本發(fā)明涉及基因工程及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種用于鑒定糙果莧的CAPs分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

外來入侵植物糙果莧和西部莧隸屬莧科莧屬異株莧亞屬，原產(chǎn)北美，是美國大豆、玉米農(nóng)田的超級雜草。近幾年，隨著中美兩國貿(mào)易增加，借助糧谷等貨物傳入我國風(fēng)險加大，已在我國口岸多次截獲。糙果莧和西部莧種子小，僅0.6～0.8mm，形態(tài)相近，難以區(qū)分。種間常發(fā)生雜交，產(chǎn)生一系列多態(tài)性復(fù)合群，是口岸檢測鑒定以及植物分類學(xué)上的難題。Robertson(1981)和Pratt(2001)認(rèn)為糙果莧和西部莧地理分布重疊，應(yīng)屬于同一個種。莧屬植物ITS序列的研究也顯示糙果莧和西部莧聚為一個進(jìn)化支(自展支持率99％)，難以區(qū)分。但形態(tài)學(xué)上，西部莧胞果周裂、花被片1-2、雌花花序間生有小葉、葉片黃綠或綠色并長橢圓型的特征，與糙果莧胞果不裂、無花被片、雌花花序細(xì)長無小葉、葉片深綠色并狹長橢圓型的特征相區(qū)別，難以作為一個物種來處理。Sauer(1967、1972)便根據(jù)雌花花被片數(shù)目及等位酶實驗，將兩個種分別定義。糙果莧和西部莧為雌雄異株植物，雖然雌株可通過形態(tài)明顯區(qū)分，雄株卻缺乏充分的分類依據(jù)，常被誤鑒。因此，借助新的方法來澄清兩個物種的分類問題十分必要。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)是指由于單個核苷酸的變異所形成的遺傳標(biāo)記，其數(shù)量多、多態(tài)性豐富、適于快速、自動化分析。SNP的檢測方法有多種，但是由于技術(shù)難度高、成本費用高，阻礙了其應(yīng)用。酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(C1eaved Amplified Polymorphic Sequences，CAPS)是一類以PCR為基礎(chǔ)的共顯性的分子標(biāo)記，它的基本原理是先用已知SNP位點的DNA序列去設(shè)計一套特異性的PCR引物(19～27bp)。然后應(yīng)用這些去擴(kuò)增該位點上的某一DNA片段；接著用一種專一性的限制性內(nèi)切酶切割所得的擴(kuò)增帶并進(jìn)行RFLP分析。CAPs標(biāo)記的應(yīng)用降低了SNP位點檢測成本和難度。自1993年Konieczny和Ausubel在擬南芥上發(fā)展的CAPS標(biāo)記以來,因具有共顯性、位點特異性、操作簡單、成本低、所需DNA樣品量少和對DNA的純度要求不高等優(yōu)點成為現(xiàn)代生物學(xué)研究的一個非常重要的分子標(biāo)記技術(shù)，在種質(zhì)鑒定、輔助育種、基因鑒定和圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域得到相當(dāng)廣泛的應(yīng)用。

內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internally Transcribed Spacer)ITS,位于rRNA編碼基因18S，5.8S和26/28S之間的小基因片段。這些rDNA高度保守地分布在染色體的不同位置，在每個單倍染色體基因組中的拷貝數(shù)超過200個,這使得保守區(qū)域能夠很容易被擴(kuò)增出來。同時包含保守與變異序列,能根據(jù)保守序列中的變異位點設(shè)計特殊引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增比較，rDNA在物種的鑒定應(yīng)用中，具有檢測種水平的多態(tài)性特征。莧屬大部分植物可以通過ITS序列(629bp)相區(qū)分，但對于西部莧和糙果莧，以及綠穗莧復(fù)合群無法進(jìn)一步辨識。只能根據(jù)序列內(nèi)部SNP位點進(jìn)行物種鑒定。多拷貝序列26SrDNA是編碼核糖體亞基的基因，序列長度在600bp左右。Gutell等研究表明這段區(qū)域具有較高的變異率，可以用于親緣關(guān)系較近的物種間的分類研究。該序列在酵母菌分類方面應(yīng)用最多。莧屬植物中26S位于ITS2下游，將ITS序列與26S相結(jié)合，可發(fā)現(xiàn)更有價值的分子標(biāo)記，進(jìn)而用于種下單元鑒定。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種用于鑒定糙果莧的基于SNP位點的CAPs分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

本發(fā)明通過對莧屬(Amaranthus L.)16個類群52份樣本及2個外類群(青葙和空心蓮子草)多拷貝核基因ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增和測序，分析其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及序列差異，得到用于區(qū)分鑒定糙果莧的SNP位點。用于糙果莧SNP位點分析的序列除來自本實驗樣本外，還含有Genbank中莧屬植物ITS序列，共計34種177條。對序列進(jìn)行比對分析后，根據(jù)糙果莧全基因組序列的contig00002片段(Genbank編號：ACQK01000002.1)，在SNP位點下游擴(kuò)展尋找合適區(qū)間，通過Primer premier 5軟件設(shè)計特異引物，擴(kuò)增易于檢測該位點的序列。并將擴(kuò)增的目的片段命名為ITS616(SEQ ID NO.1)。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種用于區(qū)分鑒定糙果莧的特異性分子標(biāo)記，其位于莧屬植物多拷貝核基因ITS和26S序列上，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明的CAPs分子標(biāo)記通過以下引物擴(kuò)增得到:

正向引物347f：F5'-CCCGTGAACCATCGAGTT-3'，(SEQ ID NO.2)

反向引物807r：R5'-AACATCAGACCTCTTCGCAGG-3'(SEQ ID NO.3)。

本發(fā)明還提供用于鑒定西部莧和糙果莧的特異性PCR引物，包括正向引物F5'-CCCGTGAACCATCGAGTT-3'和反向引物R5'-AACATCAGACCTCTTCGCAGG-3'。

本發(fā)明還提供所述CAPs分子標(biāo)記在鑒定糙果莧中的應(yīng)用，其包括步驟：1)提取待測植株的基因組DNA；2)以待測植株的基因組DNA為模版，利用SEQ ID NO.2-3所示的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；3)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行PCR-RFLP限制酶(StyI)切反應(yīng)，并對反應(yīng)產(chǎn)物凝膠電泳；4)檢測PCR-RFLP反應(yīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如果能夠擴(kuò)增出3個條帶，且3個條帶大小分別為461bp、273bp、188bp，則待測植株為糙果莧。

其中，2)中PCR反應(yīng)體系以25μl計為：30ng/μl模板DNA 1μl，10pmol/μl引物F和R各1μl，2.5mmol/L dNTP mix2.0μl，5U/μL Taq DNA聚合酶0.3μl，10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5μl，25mmol/L MgCl₂ 2μl，余量為水。

PCR反應(yīng)條件為：94℃5分鐘；94℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，24個循環(huán)；72℃10分鐘。

3)中PCR-RFLP酶切反應(yīng)體系為20μL：30ng/μl模板DNA 10μL，10X Buffer 2.0μL，StyI(Eco130I)酶1μL，余量為水。

PCR-RFLP酶切反應(yīng)條件為：37℃水浴1小時。

本發(fā)明還提供含有SEQ ID NO.2-3所示引物的用于檢測糙果莧的試劑盒。優(yōu)選地，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反應(yīng)緩沖液中的一種或多種。更優(yōu)選地，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。

本發(fā)明通過對莧屬(Amaranthus L.)16個類群52份樣本及2個外類群(青葙Celosia argentea和空心蓮子草Alternanthera philoxeroides)多拷貝核基因ITS序列進(jìn)行的序列擴(kuò)增、測序和分析，得到用于鑒定糙果莧的SNP位點。同時結(jié)合26S rDNA序列，得到用于鑒定糙果莧的CAPs分子標(biāo)記。為口岸快速鑒定外來入侵物種提供了可靠的檢測方法。利用本發(fā)明提供的CAPs分子標(biāo)記可實現(xiàn)對糙果莧的快速、準(zhǔn)確檢測鑒定。

附圖說明

圖1 ITS616(SEQ ID NO.1)段PCR-RFLP(StyI限制性內(nèi)切酶)結(jié)果；其中，1：北美莧；2：反枝莧；3：菱葉莧；4：皺葉莧；5：脹果莧；6：刺莧；7：長芒莧；8-12：西部莧；13：糙果莧；14-15：西部莧；16-20：糙果莧；M：DNA marker DL2000。

圖2 ITS基因系統(tǒng)發(fā)生樹。

圖3糙果莧、西部莧及其同屬種植物ITS序列比對結(jié)果；方框部分為糙果莧特異堿基位點，方框內(nèi)的1個堿基為SNP位點616。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段；若未特別指明，實施例中所用試劑均為市售。

實施例1用于鑒定糙果莧的CAPs分子標(biāo)記的獲得

1、植物材料本實施例中所選材料的具體名稱及材料來源見表1，用于實驗的植物材料為硅膠干燥的葉片和種子。

表1植物材料及來源

2、試劑PCR擴(kuò)增所用試劑均購自大連寶生物有限公司，引物均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，測序由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

3、方法

3.1DNA提取

硅膠干燥的植物葉片或種子100mg置于事先加入4mm鋼珠的2mlEP管中，迅速放入液氮中冷凍30min,將EP管置于Geno/Grinder2000(SPEX SamplePrep)高通量研磨機上，研磨1.5min,1000rpm/min。按照TIANGEN植物基因組DNA提取試劑盒提取葉片總DNA。

3.2ITS基因擴(kuò)增及測序

通用引物為ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)。PCR反應(yīng)體積25μL，體系包含MgCl₂ 2μL(25mmol/L)，dNTP 2μL(2.5mmol/L)，PCR緩沖液2.5μL(10×)，引物各1.0μL(2.5μmol/L)，聚合酶1.0U,總DNA1μL(約30ng)，余量為水。擴(kuò)增程序：94℃變性5min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸90s(進(jìn)行30個循環(huán))；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，擴(kuò)增引物同時作為測序引物進(jìn)行雙向測序。

3.3序列分析及系統(tǒng)樹構(gòu)建

序列編輯和拼接應(yīng)用Lasergenev7.1軟件中的SeqMan完成，用ClustalX進(jìn)行序列比對，序列比對后，以青葙(Celosia argentea)和空心蓮子草(Alternanthera philoxeroides)為外類群，使用MEGA6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析?？瘴?Gap)被處理為缺失(Missing)，以鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)分支樹。NJ樹序列間分化程度使用Kimura的二參數(shù)距離度量，每一分支的bootstrap支持率的計算設(shè)定為1000次重復(fù)取樣的計算結(jié)果。

3.4 347-807特異片段擴(kuò)增

設(shè)計上游引物F(5'-CCCGTGAACCATCGAGTT-3')和下游引物R(5'-AACATCAGACCTCTTCGCAGG-3')，PCR反應(yīng)體系以25μl計為：30ng/μl模板DNA 1μl，10pmol/μl引物F和R各1μl，2.5mmol/L dNTP mix2.0μl，5U/μL Taq DNA聚合酶0.3μl，10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5μl，25mmol/L MgCl2 2μl，余量為水。

PCR擴(kuò)增程序為：94℃5分鐘；94℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，24個循環(huán)；72℃10分鐘。3％瓊脂糖凝膠電泳檢查結(jié)果。

3.5PCR-RFLP限制內(nèi)切酶StyI反應(yīng)結(jié)果

PCR-RFLP酶切反應(yīng)體系為20μl：30ng/μl模板DNA 10μl，10X Buffer 2.0μl，StyI(Eco130I)酶1μl，余量為水。

PCR-RFLP酶切反應(yīng)條件為：37℃水浴1小時。3％瓊脂糖凝膠電泳檢查結(jié)果。

4、結(jié)果

4.1植物材料DNA提取及ITS基因擴(kuò)增

本實施例中，將多個植物樣品同時在Geno/Grinder 2000高通量組織研磨儀內(nèi)進(jìn)行研磨，可以一次獲得大規(guī)模的DNA樣本，大大提高了實驗效率。研磨后樣品直接用TIANGEN試劑盒提取DNA效果較好，樣品濃度均在50-100μg/μL,可用于后續(xù)試驗。ITS基因的擴(kuò)增產(chǎn)物為一條650bp的條帶，該PCR產(chǎn)物純化后送上海生工測序。

4.2ITS和26S基因序列分析和特異引物設(shè)計

用Lasergenev7.1軟件進(jìn)行序列的剪切、拼接和統(tǒng)計等分析，確保序列的準(zhǔn)確性，保存成FASTA或純文本格式。用ClustalX軟件進(jìn)行排序，個別位點手工校對，使用MEGA6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。根據(jù)序列相似度繪制的系統(tǒng)發(fā)生樹(圖2)，由NJ樹可以看出，西部莧和糙果莧呈明顯的并系關(guān)系，二者聚類為一支(97％自展支持率)，屬單系起源，與其它莧互為姊妹群。通過ITS序列，僅能將兩種莧與其它莧區(qū)分，但不能區(qū)分西部莧和糙果莧。

在對16個莧屬植物ITS基因序列的差異堿基進(jìn)行比較后,發(fā)現(xiàn)糙果莧與西部莧以及其它莧在616位點存在變異，糙果莧在該位點為A且為雜合位點(A>G)，西部莧及其它莧在該位點為G，為純合位點。該SNP位點與相鄰堿基組成“CCA₆₁₆AGG”，為StyI內(nèi)切酶識別位點。但該位點靠近ITS2序列末端，酶切后的片段長度差異小，電泳結(jié)果不檢測。因此，通過Genbank核酸序列檢索，根據(jù)糙果莧全基因組序列的contig00002片段(Genbank編號：ACQK01000002.1)，在SNP位點616的下游(26S)擴(kuò)展尋找合適區(qū)間，即ITS與26S序列相結(jié)合，通過Primer premier 5軟件設(shè)計特異引物347f(SEQ ID NO.2)、807r(SEQ ID NO.3)，擴(kuò)增易于檢測該位點的序列。

4.3ITS616基因(SEQ ID NO.1)的PCR-RFLP檢測

用特異引物347f、807r，對糙果莧和西部莧以及其它莧進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗，由圖1可以看出，只有糙果莧有3條帶，分別為461bp、273bp、188bp，其他的物種僅有461bp一個條帶，可以達(dá)到區(qū)分糙果莧的目的。切膠純化上述條帶，測序得到擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國環(huán)境科學(xué)研究院

<120> 基于SNP位點鑒定糙果莧的CAPs分子標(biāo)記及其應(yīng)用

<130> KHP161118887.4C

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 461

<212> DNA

<213> 糙果莧

<400> 1

tcgagttttt gaacgcaagt tgcgcccgaa gcctttggcc agggcacgtc tgcctgggcg 60

tcacgcactg cgtctccccc aacccgccta gctgtgggag gggcgaggag gatggtctcc 120

catgcctcac cgggcgtgga tggcctaaaa caggagccca cggtttcgag ctgctgcggc 180

gattggtggt gtgcaaggcc tagcctagaa tgcaatcgcg tcgtacagcg cgtggacctt 240

gtggccttga ggaccctaga gtgttgcccg agggcgacca accactgcga ccccaggtca 300

ggcgggacta cccgctgagt ttaagcatat caataagcgg aggaaaagaa acttacaagg 360

attcccctag taacggcgag cgaaccggga atagcccagc tttaaaatcg ggcggctttg 420

ctgtctgaat tgtagtctgg agaagcgtcc tctgcggcgg a 461

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cccgtgaacc atcgagtt 18

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aacatcagac ctcttcgcag g 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcctccgctt attgatatgc 20