專利名稱：完全人源抗vegf抗體及其使用方法
完全人源抗VEGF抗體及其使用方法
相關(guān)申請本申請要求美國臨時申請60/853，260的優(yōu)先權(quán)，該臨時申請于2006年10月20
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背景技術(shù)：
血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一類主要的促血管生成蛋白，其參與內(nèi)皮細(xì)胞激活、 增殖、和生存，特別是參與視網(wǎng)膜增殖性病變和腫瘤發(fā)生過程。VEGF屬于VEGF-PDGF(血 小板衍生生長因子)超家族，為小糖蛋白二聚體，可結(jié)合表達(dá)在血管和淋巴內(nèi)皮細(xì)胞上 的受體。目前在VEGF家族中有七種已知配體VEGF-A (VEGF)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、 VEGF-E(衍生自病毒)、或胎盤生長因子(PIGF)-I和-2。這些VEGF配體通過結(jié)合三種已知 VEGF受體(VEGF-R)中一種或多種來實現(xiàn)其作用，每種VEGF受體都具有酪氨酸激酶的活性。 絕大多數(shù)的VEGF-Rl (Flt-I)表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞上，可結(jié)合VEGF和VEGF-B，介導(dǎo)內(nèi) 皮和單核細(xì)胞的遷移。VEGF-R2 ( S卩，人KDR或鼠Flk-I)主要表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞上，對VEGF (以 及VEGF-C和VEGF-D的特定片段)有選擇性，介導(dǎo)VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖，生存和遷移， 以及血管通透性。VEGF-R3(Flt-4)主要表達(dá)在淋巴內(nèi)皮細(xì)胞上，可與VEGF-C和VEGF-D結(jié) 合促進(jìn)淋巴管生成。VEGF-R1，VEGF-R2，和VEGF-R3各自表達(dá)在某些腫瘤細(xì)胞上。VEGF與 VEGF受體的結(jié)合引發(fā)受體二聚化，導(dǎo)致隨后的受體激活和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。VEGF與VEGF-R2的結(jié) 合可開啟某信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，該通路在促血管生成中起主導(dǎo)作用。這個通路包括受體激活以 及隨后產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)。在這種情況下的受體激活需要三個基本事件(I)VEGF與 VEGF-R2結(jié)合，(II)受體二聚化，以及(III)受體酪氨酸激酶的受體自身磷酸化(以及由此 的激活)。細(xì)胞內(nèi)信使例如磷脂酶C和磷脂酰肌醇-3-激酶可直接結(jié)合VEGF-R2的自身磷 酸化形式并被受體酪氨酸激酶磷酸化，這隨后引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的級聯(lián)信號傳導(dǎo)并導(dǎo)致細(xì)胞核信 號，該信號最終促使細(xì)胞增殖、遷移和生存(抗凋亡)，并提高血管通透性。血管生成異常與多種疾病狀態(tài)相關(guān)，包括癌癥(Holash 2002)。VEGF信號通路是 唯一一個被證實的在正常血管生長中和多種疾病相關(guān)的病態(tài)血管生長中都起作用的信號 傳導(dǎo)通路(Erikkson 1999 ；Ferrara 1999 ；Yancopoulos 2000)。VEGF 可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞 生長以及增加血管通透性(Ferrara 2004)。以前的研究揭示，在大多數(shù)腫瘤種類中VEGF的表達(dá)水平都有提高(Berkman 1993 ；Brown 1993 ；Brown 1995 ；Dvorak 1995 ；Mattern 1996)。研究表明患眼部血管增生 性疾病如濕性AMD的病人中VEGF的水平升高。濕性AMD在總的AMD病例中僅占約10%，但 卻在因AMD導(dǎo)致的失明中占到近90%。濕性AMD以脈絡(luò)膜新生血管(CNV)為特征，即在視 網(wǎng)膜的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層下面的異常血管生長。VEGF-A被認(rèn)為在這些血管生成中起主 要作用，這些血管在黃斑下面滲漏并導(dǎo)致視網(wǎng)膜扭曲和視力損傷。已有多個分子被開發(fā)用于抑制VEGF與其受體間的相互作用，或抑制VEGF受體的 酪氨酸激酶活性，這些分子已在臨床研究的多個階段。例如，BAY43-9006 (索拉非尼，拜耳公 司)，SUl 1248 (舒尼替尼)，和瓦他拉尼(Vatalanib，諾華公司)都是VEGF-R2激酶抑制劑，已被作為潛在的癌癥藥物開發(fā)。VEGF-TRAP (Regeneron，賽諾非安萬特公司)是VEGF-Rl和 VEGF-R2的胞外結(jié)構(gòu)域雜合體，對VEGF有高度的結(jié)合親和力(Holash 2002 ；Dupont 2005)。 VEGF-TRAP目前正在進(jìn)行治療實體腫瘤的臨床研究?？贵w還被廣泛開發(fā)用作VEGF通路的 抑制劑。例如，IMC-ICll (Imclone)是結(jié)合VEGF-R2的契合單克隆抗體(Hunt 2001)。目前 正在進(jìn)行臨床研究，以確定IMC-ICll在治療惡性腸癌中的療效。⑶P-791 (Imclone)是一 個聚乙二醇化的人源化Fab，可結(jié)合VEGF-R2。IMC-1121B (Imclone)是一個完全人源單克 隆抗體，可結(jié)合VEGF-R2，具有較高的親和力，可阻斷VEGF和VEGF-R2間的相互作用(Miao， H. Q. ， et al. 2005. Biochem Biophys Res Commun 345 438-445)。 IMC—18F1(Imclone) ^ 一個完全人源的單克隆抗體，可結(jié)合VEGF-Rl，具有較高的親和力，可阻斷VEGF和VEGF-Rl 間的相互作用。2C3 (Peregrine)是一個鼠源抗體，可結(jié)合VEGF并可阻斷VEGF和VEGF-R2 間的相互作用，但不阻斷VEGF-Rl。Ranibizumab (Lucentis ，Genentech)是一個衍生自 貝伐單抗的人源化的Fab，最近被批準(zhǔn)用于治療濕性急性黃斑變性(AMD) (MicheIs 2004 ； Rosenfeld 2005)。最常用的靶向作用于VEGF的生物制劑是人源化的IgGl單克隆抗體貝伐單抗 (a. k. a.，Avastin Genentech ；本發(fā)明中也被稱為BM-1)。貝伐單抗是通過將鼠源單克 隆抗體A. 4. 6. 1進(jìn)行人源化開發(fā)得到，其含有約93%的人源序列和7%鼠源序列(Presta 1997 ；Ferrara 2004)。貝伐單抗與VEGF的結(jié)合親和力為約為500pM，可抑制VEGF與 VEGF-Rl和VEGF-R2的結(jié)合。貝伐單抗在人體內(nèi)的消除半衰期為17-21天(Ferrara2004)。 貝伐單抗已被批準(zhǔn)用于治療惡性腸癌(Presta 1997 ；Rosenfeld 2005)。研究還顯示，貝伐 單抗可能可以用于治療新生血管性AMD (Michels 2005)。雖然多種分子已被開發(fā)用于抑制VEGF通路，但仍然需要更多具有更好結(jié)合特性 和治療性質(zhì)的分子。本發(fā)明提供了可結(jié)合VEGF并抑制VEGF通路的完全人源抗體。由于這 些抗體是完全人源的，因此它們可以作為治療物質(zhì)使用，且不具有先前開發(fā)的非人源抗體、 契合抗體、或人源化抗體所具有的免疫原性副作用。

發(fā)明內(nèi)容
某些實施方式提供了一種抗體，其含有如SEQ ID NO :2所示的重鏈序列和SEQ IDNO :3所示的輕鏈序列。某些其他實施方式提供了一種抗體，其含有如SEQ ID N0:4所示 的重鏈序列和SEQ ID NO :5所示的輕鏈序列。在某些上述實施方式中，所述抗體含有IgG2 恒定區(qū)。在某些上述實施方式中，所述抗體與hVEGF165結(jié)合的Kd值為彡2.0nM。在某些實 施方式中，所述抗體結(jié)合hVEGF165上的某一抗原表位，該抗原表位與貝伐單抗結(jié)合的抗原表 位重疊。在某些實施方式中，所述抗體可阻斷hVEGF165與VEGF-Rl和VEGF-R2的結(jié)合。某些實施方式提供了在所需對象中抑制血管生成的方法，該方法通過在所述對象 中給藥治療有效劑量的抗體，該抗體含有如SEQ ID NO :2所示的重鏈序列和SEQ ID NO 3 所示的輕鏈序列。某些其他實施方式提供了在所需對象中抑制血管生成的方法，該方法通 過在所述對象中給藥治療有效劑量的抗體，該抗體含有如SEQ ID NO :4所示的重鏈序列和 SEQ IDNO 5所示的輕鏈序列。某些實施方式提供了在所需對象中治療與血管生成異常相關(guān)的疾病的方法，該方 法包括對所述對象給藥治療有效劑量的抗體，該抗體含有如SEQ ID NO :2所示的重鏈序列和SEQ ID NO :3所示的輕鏈序列。某些其他實施方式提供了在所需對象中治療與血管生成 異常相關(guān)的疾病的方法，該方法包括對所述對象給藥治療有效劑量的抗體，該抗體含有如 SEQ IDNO 4所示的重鏈序列和SEQ ID NO 5所示的輕鏈序列。某些實施方式提供了在所需對象中治療與VEGF信號傳導(dǎo)相關(guān)的炎癥性疾病的方 法，該方法包括對所述對象給藥治療有效劑量的抗體，該抗體含有如SEQ ID N0:2所示的 重鏈序列和SEQ ID NO :3所示的輕鏈序列。某些其他實施方式提供了在所需對象中治療 與VEGF信號傳導(dǎo)相關(guān)的炎癥性疾病的方法，該方法包括對所述對象給藥治療有效劑量的 抗體，該抗體含有如SEQ ID NO :4所示的重鏈序列和SEQ ID NO :5所示的輕鏈序列。某些實施方式提供了在所需對象中治療濕性急性視網(wǎng)膜黃斑變性或糖尿病視網(wǎng) 膜病變的方法，該方法包括對所述對象給藥治療有效劑量的抗體，該抗體含有如SEQ ID NO :2所示的重鏈序列和SEQ ID NO :3所示的輕鏈序列。某些其他實施方式提供了在所需 對象中治療濕性急性視網(wǎng)膜黃斑變性或糖尿病視網(wǎng)膜病變的方法，該方法包括對所述對象 給藥治療有效劑量的抗體，該抗體含有如SEQ ID NO :4所示的重鏈序列和SEQ ID NO :5所 示的輕鏈序列。某些實施方式提供了在所需對象中治療與VEGF信號傳導(dǎo)增加相關(guān)的癌癥的方 法，該方法包括對所述對象給藥治療有效劑量的抗體，該抗體含有如SEQ ID NO :2所示的重 鏈序列和SEQ ID NO :3所示的輕鏈序列。某些其他實施方式提供了在所需對象中治療與 VEGF信號傳導(dǎo)增加相關(guān)的癌癥的方法，該方法包括對所述對象給藥治療有效劑量的抗體， 該抗體含有如SEQ ID NO 4所示的重鏈序列和SEQ ID NO 5所示的輕鏈序列。某些實施方式提供了一種成套物件(kit)，其含有一種抗體，該抗體含有如SEQ IDNO :2所示的重鏈序列和SEQ ID NO :3所示的輕鏈序列。其他實施方式提供了一種成套 物件，其含有一種抗體，該抗體含有如SEQ ID NO :4所示的重鏈序列和SEQ ID NO :5所示的 輕鏈序列。某些實施方式提供了多核苷酸，該多核苷酸編碼如SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :3， SEQID N0:4，和/或SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列。某些其他實施方式提供了載體，該載 體含有這些多核苷酸，某些其他實施方式提供了含有這些載體的宿主細(xì)胞。


圖1 :XPA. 10. 064和XPA. 10. 072的重鏈可變區(qū)(包括HCDR)和輕鏈可變區(qū)(包括 LCDR)。圖 2 :XPA. 10. 064 IgG2 與人 hVEGF165 結(jié)合的 Biacore 分析。圖 3 :XPA. 10. 072 IgG2 與人 hVEGF165 結(jié)合的 Biacore 分析。圖4 貝伐單抗與人hVEGF165結(jié)合的Biacore分析。圖 5 貝伐單抗(BMl)、XPA. 10. 064 和 XPA. 10. 072 對人 hVEGF165 與 VEGF-Rl 結(jié)合 的抑制作用。圖 6 貝伐單抗(BMl)、XPA. 10. 064 和 XPA. 10. 072 對人 hVEGF165 與 VEGF-R2 結(jié)合 的抑制作用。圖 7 貝伐單抗(BMl)、XPA. 10. 064 (064)和 XPA. 10. 072 (072)結(jié)合 hVEGF165 抗原 表位的分析。
圖8 =XPA. 10. 064和G153-694的共定位。A列為XPA. 10. 064的染色結(jié)果。B列為 G153-694的染色結(jié)果。C列為核染料的染色結(jié)果。D列為合并后的圖像，強(qiáng)度高的(白色) 表示共定位。圖9 =XPA. 10. 072和G153-694的共定位。A列為XPA. 10. 072的染色結(jié)果。B列為 G153-694的染色結(jié)果。C列為核染料的染色結(jié)果。D列為合并后的圖像，強(qiáng)度高的(白色) 表示共定位。圖 10 :XPA. 10. 064 IgG2 (A)和 XPA. 10. 072 IgG2 (B)對 HUVEC 的生長抑制。圖11 對 HUVEC 用 hVEGF165 進(jìn)行劑量滴定(dose titration)后，VEGF-R2 的磷酸 化水平升高。圖12 對HUVEC用hVEGF165加貝伐單抗進(jìn)行劑量滴定(dose titration)后， VEGF-R2的磷酸化水平降低。圖 13 :XPA. 10. 064 (064)和 XPA. 10. 072 (072) IgG2 抑制 hVEGF165 誘導(dǎo)的 VEGF-R2
磷酸化。圖14 基底膠栓(Matrigel Plugs)的可視計分。由于PH07-VAL-021血紅蛋白試 驗未獲得膠栓實驗的發(fā)現(xiàn)，因此開發(fā)了可視計分。圖15 基底膠栓實驗顯示在多個劑量的貝伐單抗(BM-I)、XPA. 10. 064 (064)，和 XPA. 10. 072(072)存在下，血管生成的抑制。圖16:基底膠栓實驗測定的血管生成抑制。數(shù)值為兩個不知情的打分員 (blind scorers)給出的結(jié)果的平均值。(A)無細(xì)胞；⑶DU145加α KLH ； (C)貝伐單抗 (0. lmg/kg) ； (D)貝伐單抗(lmg/kg) ； (E)貝伐單抗(5mg/kg) ； (F)XPA. 10. 064(0. Img/ kg) ； (G) XPA. 10. 064 (lmg/kg) ； (H) XPA. 10. 064 (5mg/kg) ； (I)XPA. 10. 072(0. lmg/kg) ； (J) XPA. 10. 072 (lmg/kg) (K)XPA. 10. 072 (5mg/kg)。圖17 =XPA. 10. 064和XPA. 10. 072在體內(nèi)對A673腫瘤生長的抑制。(1)只有溶 媒；(2)0. 5mg/kg 的 XPA. 10. 064 IgG2 ； (3) 5mg/kg 的 XPA. 10. 064 IgG2 ； (4)0. 5mg/kg 的 XPA. 10. 072 IgG2 ； (5) 5mg/kg 的 XPA. 10. 072 IgG2 ； (6) 5mg/kg 的 CH0. KLH IgG2 ； (7) 0. 5mg/ kg的貝伐單抗；⑶5mg/kg的貝伐單抗(第8組)。
具體說明書本發(fā)明的以下說明僅旨在描述本發(fā)明的多種實施方式。同樣的，所討論的具體改 進(jìn)不應(yīng)被理解為對本發(fā)明范圍的限制。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可以很容易地知道，在不跳出 本發(fā)明范圍的情況下可以做出多種等同物、改變和修改，應(yīng)理解這樣的等同實施方式是包 括在本發(fā)明中的。
縮略語本發(fā)明中使用了如下的縮略語:ADCC，抗體-依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒反應(yīng)；AMD， 年齡相關(guān)性黃斑變性；CDC，補(bǔ)體依賴性的細(xì)胞毒反應(yīng)；CNV，脈絡(luò)新生血管；C0PD，慢性阻塞 性肺疾??；HUVEC，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；hVEGF，人VEGF ；mVEGF,鼠VEGF ；PD,藥效動力學(xué)；PK， 藥物代謝動力學(xué)；RA，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；RIA，放射性免疫共沉淀；VEGF，血管內(nèi)皮生長因子； VEGF-R，血管內(nèi)皮生長因子受體；VHL，視網(wǎng)膜及中樞神經(jīng)血管瘤病(von Hippel/Lindau)；X-反應(yīng)性，交叉反應(yīng)性。 定義本發(fā)明中的“抗體”是指任意免疫球蛋白，包括可結(jié)合某特定抗原的單克隆抗體、 多克隆抗體、或多特異性抗體或雙特異性抗體。一個完整的抗體包含兩條重鏈和兩條輕鏈。 每條重鏈由一可變區(qū)和第一、第二、以及第三恒定區(qū)組成，每條輕鏈由一可變區(qū)和一恒定區(qū) 組成?？贵w呈“Y”型，“Y”型結(jié)構(gòu)的頸部由兩條重鏈的第二和第三恒定區(qū)組成，其通過二硫 鍵結(jié)合?！癥”型結(jié)構(gòu)的每條臂包括一條重鏈的可變區(qū)和第一恒定區(qū)，其與一條輕鏈的可變區(qū) 和恒定區(qū)相結(jié)合。輕鏈和重鏈的可變區(qū)決定抗原的結(jié)合。兩條鏈中的可變區(qū)通常含有三個 高變環(huán)狀結(jié)構(gòu)，稱為互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)(輕鏈(L)的⑶R包含IXDR1、IXDR2和IXDR3，重鏈 (H)的 CDR 包含 HCDR1、HCDR2、HCDR3)。三個 CDR 介于被稱為構(gòu)架區(qū)(FrameworkRegions， FR)的側(cè)翼序列(franking stretches)之間，構(gòu)架區(qū)比⑶R更加高度保守并形成一個支架 支撐超變環(huán)。重鏈和輕鏈的恒定區(qū)與抗原結(jié)合無關(guān)，但具有多種效應(yīng)功能。根據(jù)其重鏈恒 定區(qū)的氨基酸序列可將抗體分類?？贵w的主要種類有IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，這些種類 中的一些類又被分為亞類，如IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl或IgA2等。本發(fā)明中的“抗原結(jié)合片段”進(jìn)一步指免疫球蛋白片段或抗體片段(即，免疫球蛋 白分子的至少一段具有免疫活性的部分)，例如Fab、Fab'、F(ab' )2、Fv片段、單鏈抗體分 子、由含有一個或多個CDR的免疫球蛋白分子的任何片段形成的多特異性抗體。另外，本發(fā) 明中的抗原結(jié)合片段還可含有來自某特定人源免疫球蛋白的一個或多個CDR，其被移接至 來自一個或多個不同人源免疫球蛋白的框架區(qū)。抗原結(jié)合片段可結(jié)合母免疫球蛋白或母抗 體結(jié)合的靶位?？贵w的“Fab”片段是指由一條輕鏈(包括可變區(qū)和恒定區(qū))和一條重鏈的可變區(qū) 和第一恒定區(qū)經(jīng)二硫鍵結(jié)合起來的那部分抗體分子。"Fab' ”片段是指包含了部分鉸鏈區(qū)的Fab片段。"F(ab' )2”是指 Fab'的二聚體?？贵w的“Fe”是指由一條重鏈的第二、第三恒定區(qū)經(jīng)二硫鍵與另一條重鏈的第二、 第三恒定區(qū)結(jié)合組成的那部分抗體?？贵w的Fc段負(fù)責(zé)多種不同的效應(yīng)功能如ADCC，和CDC， 但不參與抗原的結(jié)合?？贵w的“Fv”是指含有完整抗原結(jié)合位點的最小抗體片段。Fv片段由單條輕鏈的 可變區(qū)和單條重鏈的可變區(qū)結(jié)合組成?！皢捂淔v抗體”或“scFv”是指由輕鏈可變區(qū)與重鏈可變區(qū)直接相連或通過一個肽 鏈連接而成的工程抗體(Houston 1988)。“單鏈抗體Fv-Fc抗體”或“scFv-Fc”是指由連接到某抗體Fc段的scFv組成的工 程抗體。本發(fā)明中的“抗原表位”是指抗原分子中與抗體結(jié)合的那部分氨基酸或原子基團(tuán)。 在本發(fā)明中，如果兩種抗體表現(xiàn)出對抗原的競爭性結(jié)合，則這兩種抗體在該抗原上結(jié)合相 同的抗原表位。例如，如果本發(fā)明中公開的某抗體或其抗原結(jié)合片段與貝伐單抗競爭結(jié)合 VEGF，則該抗體被認(rèn)為是與貝伐單抗結(jié)合相同的抗原表位。本發(fā)明中的“VEGF”或“VEGF配體”是指目前已知的七種VEGF配體VEGF_A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E(衍生自病毒)、或胎盤生長因子(PIGF)-I 或-2。就 VEGF-A 而言，目前已知有四種剪接變體，每種都顯示出獨特的生物學(xué)功能。含165個氨基酸的異構(gòu) 體(VEGF165，SEQ ID NO 1)可同時以肝素結(jié)合的形式以及可溶的形式存在。含121個氨基 酸的異構(gòu)體(VEGF121)缺失人VEGF165中對應(yīng)于在第115位殘基和第159位殘基間的區(qū)域的 片段，且只以可溶性形式存在。較長的189和206個氨基酸的異構(gòu)體(分別對應(yīng)于VEGF189 和VEGF2J保留了與肝素結(jié)合的能力。本發(fā)明中提供的抗體對VEGF165表現(xiàn)出高結(jié)合親和 力，但在某些實施方式中，可能對非人VEGF蛋白或其他VEGF異構(gòu)體產(chǎn)生交叉作用或表現(xiàn)出 低水平的結(jié)合親和力。本發(fā)明中對某種狀態(tài)的“治療”或“療法”可指預(yù)防或減輕該狀態(tài)，減緩該狀態(tài)發(fā)生 或發(fā)展的速度，減少發(fā)展為該狀態(tài)的風(fēng)險，預(yù)防或延遲與該狀態(tài)相關(guān)的癥狀發(fā)展，減少或終 止與該狀態(tài)相關(guān)的癥狀，產(chǎn)生該狀態(tài)的完全或部分的逆轉(zhuǎn)，或以上的組合。對于腫瘤來說， “治療”或“療法”可以指根除某腫瘤的部分或全部，抑制或減緩腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，預(yù)防或 減緩腫瘤的發(fā)展，或以上的某些組合。本發(fā)明中的“特異性結(jié)合”是指，兩分子間的非隨機(jī)結(jié)合反應(yīng)，如抗體與導(dǎo)致該抗 體產(chǎn)生的配體間的反應(yīng)。在本發(fā)明中，特異性結(jié)合第一種配體的抗體可表現(xiàn)出與第二種配 體的交叉反應(yīng)性或低水平的結(jié)合親和力。在某些實施方式中，一種可特異性結(jié)合某配體的 抗體與該配體的結(jié)合親和力(Kd)彡10_7M(如^ΧΙΟΛ ,ΙΟΛυΧΙ ^Μ,Κ^Μ,ΙΟ,Μ)。本 發(fā)明中的Kd是指解離速度與結(jié)合速度的比值(k。ff/k。n)，可通過本領(lǐng)域公知的方法測定。在 另外的實施方式中，一種可特異性結(jié)合第一種配體的抗體，其與第一種配體的結(jié)合親和力 可高于或低于與第二種配體結(jié)合的親和力至少10倍(如彡15倍，彡20倍，彡50倍，彡IO2 倍，> IO3倍，> IO4倍)。在另外的實施方式中，一種可特異性結(jié)合某配體的抗體其結(jié)合親 和力(Kd)為《1(ΤΜ，但對第二種配體可幾乎不表現(xiàn)出結(jié)合親和力。本發(fā)明中的“被分離”是指“經(jīng)人工”由自然狀態(tài)改變。如果自然界中出現(xiàn)某種“被 分離”的組合物或物質(zhì)，那么其已經(jīng)被改變或脫離其原始環(huán)境，或二者均有發(fā)生。例如，某一 活體動物體內(nèi)天然存在的多核苷酸或多肽是未“被分離”的，但如果這些多核苷酸或多肽與 之在天然狀態(tài)下共存的物質(zhì)足夠分離并以足夠純的狀態(tài)存在，則可以認(rèn)為是“被分離”。本 發(fā)明中的“被分離”不排除與其他化合物或物質(zhì)混合的人造或合成混合物，也不排除不影響 活性的雜質(zhì)的存在。本發(fā)明中“載體”是指一種運載工具，可將編碼某蛋白的多核苷酸操作性地插入其 中從而使該蛋白獲得表達(dá)。載體可用于轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，使其攜帶的遺傳元件在 宿主細(xì)胞內(nèi)得以表達(dá)。舉例來說，載體包括質(zhì)粒、噬菌粒、柯斯質(zhì)粒、人工染色體如酵母人工 染色體(YAC)、細(xì)菌人工染色體(BAC)或Pl衍生的人工染色體(PAC)、細(xì)菌噬菌體如λ噬 菌體或Μ13噬菌體，以及動物病毒等。用作載體的動物病毒種類有逆轉(zhuǎn)錄病毒(包括慢病 毒)、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒(如單純皰疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病毒、乳 頭多瘤空泡病毒(如SV40)。載體可含有多種控制表達(dá)的元件，包括啟動子序列、轉(zhuǎn)錄起始 序列、增強(qiáng)子序列、選擇元件及報告基因。另外，載體還可含有復(fù)制起始位點。載體還可包 括協(xié)助其進(jìn)入細(xì)胞的成分，包括但不限于，病毒顆粒、脂質(zhì)體或蛋白外殼。本發(fā)明中“宿主細(xì)胞”是指導(dǎo)入載體的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可選自多種細(xì)胞種類，包括 例如細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌或枯草菌，真菌細(xì)胞如酵母細(xì)胞或曲霉菌細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞如果蠅S2細(xì)胞或夜蛾Sf9細(xì)胞，或者動物細(xì)胞如成纖維細(xì)胞，CHO細(xì)胞，COS細(xì)胞，NSO細(xì)胞，HeLa 細(xì)胞，BHK細(xì)胞，HEK 293細(xì)胞，或人細(xì)胞。本發(fā)明中的“與血管生成異常相關(guān)的疾病”是指，任何由于血管生長增加，特別是 與VEGF信號通路相關(guān)聯(lián)的血管生長增加，而導(dǎo)致、加劇、或以其他形式相關(guān)聯(lián)的狀態(tài)。這些 狀態(tài)包括由依賴于新生血管才能生長的腫瘤，眼部疾病例如濕性AMD，以及炎癥狀態(tài)例如類 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、硬皮病、慢性阻塞性肺部疾病，或哮喘。本發(fā)明中的“阻斷結(jié)合”或“競爭性結(jié)合”的能力是指抗體將兩個分子間結(jié)合的相 互作用抑制到50 %或更高的能力。在某些實施方式中，這種抑制作用可以大于60 %，在某 些實施方式中大于70%，在某些實施方式中大于80%，在某些實施方式中大于90%。在某 些實施方式中，被抑制的結(jié)合相互作用可以是貝伐單抗與hVEGF165的結(jié)合。在某些實施方 式中，被抑制的結(jié)合相互作用可以是hVEGF165與VEGF-Rl和/或VEGF-R2結(jié)合。本發(fā)明中的“治療有效劑量”是指，某種藥物有效治療某種疾病或狀態(tài)的劑量或濃 度。例如，對于本發(fā)明中公開的抗體在治療癌癥上的用途來說，抗體的治療有效劑量是指在 該劑量或濃度下，該抗體可以根除全部或部分腫瘤、抑制或減緩腫瘤生長及轉(zhuǎn)移、預(yù)防或延 緩腫瘤的發(fā)展，或以上的某些組合。又例如，治療劑量可從約0. 01mg/kg到約100mg/kg，如， 在約0. 01mg/kg和約50mg/kg之間(如，約0. lmg/kg, lmg/kg,或10mg/kg)。在某些實施方 式中，初始治療劑量不超過約100mg/kg或50mg/kg，后續(xù)治療劑量為至少0. 01mg/kgo某給 藥劑量可以是每天給藥、兩周給藥、每周給藥、或每月給藥。
完全人源VEGF抗體完全人源抗體與鼠源抗體、契合抗體、或人源化抗體相比，在安全性和療效上都有 多個潛在優(yōu)勢。第一，完全人源抗體不含非人源殘基，從而使其在給藥后不易產(chǎn)生宿主免疫 反應(yīng)。第二，與其他抗體種類相比，完全人源抗體通常表現(xiàn)出較低的清除率。降低的清除率 可以允許較低的劑量和給藥頻率。本發(fā)明中提供了兩種完全人源抗體，XPA. 10. 064和XPA. 10. 072，其可特異性結(jié) 合hVEGF165。XPA. 10. 064和XPA. 10. 072通過用hVEGF165篩選噬菌體展示scFv文庫得 到。XPA. 10. 072的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列分別在SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3中列出， XPA. 10. 064的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列分別在SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5中列出。在 SEQ IDNO :2中列出的XPA. 10. 072重鏈可變區(qū)含有CDR，在第31-35位氨基酸殘基(CDRH1， SEQID NO 6)，第50-66位氨基酸殘基(CDRH2，SEQ ID NO 7)，以及在第99-108位氨基酸殘 基(CDRH3，SEQ ID NO 8)。在SEQ ID NO 3中列出的XPA. 10. 072輕鏈可變區(qū)含有CDR，在 第 26-35 位氨基酸殘基(072CDRL1，SEQ ID NO :9)，第 51-57 位氨基酸殘基(072CDRL2，SEQ ID NO 10)，以及在第 90-100 位氨基酸殘基(072CDRL3, SEQ ID N0:11)。在 SEQ ID N0:4 中 列出的XPA. 10. 064重鏈可變區(qū)含有CDR，在第31-35位氨基酸殘基(CNRH1, SEQ IDNO 6)， 第50-66位氨基酸殘基(CDRH2，SEQ ID NO 7)，以及在第90-108位氨基酸殘基(CDRH3，SEQ ID NO 8)。在SEQ ID NO 5中列出的XPA. 10. 064輕鏈可變區(qū)含有⑶R，在第26-35位氨基 酸殘基(064CDRL1,SEQ ID NO 12)，第 51-57 位氨基酸殘基(064CDRL2, SEQ ID NO :13)，以 及在第 90-100 位氨基酸殘基(064CDRL3, SEQ ID NO 14)。鑒于XPA. 10. 064 和 XPA. 10. 072 這兩禾中 scFv 在 ELISA 實驗中可結(jié)合 hVEGF165，具有高親和力，而且可抑制HVEGF165與VEGF-Rl和VEGF-R2的結(jié)合，因此選擇將這些抗體 轉(zhuǎn)換成scFv-Fc和IgG2，以用于其它功能性研究。Biacore分析結(jié)果顯示，XPA. 10. 064和 XPA. 10. 072的IgG2對hVEGF165表現(xiàn)出了相似的高結(jié)合親和力，但是對mVEGF165只表現(xiàn)出微 弱的結(jié)合力。兩種抗體都可結(jié)合hVEGF121。XPA. 10. 064和XPA. 10. 072的IgG2對hVEGF165 的結(jié)合親和力分別為1. 5nM和1. 7nM，兩種抗體的解離速率約為貝伐單抗的兩倍。Biacore 分析結(jié)果還顯示，XPA. 10. 064 和 XPA. 10. 072 的 IgG2 對 hVEGF165 與 VEGF-Rl 和 VEGF-R2 的 結(jié)合抑制作用比貝伐單抗更強(qiáng)。XPA. 10. 064和XPA. 10. 072抑制VEGF信號傳導(dǎo)的作用通過 ELISA實驗得到證明，兩種抗體都可抑制hVEGF165誘導(dǎo)的VEGF-R2的磷酸化?？乖砦环治鲲@示，XPA. 10. 064和XPA. 10. 072可結(jié)合hVEGF165上的線性抗原表 位，且這些抗原表位與貝伐單抗結(jié)合的抗原表位至少在某種程度上重疊。免疫組化分析顯 示，與貝伐單抗不同，XPA. 10. 064和XPA. 10. 072都表現(xiàn)出大范圍的組織交叉反應(yīng)性。兩種 抗體都可抑制HUVEC的增殖，都可在體內(nèi)抑制血管生成和腫瘤生長。表1列出了 XPA. 10. 064 和XPA. 10. 072的性質(zhì)總結(jié)。因此，在某些實施方式中提供了分別含有如SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5所列的 XPA. 10. 064輕鏈和重鏈的抗體。在其他實施方式中，提供了分別含有如SEQ ID NO :2和 SEQID NO 3所列的XPA. 10. 072輕鏈和重鏈的抗體。鑒于本發(fā)明中提供的抗體對hVEGF165 和hVEGFm有高親和力，以及可阻斷VEGF與VEGF-Rl和VEGF-R2的結(jié)合及阻斷VEGF-誘導(dǎo) 的受體磷酸化，這些抗體可用于抑制VEGF信號傳導(dǎo)及阻斷VEGF通路。在這個基礎(chǔ)上，所述 抗體可用于治療與VEGF表達(dá)相關(guān)的多種狀態(tài)。本發(fā)明中提供的抗體已被發(fā)現(xiàn)可抑制HUVEC增殖以及在體外抑制血管生成。因 此，所述抗體可用于治療與血管生成增加相關(guān)的多種狀態(tài)。例如，所述抗體可用于治療癌 癥，通過抑制腫瘤位點的血管增殖從而抑制腫瘤生長。相同地，所述抗體可用于治療癌癥， 通過破壞腫瘤位點的血管，從而導(dǎo)致腫瘤壞死。本發(fā)明中公開的抗體在治療癌癥方面的療 效在體內(nèi)已經(jīng)得到證實。某些實施方式提供的抗體可抑制血管生成和/或腫瘤生長，其抑制程度與貝伐單 抗相近或更強(qiáng)。在體內(nèi)A673腫瘤生長抑制實驗中，XPA. 10. 064和XPA. 10. 072在所有的測 試劑量中都抑制了 A673腫瘤的生長，抑制程度與貝伐單抗相近。某些實施方式公開的抗 體在以低于貝伐單抗的劑量或濃度給藥時也抑制了血管生成和/或腫瘤生長，抑制程度與 貝伐單抗相同或更高。本發(fā)明中提供的抗體與貝伐單抗相比，可表現(xiàn)出相似或更佳的藥代 動力學(xué)性質(zhì)。例如，所述抗體與貝伐單抗相比可表現(xiàn)出更長的循環(huán)半衰期或更低的免疫原 性。在某些實施方式中，所述抗體與貝伐單抗相比表現(xiàn)出相似或更佳的藥代動力學(xué)性質(zhì)，但 所述抗體的給藥間隔可長于貝伐單抗，且不具有貝伐單抗在給藥間隔較長時導(dǎo)致的負(fù)面作 用。本發(fā)明中公開的抗體可用于治療任何與血管生成異常相關(guān)的狀態(tài)，所述血管生成 異常至少部分被VEGF通路控制。這些狀態(tài)，通常與VEGF表達(dá)水平升高相關(guān)，包括與血管生 成增加相關(guān)的眼部疾病，如濕性AMD或增殖性視網(wǎng)膜病變?nèi)缣悄虿⌒砸暰W(wǎng)膜病變，糖尿病 腎病和其他糖尿病血管增生疾病，囊性纖維化病以及多種腫瘤(Amoroso 1997 ；McColley 2000 ；Khamaisi 2003)?？捎帽景l(fā)明中公開的抗體治療的腫瘤種類包括但不限于惡性腫瘤、淋巴瘤、胚細(xì)胞瘤、肉瘤、白血病、或淋巴的惡性腫瘤。更具體地，可用本發(fā)明中公開的抗體治療的腫瘤種 類包括但不限于鱗狀細(xì)胞癌例如上皮鱗狀細(xì)胞癌，肺癌包括小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌， 腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃癌例如胃腸癌、胰腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞腦瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱 癌、肝腫瘤(heptoma)、子宮內(nèi)膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸 癌、腸癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝細(xì)胞癌、肛門癌、陰莖癌、頭頸癌、以及兒童癌如小兒肉瘤。此 外，腫瘤可以是惡性的(如，癌癥)或良性的(如增生、囊腫、擬孢囊、錯構(gòu)瘤和良性腫瘤)。可用本發(fā)明中公開的抗體治療的腫瘤種類也可包括與某特定生物標(biāo)記相關(guān)的癌 癥。例如，生物標(biāo)記包括，但不限于，視網(wǎng)膜及中樞神經(jīng)血管瘤病(von Hippel/Lindau,VHL) 腫瘤抑制基因中的突變和/或缺氧誘導(dǎo)因子1 α (ΗΙΡ-1 α )的過量表達(dá)。在某些實施方式 中，所述抗體可用于治療在VHL腫瘤抑制基因中存在突變的癌癥。VHL基因中的突變會導(dǎo)致 缺氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Ia和2α組成性穩(wěn)定，從而結(jié)合VEGF基因的增強(qiáng)子元件并刺激血管生 成(HarridOOO)?？捎帽景l(fā)明中公開的抗體進(jìn)行治療的VHL突變的腫瘤種類包括，例如，中 樞神經(jīng)系統(tǒng)血管母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜血管母細(xì)胞瘤、內(nèi)淋巴囊腫瘤，透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌和/ 或腎囊腫、嗜鉻細(xì)胞瘤、胰腺囊腫、神經(jīng)內(nèi)分泌瘤、附睪和闊韌帶囊腺瘤。首先根據(jù)是否存在 VHL基因突變對受試對象通過已知方法進(jìn)行選擇或篩選，篩選方法例如使用突變特異性的 巢式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或巢式單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析的分子檢測方法(Ashida et al.， J.Urol. 169:20898-93(2003))。再挑選出識別的對象，并用本發(fā)明中的抗體進(jìn)行治療。在 其他實施方式中，所述抗體可用于在對象中治療有ΗΙΡ-Ια過量表達(dá)的癌癥。ΗΙΡ-Ια過 量表達(dá)可通過對組織(如，腦組織、乳房組織、宮頸組織、食管組織、口咽組織、卵巢組織和 前列腺組織)進(jìn)行活組織檢查的方法檢查。再對篩選出的對象用所述抗體治療或者用所 述抗體與HIP-I α抑制劑聯(lián)用治療，HIP-I α抑制劑例如2_甲氧雌二醇、4_0_甲基三白草 酉享(4-0-methylsarcerneol)、雙木月旨素 A (manassantinA)、雙木月旨素 Bl (manassantin Bi)、 NSC-134754、NSC-643735、拓?fù)涮婵怠?0166336、？乂-478、1 115777、西妥昔單抗、103051 、以及 非甾體抗炎藥(見 Kimbro&Simons，Endocrine-Related Cancer, 13 739-749 (2006)) 其他可用本發(fā)明中描述的抗體治療的狀態(tài)包括炎癥性狀態(tài)如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛 皮癬、硬皮病、慢性阻塞性肺疾病，以及哮喘。某些實施方式提供的抗體可用于治療某種已 經(jīng)對貝伐單抗療法產(chǎn)生耐藥性的狀態(tài)。本發(fā)明中提供的抗體可用于多種非治療用途。在某些實施方式中，所述抗體可作 為親和純化劑用于純化hVEGF165，其他VEGF異構(gòu)體，或其片段。在這些實施方式中，可通過 本領(lǐng)域已知方法將所述抗體固定在某固相上，如樹脂或濾紙上。所述抗體也可以用于從溶 液中沉淀hVEGF165，其他VEGF異構(gòu)體，或其片段。在其他非治療用途的實施方式中，所述 抗體可應(yīng)用于多種體外或體內(nèi)的診斷或檢測中。在某些這樣的實施方式中，所述抗體可以 綴合到某可檢測的標(biāo)記上。在某些這樣的實施方式中，所述抗體可以不綴合到某可檢測的 標(biāo)記上，但可通過可結(jié)合所述抗體的標(biāo)記抗體來檢測。某些實施方式中公開的抗體可用于 檢測hVEGF165的表達(dá)。在某些這樣的實施方式中，所述抗體可用于診斷與hVEGF165表達(dá)升 高相關(guān)的狀態(tài)。例如，所述抗體可與來自某對象的生物樣本接觸，從而診斷在該對象中與 hVEGF165表達(dá)升高相關(guān)的狀態(tài)。同樣地，所述抗體可直接給藥于所述對象，利用本領(lǐng)域中已 知方法檢測所述抗體與hVEGF165的結(jié)合。突變的抗原表位結(jié)合研究表明，本發(fā)明中公開的抗體結(jié)合VEGF上的線性抗原表位，該抗原表位與貝伐單抗識別的抗原表位至少部分重疊。因此，在某些實施方式中，本發(fā) 明中公開的抗體可結(jié)合含有hVEGF165第79-94位氨基酸殘基(SEQ ID NO=D的抗原表位， 或由hVEGF165第79-94位氨基酸殘基(SEQ ID NO :1)組成的抗原表位。同樣地，所述抗體 可結(jié)合與SEQ ID NO :1的第79-94位氨基酸殘基所對應(yīng)的序列完全或部分重疊的抗原表 位?；诳乖砦坏闹丿B，某些實施方式中公開的抗體可競爭性地抑制貝伐單抗與hVEGF165 的結(jié)合。本發(fā)明中提供的抗體在優(yōu)選的情況下在人體中的清除半衰期(T1/2)可與貝伐單 抗相似或更高，貝伐單抗的半衰期為17-21天。清除半衰期，指給藥抗體的血漿濃度降至低 一半時所需的時間，可通過本領(lǐng)域中的已知方法計算。某些實施方式中公開的抗體的清除 半衰期可以是至少17天。在某些其他實施方式中，可以是17-21天，在某些這樣的實施方 式中可以是大于21天。本發(fā)明中公開的抗原結(jié)合片段可含有全長抗體的某一片段或某幾片段，例如， Fab.Fab'、F(ab' )2、Fv、或scFv片段。這些片段可由全長抗體經(jīng)本領(lǐng)域已知的方法制得， 例如用酶進(jìn)行蛋白水解剪切，如用木瓜蛋白酶制得Fab片段或用胃蛋白酶制得F (ab ‘ ) 2片 段。某些實施方式中公開的抗體可含有來自SEQ ID NOs 2-5的一種或多種⑶R，其被移接 至一種或多種人源框架區(qū)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可知，本發(fā)明中提供的抗體可與多種綴合物偶聯(lián)或關(guān)聯(lián)或聯(lián) 用(參見，例如， “Conjugate Vaccines “，Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse andR. E. Lewis, Jr. (eds· )，Carger Press，New York，(1989))。這 些綴合物與所述抗體的連接可通過共價鍵、親和結(jié)合、夾入(intercalation)、協(xié)同結(jié)合、復(fù) 合、關(guān)聯(lián)、混合、或添加等，以及其他方法。某些實施方式中，所述的抗體可通過工程化使其 含有抗原表位結(jié)合部位以外的特定位點，這些位點可被用于結(jié)合一種或多種綴合物。例如， 這種位點可包括一種或多種反應(yīng)性氨基酸殘基，例如半胱氨酸或組氨酸殘基，以促使其與 某綴合物形成共價連接。在某些實施方式中，所述抗體可間接連接于某綴合物，或通過另一 個綴合物連接。例如，所述抗體可與生物素綴合，然后間接綴合至另一種親和素綴合的綴合 物。在某些實施方式中，與公開的抗體相連或聯(lián)合使用的綴合物可包含一種或多種物 質(zhì)，這些物質(zhì)旨在改變所述抗體的一種或多種藥物代謝性質(zhì)(PK)，例如聚乙二醇(PEG)可 增加所述抗體的半衰期或降低其免疫源性(見，例如，Katre 1990)。在某些實施方式中，綴合物可含有一種或多種細(xì)胞因子，其在本發(fā)明中指任何在 細(xì)胞上作為細(xì)胞間調(diào)節(jié)因子的蛋白。細(xì)胞因子的實例包括但不限于淋巴細(xì)胞因子、單核因 子、人生長激素、N-甲硫氨酰基人生長激素、牛生長激素、甲狀旁腺激素、甲狀腺素、胰島素、 胰島素原、恥骨松弛激素、恥骨松弛激素原、卵泡刺激素(FSH)、促甲狀腺素(TSH)、黃體生 成素(LH)、肝生長因子、纖維原生長因子、泌乳刺激素、胎盤催乳激素、腫瘤壞死因子α和 β、繆勒(氏)管抑制物質(zhì)、小鼠促性腺激素相關(guān)肽、抑制素、活化素、整聯(lián)蛋白、促血小板生 成素(TPO)、神經(jīng)生長因子如NGF-β、血小板生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子如TGF-a和TGF-β、 胰島素樣生長因子I和II、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、成骨因子、干擾素如干擾素- α、-β、 和-Y ；集落刺激因子如巨噬細(xì)胞-CSF、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞CSF、和粒細(xì)胞-CSF、白介素如 IL-U IL-I a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL—10、IL-11、以及 IL-12、腫瘤壞死因子如TNF-ci和TNF-β，以及其他多肽因子。本發(fā)明中的抗體及其抗原結(jié)合物 可以與前述的任意細(xì)胞因子聯(lián)合應(yīng)用和/或給藥。 在某些實施方式中，與所述的抗體結(jié)合或聯(lián)用的綴合物可含有一種或多種化療 藥物，本發(fā)明中所述的化療藥物是指任何可用于治療癌癥的物質(zhì)。化療藥物實例包括，但 不限于，替莫唑胺、特異性結(jié)合IGFl受體的抗體、洛那法尼(Ionafarnib)、骨化三醇、坦西 莫司、伊立替康、喜樹堿、阿霉素、亞德里亞霉素，毒素類例如蓖麻毒素、白喉毒素或其他細(xì) 菌、真菌、植物或動物來源的毒素，凝結(jié)劑、烷化劑例如噻替派和環(huán)磷酰胺(CYTOXAN )、烷 基磺酸鹽類例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡，氮丙啶類例如苯佐替派(benzodopa)、卡波 醌、美妥替哌(meturedopa)、烏瑞替派(uredopa)，乙撐亞胺類和甲基蜜胺類如六甲蜜胺、 曲他胺、三亞乙基磷酰胺、三亞乙基硫代磷酰胺和三羥甲基三聚氰胺，氮芥類例如苯丁酸 氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、二氯甲基二乙胺、鹽 酸氮芥氧鹽酸鹽(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖、新恩比興、苯芥膽甾 醇、潑尼莫司汀、曲磷胺和尿嘧啶氮芥，亞硝基脲類如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫 司汀、尼莫司汀、雷莫司汀，抗生素類如阿克拉霉素、放線菌素、氨茴霉素(authramycin)、 重氮絲氨酸、博來霉素(bleomycins)、放線菌素C、卡奇霉素、卡拉星(carabicin)、卡波霉 素(carnomycin)、嗜癌霉素、色霉素、放線菌素D、柔紅霉素、地托比星、6-重氮-5-氧化-L 正亮氨酸、阿霉素、表阿霉素、依索比星、依達(dá)比星、麻西羅霉素(marcellomycin)，絲裂霉 素、霉酚酸、諾拉霉素、橄欖霉素、培洛霉素(peplomycin)、紫菜霉素、嘌呤霉素、三鐵阿霉 素、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素、鏈脲佐菌素、殺結(jié)核菌素、烏苯美司、凈司他汀、佐 柔比星、抗代謝劑如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)，葉酸類似物如二甲葉酸、甲氨蝶呤、 蝶羅呤、三甲曲沙、嘌呤類似物如氟達(dá)拉濱，6-巰基嘌呤，硫咪巰鳥嘌呤(thiamiprine)， 硫鳥嘌呤，嘧啶類似物如安西他濱、阿扎胞苷、6-氮雜尿嘧啶、卡莫氟、阿糖胞苷、雙脫氧 尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷、5-FU、雄激素類例如卡普睪酮、屈他雄酮丙酸酯、環(huán) 硫雄醇、美雄烷、睪內(nèi)酪，抗腎上腺類例如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦，葉酸補(bǔ)充劑例如亞 葉酸、醋葡醛內(nèi)酯、醛磷酰胺甙、氨基乙酰丙酸、安吖啶、bestrabucil、比生群、依達(dá)曲沙 (edatraxate)、地磷酰胺(defofamine)、秋水仙胺、地吖醌、依氟鳥氨酸(elformithine)、 依利醋銨、依托格魯、硝酸鎵、羥基脲、香菇多糖、氯尼達(dá)明、米托胍腙、米托蒽醌、莫哌達(dá)醇、 硝氨吖啶(nitracrine)、噴司他丁、蛋氨氮芥(phenamet)、吡柔比星、鬼臼毒素、2-乙基胼 (2-ethylhydrazide)、甲芐胼、PSK 、雷佐生、西佐喃、鍺螺胺、細(xì)交鏈孢菌酮酸、三亞胺醌、 三(2-氯乙基)胺、氨基甲酸乙酯、長春地辛、達(dá)卡巴嗪、甘露醇氮芥、二溴甘露醇、二溴衛(wèi) 矛醇、哌泊溴烷、加西托星(gacytosine)、阿糖胞苷(“Ara-C")、環(huán)磷酰胺、噻替派、紫 杉醇類例如紫杉醇(泰素 ，百時美施貴寶公司腫瘤部，普林斯頓，新澤西)以及多西他塞 (泰素帝 TAX0TERE , Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)，阿博利斯(ABRAXANE)(結(jié)合 白蛋白的粒徑為約130nm的紫杉醇注射用混懸劑)，苯丁酸氮芥，吉西他濱，6-硫鳥嘌呤， 巰嘌呤，甲氨蝶呤，鉬類類似物如順鉬或卡鉬、賽特鉬(satraplatin)、奧沙利鉬、長春堿， 鉬，依托泊苷(VP-16)，異環(huán)磷酰胺，絲裂霉素C，米托蒽醌，長春新堿，長春瑞賓，諾維本， 米托蒽醌，替尼泊苷，柔紅霉素，氨基蝶呤，希羅達(dá)，伊班瞵酸鈉，CPT-11，端粒酶抑制劑RFS 2000，二氟甲基鳥氨酸(DMFO)，維甲酸，埃斯培拉霉素(esperamicins)、卡培他濱、吉西他 濱(gemcitabine)，以及藥用可接受的鹽類、酸類、和/或以上任一的衍生物?；熕幬镆部砂辜に厮幬铮渥饔糜谡{(diào)控或抑制激素在腫瘤上的作用，例如抗雌激素類藥物包括他 莫西芬、雷洛西芬、抑制4(5)_咪唑類的芳香化酶，4-羥基他莫西芬，曲沃昔芬，雷洛昔芬， LY117018,奧諾前列素，托瑞米芬(法樂通)，以及抗雄激素類包括氟他胺，尼魯米特，比卡 魯胺，亮丙瑞林，戈舍瑞林。本發(fā)明提供的抗體和抗原結(jié)合片段可與任一前述化療藥物聯(lián)合 使用和/或給藥。在某些實施方式中，與公開的抗體相連的綴合物可含有一種或多種可檢測的標(biāo) 記。所述標(biāo)記包括，但不限于，放射性同位素如123I、124I、125I、mI、35S、3H、mIn、112In、14C、64CU、 67CU、86Y、88Y、9°Y、177LU、211At、186Re、188Re、153Sm、212Bi、和 32P、其他鑭系元素、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物、 熒光標(biāo)記物例如熒光素、羅丹明、丹黃酰(dansyl)、藻紅素、或得克薩斯紅(Texas Red), 以及酶_底物標(biāo)記物例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、或β -D-半乳糖苷酶。為治療與高VEGF表達(dá)水平和/或血管生成增加相關(guān)的疾病，本發(fā)明中的抗體可以 在某有效劑量下與藥用可接受的媒介進(jìn)行制劑。這種制劑可以包括生理可耐受的液體、凝 膠、固體運載物(carrier)、稀釋劑、佐劑、或輔料，或以上的某些組合。有效劑量部分取決 于對象的體重、年齡、和健康狀況，以及給藥途徑和腫瘤發(fā)展程度。含有所述抗體的藥物制 劑可單獨給藥或與其他已知治療物質(zhì)聯(lián)合給藥。例如，所述抗體可以與任何已知的可抑制 VEGF信號通路的治療藥物聯(lián)合用藥，包括其他抗體或基于抗體的藥物。同樣地，抗體也可 與不抑制VEGF信號通路但靶向作用于與目的疾病相關(guān)的另一通路或另一癥狀的治療藥物 聯(lián)合用藥。例如，本發(fā)明中的抗體可與化療、放療、和/或手術(shù)聯(lián)用，以治療癌癥。與其他治 療藥物“聯(lián)用”的抗體不是必須與該藥物同時給藥。在另一種治療物質(zhì)給藥之前或之后給 藥的抗體在本發(fā)明中也被認(rèn)為是與該治療藥物“聯(lián)用”?？贵w可以通過皮下、腹腔、靜脈、肌 肉、皮下或透皮注射以及其他方式給藥。某些實施方式提供了表達(dá)所述抗體的表達(dá)系統(tǒng)。這些表達(dá)系統(tǒng)包括編碼所述抗體 的多核苷酸，含有這些多核苷酸的載體，以及含有這些載體的宿主細(xì)胞。編碼所述抗體的多 核苷酸可通過本領(lǐng)域已知方法被分離或合成，并插入可復(fù)制的載體中進(jìn)行放大或克隆。編 碼所述抗體可變輕鏈和可變重鏈(Vh)的多核苷酸可從單個載體中表達(dá)，或者可用兩個 分開的載體表達(dá)，再在體外進(jìn)行組裝。在某些實施方式中，它們可以在同一細(xì)胞中由兩個分 開的載體中共同表達(dá)并在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行組裝(見，例如，美國專利號5，595，898)。適用的載 體可含有多種調(diào)控序列，如啟動子、增強(qiáng)子、或轉(zhuǎn)錄起始序列，以及用于表型選擇的編碼標(biāo) 記物的基因。這樣的附加序列在本領(lǐng)域中公知。在某些實施方式中，所述載體可含有編碼 人IgG2免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)(Ch)和輕鏈恒定區(qū)(Q)的多核苷酸序列?；蛘撸鲚d 體可僅表達(dá)所述抗體的Vh和\鏈，而表達(dá)出的多肽含有一 Fv片段而不是完整的抗體。載 體可以插入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中從而放大或表達(dá)所述的多核苷酸序列。所述宿主細(xì)胞可以在 本領(lǐng)域已知的多種培養(yǎng)液中培養(yǎng)并產(chǎn)生抗體，培養(yǎng)液例如最低基本培養(yǎng)液(MEM) (Sigma)、 RPMI-1640 (Sigma)，Dulbecco 改良 Eagle 培養(yǎng)液(DMEM) (Sigma)和 Ham' s FlO (Sigma)。 培養(yǎng)液可添加多種物質(zhì)，例如激素、生長因子、鹽類、緩沖液、核苷、抗生素、微量元素，葡萄 糖、或其他能量源。培養(yǎng)條件例如溫度和PH可通過本領(lǐng)域公知的參數(shù)進(jìn)行調(diào)節(jié)。本發(fā)明所述的抗體可含有綴合物用于向癌細(xì)胞中進(jìn)行特異性傳遞。另外，所述抗 體與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合可以用于招募宿主免疫反應(yīng)。這種宿主免疫反應(yīng)可通過雙價抗體得到 增強(qiáng)，雙價抗體的其中一個結(jié)合位點對應(yīng)于本發(fā)明提供的完全人源抗體而另一個結(jié)合位點則識別細(xì)胞毒T細(xì)胞。在某些實施方式中，所述的抗體可含有高巖藻糖含量的寡聚多糖。在其他實施方 式中，所述的抗體可含有低巖藻糖含量，例如無巖藻糖的Fc抗體。本發(fā)明所述的低巖藻糖 抗體可通過具有低巖藻糖糖基化活性的細(xì)胞系制得，例如大鼠YB2/0細(xì)胞(ShinkaWa2003) 或 CHO 變體細(xì)胞系 Lecl3 (Shields 2002)。藥物組合物。本發(fā)明的范圍內(nèi)包括了藥物組合物，其含有本發(fā)明所述的抗體或抗 原結(jié)合片段以及關(guān)聯(lián)的藥用可接受的運載物(例如，以單個組合物形式存在或分開存在于 成套物件中)。藥物組合物可通過藥學(xué)領(lǐng)域任何公知的方法制備；見，例如，Gilman，et al.， (eds) (1990), The Pharmacological Bases of Therapeutics,8th Ed. ,Pergamon Press ； A. Gennaro(ed. )，Remington' s Pharmaceutical Sciences，18th Edition，(1990)，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania. ；Avis, et al.，(eds.) (1993)Pharmaceutical Dosage Forms -Parenteral MedicationsDekker, New York ；Lieberman, et al.，(eds.) (1990)，Pharmaceutical Dosage Forms Tablets Dekker, New York ；以及 Lieberman，et al.，(eds.)(1990)，Pharmaceutical Dosage Forms !Disperse SystemsDekker,New York.含有本發(fā)明中所述抗體或抗原結(jié)合片段的藥物組合物，可選擇與另一化療藥物聯(lián) 合，并可采用常規(guī)藥用可接受輔料和添加劑通過常規(guī)的方法制備。所述的藥用可接受的輔 料和添加劑包括，無毒的可兼容的填充物、粘合劑、崩解劑、緩沖液、防腐劑、抗氧劑、潤滑 劑、攪味劑、增稠劑、著色劑、乳化劑以及類似物。所有的給藥途徑都可使用，包括但不限于， 注射途徑(如，皮下注射、靜脈注射，腹腔注射、肌肉注射、外用給藥、腹腔注射、吸入、顱內(nèi) 注射)以及非注射途徑(如，口服給藥、鼻腔給藥、眼內(nèi)給藥、舌下給藥、直腸給藥、或外用給 藥)。注射劑可制備成常規(guī)的形式，可以是液體溶液或混懸液，可以是固體形式，該固體 形式可在注射前于液體中形成溶液或混懸液，或者是乳劑。所述的注射劑，溶液和乳劑也 可含有一種或多種輔料。輔料包括，例如，水、鹽、葡萄糖、甘油、或乙醇。另外，如果需要的 話，用于給藥的藥物組合物還可以含有少量的無毒佐劑如保濕劑或乳化劑，PH緩沖劑、穩(wěn)定 劑、增溶劑、以及其他這樣的物質(zhì)，例如，醋酸鈉、山梨醇酐單月桂酸酯、油酸三乙醇胺和環(huán) 糊精。在本發(fā)明的某個實施方式中，注射制劑中使用的藥用可接受運載物包括水相介 質(zhì)、非水相介質(zhì)、抗微生物物質(zhì)、等滲物質(zhì)、緩沖液、抗氧劑、局部麻醉劑、助懸劑和分散劑、 乳化劑、螯合劑、及其他藥用可接受的物質(zhì)。水相介質(zhì)的實例包括氯化鈉注射液，林格氏液注射液，等滲葡萄糖注射液，無菌水 注射液，葡萄糖和乳酸林格氏注射液。非水相注射介質(zhì)包括植物來源的不揮發(fā)性油，棉花子 油，玉米油，芝麻油，和花生油。細(xì)菌抑制或真菌抑制濃度的抗菌物質(zhì)可加入包裝在多劑量 容器中的注射制劑中，抗菌物質(zhì)包括酚類或甲酚類，汞制劑，苯甲醇，氯代丁醇，甲基和丙基 對羥基苯甲酸酯、噻汞撒、氯苯甲烷銨和氯苯乙銨。等滲劑包括氯化鈉和葡萄糖。緩沖液包 括磷酸鹽和枸櫞酸酸鹽緩沖液?？寡趸瘎┌蛩釟溻c。局部麻醉劑包括鹽酸普魯卡因。 助懸劑和分散劑包括羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素、和聚乙烯吡咯烷酮。乳化劑包括 聚山梨醇酯80 (吐溫-80)。金屬離子的螯合劑包括EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇 四乙酸)。藥用運載物還可包括用于水混溶介質(zhì)的乙醇、聚乙二醇、丙二醇；以及用于PH調(diào)節(jié)的氫氧化鈉、鹽酸、枸櫞酸、或乳酸。在本發(fā)明的某一實施方式中，注射給藥的制劑可包括現(xiàn)用的無菌溶液、使用前現(xiàn) 與溶劑混合的無菌干燥的可溶物，如凍干粉，包括皮下片、注射即用的無菌混懸劑、使用前 現(xiàn)與介質(zhì)混合的無菌干燥不溶產(chǎn)品以及無菌乳劑。所述溶液可以為水相或非水相。本發(fā)明所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，可以選擇與另一個化療藥物關(guān)聯(lián)，可對所 述抗體或其抗原結(jié)合片段的濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)，使得一次注射可提供有效量，并產(chǎn)生理想的藥 理效果。本領(lǐng)域公知，精確的劑量取決于，尤其是，病人或動物的年齡、體重、以及狀態(tài)。在本發(fā)明的某一實施方式中，單位劑量的注射制劑包裝在一個安瓿、一支管或一 支帶有針的針筒中。本領(lǐng)域習(xí)知，所有注射給藥的制劑應(yīng)為無菌。在本發(fā)明的某一實施方式中，通過在某適當(dāng)?shù)娜軇┲腥芙馑隹贵w或其抗原結(jié)合 片段可制備無菌凍干的粉末，所述抗體或抗原結(jié)合片段可選擇與另一化療物質(zhì)聯(lián)合，或者 與其藥物可接受的衍生物聯(lián)合。所述溶劑可含有一種輔料，其可使所述粉末或由所述粉末 制得的重組溶液的穩(wěn)定性提高或其他藥理組分得到改善。適用的輔料包括，但不限于，葡萄 糖、三梨糖醇、果糖、玉米糖漿、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他適用的物質(zhì)。所述溶劑還 可含有緩沖液，如枸櫞酸緩沖液、磷酸鈉或磷酸鉀緩沖液或其他本技術(shù)人員公知的緩沖液， 在一種實施方式中，緩沖液的PH為中性。在本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行所述溶 液隨后的過濾除菌，以及凍干可制得理想的制劑。在一種實施方式中，將所得的溶劑分裝至 小管中進(jìn)行凍干。每支小管可容納單次劑量或多次劑量的所述抗VEGF抗體或其抗原結(jié)合 片段或其組合物。每支小管中的裝入量可略微高于每次劑量所需或多次劑量所需(例如約 10%過量)，從而保證取樣精確和給藥精確。凍干粉可在適當(dāng)?shù)臈l件下儲存，如在約4°C到 室溫范圍。凍干粉用注射用水重溶后得到可注射給藥的制劑。在本發(fā)明的一種實施方式中， 將凍干粉加至注射用水中或其他適當(dāng)?shù)囊后w運載物中進(jìn)行重溶。精確的劑量取決于所選的 治療。該劑量可根據(jù)經(jīng)驗確定。本發(fā)明提供了以下實施例，旨在更好地說明本發(fā)明，而不應(yīng)被理解為限制本發(fā)明 的范圍。對于提到的具體材料，其僅僅旨在說明而不在于限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員在 無需創(chuàng)造性勞動以及不離開本發(fā)明范圍的情況下，開發(fā)出等同的方法或反應(yīng)物。應(yīng)理解，對 本發(fā)明中所述的過程可以做出多種變動但仍然包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。發(fā)明人認(rèn)為這樣的 變動包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實施例實施例1 制備可結(jié)合hVEGF!的抗體使用固定的hVEGF165篩選人源單鏈FV(SCFV)噬菌體展示文庫，確定一組具 有結(jié)合hVEGF165能力的抗體片段。通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行篩選(如Methods in Molecular Biology, vol. 178 :Antibody Phage Display :Method and Protocols Edited by P. M. 0' Brien and R. Aitken, Humana Press ； , "Panning of Antibody Phage-Display Libraries, "Coomber, D.W. J. , pp.133-145, 禾口"Selection of Antibodies Against Biotinylated Antigens, ” Chames, P.，et al. pp. 147-157)。簡單的說，用50 μ 1溶于PBS的濃度為10 μ g/ml的重組hVEGF165 (R&D Systems,分 類號293-VE)對NUNC MAXISORP板的三個孔中進(jìn)行包被。經(jīng)過4°C過夜培養(yǎng)后，用含5% 牛奶的PBS溶液在室溫下對自由結(jié)合位點進(jìn)行包封一小時。然后，在包封后的孔中加入約 200 μ 1溶于5%牛奶的PBS的噬菌體庫，室溫培養(yǎng)大約一到兩小時。沖洗孔并使用標(biāo)準(zhǔn)方法洗脫結(jié)合的唾菌體(見，如Sambrook and Russell, Molecule Cloning :A Laboratory Manual, 3rdEdition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) 洗脫后的噬菌體在 37°C時感染對數(shù)生長期的大腸桿菌TGl宿主細(xì)胞，進(jìn)行擴(kuò)增。以2500rpm的轉(zhuǎn)速離心5分 鐘收集被感染的TGl細(xì)胞，并鋪板至15cm 2YT-氨芐青霉素-2%葡萄糖瓊脂板上，30°C培養(yǎng) 過夜。然后使用擴(kuò)增的噬菌體重復(fù)篩選過程。篩選、洗脫和擴(kuò)增的循環(huán)過程重復(fù)三輪，濃度逐漸降低(如第一輪用50yg/ HilhVEGF165，第二輪用10yg/ml，第三輪用10 μ g/ml)，直到鋪板的TGl細(xì)胞的單克隆被用于 接種96孔板中的培養(yǎng)液。將微量培養(yǎng)生長至0D600達(dá)到0. 6，加入ImM IPTG誘導(dǎo)可溶性 scFv的表達(dá)，并在30°C振蕩培養(yǎng)過夜。旋轉(zhuǎn)沉淀細(xì)菌，使用周質(zhì)提取物，以標(biāo)準(zhǔn)ELISA檢測 法檢測scFv對固定hVEGF165的結(jié)合。實施例2 使用XPA. 10. 064和XPA. 10. 072 scFv阻斷 hVEGF^與VEGF警體的結(jié)合使用基于微孔板的競爭性篩選DELFIA實驗(Perkins Elmer, Walthm, ΜΑ)檢測實 施例1中具有hVEGF165結(jié)合能力的噬菌體克隆，阻斷hVEGF165與VEGF-Rl和/或VEGF-R2 的結(jié)合能力。簡單的說，將生物素化的hVEGF165溶液以1 1的體積比加入到實施例1中得到 的周質(zhì)提取物中，使HVEGF165的終濃度為0. 5 μ g/ml。將100 μ 1該混合物加入到VEGF-Rl 或 VEGF-R2 包被的板中(R&D Systems :VEGF-Rl/Flt_l，貨號 321-FL ;VEGF-R2/KDR/Flk_l， 貨號357-KD)，室溫培養(yǎng)1. 5小時。用PBST洗板。以50 μ 1/孔加入溶于DELFIA檢測緩沖 液的1 250稀釋的Europrium-鏈霉素溶液。室溫培養(yǎng)一小時，然后使用DELFIA洗滌緩 沖溶液洗滌。以50 μ 1/孔加入DELFIA增強(qiáng)緩沖液，并將板在室溫培養(yǎng)5分鐘。使用實時 熒光Gemini讀板儀讀板。實施例3. scFv向scFv-Fc和IgG的轉(zhuǎn)化選用在實施例2中對hVEGF165與VEGF-Rl和/或VEGF-R2結(jié)合抑制超過60 % 的兩個 scFv, XPA. 10. 064 和 XPA. 10. 072，用于轉(zhuǎn)化 scFv-Fc 和 / 或 lgG。XPA. 10. 064 和 XPA. 10. 072的輕鏈可變區(qū)(包括輕鏈⑶Rs)和輕鏈可變區(qū)(包括輕鏈⑶Rs)如圖1所示。 重鏈 CDRs (如HCDR1，HCDR2 和 HCDR3)和輕鏈 CDRs (如LCDR1，LCDR2 和 LCDR3)通過 Kabat 計數(shù)系統(tǒng)石角定(Kabat, E. A. , et al. 1987, in Sequence of Proteins of Immunological Interest, USDepartment of Health and Human Services, NIH, USA)。 XPA. 10. 064 禾口 XPA. 10. 072的HCDRl，HCDR2和HCDR3被確定為如SEQ ID Nos. 6，7和8分別所示的氨基酸 序列。XPA. 10. 064 的 LCDRl，LCDR2 和 LCDR3 被確定為如 SEQ ID Nos. 12，13 和 14 分別所 示的氨基酸序列。XPA. 10. 072的LCDRl，LCDR2和LCDR3被確定為如SEQ ID Nos. 9，10和 11分別所示的氨基酸序列。為了將XPA. 10. 064 和 XPA. 10. 072 轉(zhuǎn)化為 scFv-Fc 融合蛋白，將 scFv 的 cDNAs 克 隆至真核表達(dá)載體，該真核表達(dá)載體經(jīng)修飾后可編碼gramma-2 ( γ 2)重鏈恒定區(qū)CH2和CH3 結(jié)構(gòu)域的基因(U. S. Patent No. 7，192，737 ；WO 2004/033693)。為了將XPA. 10. 064和XPA. 10. 072轉(zhuǎn)化為lgG，將重鏈和輕鏈的可變區(qū)克隆入至真 核表達(dá)雜體，該真核表達(dá)載體編碼kappa (κ), lambda ( λ )，或gamma-2 ( γ 2)重鏈和輕鏈恒 定區(qū)基因(US 2006/0121604)。按前人所述方法(US 2006/0121604)，在細(xì)胞中瞬時表達(dá)XPA. 10. 064和 XPA. 10. 072的scFv-Fc和IgG抗體。在培養(yǎng)的第六天收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液。使用蛋白-A色譜純化 IgG0 實施例 4 用 Biacore 分析 XPA. 10. 064 和 XPA. 10. 072 的 scFv-Fc 和 IgG 結(jié) 合動力學(xué)使用BIAC0RE 2000 和 CM5 傳感芯片(Biacore)檢測 XPA. 10. 064 和 XPA. 10. 072 的scFv-Fc的結(jié)合親和力，其中蛋白A/G(PierCe)以高密度固定在所有的流動細(xì)胞上。實 驗所用稀釋緩沖液和流動緩沖溶液為含有1 50稀釋的Chemiblocker (Chemicon)的 HBS-EP(Biacore)溶液?？贵w捕捉通過在流動細(xì)胞2 (fc2)上以20 μ 1/分鐘的速度注射入 不定體積的稀釋過的XPA. 10. 064和XPA. 10. 072的scFv進(jìn)行，從而實現(xiàn)約50-70 RU的抗 體捕捉。抗體的濃度約為0. 5 μ g/ml。用Kinject將sf21細(xì)胞表達(dá)的hVEGF165以30 μ 1/ 分鐘的速度注射5分鐘以上，并帶有15分鐘的fcl和fc2的解離。以三倍系列稀釋制備 四個 hVEGF165 稀釋液，得到的濃度為 5 μ g/ml (119nM) ,1.667 μ g/ml (39. 7ηΜ)，0· 55 μ g/ ml (13. 2ηΜ)和 0. 185 μ g/ml (4. 4ηΜ)。以 50 μ 1 每分鐘的速度注入 IOOmM HCl 兩次，每次 12 秒，進(jìn)行再生(Regenerations)。用Scrubber2處理數(shù)據(jù)，并在對照流動細(xì)胞注射和空白注 射兩次參考后，根據(jù)1 1 Langmuir作用模型修正。XPA. 10. 064和XPA. 10. 072的scFv-Fcs 表現(xiàn)對hVEGF165幾乎一致的高結(jié)合親和力。用相似的方法檢測了 XPA. 10. 064和XPA. 10. 072 IgG2的結(jié)合動力學(xué)。XPA. 10. 064 和XPA. 10.072 IgG2s均可特異性結(jié)合hVEGF165，兩者親和力相近，均為低的個位數(shù)納摩爾級 別(圖2-4)，同時表現(xiàn)出微弱的HiVEGF165結(jié)合力。兩種抗體都表現(xiàn)出了與貝伐單抗類似的 ka 值(表 2)。實施例 5. XPA. 10. 064 and XPA. 10. 072 IgGs 對 hVEGF，和 VEGF 警體結(jié)合的 阻斷作用使用Biacore 2000 和 CM5 芯片檢測 XPA. 10. 064 和 XPA. 10. 072 IgG2 阻斷 hVEGF165 與VEGF-Rl和/或VEGF-R2結(jié)合的能力。通過氨基偶聯(lián)(Biacore)將VEGF受體(R&D Systems)以約15，000的密度固定在 CM5芯片上。VEGF-R2固定在fc2而VEGF-Rl固定在fc4。流動細(xì)胞1和3作為參照，使用 與受體固定的流動細(xì)胞相同的方法激活和阻斷。以1 1的比例將抗體樣本或緩沖溶液 與0. 15 μ g/ml溶于HBS-EP沖洗緩沖溶液的hVEGF165溶液混合。抗體的最終濃度為15，5， 1. 667,0. 556,0. 185,0. 0617,0. 0206 和 0 μ g/ml。在Biacore 分析開始前培養(yǎng)樣品至少一小 時。所有樣品都重復(fù)注射，每組抗體重復(fù)都有其各自的陽性和陰性對照(分別為沒有VEGF 抗體和沒有VEGF)。樣品以IOul/分的速度向所有流動細(xì)胞注射1.5分鐘。以50ul/分的 速度注射GlyCene，pH 1.75用于再生。為了分析數(shù)據(jù)，結(jié)合相的線性部分(30秒到1分鐘)的斜率采用線性擬合確定。用 每一點的信號減去最接近空白的值，然后除以對應(yīng)100%的對照信號(無抗體)從而確定該 周期中的抑制百分比。數(shù)據(jù)由GraphPad Prism繪制成圖，并用sigmoidal量效曲線擬合計 算 EC50。 XPA. 10. 064 和 XPA. 10. 072 IgG2 都能阻斷 hVEGF165 和 VEGF-Rl 與 VEGF-R2 結(jié)合， 其阻斷水平與貝伐單抗相近(圖5-6，表3)。表3
貝伐單抗XPA. 10. 064XPA. 10. 07權(quán)利要求
1.一種被分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，含有，(1)一重鏈可變區(qū)，含有以下重鏈⑶R氨基酸序列SEQ ID NO 6, SEQ ID NO -J, SEQ IDNO :8，和 / 或(2)一輕鏈可變區(qū)，含有以下輕鏈CDR氨基酸序列(a) SEQ ID N0:9，SEQ ID N0:10，和 SEQID NO 11，或(b) SEQ ID NO: 12，SEQ ID NO: 13 禾口 SEQ ID NO: 14。
2.如權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述重鏈可變區(qū)含有如SEQID NO: 2所示的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述重鏈可變區(qū)含有如SEQID NO :4所示的氨基酸序列。
4.如權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述輕鏈可變區(qū)含有如SEQID N0:3所示的氨基酸序列。
5.如權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述輕鏈可變區(qū)含有如SEQID N0:5所示的氨基酸序列。
6.如權(quán)利要求1-5任一所示的抗體或其抗原結(jié)合片段，其進(jìn)一步含有一IgG 2恒定區(qū)。
7.如權(quán)利要求1-5任一所示的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體與hVEGF165結(jié)合 的Kd值為彡2. OnM0
8.如權(quán)利要求1-5任一所示的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體與hVEGF165結(jié)合 的抗原表位與貝伐單抗結(jié)合的抗原表位重疊。
9.如權(quán)利要求1-5任一所示的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體可阻斷hVEGF165 與VEGF-Rl和VEGF-R2的結(jié)合。
10.一種在所需對象中抑制血管生成的方法，包括對所述對象給藥治療有效劑量的如 權(quán)利要求1-5任一所述的抗體或其抗原結(jié)合片段。
11.一種在所需對象中治療與血管生成異常相關(guān)的疾病的方法，包括對所述對象給藥 治療有效劑量的如權(quán)利要求1-5任一所述的抗體或其抗原結(jié)合片段。
12.—種在所需對象中治療與VEGF信號傳導(dǎo)相關(guān)的炎癥疾病的方法，包括對所述對象 給藥治療有效劑量的如權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合片段。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述疾病選自下組類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、硬 皮病、慢性阻塞性肺部疾病、以及哮喘。
14.一種在所需對象中治療濕性急性視網(wǎng)膜黃斑變性或糖尿病視網(wǎng)膜病變的的方法， 包括對所述對象給藥治療有效劑量的如權(quán)利要求1-5任一所述的抗體或其抗原結(jié)合片段。
15.一種在所需對象中治療與VEGF信號傳導(dǎo)增高相關(guān)的癌癥的方法，包括對所述對象 給藥治療有效劑量的如權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合片段。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段進(jìn)一步含有一綴合物。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述綴合物選自下組毒素、細(xì)胞因子，以及化療 藥物。
18.一種成套物件，含有如權(quán)利要求1-5任一所述的抗體或其抗原結(jié)合片段。
19.一種被分離的多核苷酸，其編碼如SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :4，SEQIDNO :5,SEQ ID N0:6，SEQ ID N0:7，SEQ ID N0:8，SEQ ID N0:9，SEQ ID NO 10, SEQ IDNO 11，SEQ ID NO: 12，SEQ ID NO: 13，或 SEQ ID NO : 14 任一所示的氨基酸序列。
20.一種被分離的載體，含有如權(quán)利要求19所述的多核苷酸。
21.一種被分離的宿主細(xì)胞，含有如權(quán)利要求20所述的載體。
22.一種完全人源抗體，其中所述抗體含有一種或多種選自下組的特征(1)與hVEGF165結(jié)合的Kd值至少10倍低于該抗體與mVEGF165結(jié)合的Kd值；(2)與hVEGF165 結(jié)合的 Kd 值彡 2. OnM ；(3)與hVEGF165結(jié)合的抗原表位與貝伐單抗結(jié)合的抗原表位重疊；(4)阻斷hVEGF165與VEGF受體的結(jié)合；或(5)抑制hVEGF165誘導(dǎo)的VEGF受體的磷酸化。
23.如權(quán)利要求22所述的完全人源抗體，其中所述抗體與hVEGF165結(jié)合的Kd值 ≤ 2. OnM。
24.如權(quán)利要求22所述的完全人源抗體，其中所述抗體與hVEGF165結(jié)合的抗原表位與 貝伐單抗結(jié)合的抗原表位重疊。
25.如權(quán)利要求22所述的完全人源抗體，其中所述抗體阻斷hVEGF165與VEGF受體的結(jié)合。
26.如權(quán)利要求25所述的完全人源抗體，其中所述VEGF受體為VEGF-Rl或VEGF-R2。
27.如權(quán)利要求22所述的完全人源抗體，其中所述抗體可抑制hVEGF165誘導(dǎo)的VEGF受 體的磷酸化。
28.如權(quán)利要求22所述的完全人源抗體，其中所述抗體含有一重鏈可變區(qū)，該重鏈可 變區(qū)含有以下重鏈CDR氨基酸序列:SEQ ID NO :6，SEQ ID NO :7，和SEQ ID NO :8。
29.如權(quán)利要求28所述的完全人源抗體，其進(jìn)一步含有一輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū) 含有以下輕鏈 CDR 氨基酸序列=SEQ ID NO :9，SEQ ID NO :10，禾口 SEQ ID NO :11。
30.如權(quán)利要求29所述的完全人源抗體，其中所述重鏈可變區(qū)含有如SEQID N0:2所 示的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)含有如SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列。
31.如權(quán)利要求28所述的完全人源抗體，其進(jìn)一步含有一輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū) 含有以下輕鏈 CDR 氨基酸序歹Ij =SEQ ID NO :12，SEQ ID NO 13 和 SEQ ID NO :14。
32.如權(quán)利要求31所述的完全人源抗體，其中所述重鏈可變區(qū)含有如SEQID NO 4所 示的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)含有如SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列。
33.如權(quán)利要求1-5任一所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其為完全抗體。
34.如權(quán)利要求33所述的抗體，其為單克隆抗體。
35.如權(quán)利要求33所述的抗體，其為多克隆抗體。
36.如權(quán)利要求33所述的抗體，其為重組抗體。
37.如權(quán)利要求33所述的抗體，其為雙特異性抗體。
38.如權(quán)利要求33所述的抗體，其為人源化抗體。
39.如權(quán)利要求33所述的抗體，其為契合抗體。
40.如權(quán)利要求33所述的抗體，其為完全人源抗體。
41.一種被分離的人源抗體，其含有一輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)含有如SEQ ID NO 3 所示的氨基酸序列，和一重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)含有如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。
42.一種被分離的人源抗體，其含有一輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)含有如SEQ ID NO 5 所示的氨基酸序列，和一重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)含有如SEQ ID NO :4所示的氨基酸序 列。
43.一種藥物組合物，其含有如權(quán)利要求41所述的抗體和一藥用可接受的運載物。
44.一種藥物組合物，其含有如權(quán)利要求42所述的抗體和一藥用可接受的運載物。
45.一種藥物組合物，其含有如權(quán)利要求1-5任一所述的抗體或抗原結(jié)合片段，以及一 藥用可接受的運載物。
46.一種被分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其含有XPA. 10. 064或XPA. 10. 072的重鏈互 補(bǔ)決定域中的至少一條，以及XPA. 10. 064或XPA. 10. 072的輕鏈互補(bǔ)決定域中的至少一條。
47.如權(quán)利要求46所述的被分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述重鏈互補(bǔ)決定域 選自下組:XPA. 10. 064 或 XPA. 10. 072 的 HCDRl、HCDR2、HCDR3、以及其組合。
48.如權(quán)利要求46所述的被分離的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述輕鏈互補(bǔ)決定域選 自下組:XPA. 10. 064 或 XPA. 10. 072 的 LCDRl、LCDR2、LCDR3、以及其組合。
全文摘要
血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的過量表達(dá)與多種狀態(tài)相關(guān)聯(lián)，這些狀態(tài)涉及血管生長異常。本發(fā)明公開了可特異性結(jié)合人VEGF的完全人源抗體，其可抑制VEGF與VEGF-R1和VEGF-R2的結(jié)合，從而抑制VEGF的信號傳導(dǎo)。由于它們具有抑制VEGF信號傳導(dǎo)的活性，本發(fā)明中公開的抗體可用于在體內(nèi)和體外治療血管生成以及多種與血管生成相關(guān)的狀態(tài)。
文檔編號A61K39/395GK102006885SQ200780047541
公開日2011年4月6日 申請日期2007年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月20日
發(fā)明者琳達(dá)·瑪薩特, 瓦爾特·羅伯特·比索普, 舒曼·羅摩占羅, 黃超白 申請人:佐馬技術(shù)有限公司, 先靈公司