本發(fā)明涉及一種抗血清制備方法，具體為錦鯉皰疹病毒抗血清制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
錦鯉皰疹病毒病(KHVD)是由錦鯉皰疹病毒(KHV)感染引起的鯉魚、錦鯉及其變種的一種傳染性和急性病毒病。該病感染所有年齡段的鯉魚和錦鯉，引起嚴(yán)重疾病和死亡，死亡率高達(dá)80％～90％。目前已知發(fā)生或進(jìn)境魚發(fā)生KHVD的國家和地區(qū)至少有22個(gè)，如奧地利、比利時(shí)、丹麥、法國、意大利、盧森堡、荷蘭、波蘭、瑞典、英國、中國、中國香港、中國臺(tái)灣、印度尼西亞、日本、韓國、馬來西亞、新加坡和泰國。其他地方，如南非和美國曾報(bào)道發(fā)生KHVD。錦鯉皰疹病毒病(KHVD)被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為魚類必報(bào)疫病，并發(fā)布診斷標(biāo)準(zhǔn)(《水生動(dòng)物疫病診斷手冊》)，已多次改版，該病在我國《進(jìn)境動(dòng)物檢疫疫病名錄》中被列為二類傳染病。
該病診斷方法主要是用分子生物學(xué)方法，如PCR或?qū)崟r(shí)定量PCR，或者在某些情況下用細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒，但后者敏感性較差，而且OIE《水生動(dòng)物疾病診斷手冊》推薦至少使用2種方法監(jiān)測和診斷KHV感染。但對于體內(nèi)病毒含量非常低的病毒攜帶魚，用上述方法進(jìn)行檢測則非常困難。因此研發(fā)出可用于檢測魚血清中KHV抗體的診斷試劑對于有效監(jiān)測KHVD非常必要，特別是對于那些高價(jià)值的不能進(jìn)行致死性診斷的觀賞魚(如錦鯉)尤為重要。
根據(jù)國外已有文獻(xiàn)報(bào)道，KHVD已建立多種免疫學(xué)診斷方法，并有商品化抗KHV血清。這些抗血清的制備主要分為兩種方法獲得：
(1)通過克隆表達(dá)，獲得病毒表達(dá)蛋白，免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，獲得抗血清；
(2)直接對病毒進(jìn)行純化，獲得抗原，用抗原免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，獲得抗血清。
(3)通過以上兩種方法獲得表達(dá)蛋白或抗原，制備單克隆抗體。
該技術(shù)僅在國外有相關(guān)研究，我國國內(nèi)未有相關(guān)技術(shù)的研究；另外該技術(shù)免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物需要制備大量純化抗原；相關(guān)抗血清等試劑均需要從國外進(jìn)口，國內(nèi)沒有生產(chǎn)單位，進(jìn)口成本高。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種成本低的錦鯉抗KHV抗血清制備方法。
具體技術(shù)方案為：
錦鯉皰疹病毒抗血清制備方法，包括以下過程：
(1)、免疫動(dòng)物準(zhǔn)備
選健康錦鯉免疫動(dòng)物，未接種過錦鯉皰癥病毒病疫苗，體重為150～350g，體長15～25cm；接種前于室溫環(huán)境下養(yǎng)殖不少于一周，定期少量喂食；
接種前，尾靜脈采血，分離血清，作為陰性血清，冷凍保存?zhèn)溆茫?/p>
(2)、免疫接種
取純化的錦鯉皰癥病毒抗原，含量不低于1mg/mL，50℃水浴1min滅活，與等量不完全佐劑混合，背部皮下多點(diǎn)注射，每條魚注射0.2mL；接種后，定期小量喂食，并保持水體環(huán)境；
接種后第14天，尾靜脈采血，分離血清測效價(jià)，每隔2周，采血測效價(jià)，剔除血清效價(jià)無變化的錦鯉；
第10～12周，當(dāng)血清效價(jià)達(dá)到頂峰時(shí)，心臟或尾靜脈大量采血，分離血清，測效價(jià)，分裝冷凍保存。
所述的血清測效價(jià)的方法，為間接ELISA測血清效價(jià)，包括以下過程：
用包被液將純化的錦鯉皰癥病毒抗原稀釋至0.5μg/mL，加入酶標(biāo)板，每孔100μL，37℃2h；包被液包括8.4g/L的NaHCO3、3.56g/L的Na2CO3，pH9.5；
每孔加260μL PBST洗板3次，PBST的pH8.0；
用含10％脫脂奶粉PBST分別將抗血清和陰性血清進(jìn)行10倍倍比稀釋，即分別為1：10、1：100、1：200、1：400、1：800、1：1600、1：3200，每種血清每個(gè)稀釋度加2孔，每孔100μL，25℃環(huán)境下1h，洗板3次；
加入稀釋兔抗鯉魚IgM-HRP，每孔100μL，25℃環(huán)境下1h，洗板3次；
每孔加入底物TMB溶液100μL，25℃孵育20min，每孔加入1N硫酸溶液100μL終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測量OD450；相同稀釋度下，當(dāng)抗血清OD450值不高于1.0，陰性血清OD450值不高于0.2，即為血清效價(jià)。
純化的錦鯉皰癥病毒抗原，是通過密度梯度離心法或者沉淀法、分子篩法獲得。
本發(fā)明獲得的錦鯉皰疹病毒抗血清，用于免疫印跡、IFAT、ELISA等方法檢測KHV抗原，并可作為KHV抗體檢測方法的陽性血清。目前，還沒有用于免疫學(xué)檢測KHV或KHV抗體的商品化試劑盒，本發(fā)明獲得的抗血清也可用于組裝上述方法的檢測試劑盒。
本發(fā)明提供的錦鯉皰疹病毒抗血清制備方法，具有以下技術(shù)效果：
(1)、抗血清制備簡單
獲得純化抗原后，一次性接種規(guī)定濃度抗原，不需要進(jìn)行多次免疫，即可獲得高效價(jià)血清。
(2)、抗血清制備成本低
使用抗原量少，節(jié)省大量抗原增殖、純化的成本：濃度為1mg/mL純化KHV抗原，與等量不完全弗氏佐劑混合后，取0.2mL接種錦鯉，抗原用量僅為0.1mg。
接種程序簡單，節(jié)省抗原用量和免疫佐劑：本技術(shù)方案只需要接種一次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物錦鯉，不需要多次接種。
實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物易于獲得、養(yǎng)殖成本低：本技術(shù)方案實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為錦鯉，相對于家兔、山羊、綿羊等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，價(jià)格低，實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖簡單。
(3)、制備的抗血清填補(bǔ)國內(nèi)空白
目前國內(nèi)沒有生產(chǎn)KHV抗血清的單位，基本依靠進(jìn)口，成本高，不利于KHV免疫學(xué)診斷方法的推廣使用，本專利提供了一種簡單而有效的KHV抗血清制備方法。
本發(fā)明提供的錦鯉皰疹病毒抗血清制備方法，建立了錦鯉抗KHV抗血清制備方法，獲得了高效價(jià)抗血清，獲得的抗血清可用于IFAT、ELISA等方法進(jìn)行KHV抗原檢測和作為陽性血清用于KHV抗體的檢測。為國內(nèi)開展KHV或KHV抗體免疫學(xué)診斷提供了程序化的抗血清制備方法，可提供成品化的免疫學(xué)診斷試劑。
附圖說明
圖1是本發(fā)明的流程示意圖。
具體實(shí)施方式
結(jié)合實(shí)施例說明本發(fā)明的具體實(shí)施方式。
如圖1所示，錦鯉皰疹病毒抗血清制備方法：
(1)、免疫動(dòng)物準(zhǔn)備
選健康錦鯉免疫動(dòng)物，來源于無錦鯉皰疹病毒病(KHVD)發(fā)病歷史的養(yǎng)殖場，未接種過錦鯉皰癥病毒病疫苗，體重為150～350g，體長15～25cm。接種前于室溫環(huán)境下(水溫不超過30℃)養(yǎng)殖不少于一周，定期少量喂食。接種前，尾靜脈少量采血，分離血清，作為陰性血清，冷凍保存?zhèn)溆?。為防止接種期間錦鯉出現(xiàn)死亡而無法獲得抗血清，并考慮需要獲得的血清量，接種錦鯉數(shù)量不少于4尾。
(2)、免疫接種
取密度梯度離心法純化的錦鯉皰癥病毒(KHV)抗原，含量不低于1mg/mL，50℃水浴1min滅活，與等量不完全佐劑混合，背部皮下多點(diǎn)注射，每條魚注射0.2mL。接種后，定期小量喂食，并保持水體環(huán)境。
接種后14天后，尾靜脈少量采血，分離血清測效價(jià)，之后，每隔2周，采血測效價(jià)，期間密切注意血清效價(jià)變化情況，及時(shí)剔除血清效價(jià)無變化的錦鯉。
約10～12周，血清效價(jià)達(dá)到頂峰(之后血清效價(jià)逐步下降)，當(dāng)血清效價(jià)達(dá)到頂峰時(shí)，心臟或尾靜脈大量采血，分離血清，測效價(jià)，分裝冷凍保存。
(3)、測效價(jià)為間接ELISA測血清效價(jià)
如表1，用包被液(8.4g/L NaHCO3，3.56g/L Na2CO3，pH9.5)將密度梯度純化KHV抗原稀釋至0.5μg/mL，加入酶標(biāo)板，每孔100μL，37℃2h。每孔加260μL PBST(pH8.0)洗板3次。用含10％脫脂奶粉PBST分別將抗血清和陰性血清(免疫前獲得的血清)進(jìn)行10倍倍比稀釋(1：10、1：100、1：200、1：400、1：800、1：1600、1：3200)，每種血清每個(gè)稀釋度加2孔，每孔100μL，25℃1h，洗板3次。加入稀釋兔抗鯉魚IgM-HRP(市售商品)，每孔100μL，25℃1h，洗板3次。每孔加入底物TMB溶液100μL，25℃孵育20min，每孔加入1N硫酸溶液100μL終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測量OD450。相同稀釋度下，當(dāng)抗血清OD450值1.0左右，陰性血清OD450值不高于0.2，即為血清效價(jià)。
表1酶標(biāo)板加樣示意圖
(4)、應(yīng)用
本發(fā)明獲得的抗血清可用于免疫印跡、IFAT、ELISA等方法檢測KHV抗原，并可作為KHV抗體檢測方法的陽性血清。
本發(fā)明獲得的抗血清也可用于組裝上述方法的檢測試劑盒。