本發(fā)明屬于免疫球蛋白領(lǐng)域，具體是一種人源性抗胰淀素抗體及其制備方法。

背景技術(shù)：

胰淀素（Amylin）是胰島B細(xì)胞分泌的激素，與胰島素共貯存于B細(xì)胞的分泌顆粒中，兩者在葡萄糖及非糖激素刺激下以一定比例相伴釋放到胰島B細(xì)胞外。體內(nèi)代謝過(guò)程類似于C-肽，研究發(fā)現(xiàn)，胰淀素在肝臟的代謝速度遠(yuǎn)較胰島素慢，而且胰淀素主要經(jīng)腎臟排泄?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)胰淀素是一個(gè)多效激素，以多重角色參與了機(jī)體的物質(zhì)及能量代謝過(guò)程，但其確切的生物學(xué)功能尚不清楚。胰島淀粉樣蛋白(IA)的主要構(gòu)成成分是胰淀素，尸檢發(fā)現(xiàn)90%以上Ⅱ型糖尿病者胰島中有IA的沉積。研究表明，可溶性、具有細(xì)胞毒性的胰淀素聚集體是胰島淀粉樣蛋白變性纖維形成過(guò)程中的早期中間產(chǎn)物，這種聚集體被稱之為中等大小毒性淀粉樣蛋白顆粒，可以破壞胰島細(xì)胞雙層脂質(zhì)膜，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的紊亂、離子濃度的改變，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終胰島細(xì)胞發(fā)生凋亡。

胰淀素與Ⅱ型糖尿病的關(guān)系越來(lái)越受到重視并逐步確認(rèn)，同時(shí)也存在不少爭(zhēng)議，而胰淀素的確切生物學(xué)功能尚未完全清楚，制備該激素高純度抗體是進(jìn)一步研究這一激素的生理病理作用的關(guān)鍵。然而由于該激素的分子量小、體內(nèi)含量低，采用單克隆抗體免疫法檢測(cè)其方法復(fù)雜，抗體缺乏穩(wěn)定性和特異性；用傳統(tǒng)制備抗體的方法，如雜交瘤技術(shù)和抗原免疫的方法制備抗體得到的抗體少，且工作繁瑣，周期較長(zhǎng)，制備出來(lái)的抗體缺乏穩(wěn)定性和特異性，因此給研究這一激素在體內(nèi)的廣泛的生理和病理作用帶來(lái)阻力，因此制備該激素高純度抗體是進(jìn)一步研究這一激素的關(guān)鍵。

抗體技術(shù)發(fā)展經(jīng)歷了三個(gè)階段：第一代為抗血清多克隆抗體（Polyclonal Antibody，PcAb）, 第二代為70 年代中期德國(guó)學(xué)者Kohler和英國(guó)學(xué)者milstein利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)（細(xì)胞工程生成抗體的技術(shù)）制備了雜交瘤單克隆抗體（Monoclonal Antibody，McAb），這一發(fā)現(xiàn)是生物技術(shù)發(fā)展的里程碑之一，在診斷、治療、預(yù)防等方面已顯示了重要作用。然而，由于異蛋白易引起人抗小鼠抗體（Human anti-mouse antibody ,HAMA）反應(yīng)，而人雜交瘤技術(shù)又難以突破，因此出現(xiàn)了第三代抗體，既基因工程抗體?；蚬こ炭贵w包括三種,即嵌合抗體(chimeric antibody)、重構(gòu)型抗體(reshaping antibody)和抗體庫(kù)技術(shù)制備的抗體。其中前兩者屬于部分人源化抗體，抗體庫(kù)技術(shù)制備的抗體屬全人源化抗體。即用基因克隆技術(shù)將全套抗體（Repertoire）重鏈和輕鏈可變區(qū)基因克隆出來(lái)，重組到原核表達(dá)載體，通過(guò)在大腸桿菌直接表達(dá)有功能的抗體分子片段，篩選特異性的可變基因。采用基因工程的方法免除了雜交瘤技術(shù)繁雜的篩選過(guò)程，甚至可以不經(jīng)過(guò)免疫獲得針對(duì)任何抗原的特異性抗體，特別是人源抗體的獲得，大大推進(jìn)了抗體工程的進(jìn)展，并解決了動(dòng)物源性抗體用于人體治療時(shí)產(chǎn)生異源反應(yīng)的難題，拓寬了抗體的應(yīng)用范圍。

噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的出現(xiàn)為人天然抗體的制備開(kāi)辟了新的途徑，為大量制備用于診斷和治療的高效優(yōu)質(zhì)的人源抗體提供了可行性，它使得篩選潛在的人抗體片段成為可能性，較好的解決了抗體難制備的問(wèn)題。該技術(shù)在腫瘤免疫治療中取得了突破性進(jìn)展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明就是為了解決現(xiàn)有的胰淀素試劑盒比較昂貴，且傳統(tǒng)方法制備的人源性胰淀素抗體易引起過(guò)敏反應(yīng)，抗體穩(wěn)定性和特異性差等問(wèn)題，所提出的一種人源性抗胰淀素抗體及其制備方法。

本發(fā)明是按照以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。

一種人源性抗胰淀素抗體，所述抗體的重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO：1 所示，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO：2 所示。

上述抗體的重鏈可變區(qū)DNA序列如SEQ ID NO：3所示，輕鏈可變區(qū)DNA序列如SEQ ID NO：4所示；重鏈基因?yàn)镮gG1 亞類VH3 基因家族，輕鏈基因?yàn)長(zhǎng)ambda 基因家族。

一種上述人源性抗胰淀素抗體的制備方法，包括以下步驟：

Ⅰ.人IgG Fab 段基因的PCR擴(kuò)增：分離人外周血中的淋巴細(xì)胞，提取總RNA，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用人特異性IgG Kappa鏈、Lambda鏈及重鏈 Gamma鏈引物分別對(duì)人輕鏈和重鏈基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

Ⅱ.噬菌體抗體庫(kù)的建立：步驟Ⅰ中獲得的PCR 產(chǎn)物按Fd、κ鏈和λ鏈分別進(jìn)行混合；將雙酶切后的輕鏈 PCR 混合物和噬菌粒進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞，擴(kuò)增搖菌后構(gòu)建輕鏈基因庫(kù)；將構(gòu)建好的輕鏈庫(kù)噬菌粒DNA和重鏈Fd段 PCR混合物進(jìn)行雙酶切，連接后電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，加入培養(yǎng)基培養(yǎng)，再加入輔助噬菌體繼續(xù)培養(yǎng)；離心收集上清后加入PEG沉淀液，冰浴，離心棄上清并重懸沉淀，再次離心收集上清即為噬菌體抗體庫(kù)；

Ⅲ. 噬菌體抗體庫(kù)的特異性富集與篩選：用稀釋后的胰淀素包被酶聯(lián)板，BSA-PBS溶液封閉后加入噬菌體抗體庫(kù)，孵育，先用PBST溶液洗滌，后用Gly-HCl緩沖液洗脫，并用Tris 緩沖液中和，感染培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌，取梯度稀釋后液體鋪板測(cè)定滴度，計(jì)算每輪篩選的產(chǎn)出率；余菌加入輔助噬菌體感染進(jìn)行下一輪的富集篩選，反復(fù)3-8次；

Ⅳ.抗胰淀素抗體的Phage-ELISA檢測(cè)：從篩選后的細(xì)菌菌落中隨機(jī)挑取多個(gè)克隆制備單克隆噬菌體抗體，用稀釋后的胰淀素包被酶聯(lián)板，BSA-PBS溶液封閉后加入噬菌體上清，孵育后用PBST溶液洗滌；加入HA-Tag Mouse mAb，孵育后用PBST溶液洗滌；再加入HRP-山羊抗小鼠IgG，孵育后用PBST溶液洗滌，加TMB溶液顯色，測(cè)定A450值；

Ⅴ.可變區(qū)DNA序列測(cè)定：ELISA 檢測(cè)后篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行DNA測(cè)序。

本發(fā)明獲得了如下的有益效果。

本發(fā)明有效的解決了現(xiàn)有的胰淀素試劑盒比較昂貴，且傳統(tǒng)方法制備的人源性胰淀素抗體易引起過(guò)敏反應(yīng)，抗體穩(wěn)定性和特異性差等問(wèn)題。本發(fā)明建立了高容量的噬菌體抗菌庫(kù)，篩選出了人源性胰淀素抗體，并且該抗體具有良好的抗原特異性和抗原結(jié)合活性，為進(jìn)一步的生產(chǎn)胰淀素檢測(cè)試劑盒提供了保障，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明重鏈Fd段基因PCR純化產(chǎn)物電泳圖；

圖2是本發(fā)明輕鏈基因PCR純化產(chǎn)物電泳圖；

圖3是本發(fā)明輕鏈庫(kù)經(jīng)SacⅠ和XbaⅠ雙酶切電泳圖；

圖4是本發(fā)明噬菌體抗體庫(kù)經(jīng)SacⅠ和SpeⅠ雙酶切電泳圖；

圖5是本發(fā)明Phage-ELISA法檢測(cè)噬菌體抗體對(duì)amylin抗原的結(jié)合活性圖。

圖6是本發(fā)明C1重鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu)圖；

圖7是本發(fā)明C1輕鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu)圖。

具體實(shí)施方式

一、實(shí)驗(yàn)材料

噬菌粒載體pComb3XSS（4900bp）購(gòu)買于美國(guó)Scripps 研究所；大腸桿菌XL1-Blue 及輔助噬菌體 VCSM13 購(gòu)于美國(guó)Stratagene公司；TRNzol-A⁺ Total RNA Reagent、Quantscript RT Kit、2×Taq PCR MasterMix、普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒、高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒均購(gòu)自TIANGEN公司；限制性內(nèi)切酶 SacⅠ、XbaⅠ、XhoⅠ、SpeⅠ均購(gòu)自TaKaRa 公司；Amylin 片段（8-37）購(gòu)自Sigma 公司；HA-Tag Mouse mAb（26D11）購(gòu)自Abmart 公司、HRP-山羊抗小鼠IgG（H+L）購(gòu)自北京鼎國(guó)公司；HRP標(biāo)記羊抗人Fab IgG抗體購(gòu)自Sigma公司；其他試劑為國(guó)內(nèi)分析純。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.人IgG Fab 段基因的PCR擴(kuò)增：

用淋巴細(xì)胞分離液從正常健康人的外周血中分離淋巴細(xì)胞，用TRNzol-A⁺提取細(xì)胞總RNA，用Oligo（dT）₁₅為引物將提取的RNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，（參照文獻(xiàn) Kang AS, Burton DR, Jones TM, et al. Combinatorial immunoglubulin libraries in phage λ. Methods: Comp Methods Enzymol,1991;2(2): 111-118. 和Marks JD,Hoogenboom HK, Bonnert TP, et al. By-passing immunization. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage. J Mol Biol, 1991;222(3):581-597.）分別以人特異性IgG Kappa鏈、Lambda鏈及重鏈 Gamma鏈5’端和3’端引物的不同組合（引物序列如下）對(duì)人輕鏈（VC+HC）和重鏈（VH+CH1）基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為94℃預(yù)變性3min，94℃ 1min，54℃~58℃ （54℃、55℃、56℃、57℃、58℃）50s，72℃ 1min，30個(gè)循環(huán)后，72℃ 延伸10min。

（1）人免疫球蛋白重鏈（Gamma鏈）Fd 段可變區(qū)5’端引物：

VH1a：5’-CAG GTG CAG CTC GAG CAG TCT GGG-3’，

VH1f：5’-CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GGG-3’，

VH2f：5’-CAG GTG CAG CTA CTC GAG TCG GG-3’，

VH3a：5’-CAG GTG CAG CTC GAG GAG TCT GGG-3’，

VH3f：5’-GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GGG-3’，

VH4f：5’-CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCG GG-3’，

VH6a：5’-CAG GTA CAG CTC GAG CAG TCA GG-3’，

VH6f：5’-CAG GTG CAG CTA CTC GAG TGG GG-3’。

人免疫球蛋白重鏈（Gamma鏈）CH1區(qū)3’端引物：

CG1z：5’-GCA TGT ACT AGT TTT GTC ACA AGA TTT GGG-3’，

CG2a：5’-CTC GAC ACT AGT TTT GCG CTC AAC TGT CTT-3’，

CG3a：5’-TGT GTG ACT AGT GTC ACC AAG TGG GGT TTT-3’，

CG4a：5’-GCA TGA ACT AGT TGG GGG ACC ATA TTT GGA-3’，

（2）人免疫球蛋白Kappa 鏈可變區(qū)5’端引物：

Vκ1a：5’-GAC ATC GAG CTC ACC CAG TCT CCA -3’，

Vκ1s：5’-GAC ATC GAG CTC ACC CAG TCT CC-3’，

Vκ2a：5’-GAT ATT GAG CTC ACT CAG TCT CCA -3’，

Vκ3a：5’-GAA ATT GAG CTC ACG CAG TCT CCA -3’，

Vκ3b：5’-GAA ATT GAG CTC ACG CAG TCT CCA-3’。

人免疫球蛋白Kappa 鏈恒定區(qū)3’端引物：

Cκ1d：5’-GCG CCG TCT AGA ATT AAC ACT CTC CCC TGT TGA AGC TCT TTG TGA CGG GCG AAC TCA G-3’。

（3）人免疫球蛋白Lambda 鏈可變區(qū)5’端引物：

VL1：5’-AAT TTT GAG CTC ACT CAG CCC CAC -3’，

VL2：5’-TCT GCC GAG CTC CAG CCT GCC TCC GTG -3’，

VL3：5’-TCT GTG GAG CTC CAG CCG CCC TCA GTG -3’，

VL4：5’-TCT GAA GAG CTC CAG GAC CCT GTT GTG TCT GTG-3’，

VL5：5’-CAG TCT GAG CTC ACG CAG CCG CCC-3’，

VL6：5’-CAG ACT GAG CTC ACT CAG GAG CCC-3’，

VL7：5’-CAG GTT GAG CTC ACT CAA CCG CCC-3’，

（4）人免疫球蛋白Lambda 鏈恒定區(qū)3’端引物：

Cλ2：5’-CGC CGT CTA GAA TTA TGA ACA TTC TGT AGG-3’

CTC GAG 為內(nèi)切酶XhoⅠ識(shí)別位點(diǎn)；ACT AGT為內(nèi)切酶SpeⅠ識(shí)別位點(diǎn)；GAG CTC 為內(nèi)切酶SacⅠ識(shí)別位點(diǎn)；TCT AGA 為內(nèi)切酶XbaⅠ識(shí)別位點(diǎn)。

2.噬菌體抗體庫(kù)的建立：

上述 PCR 產(chǎn)物分別經(jīng)瓊脂糖凝膠純化回收（680bp）后，按Fd、κ鏈和λ鏈分別混合。將輕鏈 PCR 混合產(chǎn)物及噬菌粒 pComb3XSS分別用XbaⅠ和SacⅠ雙酶切，經(jīng)電泳后純化回收。然后將二者用T4連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物10μl電轉(zhuǎn)化入300μl感受態(tài)細(xì)胞 XL1-Blue，電轉(zhuǎn)條件為：Bio-Red電轉(zhuǎn)儀，0.2cm電轉(zhuǎn)杯，2.5kV，擴(kuò)增搖菌后構(gòu)建輕鏈基因庫(kù)。

將提取的輕鏈庫(kù)噬菌粒DNA和重鏈Fd段PCR混合產(chǎn)物用SpeⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，連接后電轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌XL1-Blue。電轉(zhuǎn)后加入3ml 預(yù)熱SOC培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h后加入10ml 預(yù)熱的SB-A⁺T⁺（Amp 50μg/ml ，Tet 10μg/ml）培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h 后加Amp至100μg/ml，37℃振蕩培養(yǎng)1h，加入輔助噬菌體VCSM13約10¹² pfu/ml 混勻后并入100ml SB-A⁺T⁺（Amp 50μg/ml ，Tet 10μg/ml）培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)2h后加入Kan 至70μg/ml后振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次晨離心收集上清后加入PEG沉淀液，冰浴30min后離心棄上清，2ml 1% BSA-PBS重懸沉淀后再次離心收集上清即為噬菌體抗體庫(kù)。

其中

SOC培養(yǎng)基：

胰化蛋白胨 20g

酵母提取物 5 g

NaCl 0.5 g

KCl（1mol/L） 2.5ml

溶于800ml雙蒸水中，用5mol/L NaOH 調(diào)PH至7.0，補(bǔ)雙蒸水至1000ml，高溫高壓滅菌后，4℃保存。使用前加入除菌葡萄糖至20mmol/L和除菌MgCl₂至10mmol/L。

SB培養(yǎng)基：

胰化蛋白胨 30g

酵母提取物 20 g

MOPS 10 g

溶于800ml雙蒸水中，用5mol/L NaOH 調(diào)PH至7.0，補(bǔ)雙蒸水至1000ml，高溫高壓滅菌后，4℃保存。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：取血正常健康人的新鮮外周血，分離外周血淋巴細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA ，用13對(duì)輕鏈引物和21對(duì)重鏈Fd段引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在680bp處出現(xiàn)特異性條帶（參見(jiàn)圖1，2；其中，圖1中1-5泳道分別是用人免疫球蛋白重鏈Gamma鏈Fd 段可變區(qū)5’端引物和CH1區(qū)3’端引物作為引物進(jìn)行PCR后的產(chǎn)物：VH1a+CG2a、VH1f+CG2a、VH2f+CG2a、VH3a+CG2a、VH4f+CG2a；圖2中1-5泳道分別是用人免疫球蛋白Lambda 鏈可變區(qū)5’端引物和人免疫球蛋白Lambda 鏈恒定區(qū)3’端引物作為引物進(jìn)行PCR后的產(chǎn)物：VL3+ Cλ2、VL4+ Cλ2、VL5+ Cλ2、VL6+ Cλ2、VL7+ Cλ2）。輕鏈PCR產(chǎn)物混合后經(jīng)酶切電轉(zhuǎn)入XL1-Blue 細(xì)菌，建立輕鏈基因庫(kù)（4380bp）。用SacⅠ和 XbaⅠ雙酶切將轉(zhuǎn)入的輕鏈（680bp）基因切下來(lái)，電泳在3700bp和680bp處得到兩條特異性條帶（參見(jiàn)圖3，其中1-10泳道為輕鏈庫(kù)經(jīng)SacⅠ和XbaⅠ雙酶切后的產(chǎn)物，M1為Marker DL15000，從上到下依次為15000bp、10000bp、7500bp、5000bp、3000bp、1500bp、1000bp、500bp；M2 為Marker DL2000，從上到下依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp）。將提取的輕鏈庫(kù)噬菌粒DNA和重鏈Fd段 PCR 產(chǎn)物均用XhoⅠ和SpeⅠ雙酶切，連接后電轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌XL1-Blue，建立了噬菌體抗體基因庫(kù)（4760bp），庫(kù)容為8.4×10⁷。用SacⅠ和SpeⅠ雙酶切將轉(zhuǎn)入的含輕鏈（680bp）和重鏈Fd（680bp）的共同片段切下來(lái)，電泳在3260bp和1500bp處得到兩條特異性條帶（參見(jiàn)圖4，其中1-10泳道為噬菌體抗體庫(kù)經(jīng)SacⅠ和SpeⅠ雙酶切后的產(chǎn)物；M1為Marker DL15000，從上到下依次為15000bp、10000bp、7500bp、5000bp、3000bp、1500bp、1000bp、500bp；M2 為Marker DL2000，從上到下依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；3-7，9、10為陽(yáng)性克隆，釋放出1500bp的基因片段，為Fab片段）。

3. 噬菌體抗體庫(kù)的特異性富集與篩選：（參照文獻(xiàn)Griffiths AD, Duncan AR. Strategies for selection of antibodies by phage display [J] . Curr Opin Biotechnol, 1998; 9(1): 102-108, 和Barbas C Ⅲ, Kang AS, Lenner RA, et al. Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surfaces : the gene Ⅲ site. Proc Natl Acad Sci USA, 1991; 89: 10164-10168, 以及 Barbas C Ⅲ, Lenner RA, Combinatorial immunoglobulin libraries on the surface of phage (phabs) : rapid selection of antigen specific Fabs. Methods: Comp Methods Enzymol, 1991; 2(2): 119-124. ）用碳酸氫鹽緩沖液（pH8.6）稀釋胰淀素至濃度為50μg/ml，每孔50μl包被酶聯(lián)板，濕盒中4℃過(guò)夜；次日用3% BSA-PBS（牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液（PBS））封閉1h，加入新鮮制備的噬菌體抗體庫(kù)（100μl/孔），濕盒中37℃孵育2小時(shí)；棄抗體庫(kù)液，用含0.05% Tween-20的PBS（PBST）洗去非特異性結(jié)合或結(jié)合力弱的噬菌體抗體（第一輪篩選時(shí)洗1次；第二輪洗5次；第三輪洗10次），每孔以 50μl pH2.2 的0.1mol/L Gly-HCl 緩沖液洗脫下與胰淀素特異性結(jié)合的噬菌體抗體，并用8μl pH9.6的2M Tris 緩沖液中和，感染2ml新鮮培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD600為0.6~1.0）的大腸桿菌XL1-blue ，37℃孵育30 min。取10μl梯度稀釋后鋪板測(cè)定滴度，計(jì)算每輪篩選的產(chǎn)出率；余菌加入VCSM13感染后進(jìn)行下一輪的富集篩選，如此“吸附-洗脫-擴(kuò)增”反復(fù)3-8次，優(yōu)選5次。

其中PBS組成及配制方法：

在800ml蒸餾水中溶解

NaCl 8g

KCl 0.2g

Na₂HPO₄ 1.44g

KH₂PO₄ 0.24g

用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4加水定容至1L，高壓下蒸汽滅菌30min。保存于室溫。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：用固相化的人Amylin作為抗原對(duì)噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行了3輪篩選，計(jì)算每一輪產(chǎn)率（yield%）見(jiàn)表1，雖然洗滌強(qiáng)度逐輪增加，但洗脫下來(lái)的特異性噬菌體抗體滴度卻明顯增加，產(chǎn)率也增加，特異性噬菌體抗體得到了明顯富集。經(jīng)3輪篩選后富集的滴度為4×10⁹。

*：產(chǎn)率（%）=（產(chǎn)出的噬菌體量）/（投入的噬菌體量）×100%

4. 抗胰淀素抗體的Phage-ELISA檢測(cè)：

從篩選后的細(xì)菌菌落中隨機(jī)挑取28個(gè)克隆制備單克隆噬菌體抗體，將Amylin抗原稀釋至10μg/ml包被酶聯(lián)板，同時(shí)設(shè)空載體pComb3XSS 噬菌體上清、無(wú)關(guān)抗原BSA 作為陰性對(duì)照。3% BSA-PBS封閉后加入上述噬菌體上清，37℃ 孵育2h。PBST洗6次，每次5min。每孔加入50μl HA-Tag Mouse mAb（26D11）（1：600），37℃ 孵育1 h 后 PBST 洗6次；每孔再加入50μl HRP-山羊抗小鼠IgG（H+L）（1：2000），37℃ 孵育1 h，PBST洗板后加TMB 顯色，酶標(biāo)儀測(cè)A₄₅₀值（見(jiàn)表2）。

C10：空載體噬菌體上清陰性對(duì)照；C11：無(wú)關(guān)抗原BSA對(duì)照；C12：空白對(duì)照

ELISA 檢測(cè)后選陽(yáng)性克隆的菌株送上海Invitrogen 公司完成DNA測(cè)序。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：其中有4個(gè)克?。ˋ12，B11，C1，C2）呈陽(yáng)性（以O(shè)D₄₅₀>陰性對(duì)照值2.1倍判定為陽(yáng)性），陽(yáng)性率為14.3%（表2）。用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，陽(yáng)性克隆組與空載體對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；陽(yáng)性克隆組與無(wú)關(guān)抗原BSA對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。上述結(jié)果表明陽(yáng)性克隆的抗體具有amylin抗原的特異結(jié)合活性（參見(jiàn)圖5，其中^bP<0.01 vs 空載體對(duì)照組；^dP<0.01 vs BSA對(duì)照組）。

取C1陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取噬粒DNA，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序分析。用NCB1中的NucleotidemBlast和Blast Analysis of Immunoglobulin Sequences分析軟件對(duì)其序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：C1號(hào)陽(yáng)性克隆的輕鏈可變區(qū)與人免疫球蛋白λ鏈有93%的同源性，重鏈可變區(qū)基因與人免疫球蛋白IgG重鏈VH3有88%的同源性。λ輕鏈V基因?qū)儆赩λ 2亞群，J基因?qū)儆贘λ3；重鏈V基因?qū)儆赩H3-15亞群，D基因來(lái)自D3-16，J基因來(lái)自JH5。

5.氨基酸序列翻譯

將陽(yáng)性克隆C1輕鏈和重鏈Fd段核苷酸序列按正確的讀碼框翻譯成氨基酸序列并對(duì)其決定簇互補(bǔ)區(qū)(CDR)進(jìn)行了定位。用分析軟件對(duì)陽(yáng)性克隆輕鏈和重鏈Fd段的氨基酸序列進(jìn)行了二級(jí)結(jié)構(gòu)模擬，結(jié)果顯示二者均符合抗體二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)型（圖6、7）。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院

<120> 人源性抗胰淀素抗體及其制備方法

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 60

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<220>

<221> C1重鏈可變區(qū)氨基酸序列

<222> (1)..(60)

<400> 1

Glu Glu Phe Lys Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu

20 25 30

Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

35 40 45

Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala Trp Met

50 55 60

<130> 2

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 104

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<220>

<221> C1輕鏈可變區(qū)氨基酸序列

<222> (1)..(104)

<400> 1

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

1 5 10 15

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

20 25 30

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

35 40 45

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

50 55 60

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

65 70 75 80

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

85 90 95

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Ala

100

<130> 3

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 679

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<220>

<221> C1重鏈可變區(qū)DNA序列

<222> (1)..(679)

<400> 1

aactcataat ttataatgtc agtcatcagc cctcaggggt ttctagtcgc ttctctggct 60

ccaagtctgg caacacggcc tccctgacca tctctgggct ccaggctgag gacgaggctg 120

attattactg cagctcacat acaagcagca gaacttgggt gttcggcgga gggaccaagc 180

tgaccgtcct aggtcagccc aaggctgccc cctcggtcac tctgttcccg ccctcctctg 240

aggagcttca agccaacaag gccacactgg tgtgtctcat aagtgacttc tacccgggag 300

ccgtgacagt ggcctggaag gcagatagca gccccgtcaa ggcgggagtg gagaccacca 360

caccctccaa acaaagcaac aacaagtacg cggccagcag ctacctgagc ctgacgcctg 420

agcagtggaa gtcccacaaa agctacagct gccaggtcac gcatgaaggg agcaccgtgg 480

agaagacagt ggcccctaca gaatgttcat aattctagat aattaattag gaggaattta 540

aaatgaaata cctattgcct acggcagccg ctggattgtt attactcgct gcccaaccag 600

ccatggccga ggtgcagctg ctcgagtctg ggggaggctt ggtaaagcct ggggggtccc 660

tcagactctc ctgtgcagc 679

<130> 4

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 676

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<220>

<221> C1輕鏈可變區(qū)DNA序列

<222> (1)..(676)

<400> 1

ctccaggctg aggacgaggc tgattattac tgcagctcac atacaagcag cagaacttgg 60

gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggtcagc ccaaggctgc cccctcggtc 120

actctgttcc cgccctcctc tgaggagctt caagccaaca aggccacact ggtgtgtctc 180

ataagtgact tctacccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc 240

aaggcgggag tggagaccac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc 300

agctacctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca aaagctacag ctgccaggtc 360

acgcatgaag ggagcaccgt ggagaagaca gtggccccta cagaatgttc ataattctag 420

ataattaatt aggaggaatt taaaatgaaa tacctattgc ctacggcagc cgctggattg 480

ttattactcg ctgcccaacc agccatggcc gaggtgcagc tgctcgagtc tgggggaggg 540

ttggtaaagc ctggggggtc ccttagactc tcctgtgcag cctctggatt cgctttcaga 600

gccgcctgga tgaactgggt ccgccaggct ccagggaagg gctggagtgg ttggccgcat 660

taacagacaa attatg 676

SEQUENCE LISTING

<110> 天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院

<120> 人源性抗胰淀素抗體及其制備方法

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 60

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<220>

<221> C1重鏈可變區(qū)氨基酸序列

<222> (1)..(60)

<400> 1

Glu Glu Phe Lys Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu

20 25 30

Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

35 40 45

Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala Trp Met

50 55 60

<130> 2

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 104

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<220>

<221> C1輕鏈可變區(qū)氨基酸序列

<222> (1)..(104)

<400> 1

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

1 5 10 15

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

20 25 30

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

35 40 45

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

50 55 60

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

65 70 75 80

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

85 90 95

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Ala

100

<130> 3

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 679

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<220>

<221> C1重鏈可變區(qū)DNA序列

<222> (1)..(679)

<400> 1

aactcataat ttataatgtc agtcatcagc cctcaggggt ttctagtcgc ttctctggct 60

ccaagtctgg caacacggcc tccctgacca tctctgggct ccaggctgag gacgaggctg 120

attattactg cagctcacat acaagcagca gaacttgggt gttcggcgga gggaccaagc 180

tgaccgtcct aggtcagccc aaggctgccc cctcggtcac tctgttcccg ccctcctctg 240

aggagcttca agccaacaag gccacactgg tgtgtctcat aagtgacttc tacccgggag 300

ccgtgacagt ggcctggaag gcagatagca gccccgtcaa ggcgggagtg gagaccacca 360

caccctccaa acaaagcaac aacaagtacg cggccagcag ctacctgagc ctgacgcctg 420

agcagtggaa gtcccacaaa agctacagct gccaggtcac gcatgaaggg agcaccgtgg 480

agaagacagt ggcccctaca gaatgttcat aattctagat aattaattag gaggaattta 540

aaatgaaata cctattgcct acggcagccg ctggattgtt attactcgct gcccaaccag 600

ccatggccga ggtgcagctg ctcgagtctg ggggaggctt ggtaaagcct ggggggtccc 660

tcagactctc ctgtgcagc 679

<130> 4

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 676

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<220>

<221> C1輕鏈可變區(qū)DNA序列

<222> (1)..(676)

<400> 1

ctccaggctg aggacgaggc tgattattac tgcagctcac atacaagcag cagaacttgg 60

gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggtcagc ccaaggctgc cccctcggtc 120

actctgttcc cgccctcctc tgaggagctt caagccaaca aggccacact ggtgtgtctc 180

ataagtgact tctacccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc 240

aaggcgggag tggagaccac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc 300

agctacctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca aaagctacag ctgccaggtc 360

acgcatgaag ggagcaccgt ggagaagaca gtggccccta cagaatgttc ataattctag 420

ataattaatt aggaggaatt taaaatgaaa tacctattgc ctacggcagc cgctggattg 480

ttattactcg ctgcccaacc agccatggcc gaggtgcagc tgctcgagtc tgggggaggg 540

ttggtaaagc ctggggggtc ccttagactc tcctgtgcag cctctggatt cgctttcaga 600

gccgcctgga tgaactgggt ccgccaggct ccagggaagg gctggagtgg ttggccgcat 660

taacagacaa attatg 676