檢測(cè)人gfap蛋白的熒光免疫層析試紙及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及檢測(cè)人GFAP蛋白的熒光免疫層析試紙及其制備方法。所述試紙通過(guò)雙抗體夾心法檢測(cè)人GFAP蛋白，所述雙抗體夾心法采用標(biāo)記有熒光微球的第一GFAP單克隆抗體作為捕獲抗體，所述第一GFAP單克隆抗體來(lái)源于序列表SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所述的序列中的一者；并且所述雙抗體夾心法采用第二GFAP單克隆抗體作為檢測(cè)抗體，所述第二GFAP單克隆抗體來(lái)源于序列表SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所述的序列中的另一者。本發(fā)明的熒光免疫層析試紙操作簡(jiǎn)便、快速、檢測(cè)范圍寬、特異性高、靈敏度好。
【專利說(shuō)明】檢測(cè)人GFAP蛋白的熒光免疫層析試紙及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于多肽化學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及人膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP)抗原表 位肽、用該抗原表位肽制備的GFAP特異性抗原和相應(yīng)的單克隆抗體或多克隆抗體、所述抗 體在制備人GFAP體外診斷試劑盒上的用途，人GFAP體外診斷試劑盒，以及一種用于定量檢 測(cè)待測(cè)物中人GFAP蛋白的熒光免疫層析試紙及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，對(duì)神經(jīng)生化標(biāo)志物的研究已引起許多研究者的注意，尋找一種可靠的、 非侵入性的、能反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害范圍及預(yù)后的生化標(biāo)志物是眾多研究者的共同心 愿。通過(guò)對(duì)血液和腦脊液（CSF)的研究，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些生化標(biāo)志物可以用來(lái)判斷神經(jīng) 系統(tǒng)的損害范圍以及對(duì)預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè)，這在疾病的早期要優(yōu)于CT以及MRI等影像學(xué)檢查。 其中，膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP)就是這樣一種生化標(biāo)志物。
[0003] 膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP)是一種分子量為50_52KDa的酸性蛋白，其屬于細(xì)胞骨 骼蛋白，是星形細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，在星形細(xì)胞中有豐富的、唯一的表達(dá)。膠質(zhì)纖維酸性蛋白 是成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞特有的中間絲成分，其對(duì)神經(jīng)生理功能和各種病理的發(fā)展過(guò)程具有重 要的作用。
[0004] 在正常情況下，GFAP受星形膠質(zhì)細(xì)胞的動(dòng)力調(diào)節(jié)。損傷后增生的GFAP陽(yáng)性星形膠 質(zhì)細(xì)胞能促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的有絲分裂，并使原始祖細(xì)胞分化成為成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞。 各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷均可引起星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)。星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)的標(biāo)志為細(xì)胞數(shù)增 力口，細(xì)胞體肥大，星形膠質(zhì)細(xì)胞分支增多，并且GFAP的表達(dá)增強(qiáng)。因此，GFAP可以作為中樞 神經(jīng)系統(tǒng)損傷范圍及預(yù)后的生化標(biāo)志物。此外，GFAP在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)也會(huì)出現(xiàn)異常， 因此其也可以作為反映神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性程度的特異性標(biāo)志物。
[0005] 研究發(fā)現(xiàn)，GFAP與神經(jīng)系統(tǒng)病理過(guò)程(如腦外傷、腦梗死、腦卒中、神經(jīng)退行性病） 有明顯的相關(guān)性。當(dāng)患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生損傷時(shí)，GFAP從受損傷的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中溢 出，進(jìn)入細(xì)胞間液，可溶性的GFAP由細(xì)胞間液進(jìn)入腦脊液，穿過(guò)破壞的血腦屏障進(jìn)入血液 循環(huán)。因此，可以由患者血清中的GFAP水平來(lái)判斷神經(jīng)系統(tǒng)損傷的病情及預(yù)后。
[0006] 檢測(cè)血清中的GFAP水平的最理想的方法為免疫檢測(cè)。因此，尋找合適的具有免疫 原性的GFAP抗原表位肽、制備特異性的GFAP抗原及抗體即成為了重點(diǎn)。
[0007] 熒光免疫層析方法測(cè)血液中的待測(cè)物操作簡(jiǎn)便、快速，只需10分鐘就能完成樣品 檢測(cè)，并且檢測(cè)范圍寬，靈敏度好，能夠迅速及時(shí)地幫助診斷病情，監(jiān)測(cè)預(yù)后。中國(guó)專利申 請(qǐng)No. 200910117820. 8公開(kāi)了一種熒光微球免疫層析試紙條的制備方法及定量檢測(cè)方法； 中國(guó)專利申請(qǐng)No. 200910047352. 1公開(kāi)了一種熒光免疫層析試紙及其制備方法和應(yīng)用。然 而，目前還沒(méi)有針對(duì)人GFAP蛋白的熒光免疫層析試紙。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種用于定量檢測(cè)待測(cè)物中 人GFAP蛋白的熒光免疫層析試紙及其制備方法。
[0009] 具體而言，本發(fā)明提供了：
[0010] 一種用于定量檢測(cè)待測(cè)物中人GFAP蛋白的熒光免疫層析試紙，該試紙通過(guò)雙抗 體夾心法檢測(cè)所述人GFAP蛋白，其中 ：
[0011] 所述雙抗體夾心法采用標(biāo)記有熒光微球的第一 GFAP單克隆抗體作為捕獲抗體， 所述第一 GFAP單克隆抗體來(lái)源于人GFAP抗原表位肽（1)和（2)中的一者；并且
[0012] 所述雙抗體夾心法采用第二GFAP單克隆抗體作為檢測(cè)抗體，所述第二GFAP單克 隆抗體來(lái)源于人GFAP抗原表位肽（1)和（2)中的另一者；
[0013] 所述人GFAP抗原表位肽⑴和⑵分別為：
[0014] (1)Thr-Val-Arg-Gln-Lys-Leu-Gln-Asp-Glu-Thr-Asn-Leu-Arg-Leu-Glu-Ala-Gl u-Asn-Asn-Leu-Ala-Ala-Tyr ；
[0015] (2)Tyr-Gln-Glu-Ala-Leu-Ala-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Gly-Gln-Ser-Leu-Lys-As P〇
[0016] 優(yōu)選地，所述第一 GFAP單克隆抗體是由第一 GFAP抗原制備而成的，該第一 GFAP 抗原是通過(guò)使所述人GFAP抗原表位肽（1)和（2)中的一者與載體蛋白偶聯(lián)制備而成的；并 且
[0017] 所述第二GFAP單克隆抗體是由第二GFAP抗原制備而成的，該第二GFAP抗原是通 過(guò)使所述人GFAP抗原表位肽（1)和（2)中的另一者與載體蛋白偶聯(lián)制備而成的。
[0018] 優(yōu)選地，所述突光微球的粒徑為320nm至400nm。
[0019] 優(yōu)選地，所述熒光微球上的熒光物質(zhì)為異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明、四甲基異 硫氰酸羅丹明或X-羅丹明等，其中優(yōu)選為X-羅丹明；所述熒光微球的微球材料為聚苯乙 烯、聚甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸甲酯的共聚物。
[0020] 優(yōu)選地，所述突光微球的激發(fā)波長(zhǎng)為350?600nm，優(yōu)選為390nm ;發(fā)射波長(zhǎng)為 500 ?700nm，優(yōu)選為 615nm。
[0021] 優(yōu)選地，所述熒光免疫層析試紙具有底板，并且在該底板上沿使用時(shí)的層析方向 依次以接觸方式設(shè)置有：樣品墊、結(jié)合墊、反應(yīng)膜、吸水濾紙，所述結(jié)合墊設(shè)置有所述的標(biāo)記 有熒光微球的第一 GFAP單克隆抗體，所述反應(yīng)膜包括檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，所述檢測(cè)區(qū)包被有 所述第二GFAP單克隆抗體，所述質(zhì)控區(qū)包被有能與所述的標(biāo)記有熒光微球的第一 GFAP單 克隆抗體特異性結(jié)合的抗抗體。
[0022] 優(yōu)選地，所述反應(yīng)膜為在大于550nm的波長(zhǎng)下基本上不發(fā)熒光的硝酸纖維素膜。
[0023] 優(yōu)選地，所述底板基本上不具有熒光性質(zhì)。
[0024] 優(yōu)選地，所述抗抗體為羊抗鼠 IgG單克隆抗體或兔抗鼠 IgG單克隆抗體，其中優(yōu)選 為羊抗鼠 IgG單克隆抗體。
[0025] 本發(fā)明還提供了一種制備所述的用于定量檢測(cè)待測(cè)物中人GFAP蛋白的熒光免疫 層析試紙的方法，其包括以下步驟：
[0026] 1)提供標(biāo)記有突光微球的第一 GFAP單克隆抗體；
[0027] 2)提供結(jié)合墊，其中在所述結(jié)合墊上包被所述的標(biāo)記有熒光微球的第一 GFAP單 克隆抗體；
[0028] 3)提供反應(yīng)膜，其中在所述反應(yīng)膜上沿使用時(shí)的層析方向間隔固定第二GFAP單 克隆抗體和抗抗體，以分別形成檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)；和
[0029] 4)在底板上沿使用時(shí)的層析方向依次以接觸方式設(shè)置樣品墊、所述結(jié)合墊、所述 反應(yīng)膜、吸水濾紙，從而制成所述熒光免疫層析試紙。
[0030] 優(yōu)選地，所述步驟1)包括：
[0031] a)用碳二亞胺活化熒光微球，優(yōu)選地，將熒光微球的水分散液或MES緩沖液分散 液經(jīng)超聲波處理并與碳二亞胺混合，從而活化所述熒光微球；
[0032] b)洗滌步驟a)所獲得的活化的熒光微球，優(yōu)選地，將步驟a)所獲得的活化的熒光 微球用N-羥基硫代琥珀酰亞胺-檸檬酸緩沖液洗滌、分散，并經(jīng)超聲波處理；
[0033] c)用步驟b)所獲得的熒光微球標(biāo)記第一 GFAP單克隆抗體，優(yōu)選地，將步驟b)所 獲得的熒光微球與第一 GFAP單克隆抗體混合，用BSA-乙醇胺緩沖液封閉，離心，用BSA-吐 溫水溶液分散，經(jīng)超聲波處理，從而得到標(biāo)記有熒光微球的第一 GFAP單克隆抗體。
[0034] 優(yōu)選地，在所述步驟2)中，所述的標(biāo)記有熒光微球的第一 GFAP單克隆抗體的包被 濃度為〇. 5?2mg/ml。
[0035] 優(yōu)選地，在所述步驟3)中，所述檢測(cè)區(qū)和所述質(zhì)控區(qū)間隔3mm至8mm，所述第二 GFAP單克隆抗體和所述抗抗體的包被濃度分別為0. 5?2mg/ml。
[0036] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和積極效果：
[0037] 1.本發(fā)明的人GFAP抗原表位肽具有良好的抗原性，用其制備的抗原(免疫原）免 疫動(dòng)物能夠產(chǎn)生高度特異性的單克隆抗體和多克隆抗體。
[0038] 2.用本發(fā)明制備的GFAP單克隆抗體和多克隆抗體能夠高度特異地與血液樣本中 的GFAP結(jié)合。
[0039] 3.本發(fā)明的人GFAP體外診斷試劑盒可以有效地檢測(cè)血清中的膠質(zhì)纖維酸性蛋白 GFAP的水平，可用來(lái)判斷神經(jīng)系統(tǒng)的損害范圍和對(duì)預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè)。
[0040] 4.本發(fā)明將熒光分析技術(shù)與快速層析免疫技術(shù)相結(jié)合，提供了一種用于定量檢測(cè) 待測(cè)物中人GFAP蛋白的熒光免疫層析試紙，用該試紙檢測(cè)待測(cè)物中的人GFAP蛋白，操作簡(jiǎn) 便、快速，只需10分鐘就能完成樣品檢測(cè)，并且檢測(cè)范圍寬、特異性高、靈敏度好，能夠迅速 及時(shí)地幫助診斷病情，監(jiān)測(cè)預(yù)后。
[0041] 5.本發(fā)明在制備所述人GFAP蛋白的熒光免疫層析試紙的過(guò)程中，通過(guò)大量的試 驗(yàn)摸索，優(yōu)化了各方面的制備條件，使得用本發(fā)明的熒光免疫層析試紙進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，熒光信 背比大大提高，從而提高了檢測(cè)靈敏度和結(jié)果可信度；此外，本發(fā)明還通過(guò)試紙的檢測(cè)區(qū)與 質(zhì)控區(qū)的熒光強(qiáng)度比值的變化來(lái)反應(yīng)樣品中GFAP的含量，這與傳統(tǒng)的層析技術(shù)只考查檢 測(cè)區(qū)的絕對(duì)熒光強(qiáng)度相比，最大程度上減少了外界條件和背景等的影響，進(jìn)一步提高了檢 測(cè)結(jié)果可信度。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0042] 圖1示意性示出本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的熒光免疫層析試紙的結(jié)構(gòu)示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0043] 以下通過(guò)【具體實(shí)施方式】的描述并參照附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但這并非是對(duì) 本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只 要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0044] 一、人GFAP抗原表位肽
[0045] 本文中所述的人GFAP蛋白是本領(lǐng)域已知的，其氨基酸序列是本領(lǐng)域已知的，可以 在NCBI等專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)中查到。
[0046] 本發(fā)明提供了一種人GFAP抗原表位肽（1)和（2)，其氨基酸序列分別如序列表SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 所示，為：
[0047] (1)T-V-R-Q-K-L-Q-D-E-T-N-L-R-L-E-A-E-N-N-L-A-A-Y ;和
[0048] (2)Y-Q-E-A-L-A-R-L-E-E-E-G-Q-S-L-K-D。
[0049] 本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量的理論研究和實(shí)驗(yàn)摸索，最終篩選得到兩種具有良好的 抗原性的抗原表位肽。
[0050] GFAP抗原表位肽⑴是人GFAP蛋白N端第150至172位的一段含23個(gè)氨基酸的 肽段。
[0051] GFAP抗原表位肽（2)是人GFAP蛋白C端第324至340位的一段含17個(gè)氨基酸的 肽段。
[0052] 這兩個(gè)肽段均具有親水性、抗原性強(qiáng)并且易于合成的特點(diǎn)。
[0053] 目前，本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的GFAP抗原表位肽具有如下功能：
[0054] 1.具有抗原性；2.與載體蛋白連接后作為免疫原刺激動(dòng)物產(chǎn)生特異性的抗體； 3.用抗原表位肽制備的抗體可特異性地與人GFAP結(jié)合。
[0055] 本發(fā)明的GFAP抗原表位肽的制備方法可用化學(xué)合成法：利用美國(guó)ABI431A型多肽 自動(dòng)合成儀，通過(guò)固相法合成抗原表位肽。本發(fā)明的抗原表位肽（1)和（2)的分子量分別 為2690. 27、1979. 35,可用質(zhì)譜進(jìn)行確定，并通過(guò)多肽序列測(cè)定鑒定所合成的抗原表位肽序 列。肽段的純度用薄層色譜和高效液相色譜進(jìn)行評(píng)定，并測(cè)定抗原表位肽的濃度。
[0056] 二、GFAP 抗原
[0057] 本發(fā)明還提供了一種GFAP抗原，其通過(guò)使本發(fā)明的人GFAP抗原表位肽（1)和 (2)中的一者與載體蛋白偶聯(lián)制備而成。具體而言，本發(fā)明提供了 GFAP抗原（1)和（2)，所 述GFAP抗原（1)通過(guò)使本發(fā)明的人GFAP抗原表位肽（1)與載體蛋白偶聯(lián)制備而成；所述 GFAP抗原（2)通過(guò)使本發(fā)明的人GFAP抗原表位肽（2)與載體蛋白偶聯(lián)制備而成。本發(fā)明的 GFAP抗原具有免疫原性和特異性，是一種免疫原，可用來(lái)免疫動(dòng)物從而制備特異性的GFAP 抗體。在本發(fā)明中，可用的載體蛋白的例子包括KLH(鑰孔血藍(lán)蛋白）、牛血清白蛋白（BSA)、 卵清蛋白0VA等。由于KLH (鑰孔血藍(lán)蛋白）免疫原性強(qiáng)，結(jié)合位點(diǎn)多，免疫效果較好，并且 與免疫動(dòng)物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，用其作為載體蛋白不易引起交叉反應(yīng)，因此是優(yōu)選的。
[0058] 三、GFAP單克隆抗體、GFAP多克隆抗體和人GFAP體外診斷試劑盒
[0059] 本發(fā)明還提供了人GFAP單克隆抗體和人GFAP多克隆抗體，所述抗體可以分別利 用本發(fā)明的GFAP抗原（1)和（2)(免疫原）免疫動(dòng)物制備而得。制備方法可采用本領(lǐng)域的 常規(guī)技術(shù)，具體可參見(jiàn)實(shí)施例2。
[0060] 本發(fā)明的GFAP單克隆抗體和多克隆抗體可以用于制備人GFAP體外診斷試劑盒， 該試劑盒可以基于免疫方法對(duì)人體組織、細(xì)胞或體液中的GFAP進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)選對(duì)血液標(biāo)本 中的GFAP進(jìn)行檢測(cè)。
[0061] 因此，本發(fā)明提供了一種人GFAP體外診斷試劑盒，其包含本發(fā)明的人GFAP單克隆 抗體或多克隆抗體。
[0062] 目前已知可用于臨床檢驗(yàn)的免疫實(shí)驗(yàn)方法主要包括以下幾種：ELISA法、化學(xué)發(fā) 光法、熒光層析法、膠體金免疫測(cè)定法等。
[0063] 而ELISA法包括以下幾種類型：雙抗體夾心法檢測(cè)抗原、雙抗原夾心法檢測(cè)抗體、 間接法測(cè)抗體、競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體、競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原、捕獲包被法測(cè)抗體等。
[0064] 本發(fā)明的人GFAP體外診斷試劑盒優(yōu)選采用ELISA雙抗體夾心法來(lái)檢測(cè)GFAP蛋 白。該試劑盒可以包含包被抗體、結(jié)合抗體、酶標(biāo)記的第二抗體和/或必要的工具和試劑 等。
[0065] 優(yōu)選的是，所述人GFAP體外診斷試劑盒采用本發(fā)明的人GFAP單克隆抗體作為包 被抗體。在此，術(shù)語(yǔ)"包被抗體"是指包被于固相的酶標(biāo)板上的抗體。此外，所述人GFAP體 外診斷試劑盒還優(yōu)選包含人GFAP多克隆抗體以作為結(jié)合抗體，其中，當(dāng)所述結(jié)合抗體來(lái)源 于本發(fā)明的人GFAP抗原表位肽（1)和（2)中的一者時(shí)，所述包被抗體來(lái)源于所述抗原表位 肽⑴和⑵中的另一者。在此，術(shù)語(yǔ)"結(jié)合抗體"是指試劑盒中可與待測(cè)抗原及酶標(biāo)記第 二抗體結(jié)合的特異性抗體。所述試劑盒還可以包含酶標(biāo)記的第二抗體，該第二抗體可以為 羊抗兔IgG抗體，所述酶標(biāo)記可以為辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶等。
[0066] 在本發(fā)明的試劑盒中，還可以包含檢測(cè)所需的任何試劑或工具，例如預(yù)包被板、洗 滌液、顯色劑、終止液等。
[0067] 四、用于定量檢測(cè)人GFAP蛋白的熒光免疫層析試紙
[0068] 本發(fā)明還提供了一種用于定量檢測(cè)待測(cè)物中人GFAP蛋白的熒光免疫層析試紙， 該試紙通過(guò)雙抗體夾心法檢測(cè)所述人GFAP蛋白，其中：
[0069] 所述雙抗體夾心法采用標(biāo)記有熒光微球的第一 GFAP單克隆抗體作為捕獲抗體， 所述第一 GFAP單克隆抗體來(lái)源于人GFAP抗原表位肽（1)和（2)中的一者；并且
[0070] 所述雙抗體夾心法還采用第二GFAP單克隆抗體作為檢測(cè)抗體，所述第二GFAP單 克隆抗體來(lái)源于人GFAP抗原表位肽（1)和（2)中的另一者；
[0071] 所述人GFAP抗原表位肽⑴和⑵分別為：
[0072] (1)Thr-Val-Arg-Gln-Lys-Leu-Gln-Asp-Glu-Thr-Asn-Leu-Arg-Leu-Glu-Ala-Gl u-Asn-Asn-Leu-Ala-Ala-Tyr ；
[0073] (2)Tyr-Gln-Glu-Ala-Leu-Ala-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Gly-Gln-Ser-Leu-Lys-As P〇
[0074] 在本發(fā)明中，在雙抗體夾心法熒光免疫層析試紙中，"捕獲抗體"是指能夠首先特 異性識(shí)別待測(cè)抗原的抗體，其通常設(shè)置在結(jié)合墊上；"檢測(cè)抗體"是指另一種能夠特異性識(shí) 別待測(cè)抗原的抗體，其與捕獲抗體分別識(shí)別待測(cè)抗原分子上的不同的抗原表位，其通常固 定在反應(yīng)膜的檢測(cè)區(qū)上。
[0075] 在本發(fā)明中，所述第一 GFAP單克隆抗體可以由第一 GFAP抗原制備而成，該第一 GFAP抗原可以通過(guò)使所述人GFAP抗原表位肽（1)和（2)中的一者與載體蛋白偶聯(lián)制備而 成；并且所述第二GFAP單克隆抗體可以由第二GFAP抗原制備而成，該第二GFAP抗原可以 通過(guò)使所述人GFAP抗原表位肽（1)和（2)中的另一者與載體蛋白偶聯(lián)制備而成。
[0076] 在本發(fā)明中，可用的載體蛋白的例子包括KLH (鑰孔血藍(lán)蛋白）、牛血清白蛋白 (BSA)、卵清蛋白0VA等。由于KLH (鑰孔血藍(lán)蛋白）免疫原性強(qiáng)，結(jié)合位點(diǎn)多，免疫效果較 好，并且與免疫動(dòng)物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，用其作為載體蛋白不易引起交叉反應(yīng)，因此是優(yōu)選的。
[0077] 優(yōu)選地，本發(fā)明的熒光免疫層析試紙中所用的熒光微球的粒徑為320nm至400nm， 優(yōu)選為360nm，熒光微球上的熒光物質(zhì)可為異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明、四甲基異硫氰 酸羅丹明或X-羅丹明等，其中優(yōu)選為X-羅丹明（可購(gòu)自上海晶純公司）。熒光微球的微球 材料可以為由聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸甲酯與其它單體共聚形成的共聚 物，其它單體的例子為苯乙烯等。突光微球的激發(fā)波長(zhǎng)可以為350?600nm，優(yōu)選為390nm ; 發(fā)射波長(zhǎng)可以為500?700nm，優(yōu)選為615nm。
[0078] 在本發(fā)明中，熒光微球的最大激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)差值較大，說(shuō)明熒光微球有較 大的斯托克斯（Stokes)位移，這樣，熒光試紙的背景干擾較低，以該微球做免疫層析標(biāo)記物 有較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。
[0079] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的熒光免疫層析試紙具有底板，并且在該底板 上沿使用時(shí)的層析方向依次以接觸方式設(shè)置有：樣品墊、結(jié)合墊、反應(yīng)膜、吸水濾紙，所述樣 品墊用于在使用時(shí)加載待測(cè)樣品，所述結(jié)合墊設(shè)置有所述的標(biāo)記有熒光微球的第一 GFAP 單克隆抗體，所述反應(yīng)膜包括檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，所述檢測(cè)區(qū)包被有所述第二GFAP單克隆抗 體，所述質(zhì)控區(qū)包被有能與所述的標(biāo)記有熒光微球的第一 GFAP單克隆抗體特異性結(jié)合的 抗抗體。
[0080] 優(yōu)選地，本發(fā)明的熒光免疫層析試紙的樣品墊、結(jié)合墊、反應(yīng)膜、吸水濾紙可以沿 使用時(shí)的層析方向依次搭接設(shè)置在底板上(參見(jiàn)圖1)。反應(yīng)膜上間隔設(shè)置的檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控 區(qū)可以為，但不限于，線、帶、塊等形式，檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)優(yōu)選間隔3mm至8mm。
[0081] 在本發(fā)明中，反應(yīng)膜優(yōu)選為在大于550nm的波長(zhǎng)下基本上不發(fā)熒光的硝酸纖維素 膜。此外，底板優(yōu)選基本上不具有熒光性質(zhì)。
[0082] 通常，常規(guī)的層析試紙組件(反應(yīng)膜、底板等)在550nm波長(zhǎng)下具有較明顯的熒光背 景，這對(duì)熒光信號(hào)的檢測(cè)產(chǎn)生很大干擾。本發(fā)明通過(guò)采用在大于550nm的波長(zhǎng)下基本上不 發(fā)熒光的硝酸纖維素膜和低熒光性質(zhì)的底板，從而克服了常規(guī)熒光試紙的缺陷。此外，本發(fā) 明所用的熒光物質(zhì)X-羅丹明可產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光信號(hào)，從而進(jìn)一步大大提高了熒光信背比， 使得能夠很好地區(qū)分信號(hào)和背景，進(jìn)而提高檢測(cè)靈敏度。
[0083] 在本發(fā)明中，樣品墊和結(jié)合墊的材料可采用本領(lǐng)域通常使用的材料，例如，樣品墊 和結(jié)合墊可以為玻璃纖維。
[0084] 本發(fā)明所采用的能與標(biāo)記有熒光微球的第一 GFAP單克隆抗體特異性結(jié)合的抗抗 體可以為羊抗鼠 IgG單克隆抗體或兔抗鼠 IgG單克隆抗體，其中優(yōu)選為羊抗鼠 IgG單克隆 抗體，與多克隆抗體相比，單克隆抗體特異性更高。
[0085] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的熒光免疫層析試紙?jiān)谑褂脮r(shí)，在樣品墊上滴 加樣品液(如含有GFAP的血樣)，在毛細(xì)管作用下，樣品液向吸水濾紙一端移動(dòng)，在結(jié)合墊處 與所述的標(biāo)記有熒光微球的第一 GFAP單克隆抗體形成免疫復(fù)合物，該免疫復(fù)合物進(jìn)一步 移動(dòng)，在檢測(cè)線上與所述第二GFAP單克隆抗體結(jié)合形成雙抗體夾心的免疫復(fù)合物，而未形 成免疫復(fù)合物的標(biāo)記有熒光微球的第一 GFAP單克隆抗體則與質(zhì)控線上的抗抗體結(jié)合。此 過(guò)程需要10分鐘至15分鐘，之后，用熒光檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，如果質(zhì)控線處未出現(xiàn)條帶，則說(shuō) 明試紙失效；如果質(zhì)控線處出現(xiàn)條帶，而檢測(cè)線處未出現(xiàn)條帶，則說(shuō)明樣品中不含人GFAP 蛋白；如果在質(zhì)控線和檢測(cè)線上均出現(xiàn)條帶，則說(shuō)明樣品中含有人GFAP蛋白。
[0086] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種制備用于定量檢測(cè)待測(cè)物中人GFAP蛋白的熒 光免疫層析試紙的方法，其包括以下步驟：
[0087] 1)提供標(biāo)記有熒光微球的第一 GFAP單克隆抗體；
[0088] 2)提供結(jié)合墊，其中在所述結(jié)合墊上包被所述的標(biāo)記有熒光微球的第一 GFAP單 克隆抗體；
[0089] 3)提供反應(yīng)膜，其中在所述反應(yīng)膜上沿使用時(shí)的層析方向間隔固定第二GFAP單 克隆抗體和抗抗體，以分別形成檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)；和
[0090] 4)在底板上沿使用時(shí)的層析方向依次以接觸方式設(shè)置樣品墊、所述結(jié)合墊、所述 反應(yīng)膜、吸水濾紙，從而制成所述熒光免疫層析試紙。
[0091] 本發(fā)明的方法還可以包括將制成的熒光免疫層析試紙切割成適當(dāng)寬度的步驟5)。
[0092] 本發(fā)明的發(fā)明人通過(guò)大量的試驗(yàn)摸索，優(yōu)化了制備本發(fā)明的用于檢測(cè)人GFAP蛋 白的熒光免疫層析試紙的方法的各個(gè)步驟的條件，從而使得本發(fā)明的熒光免疫層析試紙能 夠針對(duì)人GFAP蛋白獲得符合臨床檢測(cè)要求的結(jié)果，S卩，檢測(cè)范圍寬、特異性高、靈敏度好。
[0093] 因此，優(yōu)選的是，在本發(fā)明的方法中，所述步驟1)包括：
[0094] a)用碳二亞胺活化熒光微球，優(yōu)選地，將熒光微球的水分散液或MES緩沖液分散 液經(jīng)超聲波處理并與碳二亞胺混合，從而活化所述熒光微球；
[0095] b)洗滌步驟a)所獲得的活化的熒光微球，優(yōu)選地，將步驟a)所獲得的活化的熒光 微球用N-羥基硫代琥珀酰亞胺-檸檬酸緩沖液洗滌、分散，并經(jīng)超聲波處理；
[0096] c)用步驟b)所獲得的熒光微球標(biāo)記第一 GFAP單克隆抗體，優(yōu)選地，將步驟b)所 獲得的熒光微球與第一 GFAP單克隆抗體混合，用BSA-乙醇胺緩沖液封閉，離心，用BSA-吐 溫水溶液分散，經(jīng)超聲波處理，從而得到標(biāo)記有熒光微球的第一 GFAP單克隆抗體。
[0097] 在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述步驟1)包括：
[0098] a)取1 (w/v)%的突光微球水分散液，lOOOOrpm至15000rpm低溫(例如10°C )離心 5至10分鐘，去上清，將沉淀物分散到500 μ 1的蒸餾水或初洗緩沖液（0. 1M的MES水溶液） 中，超聲波（240W)處理1至2分鐘，重復(fù)以上過(guò)程三次，加入碳二亞胺10mg至50mg，攪拌 10?15分鐘，從而活化所述突光微球；
[0099] b)洗滌步驟a)所獲得的活化的熒光微球，優(yōu)選地，將步驟a)所獲得的活化的熒光 微球在lOOOrpm至15000rpm下離心5至10分鐘，將沉淀物分散到lml偶聯(lián)緩沖液（20? 100mM的N-羥基硫代琥珀酰亞胺-檸檬酸緩沖液)）中，超聲波（240W)處理1至2分鐘，重 復(fù)以上過(guò)程二次；
[0100] C)用步驟b)所獲得的熒光微球標(biāo)記第一 GFAP單克隆抗體，優(yōu)選地，按照1 μ 1至 3 μ 1抗體（8mg/ml) /100 μ 1所述活化的熒光微球的比例，將步驟b)所獲得的熒光微球與 第一 GFAP單克隆抗體混合，室溫（25°C)下攪拌1. 5?3小時(shí)(優(yōu)選2小時(shí))，加入lml封閉 緩沖液（1 (w/v)%BSA-〇. 05M乙醇胺)，繼續(xù)攪拌1小時(shí)，在lOOOOrpm至15000rpm下離心5至 10分鐘，重復(fù)離心3次，將沉淀物分散到500 μ 1終洗緩沖液（0. 5 (w/v) %BSA-〇. 11 (v/v) %吐 溫水溶液）中，超聲波（240W)處理1至2分鐘，用所述終洗緩沖液定容至500 μ 1。
[0101] 優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，所述步驟2)包括：將標(biāo)記有熒光微球的第一 GFAP單 克隆抗體用抗體稀釋液（l%(w/v)BSA-〇. 01MPBS(pH7. 2)緩沖液)進(jìn)行稀釋，以稀釋至0. 5? 2mg/ml，優(yōu)選為lmg/ml，然后用微量移液器均勻噴涂在結(jié)合墊上，之后烘干或真空冷凍干 燥。在本發(fā)明的方法的步驟2)中，所述的標(biāo)記有熒光微球的第一 GFAP單克隆抗體的包被 濃度為〇. 5?2mg/ml，優(yōu)選為lmg/ml。
[0102] 優(yōu)選地，所述步驟3)包括：用噴金機(jī)將所述第二GFAP單克隆抗體和抗抗體劃到硝 酸纖維素膜（固相載體)上以作為檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，使檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)的間隔為3_至8_， 所述第二GFAP單克隆抗體和所述抗抗體的濃度分別為0. 5?2mg/ml，優(yōu)選為lmg/ml。
[0103] 優(yōu)選地，結(jié)果檢測(cè)利用專用的熒光檢測(cè)儀(可購(gòu)自深圳市安群生物工程有限公司， 型號(hào)AQ-3000)對(duì)質(zhì)控區(qū)和檢測(cè)區(qū)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)區(qū)與質(zhì)控區(qū)熒光強(qiáng)度的比值和待測(cè)樣品中 的GFAP的含量成正比。采用檢測(cè)區(qū)與質(zhì)控區(qū)熒光強(qiáng)度的比值而不是直接采用檢測(cè)區(qū)的絕 對(duì)熒光值可盡可能地減少反應(yīng)條件、基質(zhì)等的影響，并盡量避免背景干擾。
[0104] 以下通過(guò)例子的方式進(jìn)一步解釋或說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但這些例子不應(yīng)被理解為 對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍的限制。
[0105] 實(shí)施例
[0106] 除非另有說(shuō)明，以下所述溶液均為水溶液，溶液中的百分?jǐn)?shù)均為體積百分?jǐn)?shù)。
[0107] 實(shí)施例1 :GFAP抗原表位肽⑴和⑵的制備。
[0108] 制備方法用化學(xué)合成法：利用美國(guó)ABI431A型多肽自動(dòng)合成儀，通過(guò)固相法分別 合成GFAP抗原表位肽（1)和（2)?？乖砦浑牡募兌扔酶咝б合嗌V進(jìn)行評(píng)定，并測(cè)定肽 段的濃度。本發(fā)明的抗原表位肽（1)和（2)的分子量分別為2690. 27U979. 35,利用質(zhì)譜進(jìn) 行確定，通過(guò)多肽序列測(cè)定鑒定所合成的多肽序列。
[0109] 一、GFAP抗原表位肽（1)和（2)的合成
[0110] 上述肽段采用固相法合成。固相肽合成的主要思想是：先將所要合成肽鏈的羧基 末端氨基酸的羧基以共價(jià)鍵形式同一個(gè)不溶性的高分子化合物（樹(shù)脂）相連接，然后以此 結(jié)合在固相載體上的氨基酸作為氨基組份，經(jīng)過(guò)脫去氨基保護(hù)基并同過(guò)量的活化羧基組份 反應(yīng)，接長(zhǎng)肽鏈。這樣的步驟可以反復(fù)地多次進(jìn)行下去，最后達(dá)到所需要合成的肽鏈的長(zhǎng) 度。這個(gè)合成過(guò)程如下所示。
[0111]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于定量檢測(cè)待測(cè)物中人GFAP蛋白的熒光免疫層析試紙，該試紙通過(guò)雙抗體 夾心法檢測(cè)所述人GFAP蛋白，其中 ： 所述雙抗體夾心法采用標(biāo)記有熒光微球的第一 GFAP單克隆抗體作為捕獲抗體，所述 第一 GFAP單克隆抗體來(lái)源于人GFAP抗原表位肽（1)和（2)中的一者；并且 所述雙抗體夾心法采用第二GFAP單克隆抗體作為檢測(cè)抗體，所述第二GFAP單克隆抗 體來(lái)源于人GFAP抗原表位肽（1)和（2)中的另一者； 所述人GFAP抗原表位肽（1)和（2)分別為： (1) Thr-Val-Arg-Gln-Lys-Leu-Gln-Asp-Glu-Thr-Asn-Leu-Arg-Leu-Glu-Ala-Glu-As n-Asn-Leu-Ala-Ala-Tyr ； (2) Tyr-Gln-Glu-Ala-Leu-Ala-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Gly-Gln-Ser-Leu-Lys-Asp 〇
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光免疫層析試紙，其中所述第一GFAP單克隆抗體是由第一 GFAP抗原制備而成的，該第一 GFAP抗原是通過(guò)使所述人GFAP抗原表位肽（1)和（2)中的 一者與載體蛋白偶聯(lián)制備而成的；并且 所述第二GFAP單克隆抗體是由第二GFAP抗原制備而成的，該第二GFAP抗原是通過(guò)使 所述人GFAP抗原表位肽（1)和（2)中的另一者與載體蛋白偶聯(lián)制備而成的。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光免疫層析試紙，其中所述熒光微球的粒徑為320nm至 400nm。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光免疫層析試紙，其中所述熒光微球上的熒光物質(zhì)為異硫 氰酸熒光素、四乙基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明或X-羅丹明等，其中優(yōu)選為X-羅丹明； 所述熒光微球的微球材料為聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸甲酯的共聚物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光免疫層析試紙，其中所述熒光微球的激發(fā)波長(zhǎng)為350? 600nm，優(yōu)選為390nm ;發(fā)射波長(zhǎng)為500?700nm，優(yōu)選為615nm。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光免疫層析試紙，其中所述試紙具有底板，并且在該底板 上沿使用時(shí)的層析方向依次以接觸方式設(shè)置有：樣品墊、結(jié)合墊、反應(yīng)膜、吸水濾紙，所述結(jié) 合墊設(shè)置有所述的標(biāo)記有熒光微球的第一 GFAP單克隆抗體，所述反應(yīng)膜包括檢測(cè)區(qū)和質(zhì) 控區(qū)，所述檢測(cè)區(qū)包被有所述第二GFAP單克隆抗體，所述質(zhì)控區(qū)包被有能與所述的標(biāo)記有 熒光微球的第一 GFAP單克隆抗體特異性結(jié)合的抗抗體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的熒光免疫層析試紙，其中所述反應(yīng)膜為在大于550nm的波長(zhǎng) 下基本上不發(fā)熒光的硝酸纖維素膜。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的熒光免疫層析試紙，其中所述底板基本上不具有熒光性質(zhì)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的熒光免疫層析試紙，其中所述抗抗體為羊抗鼠 IgG單克隆抗 體或兔抗鼠 IgG單克隆抗體，其中優(yōu)選為羊抗鼠 IgG單克隆抗體。
10. -種制備根據(jù)權(quán)利要求1至9中任意一項(xiàng)所述的熒光免疫層析試紙的方法，其包括 以下步驟： 1) 提供標(biāo)記有突光微球的第一 GFAP單克隆抗體； 2) 提供結(jié)合墊，其中在所述結(jié)合墊上包被所述的標(biāo)記有熒光微球的第一 GFAP單克隆 抗體； 3) 提供反應(yīng)膜，其中在所述反應(yīng)膜上沿使用時(shí)的層析方向間隔固定第二GFAP單克隆 抗體和抗抗體，以分別形成檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)；和 4)在底板上沿使用時(shí)的層析方向依次以接觸方式設(shè)置樣品墊、所述結(jié)合墊、所述反應(yīng) 膜、吸水濾紙，從而制成所述熒光免疫層析試紙。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述步驟1)包括： a) 用碳二亞胺活化熒光微球，優(yōu)選地，將熒光微球的水分散液或MES緩沖液分散液經(jīng) 超聲波處理并與碳二亞胺混合，從而活化所述熒光微球； b) 洗滌步驟a)所獲得的活化的熒光微球，優(yōu)選地，將步驟a)所獲得的活化的熒光微球 用N-羥基硫代琥珀酰亞胺-檸檬酸緩沖液洗滌、分散，并經(jīng)超聲波處理； c) 用步驟b)所獲得的熒光微球標(biāo)記第一 GFAP單克隆抗體，優(yōu)選地，將步驟b)所獲得 的熒光微球與第一 GFAP單克隆抗體混合，用BSA-乙醇胺緩沖液封閉，離心，用BSA-吐溫水 溶液分散，經(jīng)超聲波處理，從而得到標(biāo)記有熒光微球的第一 GFAP單克隆抗體。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中在所述步驟2)中，所述的標(biāo)記有熒光微球的第 一 GFAP單克隆抗體的包被濃度為0. 5?2mg/ml。
13. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中在所述步驟3)中，所述檢測(cè)區(qū)和所述質(zhì)控區(qū)間 隔3mm至8mm，所述第二GFAP單克隆抗體和所述抗抗體的包被濃度分別為0· 5?2mg/ml。
【文檔編號(hào)】C07K14/47GK104142404SQ201310173234
【公開(kāi)日】2014年11月12日 申請(qǐng)日期:2013年5月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月10日
【發(fā)明者】朱建安 申請(qǐng)人:深圳市安群生物工程有限公司