錄的cDNA，按照兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行擴(kuò)增：
Stage 1：預(yù)變性
Reps：1
95℃30sec
Stage 2：PCR反應(yīng)
Reps：40
95℃5sec
60℃34sec
Stage 3:Melt Curve
4.復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評分計(jì)算
每個(gè)樣本組織中檢測的基因相對mRNA水平定義為：2△CT，其中△CT＝CT(檢測基因)-CT(4個(gè)參考基因的平均值)。將每個(gè)基因的mRNA水平帶入公式“評分＝0.03×BCL2+0.052×Survivin+0.037×STAT3+0.023×cIAP1+0.025×cIAP2+0.026×β-catenin-0.042×Cyclin D1-0.047×CDKN2A-0.035×TCF4+0.041×EGFR+0.016×HER-2+0.025×AREG+0.033×EREG+0.02×TFPI-2+0.016×WNT1+0.01×BMI-1+0.03×MTOR-0.042×ATM-0.039×ATR-0.013×XRCC1-0.011×XRCC2-0.01×XRCC3-0.011×XRCC4-0.013×XRCC5+0.035×HIF-1α+0.032×HIF-2α+0.04×VEGF+0.028×RAD51”，得出該患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評分為52分。依據(jù)低風(fēng)險(xiǎn)：評分＜22；中風(fēng)險(xiǎn)：22≤評分≤42；高風(fēng)險(xiǎn)：評分＞42，評估該患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)為高風(fēng)險(xiǎn)。依據(jù)我院對該患者隨訪結(jié)果，該患者于術(shù)后11個(gè)月10天發(fā)現(xiàn)局部復(fù)發(fā)。
SEQUENCE LISTING
<110> 江蘇省人民醫(yī)院
<120> 一種預(yù)測早期可手術(shù)食管鱗癌患者復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒
<160> 64
<170> PatentIn version 3.5
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<213> 人工序列
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