專利名稱：抗c-Met人源化抗體及含其的預(yù)防或治療癌癥用的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開內(nèi)容涉及抗C-Met人源化抗體及包括其的用于預(yù)防和治療癌癥的藥物組合物。
背景技術(shù)：
c-Met是肝細(xì)胞生長因子(HGF)的受體，且HGF是與c_Met受體酪氨酸激酶的胞外區(qū)結(jié)合以誘發(fā)在多種正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的有絲分裂發(fā)生、運(yùn)動(movement)、形態(tài)發(fā)生和血管發(fā)生的一類細(xì)胞因子。c-Met是存在于細(xì)胞表面上的代表性的受體酪氨酸激酶，本身是原癌基因，且有時涉及與癌癥相關(guān)的多種機(jī)制如癌癥發(fā)生(development)、轉(zhuǎn)移、遷移、侵入和血管發(fā)生，與配體HGF無關(guān)。因此，c-Met近來形成為新的用于抗癌治療的靶。特別地，已知c-Met涉及誘發(fā)對常用抗癌藥物的耐藥性，且因此被認(rèn)為對于個人化的治療是重要的。靶向表皮生長因子受體(EGFR) (ERBBl)的代表性的抗癌治療藥物即Erbitux或Tarceva通過阻斷涉及癌癥發(fā)生機(jī)制的信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)而起作用。另外,公知作為乳腺癌治療藥物的Herceptin靶向ERBB2 (HER2)并通過阻斷細(xì)胞增殖所必需的信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)而起作用。但是，近來的報道是，在對上述藥物有耐藥性的患者中，抗癌藥物由于c-Met蛋白質(zhì)的過表達(dá)而不起作用和誘發(fā)細(xì)胞增殖的其它信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制被激活。因此，對于許多藥物公司，c-Met已形成為抗癌藥物的祀分子。相關(guān)技術(shù)公開了抑制C-Met作用的抗體治療藥物。但是，在該相關(guān)技術(shù)中，具有原始結(jié)構(gòu)的所述抗體誘發(fā)c-Met分子的二聚，由此導(dǎo)致癌癥。在公開了抑制c-Met作用的抗體治療藥物的另一相關(guān)技術(shù)中，所述抗體能夠抑制c-Met與HGF (其為c-Met配體)的結(jié)合,但是所述抗體與c_Met的結(jié)合誘發(fā)c_Met的二聚，與所述配體無關(guān)。結(jié)果，所述抗體作為誘發(fā)致癌信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)的激動劑。另一相關(guān)技術(shù)公開了，為了防止c-Met的二聚,c-Met的單臂(one-armed)拮抗抗體(其通過修飾激動劑而制備)、和使用遺傳重組方法的雙臂(two-armed)抗體、及在臨床試驗(yàn)中的產(chǎn)品開發(fā)目前正在進(jìn)行中。但是，即使在該相關(guān)技術(shù)中，所述抗體僅在與化學(xué)治療一起進(jìn)行治療時起作用，且當(dāng)所述抗體獨(dú)立地治療時，抗癌治療效果被證明是低的。因此，仍需要開發(fā)抑制c-Met作用的用于預(yù)防和治療癌癥的新的藥物組合物。

發(fā)明內(nèi)容
提供抗C-Met人源化抗體。提供用于預(yù)防和治療癌癥的包括抗C-Met人源化抗體的藥物組合物。


由結(jié)合附圖考慮的實(shí)施方式的以下 描述，這些和/或其它方面將變得明晰和更容易理解，其中
圖1說明根據(jù)實(shí)施方式證實(shí)嵌合抗體chAbF46及3種類型人源化抗體huAbF46-II1、huAbF46-II2 和 huAbF46_II4 是否識別抗原的結(jié)果；圖2說明根據(jù)實(shí)施方式證實(shí)人源化抗體的激動副作用程度的結(jié)果；圖3說明根據(jù)實(shí)施方式使用BrdU測定證實(shí)具有修飾的鉸鏈區(qū)的chAbF46的激動副作用程度的結(jié)果；圖4說明根據(jù)實(shí)施方式通過測量Akt磷酸化程度證實(shí)具有修飾的鉸鏈區(qū)的chAbF46的激動副作用程度的結(jié)果；圖5說明根據(jù)實(shí)施方式在體外進(jìn)行的具有修飾的鉸鏈區(qū)的chAbF46的細(xì)胞增殖分析的結(jié)果的圖；圖6說明根據(jù)實(shí)施方式在體內(nèi)進(jìn)行的在胃癌小鼠異種移植物模型中具有修飾的鉸鏈區(qū)的chAbF46的抗癌分析的結(jié)果的圖；圖7說明根據(jù)實(shí)施方式使用BrdU測定證實(shí)具有修飾的鉸鏈區(qū)的人源化抗體huAbF46的激動副作用程度的結(jié)果；圖8說明根據(jù)實(shí)施方式在體外進(jìn)行的具有修飾的鉸鏈區(qū)的人源化抗體huAbF46的細(xì)胞增殖分析的結(jié)果的圖；和圖9說明根據(jù)實(shí)施方式在體內(nèi)進(jìn)行的在胃癌小鼠異種移植物模型中具有修飾的鉸鏈區(qū)的人源化抗體huAbF46的抗癌分析的結(jié)果的圖。
具體實(shí)施例方式現(xiàn)在將詳細(xì)介紹實(shí)施方式，其實(shí)例說明在附圖中，其中相同的附圖標(biāo)記始終是指相同的元件。在這點(diǎn)上，本實(shí)施方式可具有不同的形式，且不應(yīng)解釋為限于本文中闡述的描述。因此，以下僅通過參考附圖描述實(shí)施方式以解釋本描述的各方面。如本文中使用的術(shù)語“和/或”包括相關(guān)所列項(xiàng)目的一個或多個的任何和全部組合。根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供抗c-Met人源化抗體，其包括具有SEQ ID N0:1的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有SEQ ID NO :2的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供抗c-Met人源化抗體，其包括具有SEQ ID N0:3的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有SEQ ID NO :4的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。術(shù)語“c-Met”或“c-Met蛋白質(zhì)”是指與肝細(xì)胞生長因子(HGF)結(jié)合的受體酪氨酸激酶。c-Met蛋白質(zhì)包括通過確定為GenBank登錄號匪000245的核苷酸序列編碼的多肽，通過確定為GenBank登錄號匪000236的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)，和/或其胞外區(qū)。受體酪氨酸激酶c-Met參與多種機(jī)制如癌癥發(fā)生、轉(zhuǎn)移、遷移、侵入和血管發(fā)生。所述c-Met可衍生自選自人、猴子、小鼠和大鼠的c_Met。通過用所需抗原使非免疫性動物免疫產(chǎn)生的動物衍生的抗體當(dāng)為了醫(yī)療向人注射時通常引起免疫原性，因此已開發(fā)嵌合抗體以抑制這樣的免疫原性。嵌合抗體通過如下制備通過遺傳工程用人抗體的恒定區(qū)置換導(dǎo)致抗-同種型反應(yīng)的動物衍生的抗體的恒定區(qū)。與動物衍生的抗體相比，嵌合抗體在抗-同種型反應(yīng)方面顯著改善，但是動物衍生的氨基酸仍存在于可變區(qū)中，因此嵌合抗體具有關(guān)于潛在的抗獨(dú)特型基因型(ant1-1diotypic)反應(yīng)的副作用。開發(fā)人源化抗體以減少這樣的副作用。人源化抗體通過如下產(chǎn)生將在嵌合抗體的可變區(qū)中抗原結(jié)合方面起重要作用的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)移植到人抗體框架。
在CDR移植以產(chǎn)生人源化抗體中最重要的事情是選擇最優(yōu)化的人抗體以接受動物衍生的抗體的CDR，且因此采用抗體數(shù)據(jù)庫的使用、晶體結(jié)構(gòu)的分析和分子模型化的技術(shù)。但是，即使當(dāng)動物衍生的抗體的CDR移植到最優(yōu)化的人抗體框架時，也存在影響抗原結(jié)合的位于動物衍生的抗體的框架中的氨基酸。因此，在許多情況下，抗原結(jié)合力未保持，且因此應(yīng)用另外的抗體工程技術(shù)以恢復(fù)所述抗原結(jié)合力是必需的。所述c-Met的人源化抗體是使c_Met小鼠抗體的免疫原性最小化的人源化抗體，其包括具有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 3的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。根據(jù)實(shí)施方式，所述抗體可為單克隆抗體。完整抗體包括兩個全長輕鏈和兩個全長重鏈，其中各輕鏈通過二硫鍵與所述重鏈連接。所述抗體具有重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)。所述重鏈恒定區(qū)為伽馬(Y)、謬(U)、阿爾法(a )、德爾塔(S )或厄普西隆(￡ )型，其可進(jìn)一步分類為伽馬I ( Y I)、伽馬2 ( Y 2)、伽馬3 ( Y 3)、伽馬4 ( Y 4)、阿爾法I ( a I)或阿爾法2 ( a 2)。所述輕鏈恒定區(qū)為卡帕(k )或拉姆達(dá)U)型。 術(shù)語“重鏈”是指全長重鏈、及其片段，包括可變區(qū)Vh和三個恒定區(qū)的域CH1、CH2、CH3、以及鉸鏈，所述可變區(qū)Vh包括其存在是抗原結(jié)合所必需的CDR的氨基酸序列。術(shù)語“輕鏈”是指全長輕鏈、及其片段，包括可變區(qū)\和恒定區(qū)Q，所述可變區(qū)\包括其存在是抗原結(jié)合所必需的CDR的氨基酸序列。在本文中使用的術(shù)語“互補(bǔ)決定區(qū)(CDR) ”是指抗體可變域的氨基酸殘基，其存在是抗原結(jié)合所必需的。特別地，它們存在于免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的高變區(qū)。各可變域典型地具有三個⑶R，確定為⑶Rl (⑶RH1&CDRL1)、⑶R2(⑶RH2&CDRL2)和CDR3(CDRH3&CDRL3)。CDR可提供在抗體與抗原或表位的結(jié)合中起主要作用的接觸殘基。另夕卜，術(shù)語“特異性結(jié)合”或“特異性識別”是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，且表明抗體和抗原彼此特異性相互作用以產(chǎn)生免疫學(xué)活性。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，所述抗體可為選自scFv、(scFv)2、Fab、Fab’和F(ab’ )2的抗原結(jié)合片段。本文中使用的術(shù)語“抗原結(jié)合片段”是指包括完整抗體的具有抗原結(jié)合區(qū)的部分的片段。例如，所述抗原結(jié)合片段可為scFv、(ScFv)2, Fab, Fab^或F(ab’)2，但不限于此。Fab片段包含所述輕鏈的可變和恒定域以及所述重鏈的可變域和第一恒定域(Cm)。Fab片段具有一個抗原結(jié)合位點(diǎn)。Fab’片段與Fab片段的不同在于Fab’具有在Cm的C-末端的擁有至少一個半胱氨酸殘基的鉸鏈區(qū)。F(ab’)2片段包括一對Fab片段，所述一對Fab片段通常通過在它們之間的鉸鏈半胱氨酸殘基經(jīng)由在它們的羧基末端附近的二硫鍵共價連接。Fv片段是包含完整抗原識別和結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段。該區(qū)由緊密聯(lián)合的一個重和一個輕鏈可變區(qū)的二聚體組成，且用于產(chǎn)生Fv片段的重組技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。Fv片段可具有其中所述重鏈和輕鏈可變區(qū)通過非共價鍵連接的結(jié)構(gòu)。單鏈Fv(ScFv)片段通?？删哂衅渲兄劓満洼p鏈可變區(qū)經(jīng)由肽接頭共價結(jié)合的二聚體結(jié)構(gòu)，而二硫連接的(ScFv)2片段可具有其中兩個scFv片段經(jīng)由肽接頭在C-末端彼此直接連接的結(jié)構(gòu)。所述抗原結(jié)合片段可使用蛋白酶獲得，如使用木瓜蛋白酶以獲得Fab片段和使用胃蛋白酶以獲得F(ab’)2片段，且可通過遺傳重組技術(shù)制備。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，所述抗體可包括具有通過缺失、插入或取代一個或多個氨基酸的修飾的氨基酸序列的鉸鏈區(qū)。例如，所述抗體可包括具有SEQ ID NO :5或SEQ IDNO 6的氨基酸序列的鉸鏈區(qū)。術(shù)語“鉸鏈區(qū)”是指抗體的重鏈中包含的區(qū)，其存在于C01和Ch2區(qū)之間，并用于向所述抗體中的抗原結(jié)合位點(diǎn)提供柔性。當(dāng)動物衍生的抗體經(jīng)歷嵌合(chimerization)過程時,動物衍生的IgGl鉸鏈用人IgGl鉸鏈置換，但是動物衍生的IgGl鉸鏈的長度比人IgGl鉸鏈的長度短，且在兩個重鏈之間的二硫鍵由3個減少至2個，且因此鉸鏈的剛性可具有不同的效果。因此，鉸鏈區(qū)的修飾可增加人源化抗體的抗原結(jié)合效率。用于修飾所述鉸鏈區(qū)的氨基酸序列的缺失、插入或取代氨基酸的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，提供包括SEQ ID NO 1的氨基酸序列的抗c_Met人源化抗體的重鏈可變區(qū)和包括SEQ ID NO :2的氨基酸序列的抗c-Met人源化抗體的輕鏈可變區(qū)。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，提供包括SEQ ID NO 3的氨基酸序列的抗c_Met人源化抗體的重鏈可變區(qū)和包括SEQ ID NO :4的氨基酸序列的抗c-Met人源化抗體的輕鏈可變區(qū)。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，提供用于預(yù)防或治療癌癥的藥物組合物。所述藥物組合物包括藥物有效量的抗c-Met人源化抗體和可藥用載體、稀釋劑或賦形劑，所述抗c-Met人源化抗體包括具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，或所述抗c-Met人源化抗體包括具有SEQ ID NO :3的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有SEQ ID NO 4的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。根據(jù)實(shí)施方式，所述癌癥可為選自如下的一種鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、腹膜癌、皮膚癌、皮膚或眼球中的黑素瘤、直腸癌、肛門附近的癌、食道癌、小腸腫瘤、內(nèi)分泌腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、慢性或急性白血病、淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、肝瘤(hepatoma)、胃腸癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細(xì)胞腺瘤、乳腺癌(breast cancer)、結(jié)腸癌、大腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、夕卜陰癌、甲狀腺癌、和頭頸癌。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，所述抗體可包括具有通過缺失、插入或取代一個或多個氨基酸的修飾的氨基酸序列的鉸鏈區(qū)。例如，所述抗體可包括具有SEQ ID NO :5或SEQ IDNO 6的氨基酸序列的鉸鏈區(qū)。當(dāng)所述組合物制造為用于預(yù)防或治療癌癥的藥物組合物時，所述組合物可包括可藥用載體。所述組合物中包括的可藥用載體可包括常用的乳糖、葡萄糖(右旋糖)、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯樹膠、磷酸鈣、藻酸鹽、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油，但不限于此。所述藥物組合物可進(jìn)一步包括潤滑劑、潤濕劑、增甜劑、增香劑、乳化齊U、懸浮劑和防腐劑。所述用于預(yù)防或治療癌癥的藥物組合物可口服或胃腸外施用(給藥)。所述胃腸外施用可包括靜脈內(nèi)注射、皮下注射、肌肉注射、腹膜內(nèi)注射、內(nèi)皮施用、局部施用、鼻內(nèi)施用、肺內(nèi)施用、和直腸施用。由于口服施用導(dǎo)致蛋白質(zhì)或肽的消化，因此活性組分必須包覆或配制在所述藥物組合物中以防止消化。另外，所述藥物組合物可具有靶向能力以在施用時追蹤特定細(xì)胞。所述用于預(yù)防或治療癌癥的藥物組合物的合適劑量可取決于許多因素，如配制方法、施用方法、患者的年齡、體重、性別、病理情況、飲食、施用時間、施用途徑、排泄速度和反應(yīng)敏感性。對于成年人，所述藥物組合物的合乎需要的劑量可在約0. OOl-lOOmg/kg的范圍內(nèi)。本文中使用的術(shù)語“藥物有效量”是指在預(yù)防或治療癌癥和/或血管發(fā)生相關(guān)的疾病中使用的足夠量。所述藥物組合物與可藥用載體和/或添加劑可通過本領(lǐng)域中公知的方法配制為單位或多劑量形式。在這點(diǎn)上，所述配制物可為在油或水性介質(zhì)中的溶液、懸浮液、糖漿、乳化溶液、浸膏(extract)、粉末、顆粒、片劑、或膠囊，且可進(jìn)一步包括分散或穩(wěn)定劑。另外，所述藥物組合物可作為單獨(dú)的藥物施用、或與其它藥物一起施用，且可與先前存在的藥物順序或同時施用。所述藥物組合物包括所述抗體或其抗原結(jié)合片段，且因此可配制為免疫脂質(zhì)體。包含所述抗體的脂質(zhì)體可使用本領(lǐng)域中公知的方法制備。所述免疫脂質(zhì)體為包括磷脂酰膽堿、膽固醇和聚乙二醇衍生的磷脂酰乙醇胺的脂質(zhì)組合物，且可通過反相蒸發(fā)法制備。例如，F(xiàn)ab’片段可通過硫醇-二硫化物交換附著到所述脂質(zhì)體?；瘜W(xué)藥物如多柔比星(doxorubicin)也可包括在所述脂質(zhì)體中。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，所述抗體可用作針對C-Met蛋白質(zhì)的拮抗劑。術(shù)語“拮抗劑”理解為包括部分或完全地將它們的目標(biāo)(即c-Met)的至少一種生物學(xué)活性阻斷、抑制和/或中和(neutralize)的所有分子。例如，術(shù)語“拮抗性抗體”是指抑制或降低抗體結(jié)合的抗原(例如c-Met)的生物學(xué)活性的抗體。拮抗劑可由于結(jié)合受體至配體而減少受體磷酸化，或可使由配體活化的細(xì)胞無能力或破壞。而且，拮抗劑可完全阻斷受體和配體之間的相互作用，或可由于所述受體的三級結(jié)構(gòu)變化或減量調(diào)節(jié)而實(shí)際上減少所述相互作用。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，提供向受驗(yàn)者(subject)施用用于預(yù)防或治療癌癥的藥物組合物的方法。所述藥物組合物包括藥物有效量的抗c-Met人源化抗體和可藥用載體、稀釋劑或賦形劑，所述抗c-Met人源化抗體包括具有SEQ ID NO :1的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，或者所述抗c-Met人源化抗體包括具有SEQ ID NO :3的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有SEQ ID NO :4的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。所述用于預(yù)防或治療癌癥的藥物組合物的詳細(xì)描述和其施用方法已在上面提供。所述用于預(yù)防或治療癌癥的藥物組合物向其施用的受驗(yàn)者包括動物。例如，所述動物可為人、犬、貓或小鼠?，F(xiàn)在將參考以下實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的一個或多個實(shí)施方式。但是，這些實(shí)施例僅用于說明的目的，而不意圖限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 :針對c-Met的小鼠抗體AbF46的制備(1)小鼠的免疫為了得到對于建立雜交瘤細(xì)胞系所必需的經(jīng)免疫的小鼠,將100 μg人c-Met/Fc融合蛋白(R&D Systems)和相同量的完全弗氏佐劑混合，并將混合物經(jīng)由腹膜內(nèi)注射向五只4-6周大的BALB/c小鼠(Japan SLC, Inc.)的每一只施用。在兩周后，使用與上述相同的方法將所述抗原(先前注射量的一半)與不完全弗氏佐劑混合，并將混合物經(jīng)由腹膜內(nèi)注射向每一只小鼠施用。在一周后，進(jìn)行最終的加強(qiáng)(boosting)，并在三天后從每一只小鼠的尾巴收集血液以得到血清。然后，將血清用PBS以1/1000稀釋，并進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)以分析識別c-Met的抗體的滴定度是否增加。之后，選擇其中得到足夠量抗體的小鼠，并對所選擇的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合過程。(2)細(xì)胞融合和雜交瘤細(xì)胞的制備在細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)前的三天，將50 ii g PBS和人c-Met/Fc融合蛋白的混合物經(jīng)由腹膜內(nèi)注射向每一只小鼠施用。使每一只經(jīng)免疫的小鼠麻醉，且然后將其位于身體左側(cè)的脾取出并用網(wǎng)(mesh)磨碎以分離細(xì)胞，所述細(xì)胞然后與培養(yǎng)基(DMEM)混合以制備脾細(xì)胞懸浮液。將所述懸浮液離心以收集細(xì)胞層。將得到的IxlO8個脾細(xì)胞與IxlO8個骨髓瘤細(xì)胞(Sp2/0)混合，并將混合物離心以使細(xì)胞沉淀。將所述沉淀緩慢分散，用Iml在DMEM中的45%聚乙二醇(PEG)處理，并在添加Iml DMEM前保持在37°C —分鐘。在引入另外IOmlDMEM I分鐘后，將所得物保持在37°C的水浴中5分鐘。通過添加DMEM使其總量達(dá)到50ml，并將所得物離心。將所得細(xì)胞沉淀以I X IO5個細(xì)胞/ml-2 X IO5個細(xì)胞/ml的濃度再懸浮在分離培養(yǎng)基(HAT培養(yǎng)基)中。然后，將所得物分布至96-孔板(0.1ml/孔)，所述96-孔板置于37°C的二氧化碳溫育器中以制備雜交瘤細(xì)胞。(3)產(chǎn)生針對c-Met蛋白質(zhì)的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的選擇為了從(2)中制備的雜交瘤細(xì)胞中選擇與c-Met特異性結(jié)合的雜交瘤細(xì)胞，進(jìn)行ELISA以篩選產(chǎn)生針對人c-Met/Fc融合蛋白 和人Fe蛋白有活性的抗體的細(xì)胞。將50 ill (2 ii g/ml)人c-Met/Fc融合蛋白包被(coat)在微量滴定板的各孔中，并通過洗滌除去未反應(yīng)的抗原。為了排除與Fe結(jié)合但不與c-Met結(jié)合的抗體，使用如上相同的方法在不同的微量滴定板的各孔中包被人Fe蛋白質(zhì)。接著，將50 Ul雜交瘤細(xì)胞懸浮液添加到所述微量滴定板的各孔中以反應(yīng)I小時。然后，將微孔板用磷酸鹽緩沖液-吐溫20 (TBST)溶液洗滌。向其添加山羊抗小鼠IgG-辣根過氧化物酶(IgG-HRP)，并容許反應(yīng)在室溫下發(fā)生I小時，且用所述TBST溶液進(jìn)行洗滌以除去未反應(yīng)的抗體。隨后，向各孔添加過氧化物酶的底物溶液(OPD)，并通過使用ELISA讀取器測量在450nm的吸收評價反應(yīng)度。通過該方法，重復(fù)地選擇產(chǎn)生對人c-Met蛋白質(zhì)且不對人Fe蛋白質(zhì)高度特異性的抗體的雜交瘤細(xì)胞系。對獲得的雜交瘤細(xì)胞系進(jìn)行有限稀釋以獲得產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系的單克隆(single clone)。所選擇的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系以登記號KCLRF-BP-00220 登記在韓國細(xì)胞系庫(Korean Cell Line Bank)中。(4)單克隆抗體的產(chǎn)生和純化將以上(3)中獲得的雜交瘤細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)以產(chǎn)生和純化單克隆抗體。首先，將在50ml具有10%FBS的培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞離心以獲得細(xì)胞沉淀，其用20ml PBS洗滌超過兩次以除去FBS。然后，引入50ml DMEM以使所述細(xì)胞沉淀再懸浮，并將所得物在37°C的二氧化碳溫育器中溫育3天。在離心以除去產(chǎn)生抗體的細(xì)胞后，將包括所述抗體的細(xì)胞培養(yǎng)物分離并在4°C儲存，或直接使用。使用配有親和柱(蛋白質(zhì)G瓊脂糖柱；Pharmacia，USA)的AKTA純化設(shè)備(GE Health)從50_300ml所述培養(yǎng)物純化抗體,并通過使用用于蛋白質(zhì)聚集的過濾器(Amicon)以PBS置換上清液而儲存純化的抗體。實(shí)施例2 :制備針對c-Met的嵌合抗體chAbF46通常，當(dāng)為了醫(yī)療的目的將小鼠抗體注射到人中時，可經(jīng)常發(fā)生免疫原性。因此，為了減少這樣的反應(yīng)，由在實(shí)施例1中制備的小鼠抗體AbF46制備嵌合抗體chAbF46，其中除了抗原結(jié)合所涉及的可變區(qū)之外的恒定區(qū)被人IgGl抗體的序列代替。合成多核苷酸以具有各自設(shè)計有如下的結(jié)構(gòu)，即對應(yīng)于重鏈的序列的EcoR1-信號序列-VH-Nhel-CH-TGA-Xhol (SEQ ID NO: 7)和對應(yīng)于輕鏈的序列的EcoR1-信號序列-VL-BsiW1-CL-TGA-XhoI (SEQ ID N0:8)。然后，通過如下構(gòu)建用于嵌合抗體表達(dá)的載體通過分別使用限制酶EcoRI (NEB，R0101S)和XhoI (NEB，R0146S)將具有所述對應(yīng)于重鏈的序列的DNA片段(SEQ ID NO: 7)克隆入pOptiVEC -由Invitrogen制造的OptiCHO AntibodyExpress Kit (Cat no. 12762-019)中包括的 TOPO TA Cloning Kit 和將具有所述對應(yīng)于輕鏈的序列的 DNA 片段(SEQ ID N0:8)克隆入 pcDNA 3. 3-T0P0 TACloning Kit (Catno. 8300-01)。使用Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)擴(kuò)增所構(gòu)建的載體,并將包括所述重鏈的載體和包括所述輕鏈的載體用360 u I 2M CaCl2以約4:1 (約80 y g: 20 y g)的比添加到293T細(xì)胞(2. 5xl07)且轉(zhuǎn)染。接著，將混合物在添加有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中在37°C在5%C02條件下培養(yǎng)5小時，然后在沒有FBS的DMEM培養(yǎng)基中在37°C在5%C02條件下培養(yǎng)48小時。通過將培養(yǎng)的細(xì)胞分離獲得各IOOml上清液，并使用AKTA Prime (GEHealthcare)純化。蛋白質(zhì)A柱(GE Healthcare, 17-0405-03)置于AKTA Prime中，且使培養(yǎng)的溶液以5ml/分鐘的流速流動并用IgG洗脫緩沖液(Thermo Scientific, 21004)洗脫。將所述緩沖液用PBS緩沖液置換，且因此純化最終的嵌合抗體(下文中chAbF46)。 實(shí)施例3 由嵌合抗體制備人源化抗體huAbF46(I)重鏈人源化對于Hl-重和H3-重的2種類型的設(shè)計，首先使用Ig Blast (http ://www. ncb1.nlm. nih. rov/ifiblast/)分析與小鼠抗體AbF46的VH基因最同源的人種系基因。結(jié)果,證實(shí)VH3-71在氨基酸水平具有83%同源性，且小鼠抗體AbF46的⑶R-Hl、⑶R-H2和⑶R-H3使用Kabat編號方式進(jìn)行編號，并設(shè)計使得小鼠抗體AbF46的CDR部分引入VH3-71的框架中。No.30(S —T)、No.48(V —L)、No.73(D —N)和 No. 78 (T — L)的氨基酸回復(fù)突變?yōu)樵夹∈驛bF46抗體的氨基酸序列。然后，在Hl-重中，No. 83 (R — K)和No. 84 (A — T)的氨基酸額外地突變，由此完成Hl-重(SEQ ID NO:9)和H3-重(SEQ ID NO: 10)的構(gòu)建。對于H4-重的設(shè)計，得到人抗體的框架序列，且使用已知為具有與小鼠AbF46抗體框架序列類似的序列且常規(guī)已知為最穩(wěn)定的VH3亞型以引入如Kabat編號方式限定的小鼠抗體 AbF46 的 CDR-Hl、CDR-H2 和 CDR-H3。(2)輕鏈人源化對于Hl-輕(SEQ ID NO: 12)和H2-輕(SEQ ID NO: 13)的2種類型的設(shè)計，使用Ig Blast (http://www. ncb1. nlm. nih. gov/igblast/)分析與小鼠抗體 AbF46 的 VL 基因最同源的人種系基因。結(jié)果，證實(shí)VK4-1在氨基酸水平具有75%同源性，且小鼠抗體AbF46的⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3使用Kabat編號方式進(jìn)行編號，并設(shè)計使得小鼠抗體AbF46的⑶R部分引入 VK4-1 的框架中。在 Hl-輕中，No.36(Y —H)、No.46(L —M)和 No. 49 (Y—I)的3個氨基酸回復(fù)突變，且在H2-輕中，僅No. 49 (Y — I)的I個氨基酸回復(fù)突變。對于H3-輕(SEQ ID NO: 14)的設(shè)計，使用 Ig Blast (http://www. ncb1. nlm. nih.gov/igblast/)分析與小鼠抗體AbF46的VL基因最同源的人種系基因。結(jié)果,選擇VK2-40和上述VK4-1。證實(shí)小鼠抗體AbF46VL和VK2-40在氨基酸水平具有61%同源性，且小鼠抗體AbF46的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3使用Kabat編號方式進(jìn)行編號，并設(shè)計使得小鼠抗體AbF46的CDR部分可引入VK4-1的框架中。H3-輕回復(fù)突變No. 36 (Y — H)、No. 46 (L — M)和No. 49 (Y— I)的3個氨基酸。對于H4-輕(SEQ ID NO: 15)的設(shè)計，得到人抗體的框架序列，且使用常規(guī)已知為最穩(wěn)定的Vkl亞型以引入使用Kabat編號方式進(jìn)行編號的小鼠抗體AbF46的⑶R-L1、CDR-L2 和 CDR-L3。在 H4-輕中，No. 36 (Y — H)、No. 46 (L — M)和 No. 49 (Y — I)的 3 個氨
基酸額外地回復(fù)突變?！と缓螅糜谌嗽椿贵w表達(dá)的載體通過如下構(gòu)建通過分別使用限制性內(nèi)切酶EcoRI(NEB，R0101S)和XhoI (NEB，R0146S)將具有所述對應(yīng)于重鏈的序列的DNA片段(Hl-重SEQ ID NO: 16，H3-重SEQ ID NO: 17，和 H4-重SEQ ID NO: 18)克隆入pOptiVEC -由 Invitrogen 制造的 0ptiCH0 Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)中包括的TOPO TA Cloning Kit和將具有所述對應(yīng)于輕鏈的序列的DNA片段(Hl-輕SEQID NO: 19，H2-輕SEQ ID NO: 20，H3-輕SEQ ID NO: 21，和 H4-輕SEQ ID NO:22)克隆入pcDNA 3. 3-T0P0 TA Cloning Kit (Cat no.8300-01)。使用Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)擴(kuò)增所構(gòu)建的載體,并將包括所述重鏈的載體和包括所述輕鏈的載體用360 u I 2M CaCl2以約4:1 (約80 y g: 20 y g)的比添加到293T細(xì)胞(2. 5x IO7)且轉(zhuǎn)染。接著，將混合物在添加有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中在37°C在5%C02條件下培養(yǎng)5小時，然后在沒有FBS的DMEM培養(yǎng)基中在37°C在5%C02條件下培養(yǎng)48小時。通過將培養(yǎng)的細(xì)胞離心獲得各IOOml上清液，并使用AKTA Prime (GEhealthcare)純化。蛋白質(zhì)A柱(GE healthcare, 17-0405-03)置于AKTA Prime中，且使培養(yǎng)的溶液以5ml/分鐘的流速流動并用IgG洗脫緩沖液(ThermoScientific, 21004)洗脫。將所述緩沖液用PBS緩沖液置換，且因此純化最終的人源化抗體(下文中huAbF46)。實(shí)施例4 :具有修飾的鉸鏈區(qū)的嵌合抗體和人源化抗體的制備人IgGl的鉸鏈具有‘EPKSCDKTHTCPPCP’的氨基酸序列(SEQ ID NO:23)。所述鉸鏈分別用具有SEQ ID N0:5的氨基酸序列的U7-HC6鉸鏈、具有SEQ ID NO: 24的氨基酸序列的U3-HC9鉸鏈、具有SEQ ID NO: 25的氨基酸序列的U6-HC8鉸鏈、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的U6-HC7鉸鏈和具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的U8-HC5鉸鏈置換。對于所述置換，合成包括各鉸鏈序列的多核苷酸(SEQ ID N0:27-SEQ ID NO:31)編碼基因(Bioneer，Inc.)，并將所得物通過使用限制酶KasI (NEB, R0544S)和BsrGI (NEB, R0575S)在實(shí)施例2或3中制備的包括chAbF46抗體或huAbF46抗體的重鏈區(qū)的載體上克隆。使用Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)各自擴(kuò)增所述包括具有修飾的鉸鏈區(qū)的重鏈區(qū)的載體和包括chAbF46或huAbF46的輕鏈區(qū)的載體，并將包括所述重鏈的載體和包括所述輕鏈的載體用360 ill 2M CaCl2以約4:1(約80ii g:20ii g)的比添加到293T細(xì)胞(2. 5x IO7)且轉(zhuǎn)染。接著，將混合物在添加有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中在37°C在5%C02條件下培養(yǎng)5小時，然后在沒有FBS的DMEM培養(yǎng)基中在37°C在5%C02條件下培養(yǎng)48小時。
通過將培養(yǎng)的細(xì)胞離心獲得各IOOml上清液，并使用AKTA Prime (GEhealthcare) 純化。蛋白質(zhì)A柱(GE healthcare, 17-0405-03)置于AKTA Prime中，且使培養(yǎng)的溶液以 5ml/分鐘的流速流動并用IgG洗脫緩沖液(Thermo Scientific, 21004)洗脫。將所述緩沖液用PBS緩沖液置換，且因此最終純化具有修飾的鉸鏈區(qū)的嵌合抗體和具有修飾的鉸鏈區(qū)的人源化抗體(下文中以在chAbF46或huAbF46后的鉸鏈名稱表示)。
實(shí)施例5 :對于C-Met的chAbF46抗體和huAbF46抗體反應(yīng)性的證實(shí)
使用ELISA分析在實(shí)施例2和3中制備的chAbF46抗體和huAbF46抗體是否識別鼠C-Met抗原。在當(dāng)前實(shí)施方式中使用的人源化抗體為4種類型，且所述重鏈和輕鏈組合的每一種如表I中所示。
〈表1>
權(quán)利要求
1.抗C-Met人源化抗體，包括具有SEQID NO :1的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有SEQID NO 2的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
2.抗c-Met人源化抗體，包括具有SEQID NO :3的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有SEQID NO 4的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
3.權(quán)利要求1或2的抗c-Met人源化抗體，其中所述c-Met衍生自選自人、猴子、小鼠和大鼠的c-Met。
4.權(quán)利要求1或2的抗c-Met人源化抗體，其中所述抗體為單克隆抗體。
5.權(quán)利要求1或2的抗c-Met人源化抗體,其中所述抗體為選自scFv、(scFv)2、Fab、Fab，和F(ab’ )2的抗原結(jié)合片段。
6.權(quán)利要求1或2的抗c-Met人源化抗體，其中所述抗體包括具有通過缺失、插入或取代一個或多個氨基酸而修飾的氨基酸序列的鉸鏈區(qū)。
7.權(quán)利要求1或2的抗c-Met人源化抗體，其中所述抗體包括具有SEQID NO :5或SEQID NO 6的氨基酸序列的鉸鏈區(qū)。
8.抗c-Met人源化抗體的重鏈可變區(qū)，具有SEQID NO 1的氨基酸序列。
9.抗c-Met人源化抗體的輕鏈可變區(qū)，具有SEQID NO :2的氨基酸序列。
10.抗c-Met人源化抗體的重鏈可變區(qū)，具有SEQID NO :3的氨基酸序列。
11.抗C-Met人源化抗體的輕鏈可變區(qū)，具有SEQID NO :4的氨基酸序列。
12.用于預(yù)防或治療癌癥的藥物組合物，所述藥物組合物包括藥物有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的抗c-Met人源化抗體和可藥用載體、稀釋劑或賦形劑。
13.權(quán)利要求12的藥物組合物，其中所述癌癥為選自如下的一種鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、腹膜癌、皮膚癌、皮膚或眼球中的黑素瘤、直腸癌、肛門附近的癌、食道癌、小腸腫瘤、內(nèi)分泌腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、慢性或急性白血病、淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、肝瘤、胃腸癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細(xì)胞腺瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、大腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、和頭頸癌。
14.權(quán)利要求12的藥物組合物，其中所述抗體用作針對c-Met的拮抗劑。
15.治療癌癥的方法，所述方法包括向受驗(yàn)者施用用于預(yù)防或治療癌癥的藥物組合物，所述藥物組合物包括藥物有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的抗c-Met人源化抗體和可藥用載體、稀釋劑或賦形劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的抗c-Met人源化抗體在制造用于預(yù)防或治療癌癥的藥物組合物或藥物中的用途，所述藥物組合物或藥物包括藥物有效量的所述抗c-Met人源化抗體和可藥用載體、稀釋劑或賦形劑。
全文摘要
抗c-Met人源化抗體及包括其的用于預(yù)防或治療癌癥的藥物組合物。所述抗c-Met人源化抗體包括具有SEQ ID NO1的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，或者包括具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有SEQ ID NO4的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。根據(jù)所述抗c-Met人源化抗體及包括其的用于預(yù)防或治療癌癥的藥物組合物，可有效地預(yù)防或治療癌癥。
文檔編號A61P35/02GK103030695SQ20121036505
公開日2013年4月10日 申請日期2012年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月5日
發(fā)明者鄭光鎬, 李承炫, 金健雄, 金敬兒, 吳永美, 李 S-b, 鄭收硯, 鄭閏宙, 趙恩徹, 韓榮奎 申請人:三星電子株式會社