關(guān)于聯(lián)邦資助研究的聲明

本發(fā)明在美國國立過敏和傳染病研究所、美國國立衛(wèi)生研究院提供的合同HHSN272200900037C的美國政府支持下完成。政府對本專利具有某些權(quán)利。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及CD40片段、抗CD40抗體和所述抗體的用途，例如，降低移植排斥的可能性、或增加移植排斥之前的持續(xù)時間，誘導(dǎo)免疫抑制或治療自身免疫性病癥。

背景技術(shù)：

免疫系統(tǒng)、特別是體液免疫系統(tǒng)的抑制在器官移植和自身免疫性病癥的治療中是有益的。例如，器官移植已成為涉及器官損害的多種形式的危及生命的疾病的優(yōu)選治療方法。當(dāng)接受移植的細(xì)胞或組織的生物體產(chǎn)生對該組織的不期望的免疫應(yīng)答時，發(fā)生移植排斥。組織型匹配可以最大限度地減少移植排斥，但是甚至匹配的組織通常受供體排斥。因此，對于幾乎所有組織移植的情況，都需要免疫抑制治療。

已經(jīng)實現(xiàn)了臨床移植的改善結(jié)果，這主要通過開發(fā)日益強大的非特異性免疫抑制藥物來抑制排斥反應(yīng)。盡管短期結(jié)果已經(jīng)改善，但是長期結(jié)果仍然不足。需要長期免疫抑制劑來抗擊移植器官的慢性排斥，并且這些藥劑的使用極大地增加了心血管疾病、感染和惡性腫瘤的風(fēng)險。

用于減少移植排斥的一個潛在目標(biāo)是CD40/CD154相互作用。CD40在B淋巴細(xì)胞表面上表達，而CD154在T細(xì)胞表面上表達。這兩種蛋白之間的相互作用與B細(xì)胞活化相關(guān)，所述B細(xì)胞活化觸發(fā)細(xì)胞因子表達，以及細(xì)胞表面標(biāo)志物包括CD23、CD80和CD86的表達。已經(jīng)顯示使用抗CD154抗體阻斷該相互作用以減少或消除非人靈長類動物中移植組織的排斥。

對于任何類型的免疫抑制(例如，在移植程序中)，效力和毒性之間的平衡對于其臨床接受性而言是一個關(guān)鍵因素。因此，存在對于特異性靶向參與(例如)移植排斥和自身免疫性病癥的免疫途徑的療法的需求。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

在第一方面，本發(fā)明的特征在于分離的抗體或其抗原結(jié)合片段(例如，缺乏Fc部分或者是F(ab')₂、Fab、Fv或scFv結(jié)構(gòu)的抗體)，其特異性結(jié)合CD40(例如，獼猴、鼠或人CD40)上存在的表位，其中該表位被2C10抗體所識別(例如，其中所述表位不被3A8或Chi220抗體或兩者所識別)。該抗體在體外能夠阻斷表達CD154的Jurkat細(xì)胞對B淋巴細(xì)胞(例如，獼猴或人B淋巴細(xì)胞)的活化，或者在體外能夠抑制獼猴B細(xì)胞，例如，降低CD23、CD80或CD86表達。該抗體可以是2C10抗體。該抗體可以具有人恒定區(qū)。在某些實施方案中，該抗體是人源化抗體或人抗體。在某些實施方案中，該抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。

在具體實施方案中，該抗體包括由SEQ ID NO:2的氨基酸20-132定義的重鏈可變區(qū)，其抗體結(jié)合部分或片段，或其人源化形式。在其他實施方案中，抗體的抗體輕鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO:4的23-128的序列，其抗體結(jié)合部分或片段，或其人源化形式。在其他實施方案中，抗體的重鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO:2的氨基酸20-132，并且抗體的輕鏈可變序列包括SEQ ID NO:4的氨基酸23-128。

本發(fā)明的特征還在于編碼第一方面的抗體或抗體片段的多核苷酸，包括該多核苷酸的載體，和包括該載體的細(xì)胞。該細(xì)胞可以是真核細(xì)胞(例如，哺乳動物諸如人、小鼠、猴或兔細(xì)胞)，或者可以是原核細(xì)胞(例如，細(xì)菌細(xì)胞諸如大腸桿菌細(xì)胞)。

在另一個方面，本發(fā)明的特征在于抑制受試者(例如，哺乳動物諸如人)的免疫系統(tǒng)的方法。該方法包括給受試者施用有效量的第一方面的抗體或其抗原結(jié)合片段。

在又另一個方面，本發(fā)明的特征在于在需要其的受試者(例如，哺乳動物諸如人)中治療或預(yù)防性治療移植排斥或增加發(fā)生移植排斥之前的持續(xù)時間的方法。該方法包括給受試者施用有效量的第一方面的抗體或其抗原結(jié)合片段。

在前述兩個方面的任一個中，受試者可能已經(jīng)接受，或者可能需要，器官移植(例如，心臟、腎、肺、肝臟、胰腺、腸、和胸腺、或其部分)或組織移植(例如，骨、肌腱、角膜、皮膚、心臟瓣膜、靜脈、或骨髓)。

在前述兩個方面的任一個中，可以在移植(transplantation)或嫁接(graft)之前開始施用。施用可以在移植(transplantation)或嫁接(graft)之后繼續(xù)至少1、2、3、4、5、7 或10天；2、3、4、6、8、10、或12周；3、4、5、6、8、10、12、24、或36個月。

在又另一個方面，本發(fā)明的特征在于在需要其的受試者(例如，哺乳動物諸如人)中治療或預(yù)防性治療移植物抗宿主疾病(graft-versus-host disease)的方法。該方法包括給受試者施用有效量的第一方面的抗體或其抗原結(jié)合片段。

在另一個方面，本發(fā)明的特征在于在需要其的受試者(例如，哺乳動物諸如人)中治療或預(yù)防性治療自身免疫性病癥的方法。該方法包括給受試者施用有效量的第一方面的抗體或其抗原結(jié)合片段。在某些實施方案中，自身免疫性病癥與自身抗體的存在相關(guān)或由自身抗體的存在所引起(例如，全身性紅斑狼瘡(SLE)、CREST綜合癥(鈣質(zhì)沉著、雷諾氏綜合癥、食道運動功能障礙、指端硬化(sclerodactyl)、和毛細(xì)血管擴張)、斜視眼陣攣、炎性肌病(例如，多肌炎、皮肌炎和包涵體肌炎)、全身性硬皮病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、乳糜瀉(例如，谷蛋白敏感腸病)、皰疹樣皮炎、Miller-Fisher綜合癥、急性運動性軸索神經(jīng)病(AMAN)、具有傳導(dǎo)阻滯的多灶性運動神經(jīng)病、自身免疫性肝炎、抗磷脂綜合癥、Wegener氏肉芽腫、顯微多血管炎、Churg-Strauss綜合癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、慢性自身免疫性肝炎、硬化性肌炎、重癥肌無力、Lambert–Eaton肌無力綜合癥、橋本氏甲狀腺炎、Graves氏病、副腫瘤性小腦變性、僵人綜合癥、邊緣性腦炎、Isaacs綜合癥、Sydenham氏舞蹈病、與鏈球菌相關(guān)的小兒自身免疫性神經(jīng)精神疾病(PANDAS)、 腦炎、1型糖尿病和視神經(jīng)脊髓炎)。在其他實施方案中，病癥選自惡性貧血、Addison氏病、牛皮癬、炎性腸病、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、Sj?gren氏綜合癥、紅斑狼瘡(例如，盤狀紅斑狼瘡、藥物誘導(dǎo)的紅斑狼瘡和新生兒紅斑狼瘡)、多發(fā)性硬化癥和反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎。在還有其他實施方案中，病癥選自多肌炎、皮肌炎、多發(fā)性內(nèi)分泌衰竭、Schmidt氏綜合癥、自身免疫性眼色素層炎、腎上腺炎、甲狀腺炎、自身免疫性甲狀腺疾病、胃萎縮、慢性肝炎、狼瘡狀肝炎、動脈粥樣硬化、早老性癡呆癥、脫髓鞘疾病、亞急性皮膚型紅斑狼瘡、甲狀旁腺功能減退、Dressler氏綜合癥、自身免疫性血小板減少癥、特發(fā)性血小板減少性紫癜、溶血性貧血、尋常型天皰瘡、天皰瘡、斑禿(alopecia arcata)、類天皰瘡、硬皮病、進行性全身性硬化癥、成人發(fā)病型糖尿病(例如，II型糖尿病)、男性和女性自身免疫性不育、強直性脊椎炎、潰瘍性結(jié)腸炎、Crohn氏病、混合性結(jié)締組織病、結(jié)節(jié)性多動脈炎、全身性壞死性血管炎、少年發(fā)病性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、腎小球腎炎、特應(yīng)性皮炎、特應(yīng)性鼻炎、Goodpasture氏綜合癥、Chagas氏綜合癥、肉狀瘤病、風(fēng)濕熱、哮喘、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、抗磷脂綜合癥、farmer氏肺、多形性紅斑、心切開后綜合癥、Cushing氏綜合癥、自身免疫性慢性活躍肝炎、bird-fancier氏肺、過敏性疾病、過敏性腦脊髓炎、中毒性表皮壞死松解癥、禿頭癥、Alport氏綜合癥、肺泡炎、過敏性肺泡炎、纖維化性肺泡炎、間質(zhì)性肺疾病、結(jié)節(jié)性紅斑、壞疽性膿皮病、輸血反應(yīng)、麻風(fēng)病、瘧疾、利什曼病、錐蟲病、高安氏動脈炎、風(fēng)濕性多肌痛、顳動脈炎、血吸蟲病、巨細(xì)胞動脈炎、蛔蟲病、曲霉病、 Sampter氏綜合癥、濕疹、淋巴瘤樣肉芽腫、Behcet氏病、Caplan氏綜合癥、川崎氏病、登革熱、心內(nèi)膜炎、心內(nèi)膜纖維化、眼內(nèi)炎、持久性隆起性紅斑(erythema elevatum et diutinum)、胎兒紅細(xì)胞增多癥、嗜酸性筋膜炎、Shulman氏綜合癥、Felty氏綜合癥、絲蟲病、睫狀體炎、慢性睫狀體炎、異時睫狀體炎、 Fuch氏睫狀體炎、IgA腎病、Henoch-Schonlein紫癜、移植物抗宿主病、移植排斥、人免疫缺陷病毒感染、埃可病毒感染、心肌病、阿爾茨海默氏病、細(xì)小病毒感染、風(fēng)疹病毒感染、接種疫苗后綜合癥、先天性風(fēng)疹感染、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、腎細(xì)胞癌、多發(fā)性骨髓瘤、Eaton-Lambert綜合癥、復(fù)發(fā)性多軟骨炎、惡性黑色素瘤、冷球蛋白血癥、Waldenstrom氏巨球蛋白血癥、Epstein-Barr病毒感染、腮腺炎、Evan氏綜合癥和自身免疫性性腺衰竭。

在前述三個方面的任一個中，施用可以是腸胃外、靜脈內(nèi)、皮下、口服、外用、鞘內(nèi)、局部、或通過本文所述的任何途徑。

在前述四個方面的任一個中，該方法可以進一步包括在6個月內(nèi)施用第二藥劑(例如，抗體施用的3、2、或1個月內(nèi)；4、3、2、或1周內(nèi)；6、5、4、3、2或1天內(nèi)；或18、12、6、3、2或1小時內(nèi))，其中所述第二藥劑是免疫抑制劑。第二藥劑可以選自鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑(例如，環(huán)孢素A、環(huán)孢素G)、他克莫司、mTor抑制劑(例如，西羅莫司、替西羅莫司、佐他莫司或依維莫司)、芬戈莫德、多球殼菌素、阿侖單抗、利妥昔單抗、抗CD4單克隆抗體、抗LFA1單克隆抗體、抗LFA3單克抗體、抗CD45抗體(例如，抗CD45RB抗體)、抗CD19抗體、monabatacept、貝拉西普、吲哚基-ASC；硫唑嘌呤、淋巴細(xì)胞免疫球蛋白和抗胸腺細(xì)胞球蛋白[馬]、嗎替麥考酚酯、麥考酚鈉、達利珠單抗、巴利昔單抗、環(huán)磷酰胺、潑尼松、潑尼松龍、來氟米特、FK778、FK779、15-脫氧精胍菌素、白消安、氟達拉濱、甲氨蝶呤、6-巰基嘌呤、15-脫氧精胍菌素、LF15-0195、布雷青霉素、布喹那和莫羅單抗-CD3。在某些實施方案中，第二藥劑是貝拉西普。

在又另一個方面，本發(fā)明的特征在于制備抗體的方法。該方法包括：(a) 給哺乳動物(例如，小鼠或兔)施用包含CD40多肽的片段(例如，小于50、40、30、20、10個氨基酸長度，但多于6、8、或10個氨基酸長度)、但非全長CD40分子的多肽，其方式足以生成針對所述片段的免疫應(yīng)答，所述CD40多肽的片段包括被2C10抗體識別的表位的，；(b)從哺乳動物分離脾細(xì)胞；(c)形成脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞之間的雜交瘤；和(d)純化雜交瘤產(chǎn)生的抗體。多肽可以是(例如，CD40片段和鑰孔血藍蛋白或谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶之間的)融合蛋白。本發(fā)明的特征還在于通過這種方法產(chǎn)生的抗體。

在另一個方面，本發(fā)明的特征在于被2C11抗體特異性結(jié)合的小于150 (例如，小于120、100、80、70、60、50、40、30、20、15、12、11、10、9、8、或7)個氨基酸長度的CD40的片段。在某些實施方案中，該片段是8-10、8-12、8-15、8-20、8-30、8-40、8-50、8-60、8-70、8-80、或8-100個氨基酸長度。在其他實施方案中，該片段是7-10、7-12、7-15、7-20、7-30、7-40、7-50、7-60、7-70、7-80、或7-100個氨基酸長度。CD40片段可以來自CD40的胞外結(jié)構(gòu)域(例如，SEQ ID NO：5和6)。本發(fā)明的特征還在于包括本文所述片段和異源序列的融合蛋白。

“特異性結(jié)合”是指識別并結(jié)合特定表位、但基本上不識別并結(jié)合樣品(例如，天然包括其他多肽、核酸和/或其他生物分子的生物樣品)中存在的其他分子的化合物或抗體。在一個實例中，特異性結(jié)合被2C10抗體識別的CD40表位的抗體不結(jié)合CD40上存在的其他表位。

抗體的“抗原結(jié)合片段”是指具有特異性結(jié)合全長抗體的目標(biāo)抗原的能力的抗體的任何片段或部分。

非人(例如鼠類)抗體的“人源化”形式是嵌合抗體，其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。在一個實施方案中，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體高變區(qū)(HVR)的殘基被來自非人物種((供體抗體)，諸如小鼠、大鼠、兔非人靈長類)HVR的殘基替換，所述人源化抗體具有所需特異性、親和力和/或能力。在一些情況下，人免疫球蛋白的框架(FR)殘基(即，在除了高變區(qū)以外的可變區(qū)的殘基)被相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒有發(fā)現(xiàn)的殘基?？蛇M行這些修飾，以進一步完善抗體性能。通常，人源化抗體可以包含基本上所有的至少一個，通常兩個可變結(jié)構(gòu)域，其中所有的或基本上所有的高變環(huán)對應(yīng)非人免疫球蛋白的那些高變環(huán)，并且所有的或基本上所有的FRs是人免疫球蛋白序列的那些FRs。人源化抗體任選還包含至少部分的免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)(Fc)。對于其他細(xì)節(jié)，參見例如Jones等人，Nature 321:522-25, 1986; Riechmann等人，Nature 332:323-29, 1988; 和Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-6, 1992。還參見例如，Vaswani 等人，Ann. Allergy Asthma & Immunol. 1:105-15, 1998; Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-8, 1995; Hurle等人，Curr. Op. Biotech. 5:428-33, 1994; 以及美國專利號6,982,321和7,087,409。

“人抗體”是具有對應(yīng)于人產(chǎn)生的抗體的氨基酸序列的氨基酸序列和/或已經(jīng)使用用于制備本文公開的人抗體的任何技術(shù)制備的人抗體。這種人抗體的定義特別排除了包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。可使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)，包括噬菌體展示文庫(Hoogenboom等人，J. Mol. Biol. 227:381-8, 1992; Marks 等人，J. Mol. Biol, 222:581-97, 1991)產(chǎn)生人抗體。也可以用于制備人單克隆抗體的是在Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer等人，J. Immunol. 147:86-95, 1991中描述的方法。也參見van Dijk等人，Curr. Opin. Pharmacol. 5:368-74, 2001?？赏ㄟ^向轉(zhuǎn)基因動物施用抗原制備人抗體，已經(jīng)修飾了所述轉(zhuǎn)基因動物，以產(chǎn)生響應(yīng)抗原攻擊的此類抗體，但所述轉(zhuǎn)基因動物(例如經(jīng)免疫的異種小鼠(xenomice))的內(nèi)源基因座的功能已經(jīng)喪失(參見例如，關(guān)于XenoMouse^?技術(shù)的美國專利號6,075,181和 6,150,584)。關(guān)于經(jīng)由人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)生成的人抗體，也參見例如，Li等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:3557-62, 2006。

“治療”受試者中的疾病、病癥或狀況是指通過給受試者施用治療劑而減少所述疾病、病癥或狀況的至少一種癥狀。

“預(yù)防性治療”受試者中的疾病、病癥或狀況是指通過在出現(xiàn)一種或多種疾病癥狀之前給受試者施用治療劑而減少(例如，預(yù)防)疾病、病癥或狀況的發(fā)生頻率或嚴(yán)重度。

術(shù)語“有效量”是指有效治療醫(yī)療狀況(例如，移植排斥或移植物抗宿主疾病)的生理效應(yīng)所需的劑量。

“免疫抑制劑”是指誘導(dǎo)免疫抑制的化合物或組合物，即其減少(例如，預(yù)防)或干擾(例如，細(xì)胞或體液)免疫應(yīng)答的發(fā)展。

“受試者”是指人或非人動物(例如，哺乳動物)。

“融合蛋白”是指含有(a)目標(biāo)蛋白或其片段；和(b)異源融合伴侶的多肽。

根據(jù)以下的詳細(xì)說明、附圖和權(quán)利要求，本發(fā)明的其他特征和益處將是明顯的。

附圖說明

圖1顯示2C10抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)。對于重鏈顯示的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)包括信號肽(核苷酸1-57；下劃線)和重鏈可變序列(核苷酸58-396)。對應(yīng)氨基酸序列顯示在下面(SEQ ID NO:2)，其中氨基酸1-19對應(yīng)于信號序列(下劃線)并且氨基酸20-132對應(yīng)于重鏈可變區(qū)。

對于輕鏈顯示的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)包括信號肽(核苷酸1-66；下劃線)和輕鏈可變序列(核苷酸67-384)。對應(yīng)氨基酸序列顯示在下面(SEQ ID NO:4)，其中氨基酸1-22對應(yīng)于信號肽(下劃線)并且氨基酸23-128對應(yīng)于輕鏈可變區(qū)。

圖2A是顯示確認(rèn)2C10結(jié)合人和獼猴CD20+ B細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)的圖。

圖2B是顯示如使用山羊抗小鼠IgG-HRP所檢測用不同濃度的2C10的ELISA測定的CD40吸附數(shù)據(jù)以確認(rèn)2C10結(jié)合人和獼猴CD40的圖。

圖3是顯示2C10對CD154與B細(xì)胞結(jié)合的劑量依賴性抑制的圖。通過與組氨酸標(biāo)簽的可溶性CD154孵育并且分析組氨酸表達來分析B細(xì)胞的CD154結(jié)合。結(jié)果代表實驗的多次重復(fù)。

圖4是顯示涉及獼猴或人外周血單核細(xì)胞(PBMCs)和Jurkat細(xì)胞的測定原理的示意圖和圖表。

圖5是顯示取自在各種濃度的3A8、5C8或2C10抗體存在的情況下獼猴PBMCs和Jurkat細(xì)胞的共培養(yǎng)的CD20⁺細(xì)胞中CD23表達的一組圖。

圖6是顯示取自在各種濃度的3A8、5C8或2C10抗體存在的情況下人PBMCs和Jurkat細(xì)胞的共培養(yǎng)的CD20⁺細(xì)胞中CD86表達的一組圖。

圖7是顯示來自在3A8或2C10抗體存在的情況下無Jurkat細(xì)胞培養(yǎng)的人或獼猴PBMCs的CD20⁺細(xì)胞中CD23表達的一組圖。

圖8是顯示用進行工程改造以含有獼猴IgG1 (2C10R1)或IgG4 (2C10R4)重鏈恒定區(qū)的2C10的小鼠-獼猴嵌合形式和抗CD40 3A8的嵌合IgG1形式(3A8R1)或抗CD40 Chi220 (Chi220)處理的獼猴的外周B細(xì)胞計數(shù)的圖。所有動物在第一次抗體處理后都用4-羥基-3-硝基苯基乙酰基綴合的鑰孔血藍蛋白(KLH)免疫。

圖9是顯示用2C10R1、2C10R4或3A8R1抗體處理的獼猴中的T細(xì)胞依賴性抗體應(yīng)答的圖。所有動物在第一次抗體處理后都用KLH免疫。

圖10是顯示異源胰島移植的標(biāo)準(zhǔn)獼猴模型的圖。使用鏈脲佐霉素在獼猴中誘導(dǎo)糖尿病。糖尿病猴用異源胰島進行移植，并且使用巴利昔單抗和西羅莫司開始免疫抑制。實驗動物在移植后第0天和第7天接受2C10R4治療。

圖11A是顯示胰島移植、背景免疫抑制和用2C10R4處理后4只獼猴中游離血糖水平(FBG)的圖。圖上的實線代表血漿中的2C10水平。

圖11B是顯示僅接受背景免疫抑制的獼猴中FBG的圖。

圖12是顯示與漸增濃度的2C10、3A8或Chi220抗體孵育并且用APC-綴合的2C10染色的人PBMC以評價各抗體交叉阻斷2C10的能力的競爭阻斷測定的結(jié)果的圖。

具體實施方式

本發(fā)明涉及具有結(jié)合CD40分子上特定表位的能力的抗CD40抗體和抗體片段，以及涉及使用這種抗體的方法。這種表位特異性賦予特定活性概況，從而使得抗體通常阻斷CD40與其結(jié)合伴侶(例如，CD154)相互作用的能力，并且這樣做不活化表達CD40的細(xì)胞。理解了這種活性概況來使這些抗體特別可用于減少與器官或組織移植相關(guān)的并發(fā)癥。

CD40抗體的制備和鑒定

小鼠(AJ品系)用融合蛋白進行免疫，所述融合蛋白由獼猴(M. mulatta) CD40的胞外結(jié)構(gòu)域(氨基酸序列：

和與之融合的麥芽糖結(jié)合蛋白組成(CD40-MBP)。獼猴CD40蛋白的該區(qū)域的氨基酸序列在5個氨基酸位置不同于人CD40蛋白(人氨基酸序列：

。將CD40-MBP與完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑多次施用于小鼠。將來自免疫小鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0進行融合，并且使用標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤技術(shù)選擇雜合體。

選擇抗體對第二種融合蛋白的反應(yīng)性，所述第二種融合蛋白由相同的獼猴CD40結(jié)構(gòu)域和與之融合的谷氨酰胺合成酶組成(CD40-GST)。通過流式細(xì)胞術(shù)進一步測試通過ELISA對CD40-GST有反應(yīng)的抗體對在獼猴血液B細(xì)胞、人血液B細(xì)胞和獼猴B-類淋巴母細(xì)胞細(xì)胞系上表達的天然CD40的反應(yīng)性。作為選擇的最終水平，在體外測定中測試抗體在與表達CD154的Jurkat D1.1細(xì)胞共培養(yǎng)之后抑制人或獼猴B細(xì)胞活化的能力。通過有限稀釋獲得抗CD40抗體2C10的穩(wěn)定亞克隆。抗體是小鼠IgG1-κ。

抗體克隆

可以使用本領(lǐng)域中已知的任何方法克隆單克隆抗體的可變區(qū)。用于獲得雜交瘤細(xì)胞的抗體可變區(qū)序列的基于PCR的方法描述于，例如，Larrick等人, Nat. Biotechnol. 7:934-8, 1989和Orlandi等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833-7, 1989。使用這些技術(shù)或類似技術(shù)，單克隆抗體的可變區(qū)可以進行克隆并且進一步操作。

在目前情況下，將2C10抗體的重鏈和輕鏈的可變序列進行克隆和測序。采用以下DNA引物使用5’ RACE PCR克隆代表來自2C10雜交瘤的免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)的DNA：

小鼠κ反向:

小鼠κ正向:

小鼠IgG1反向:

小鼠IgG1正向:

將PCR產(chǎn)物克隆進商售克隆載體，并使用標(biāo)準(zhǔn)測序技術(shù)進行測序。獲得的序列提供在圖1中。

使用cDNA末端-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的5'快速擴增從分泌抗CD40抗體的雜交瘤克隆2C10和抗人CD40分子克隆3A8(Kwekkeboom等人, Immunology 79:439-44, 1993) (從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection), ATCC, Vienna, VA獲得)克隆免疫球蛋白可變區(qū)基因。將免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)亞克隆到含有獼猴IgGl或獼猴IgG4重鏈和獼猴κ輕鏈恒定區(qū)序列的表達載體中。

將重組重鏈和輕鏈亞克隆到表達載體中，并且包裝在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體使用GPEx?表達技術(shù)(Catalent Pharma Solutions, Middleton, WI)轉(zhuǎn)導(dǎo)中國倉鼠卵巢細(xì)胞。經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的合并物在無血清培養(yǎng)基中生長，并且通過蛋白A親和層析純化分泌的抗體。純化的嵌合獼猴IgG1 (2C10R1, 3A8R1)和IgG4 (2C10R4)抗體在磷酸鹽緩沖液中滲濾；內(nèi)毒素水平被驗證為小于1內(nèi)毒素單位/mg。

抗體表征

2C10結(jié)合CD40并且防止CD154的結(jié)合

為了評價2C10結(jié)合獼猴和人CD40兩者的能力，將重組表達的人或獼猴CD40吸附至ELISA板，并且與不同濃度的2C10反應(yīng)。在ELISA中使用山羊抗小鼠IgG-HRP檢測2C10與CD40的結(jié)合。圖2B中的結(jié)果顯示2C10對于獼猴和人CD40具有類似的結(jié)合親和力，這對于2C10的臨床轉(zhuǎn)化是重要的。為了確認(rèn)2C10阻斷結(jié)合其同源配體CD154的能力，將獼猴和人B細(xì)胞與漸增濃度的2C10或同種型對照進行培養(yǎng)，然后與組氨酸-標(biāo)記的可溶性CD154(R&D Systems, Minneapolis, MN)進行孵育，并且分析組氨酸表達。2C10以劑量依賴的方式阻斷CD154的結(jié)合(圖3)，表明2C10可以有效阻斷T細(xì)胞結(jié)合的CD154與B細(xì)胞和抗原遞呈細(xì)胞上的CD40的相互作用。

2C10阻斷獼猴和人外周血單核細(xì)胞中的B細(xì)胞活化

使用獼猴和人外周血單核細(xì)胞(PBMC)兩者表征CD40抗體2C10影響B(tài)細(xì)胞活化的能力。選擇CD20表達作為B細(xì)胞的指標(biāo)，并且CD23、CD80和CD86的表達與B細(xì)胞活化相關(guān)。首先評價2C10結(jié)合CD20的能力。獼猴或人PBMCs與熒光染料綴合的2C10和抗CD20抗體進行孵育。使用流式細(xì)胞術(shù)分析確認(rèn)2C10與人和獼猴CD20+ B細(xì)胞的結(jié)合(圖2A)。在另一組實驗中，將來自獼猴或人的PBMCs在CD154⁺ Jurkat D1.1細(xì)胞(永生化的T淋巴細(xì)胞細(xì)胞系)存在或不存在的情況下進行培養(yǎng)。B細(xì)胞的活化通過測量PBMCs中存在的CD20⁺細(xì)胞中三種標(biāo)志物(CD23、CD80和CD86)的表達而進行測定。該測定的一般方案顯示在圖4中。如圖4中顯示，在Jurkat細(xì)胞存在的情況下培養(yǎng)PBMCs導(dǎo)致所有三種標(biāo)志物的表達增加，表明B細(xì)胞被CD154⁺Jurkat細(xì)胞活化。

為了測試抗體阻斷B細(xì)胞活化的能力，PBMCs和Jurkat細(xì)胞在三種抗體(3A8、5C8和2C10)之一存在或不存在的情況下進行共培養(yǎng)。3A8抗體是小鼠抗人CD40抗體(ATCC保藏號HB-12024)，并且5C8是抗CD154抗體(ATCC保藏號CRL-10915)。每種被用作陽性對照。在5個數(shù)量級的抗體濃度(0.001 μg至10 μg)的范圍內(nèi)進行共培養(yǎng)。如圖5中顯示，3A8沒有阻斷獼猴PBMCs中的B細(xì)胞活化，如CD23表達所測量的，而2C10和5C8兩者都能夠以類似效力阻斷活化。CD80和CD86的表達也觀察到相應(yīng)變化。這些結(jié)果表明，與3A8相比，2C10結(jié)合CD40上不同的表位。這些結(jié)果還表明，與以前已經(jīng)顯示充當(dāng)具有弱刺激潛能的部分激動劑的3A8相反，2C10主要充當(dāng)CD40拮抗劑(Adams等人, J. Immunol. 174:542-50, 2005, Badell等人, Am. J. Transplant. 接受用于出版, 2011)。當(dāng)使用人而非獼猴PBMCs 進行類似實驗時，再次觀察到2C10和5C8兩者都以類似效力阻斷B細(xì)胞活化，如通過CD86表達所測量的。此處，3A8抗體，不像用獼猴PBMCs，阻斷B細(xì)胞活化(圖6)。

還使用獼猴或人PBMCs 測試2C10和3A8抗體在Jurkat細(xì)胞不存在的情況下活化B細(xì)胞的能力。此處，在2C10或3A8存在或不存在的情況下培養(yǎng)PBMCs。然后在CD20⁺細(xì)胞中測量CD23、CD80和CD86的表達。如圖7中顯示，在3A8抗體存在的情況下，獼猴細(xì)胞中CD23表達增加，但在2C10抗體存在的情況下則沒有增加。相比之下，3A8和2C10都無法活化人B細(xì)胞。3A8和2C10抗體之間觀察到的活性差異表明，2C10抗體結(jié)合與3A8抗體的表位不同的表位。

2C10防止T細(xì)胞依賴的抗體應(yīng)答

已經(jīng)確定2C10結(jié)合CD40上的獨特表位，與抗CD154抗體類似地抑制B細(xì)胞活化，并且缺乏激動劑特性，所以我們表征2C10在體內(nèi)的作用。使用獼猴IgG1 (2C10R1)或IgG4 (2C10R4)重鏈和獼猴κ輕鏈恒定區(qū)序列生成2C10的重組小鼠-獼猴嵌合形式。還生成3A8的嵌合獼猴IgG1形式(3A8R1)用作對照。

獼猴在第0天用4-羥基-3-硝基苯基乙?；Y合的鑰孔血藍蛋白(KLH, 10 mg IM)抗原(Biosearch Technologies, Novato, CA)免疫一次。接種前和在1周時，三只動物的群組接受2C10R1、2C10R4、3A8R1或鹽水的靜脈內(nèi)劑量(50 mg/kg)。所有動物觀察70天，并且每周進行流式細(xì)胞術(shù)。與以前報道的在接受3A8R1 (Badell等人, Am. J. Transplant. 10:214, 2010)或Chi220 (Adams等人, J. Immunol. 174:542-50, 2005)的動物中存在的外周B細(xì)胞的顯著且長期的耗竭相比，用任一重組2C10同種型處理導(dǎo)致外周B細(xì)胞計數(shù)的輕微改變(圖8)。

通過ELISA測試對KLH-NP 的T細(xì)胞依賴的抗體應(yīng)答。板用KLH (0.01 mg/ml, Sigma, St. Louis, MO)包被，并且用Super Block (Thermo Scientific, Woodstock, GA)封閉。處理之前和之后的血漿樣品連續(xù)稀釋，鋪板1小時，并且用磷酸鹽緩沖鹽水/0.05% Tween洗滌?？筀LH抗體通過與單克隆抗獼猴IgG-辣根過氧化物酶(克隆1B3, NHP Reagent Resource, Boston, MA)孵育1小時而進行檢測。板然后與過氧化物酶底物溶液(KPL)孵育。然后添加終止溶液(KPL)，并且在ELISA讀板器上在450nm處讀取光密度。如果處理之后血漿的光密度讀數(shù)超過相同稀釋度的處理之前血漿的光密度2倍，則樣品在給定稀釋度被認(rèn)為是陽性的。KLH免疫之后，對照動物產(chǎn)生高滴度KLH-特異性IgG(圖9)。接受3A8R1的動物還產(chǎn)生抗-KLH應(yīng)答，但是滴度比對照約低10倍，盡管B細(xì)胞明顯耗竭。相比之下，在接受2C10R1或2C10R4的所有動物中，至第56天幾乎完全阻斷IgG抗-KLH抗體的生成。

在異源胰島移植的獼猴模型中2C10顯著延長胰島異源移植物存活

我們在非人靈長類動物異源胰島移植模型中進一步測試2C10R4(CD4純化的嵌合獼猴IgG4抗體)(圖10)。體重為10-20 kg的獼猴進行供體胰腺切除術(shù)，一天后經(jīng)由中線剖腹術(shù)進行移植。在動物末端放血后分離胰腺并置于冰上。使用膠原酶/中性蛋白酶(分別為950個Wunsch單位和63個單位；Serva, Heidelberg, Germany)進行胰島分離。消化的胰腺在四層不連續(xù)Euroficoll梯度(Mediatech, Manassas, VA)和Cobe 2991血細(xì)胞處理器(CaridianBCT, Lakewood, CO)上進行純化。對最終胰島制劑的樣品進行計數(shù)，并表示為胰島當(dāng)量(IEQ)。分離的胰島培養(yǎng)過夜，計數(shù)，并懸浮在移植培養(yǎng)基(Mediatech)中。

使用鏈脲佐霉素(1250 mg/m² IV; Zanosar, Teva Parenteral Medicines, Irvine, CA)使體重為3-5 kg的獼猴患有糖尿病，四周后進行移植。通過用靜脈推注500 mg/kg葡萄糖的靜脈內(nèi)葡萄糖耐量試驗(IVGTT)和測量靈長類C-肽驗證糖尿病。在基線和葡萄糖注射后10、30、60 和90監(jiān)測葡萄糖水平并測量C-肽。通過在可檢測的血清C-肽不存在的情況下測量血糖水平的升高而確認(rèn)糖尿病。糖尿病受體經(jīng)受MHC錯配的胰島異源移植。經(jīng)由小中線剖腹術(shù)和腸系膜靜脈插管輸注平均15,745 (± 4,063) IEQ。

通過耳棒(earstick)每天兩次測量血糖水平；施用NPH (Novolin; Novo Nordisk, Princeton, NJ)和甘精胰島素(Lantus; Sanofi-Aventis, Bridgewater, NJ)，以便在移植前和移植物排斥之后維持低于300 mg/dL 的空腹血糖(FBG)。IVGTT在移植后定期進行，以監(jiān)測移植物功能。移植受體每周進行流式細(xì)胞術(shù)分析，以監(jiān)測T細(xì)胞(CD3 V450, CD4 PerCP-Cy5.5, CD8 PerCp; BD Bioscience)和B細(xì)胞(CD20 PE, BD Bioscience)群體。胰島移植后，排斥被定義為在連續(xù)兩天FBG大于130 mg/dL。主要終點為無排斥的胰島移植物存活。根據(jù)Emory University IACUC和Guide for the Care and Use of Laboratory Animals處理這些實驗中使用的所有動物。

移植受體接受2C10R4、巴利昔單抗(basiliximab)(Simulect, Novartis, Basel, Switzerland)和西羅莫司(sirolimus)，或單獨的巴利昔單抗和西羅莫司。在手術(shù)后第0天和第7天(POD)靜脈內(nèi)施用2C10R4 (50 mg/kg)。在POD 0和3靜脈內(nèi)施用巴利昔單抗(0.3 mg/kg)。每天肌內(nèi)施用西羅莫司，以實現(xiàn)至POD 120 5-15 ng/ml的谷底水平。接受單獨的巴利昔單抗和西羅莫司的所有三只動物是歷史對照(Badell等人, J. Clin. Invest. 120:4520-312, 2010)。這些歷史對照中的兩只(RQz6和RIb7)經(jīng)歷通過胰腺切除術(shù)而誘導(dǎo)糖尿病，并且口服接受西羅莫司。

與僅接受巴利昔單抗誘導(dǎo)和西羅莫司維持治療的對照(圖11B)相比，用上述方案處理導(dǎo)致顯著延長胰島移植物存活(圖11A)。對于接受2C10R4的動物，無排斥的移植物存活時間中值為280天，與之相比，對照動物為8天(p=0.010, 表1)。藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)預(yù)測到POD 100血漿2C10R4水平將小于1 μg/ml。因為在POD120停止西羅莫司，具有最長存活(304天)的受體在排斥之前約24周沒有接受免疫抑制。用2C10R4處理的動物都沒有發(fā)生臨床相關(guān)的感染并發(fā)癥或體重減輕。這些結(jié)果反映了接受2C10的IgG4同種型的動物。接受2C10的IgG1同種型(2C10R1)連同巴利昔單抗和西羅莫司的兩只額外動物類似地實現(xiàn)了220天和162天的延長移植物存活(數(shù)據(jù)未顯示)。鑒于使用用作誘導(dǎo)治療的2C10的陽性結(jié)果，下一步是評價施用2C10作為維持治療對移植物存活的影響。

表 1

CD40/CD154途徑連同CD28/B7途徑的阻斷

CD40/CD154途徑的阻斷連同其他共刺激阻斷劑證明是有用的。已經(jīng)顯示貝拉西普(設(shè)計用于阻斷CD28/B7共刺激途徑的CTLA4-Ig的高親和力形式)在腎和胰島移植的非人靈長類動物模型中和在腎移植的II期和III期臨床試驗中的效力(Larsen等人, Transplantation 90:1528-35, 2010, Vincenti等人, Am. J. Transplant. 10:535-46, 2010, Adams等人, J. Immunol. 174:542-50, 2005, Adams等人, Diabetes 51:265-70, 2002, Larsen等人, Am. J. Transplant. 5:443-53, 2005, Vincenti等人, N. Engl. J. Med. 358:770-81, 2005)。BENEFIT試驗揭示用貝拉西普治療的患者的優(yōu)異腎功能；然而，這些患者具有活檢證明的急性排斥的較高發(fā)生率和更嚴(yán)重級別(Larsen等人, Transplantation 90:1528-35, 2010, Vincenti等人. Am. J. Transplant. 10:535-46, 2010)。鑒于CD40和B7阻斷之間的急性排斥和協(xié)同的這種增加比率(Larsen等人, Nature381:434-8, 1996)，我們接下來想試驗組合的2C10和貝拉西普治療在非人靈長類動物腎移植中的效力。

表位作圖

用于鑒定抗體結(jié)合的具體表位的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括肽掃描，其中單獨測試源自抗體結(jié)合的全長蛋白的重疊短肽(例如，10-30個氨基酸，例如，20個氨基酸長度)結(jié)合抗體的能力。然后從這種實驗可以被確定該抗體結(jié)合的蛋白的區(qū)域。

位點定向誘變也可以用來鑒定特定蛋白的一個或多個抗原性區(qū)域。在該方法中，將點突變系統(tǒng)引入目標(biāo)多肽，并且抗體結(jié)合在不同位置具有突變的肽的能力用來確定該蛋白的特定區(qū)域是否含有該抗體結(jié)合的表位。

還可以使用高通量誘變技術(shù)諸如鳥槍誘變(Integral Molecular, Inc., Philadelphia, Pa.)(其可以用來在目標(biāo)蛋白內(nèi)生成大量突變)鑒定抗體表位。這種方法允許有效鑒定蛋白內(nèi)的表位。

為了確定針對CD40的各種抗體是否結(jié)合類似表位，進行體外競爭阻斷測定。在該測定中使用抗體2C10、3A8和Chi220(嵌合的IgG1 CD40特異性抗體)。使用Lightning Link抗體標(biāo)記試劑盒(Novus Biologics, Littleton, CO)將2C10綴合至別藻藍蛋白(APC)。人PBMC與漸增濃度的2C10、3A8或Chi220孵育，然后用APT-綴合的2C10染色，以評價各抗體交叉阻斷2C10的能力。如圖12中顯示，APC-綴合的2C10的結(jié)合隨著2C10但非Chi220或3A8的濃度漸增而降低。結(jié)果表明，2C10結(jié)合不同于Chi220或3A8的獨特表位。

額外抗體的生成

可以，例如，使用本領(lǐng)域已知的制備抗體的任何多種方法制備針對2C10識別的CD40表位的額外抗體(例如，單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體或單特異性抗體)。在一個實例中，將2C10抗體識別的表位的編碼序列表達為與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST) (Smith等人, Gene 67:31-40, 1988)的C-末端融合體。融合蛋白在谷胱苷肽-瓊脂糖珠粒上純化，用谷胱甘肽洗脫，用凝血酶(在工程改造的切割位點)切割，并且純化用于免疫兔。初始免疫使用弗氏完全佐劑來實施，隨后免疫用弗氏不完全佐劑實施。使用凝血酶切割的GST融合蛋白的蛋白片段通過Western印跡和免疫沉淀分析監(jiān)測抗體滴度。免疫血清使用CNBr-瓊脂糖偶聯(lián)的蛋白進行親和純化?？寡逄禺愋钥梢允褂靡唤M無關(guān)GST蛋白進行確定。

作為GST融合蛋白的替代或輔助免疫原，可以生成對應(yīng)于本發(fā)明多肽的相對獨特免疫原性區(qū)域的肽，并且通過引入C-末端賴氨酸偶聯(lián)至鑰孔血藍蛋白(KLH)。每個這些肽的抗血清在綴合至BSA的肽上類似地親和純化，并且通過使用肽綴合物的ELISA或Western印跡分析，或者通過使用表達為GST融合蛋白的多肽的Western印跡或免疫沉淀測試特異性。

或者，可以使用標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤技術(shù)制備特異性結(jié)合被2C10抗體識別的CD40表位的單克隆抗體(參見，例如，Kohler等人, Nature 256:495-7, 1975; Kohler等人, Eur. J. Immunol. 6:511-9, 1976; Kohler等人, Eur. J. Immunol. 6:292-5, 1976; Hammerling 等人, Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, NY, 1981)。一旦產(chǎn)生，也可以通過Western印跡或免疫沉淀分析測試單克隆抗體的特異性識別。或者，可以使用上述本發(fā)明的多肽和噬菌體展示文庫(Vaughan等人, Nat. Biotechnol.14:309-14, 1996)制備單克隆抗體。

可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如，使用PCR和將片段克隆進入pGEX表達載體而生成表位片段。融合蛋白在大腸桿菌中表達并且使用谷胱甘肽瓊脂糖親和基質(zhì)進行純化。為了盡量減少抗血清的低親和力或特異性的潛在問題，對于每種蛋白生成兩種或三種這樣的融合體，并且將每種融合體注入至少兩只兔。通過一系列注射產(chǎn)生抗血清，并且可以包括，例如，至少三次加強注射。

為了大規(guī)模低成本生成多克隆抗體，可以選擇適當(dāng)?shù)膭游镂锓N?？梢詮?，例如，經(jīng)免疫奶牛的牛奶或初乳中分離多克隆抗體。牛初乳含有28 g IgG/每升，而牛奶含有1.5 g IgG /每升(Ontsouka等人 J. Dairy Sci.86:2005-11, 2003)。多克隆抗體也可以從經(jīng)免疫雞的雞蛋的蛋黃中分離(Sarker等人, J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 32:19-25, 2001)。

多種佐劑批準(zhǔn)用于奶牛。本發(fā)明中可用的佐劑包括，但不限于，Emulsigen^?(水包油型乳化佐劑)，Emulsigen^?-D(具有DDA免疫刺激劑的水包油型乳化佐劑)，Emulsigen^?-P(具有共聚物免疫刺激劑的水包油型乳化佐劑)，Emulsigen^?-BCL(具有嵌段共聚物免疫刺激劑的水包油型乳化佐劑)，Carbigen^TM(卡波姆基質(zhì))和Polygen^TM(共聚物基質(zhì))。所有列出的佐劑由Omaha, Nebr的MVP Laboratories商售。

可用的抗體可以在幾種不同的篩選測定中鑒定。首先，通過ELISA測定抗體，以確定它們對于免疫抗原(即，本文所述的CD40表位)是否是特異性的。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，ELISA板用免疫原包被，將抗體添加至板，洗滌，和通過使用對生成該抗體的物種的Ig特異性的二抗檢測結(jié)合抗體的存在。

功能性體外測定可用于篩選抗體，例如，基于單核細(xì)胞衍生的樹突狀細(xì)胞的中和測定。

人受試者的illeal體液中牛免疫球蛋白的直接測量已經(jīng)顯示，顯著量的免疫球蛋白在轉(zhuǎn)移通過胃和小腸后仍然有活性(Warny等人, Gut 44:212-7, 1999)。也已經(jīng)描述了配制用于GI遞送的禽免疫球蛋白(IgY)的方法(Kovacs-Nolan等人, Immunol.Methods296:199-209, 2005)。

人源化抗體

本發(fā)明包括人源化抗體。用于使非人抗體人源化的各種方法是本領(lǐng)域已知的。例如，人源化抗體可具有從非人來源引入其中的一個或更多氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基經(jīng)常稱為“輸入”殘基，其通常取自“輸入”可變結(jié)構(gòu)域?？苫靖鶕?jù)Winter及其同事(Jones等人，Nature 321:522-5, 1986; Riechmann等人，Nature 332:323-7, 1988; Verhoeyen 等人，Science 239:1534-6, 1988)的方法，通過將高變區(qū)序列替換為人抗體的相應(yīng)序列來進行人源化。因此，此類“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利號4,816,567)，其中基本上少于完整人可變結(jié)構(gòu)域已經(jīng)被替換成非人物種的相應(yīng)序列。實際上，人源化抗體通常是人抗體，其中至少一些高變區(qū)殘基以及其他可變區(qū)殘基替換為嚙齒類抗體中類似位點的殘基。

選擇待用于制備人源化抗體中的人輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域?qū)档涂乖允侵匾?。根?jù)所謂的“最佳擬合”方法，針對已知人可變結(jié)構(gòu)域序列的整個文庫篩選嚙齒類抗體可變結(jié)構(gòu)域的序列。然后接受與嚙齒類序列最接近的人序列作為用于人源化抗體的人構(gòu)架。參見例如，Sims等人, J. Immunol. 151:2296-308, 1993; Chothia等人, J. Mol. Biol. 196:901-17, 1987。另一種方法使用特定的構(gòu)架，其來自輕鏈或重鏈特定亞群的所有人抗體的共有序列。相同的構(gòu)架可用于幾種不同的人源化抗體。參見例如，Carter等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-9, 1992; Presta等人, J. Immunol. 151:2623-32, 1993。

通常進一步希望，抗體進行人源化，以保留對抗原的高親和力和其他有利的生物學(xué)特性。為了實現(xiàn)該目標(biāo)，根據(jù)一種方法，通過分析親本序列和多種概念上的人源化產(chǎn)物的過程，使用親本和人源化序列的三維模型制備人源化抗體。通?？色@得三維免疫球蛋白模型，并且其為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉。可獲得計算機程序，其闡明并展示所選的候選免疫球蛋白序列的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)。檢查這些顯示允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即，分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原能力的殘基。這樣，可從受體和輸入序列中選擇并組合FR殘基，從而實現(xiàn)所需抗體特征，諸如對目標(biāo)抗原提高的親和力。通常，高變區(qū)殘基直接并最實質(zhì)地參與影響抗原結(jié)合。

人抗體

本發(fā)明的人抗體可以通過將從源自人的噬菌體展示文庫選擇的Fv克隆可變結(jié)構(gòu)域序列與已知人恒定結(jié)構(gòu)域序列組合而構(gòu)建(Hoogenboom等人, J. Mol. Biol. 227:381-8, 1992; Marks等人, J. Mol. Biol. 222:581-97, 1991)。或者，本發(fā)明的人單克隆抗體可以通過雜交瘤方法制備。用于產(chǎn)生人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系已經(jīng)描述于，例如，Kozbor, J. Immunol. 133:3001-5, 1984; Brodeur等人, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 和Boerner等人, J. Immunol. 147:86-95, 1991。

目前可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物(例如，小鼠)，其在免疫后能夠在沒有內(nèi)源免疫球蛋白產(chǎn)生的情況下產(chǎn)生人抗體的全部所有組成成分。例如，已經(jīng)描述了嵌合和種系突變體小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合缺失導(dǎo)致內(nèi)源抗體產(chǎn)生的完全抑制。該種系突變體小鼠中人種系免疫球蛋白基因排列的轉(zhuǎn)移將導(dǎo)致在抗原攻擊后產(chǎn)生人抗體。參見例如，Jakobovits等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-5, 1993; Jakobovits等人, Nature 362:255-8, 1993; Brüggemann 等人, Year Immunol. 7:33-40, 1993。

基因改組也可用于從非人抗體(例如，嚙齒動物抗體)衍生人抗體，其中所述人抗體具有與初始非人抗體相似的親和力和特異性。根據(jù)該方法(也稱為“表位印跡(epitope imprinting)”)，如本文所述通過噬菌體展示技術(shù)獲得的非人抗體片段的重鏈或輕鏈可變區(qū)被人V結(jié)構(gòu)域基因的所有組成成分所替代，生成非人鏈/人鏈scFv或Fab嵌合體的群體。用抗原選擇導(dǎo)致分離非人鏈/人鏈嵌合scFv或Fab，其中人鏈保留了在初始噬菌體展示克隆中對應(yīng)的非人鏈去除后破壞的抗原結(jié)合位點，即，表位控制(印跡)了人鏈伴侶的選擇。當(dāng)重復(fù)該過程以替代剩余的非人鏈時，獲得人抗體(參見PCT公開WO 93/06213)。不同于通過CDR嫁接常規(guī)人源化非人抗體，該技術(shù)提供了完全人抗體，其不具有非人來源的FR或CDR殘基。

抗體片段

本發(fā)明的特征還在于包含完整抗體的部分，優(yōu)選包含其抗原結(jié)合區(qū)的抗體片段。抗體片段的實例包括Fab、Fab’、F(ab’)₂和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗性。

抗體的木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生兩個相同的抗原結(jié)合片段，稱為“Fab”片段(每一個片段具有單個抗原結(jié)合位點)和殘留“Fc”片段，其名稱反映了其容易結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生具有兩個抗原組合位點并仍然能夠交聯(lián)抗原的F(ab’)₂片段。

Fv是最小抗體片段，其含有完整的抗原結(jié)合位點。在一個實施方案中，雙鏈Fv種類由緊密非共價結(jié)合的一個重鏈可變結(jié)構(gòu)域和一個輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的二聚體組成。在單鏈Fv(scFv)種類中，一個重鏈可變結(jié)構(gòu)域和一個輕鏈可變結(jié)構(gòu)域可由柔性的肽接頭共價連接，從而輕鏈和重鏈可以與雙鏈Fv種類類似的“二聚體”結(jié)構(gòu)連接。其為這樣的構(gòu)型，其中每一可變結(jié)構(gòu)域的三個高變區(qū)(HVRs)相互作用，以定義VH-VL二聚體表面上的抗原結(jié)合位點?？偣玻鶄€HVRs賦予抗體的抗原結(jié)合特異性。然而，盡管比完整結(jié)合位點的親和力低，但甚至單個可變結(jié)構(gòu)域(或Fv的一半，其僅包含對抗原特異的三個HVRs)也具有識別并結(jié)合抗原的能力。

Fab片段含有重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，并且還含有輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(CH1)。Fab’片段因在重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基末端加入了一些殘基(包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸)而不同于Fab片段。Fab’-SH本文中是指其中恒定結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基攜帶游離的巰基的Fab’。F(ab’)₂抗體片段最初產(chǎn)生為Fab’片段對，其在它們之間具有鉸鏈半胱氨酸。抗體片段的其他化學(xué)偶聯(lián)也是已知的。

單鏈Fv或scFv抗體片段包含抗體的V_H和V_L結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單條多肽鏈中。通常，scFv多肽在V_H和V_L結(jié)構(gòu)域之間還包含多肽接頭，其使得scFv能夠形成所需結(jié)構(gòu)用于抗原結(jié)合。對于scFv的綜述，參見例如，Pluckthün, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg和Moore編輯，(Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315。

雙抗體是具有兩個抗原結(jié)合位點的抗體片段，所述片段包含連接同一多肽鏈(V_H-V_L)中輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(V_L)的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(V_H)。通過使用太短以至于不能允許同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域配對的接頭，結(jié)構(gòu)域被迫與另一條鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對，并產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點。雙抗體可以是二價或多特異性的。例如在歐洲專利號404,097；PCT專利號WO 1993/01161；Hudson等人，Nat. Med. 9:129-34, 2003；和Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-8, 1993中更詳細(xì)描述了雙抗體。也在Hudson等人，Nat. Med. 9:129-34, 2003中描述了三抗體和四抗體。

抗體片段可以通過傳統(tǒng)方式，諸如酶消化，或通過重組技術(shù)來生成。在某些情況下，使用抗體片段而非整個抗體具有優(yōu)點。大小較小的片段可以快速清除，并且可以導(dǎo)致改進對實體瘤的接近。對于某些抗體片段的綜述，參見Hudson等人 Nat. Med. 9:129-134, 2003。

已經(jīng)開發(fā)了多種技術(shù)用于產(chǎn)生抗體片段。通常，這些片段通過完整抗體的蛋白水解消化得到(參見例如，Morimoto等人, J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-17, 1992; 和Brennan 等人, Science 229:81-3, 1985)。然而，現(xiàn)在可通過重組宿主細(xì)胞直接產(chǎn)生這些片段。Fab、Fv和ScFv抗體片段都可以在大腸桿菌中表達并分泌，從而允許易于產(chǎn)生大量這些片段?？贵w片段可以從抗體噬菌體文庫中分離?；蛘?，可以從大腸桿菌中直接回收Fab’-SH片段，并經(jīng)化學(xué)偶聯(lián)形成F(ab’)₂片段(Carter 等人, Bio/Technology 10:163-7, 1992)。在另一種方法中，直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中分離F(ab′)₂片段。包含拯救受體結(jié)合表位殘基的具有增強的體內(nèi)半衰期的Fab和F(ab’)₂片段描述于美國專利號5,869,046。用于產(chǎn)生抗體片段的其他技術(shù)對于技術(shù)人員將是顯而易見的。

藥物組合物

本發(fā)明提供含有與藥學(xué)可接受的載體配制在一起的本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分的組合物，例如藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物還可以在組合療法中施用，即與其他藥劑(例如，免疫抑制劑)組合。本文使用的“藥學(xué)可接受的載體”包括生理相容的任何及所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。優(yōu)選地，所述載體適用于靜脈內(nèi)、鞘內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、胃腸外、脊柱或表皮施用(如通過注射或輸注)。取決于施用途徑，可將本發(fā)明的抗體包衣在一定材料中，以保護化合物免受可能使該化合物失活的酸和其他天然條件的作用。

本發(fā)明的組合物可以通過本領(lǐng)域已知的各種方法進行施用。如技術(shù)人員將理解的，使用途徑和/或模式將根據(jù)所需結(jié)果而不同。施用可以是腸胃外、靜脈內(nèi)、鞘內(nèi)、皮下、口服、外用、或局部的，例如，通過直接注射到腦脊液中。通過連續(xù)輸注的靜脈內(nèi)遞送是用于施用本發(fā)明的治療性抗體的一種示例性方法。治療性化合物可以是溶液、懸浮液、乳狀液、輸注裝置、或用于植入的遞送裝置的形式，或者它可以作為在使用前用水或另一種合適媒介物重構(gòu)的干粉提供。組合物可以是丸劑、片劑、膠囊、液體、或用于口服施用的緩釋片劑；或用于靜脈內(nèi)、鞘內(nèi)、皮下或腸胃外施用的液體；或用于局部施用的聚合物或其他緩釋媒介物的形式。

本領(lǐng)域中眾所周知的制備制劑方法可見，例如“Remington: The Science and Practice of Pharmacy” (20th ed., ed. A.R. Gennaro AR., 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA)。用于腸胃外施用的制劑可以，例如，含有賦形劑、無菌水、鹽水、聚亞烷基二醇諸如聚乙二醇、植物來源的油或氫化萘?？梢允褂蒙锵嗳莸?、可生物降解的丙交酯聚合物，丙交酯/乙交酯共聚物，或聚氧乙烯 - 聚氧丙烯共聚物來控制化合物的釋放。納米顆粒制劑(例如，可生物降解的納米顆粒、固體脂質(zhì)納米顆粒、脂質(zhì)體)可用于控制化合物的生物分布。其他可能有用的遞送系統(tǒng)包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物顆粒、滲透泵、鞘內(nèi)泵、可植入的輸注系統(tǒng)和脂質(zhì)體。制劑中化合物的濃度根據(jù)一些因素包括待施用的藥物劑量和施用途徑而變化。

為了通過某些施用途徑施用本發(fā)明的化合物，可能必須用一定材料包衣化合物或與化合物共施用，以防止其失活。例如，化合物可在適當(dāng)?shù)妮d體如脂質(zhì)體或稀釋劑中施用于受試者。藥學(xué)可接受的稀釋劑包括鹽水和水性緩沖溶液。脂質(zhì)體包括水包油包水CGF乳劑以及常規(guī)脂質(zhì)體(Strejan等人, J. Neuroimmunol. 7:27-41, 1984)。藥學(xué)可接受的載體包括無菌水溶液或分散劑以及用于在臨用時制備無菌注射溶液或分散劑的無菌粉劑。這些介質(zhì)和試劑用于藥物活性物質(zhì)的用途為本領(lǐng)域已知的并且包括在本發(fā)明中，除非其中任何常規(guī)介質(zhì)或藥劑與活性化合物不相容。補充性活性化合物也可摻入該組合物中。

治療性組合物通常在生產(chǎn)和貯藏條件下必須是無菌和穩(wěn)定的。該組合物可配制成溶液、微乳劑、脂質(zhì)體或其他適用于高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其適當(dāng)?shù)幕旌衔锏娜軇┗蚍稚⒔橘|(zhì)?？梢岳缤ㄟ^使用包衣(諸如卵磷脂)、通過維持所需微粒大小(對于分散劑的情況)以及通過使用表面活性劑來維持適當(dāng)?shù)牧鲃有?。在許多情況下，組合物中優(yōu)選包含等滲劑，例如糖、多元醇諸如甘露醇、山梨醇或者氯化鈉?？梢酝ㄟ^在組合物中包含延緩吸收的試劑(例如單硬脂酸鹽和明膠)來引起注射用組合物的延長吸收。

無菌注射溶液可通過以所需量將活性化合物與所需上述成分中的一種或組合一起摻入適當(dāng)?shù)娜軇╇S后進行無菌微過濾來制備。通常，通過將活性化合物摻入無菌媒介物來制備分散劑，所述無菌媒介物含有堿性分散介質(zhì)和來自上述那些的其他所需成分。對于用于制備無菌注射溶液的無菌粉劑的情況，優(yōu)選的制備方法為真空干燥和冷凍干燥(凍干)，所述方法從之前已無菌過濾的溶液中獲得活性成分加任何額外所期望成分的粉末。對劑量方案進行調(diào)整以提供最佳的期望應(yīng)答(例如，治療應(yīng)答)。例如，可以進行單次推注，隨時間施用幾個分開的劑量，或者可以根據(jù)治療情況的緊急程度，按比例降低或提高劑量。例如，可以通過皮下注射每周一次或兩次，或者通過皮下注射每個月一次或兩次施用本發(fā)明的抗體。

特別有利的是將腸胃外組合物配制成劑量單位形式，以便于施用和實現(xiàn)劑量的均一性。本文使用的劑量單位形式指適于作為待治療受試者的單位劑量的物理分開的單位；每個單位含有與所需藥用載體相關(guān)聯(lián)的預(yù)定量的活性化合物，所述預(yù)定量為經(jīng)計算產(chǎn)生所需療效的量。本發(fā)明劑量單位形式的規(guī)格由以下因素決定，并直接取決于以下因素：(a)活性化合物的獨特特征和待實現(xiàn)的具體療效，和(b)調(diào)配用于治療個體中敏感性狀況的這些活性化合物的領(lǐng)域中的內(nèi)在限制。

本文使用的術(shù)語“腸胃外施用”和“腸胃外施用”指除了腸內(nèi)和局部施用以外的施用模式，通常是通過注射，包括但不僅限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、椎管內(nèi)、硬膜外、胸骨內(nèi)注射和輸注?？捎糜诒景l(fā)明藥物組合物的適當(dāng)水性和非水性載體的實例包括水、乙醇、多元醇(諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其適當(dāng)?shù)幕旌衔铩⒅参镉?諸如橄欖油)以及注射用有機酯(諸如油酸乙酯)?？赏ㄟ^例如使用包衣材料(諸如卵磷脂)、通過維持所需微粒大小(對于分散劑的情況)以及通過使用表面活性劑來維持適當(dāng)?shù)牧鲃有浴?/p>

本發(fā)明的組合物還可含有輔劑，諸如防腐劑、濕潤劑、乳化劑和分散劑。通過滅菌程序和通過包含多種抗菌劑和抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)均可保證防止存在微生物。還可以期望在組合物中包含等滲劑，諸如糖、氯化鈉等。此外，可以通過包含延緩吸收的藥劑(諸如單硬脂酸鋁和明膠)來實現(xiàn)注射用藥物形式的延長吸收。

當(dāng)本發(fā)明的化合物作為藥物施用于人和動物時，它們可單獨給予或作為藥物組合物給予，所述藥物組合物包含例如0.001％至90％(更優(yōu)選0.005至70%，諸如0.01至30%)的活性成分與藥學(xué)可接受的載體的組合。

對于靜脈或鞘內(nèi)遞送或直接注射，所述組合物必須無菌，并且其流動性達到組合物可通過注射器遞送的程度。除了水以外，載體還可以是等滲緩沖的鹽水溶液、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其適當(dāng)?shù)幕旌衔铩？梢岳缤ㄟ^使用包衣(諸如卵磷脂)、通過維持所需微粒大小(對于分散劑的情況)和通過使用表面活性劑來維持適當(dāng)?shù)牧鲃有?。在許多情況下，優(yōu)選在組合物中包含等滲劑，例如糖、多元醇諸如甘露醇或山梨醇以及氯化鈉。可通過在組合物中包含延緩吸收的藥劑(諸如單硬脂酸鋁或明膠)來實現(xiàn)注射用組合物的長期吸收。

無論選擇什么施用途徑，可以適當(dāng)水化形式使用的本發(fā)明化合物，和/或本發(fā)明的藥物組合物均通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法配制成藥學(xué)可接受的劑型。可以改變本發(fā)明藥物組合物中活性成分的確切劑量水平，從而獲得對具體的患者、組合物和施用模式有效實現(xiàn)理想的治療應(yīng)答而又對患者無毒的活性成分量。所選擇的劑量水平將取決于多種藥代動力學(xué)因素，包括具體使用的本發(fā)明組合物、或其酯、鹽或酰胺的活性、施用途徑、施用時間、具體使用的化合物的排泄速率、治療持續(xù)時間、與具體使用的組合物組合使用的其他藥物、化合物和/或材料、受治患者的年齡、性別、體重、狀況、總體健康和之前的病史以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域眾所周知的類似因素。本領(lǐng)域普通醫(yī)師或獸醫(yī)能夠容易地確定所需藥物組合物的有效量并開出處方。例如，醫(yī)師或獸醫(yī)可從低于獲得理想療效所需劑量的水平開始給予藥物組合物中所用本發(fā)明化合物的劑量，并逐漸提高劑量直至實現(xiàn)理想的療效。通常，適當(dāng)?shù)谋景l(fā)明組合物的每日劑量將是有效產(chǎn)生療效的最低劑量的化合物量。這樣的有效劑量一般將取決于上述因素。必要時，治療組合物的有效日劑量可以以2、3、4、5、6或更多的小劑量以適當(dāng)?shù)拈g隔在一天中分開施用，任選地以單位劑量形式施用。盡管有可能單獨施用本發(fā)明化合物，但優(yōu)選將化合物作為藥物制劑(組合物)施用。

可以用本領(lǐng)域中已知的醫(yī)療設(shè)備施用治療性組合物?？捎糜诒景l(fā)明中的眾所周知的植入物、遞送系統(tǒng)和模塊的實例是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。

狀況和病癥

本文所述的抗體和抗體片段可用于其中期望免疫抑制的任何情況(例如，移植排斥或自身免疫性病癥)。這些抗體尤其可用于治療移植排斥，例如，降低特定移植被宿主排斥的可能性，或增加排斥發(fā)生之前的時間。本文所述的抗體可以與適合用于移植的任何器官或任何組織的移植組合使用。示例性的器官包括心臟、腎臟、肺、肝、胰腺、小腸和胸腺；示例性的組織包括骨、肌腱、角膜、皮膚、心臟瓣膜、靜脈和骨髓。

抗體和抗體片段也可用于治療自身免疫性病癥，特別是其中自身抗體牽涉于疾病的發(fā)病機制中的病癥。與或可以與自身抗體產(chǎn)生相關(guān)的自身免疫性病癥包括全身性紅斑狼瘡(SLE)、CREST綜合癥(鈣質(zhì)沉著、雷諾氏綜合癥、食道運動功能障礙、指端硬化(sclerodactyl)、和毛細(xì)血管擴張)、斜視眼陣攣、炎性肌病(例如，多肌炎、皮肌炎和包涵體肌炎)、全身性硬皮病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、乳糜瀉(例如，谷蛋白敏感腸病)、皰疹樣皮炎、Miller-Fisher綜合癥、急性運動性軸索神經(jīng)病(AMAN)、具有傳導(dǎo)阻滯的多灶性運動神經(jīng)病、自身免疫性肝炎、抗磷脂綜合癥、Wegener氏肉芽腫、顯微多血管炎、Churg-Strauss綜合癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、慢性自身免疫性肝炎、硬化性肌炎、重癥肌無力、Lambert–Eaton肌無力綜合癥、橋本氏甲狀腺炎、Graves氏病、副腫瘤性小腦變性、僵人綜合癥、邊緣性腦炎、Isaacs綜合癥、Sydenham氏舞蹈病、與鏈球菌相關(guān)的小兒自身免疫性神經(jīng)精神疾病(PANDAS)、 腦炎、1型糖尿病和視神經(jīng)脊髓炎。

其他自身免疫性病癥包括惡性貧血、Addison氏病、牛皮癬、炎性腸病、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、Sj?gren氏綜合癥、紅斑狼瘡(例如，盤狀紅斑狼瘡、藥物誘導(dǎo)的紅斑狼瘡和新生兒紅斑狼瘡)、多發(fā)性硬化癥和反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎。

可以使用本發(fā)明的方法治療的額外病癥包括，例如，多肌炎、皮肌炎、多發(fā)性內(nèi)分泌衰竭、Schmidt氏綜合癥、自身免疫性眼色素層炎、腎上腺炎、甲狀腺炎、自身免疫性甲狀腺疾病、胃萎縮、慢性肝炎、狼瘡狀肝炎、動脈粥樣硬化、早老性癡呆癥、脫髓鞘疾病、亞急性皮膚型紅斑狼瘡、甲狀旁腺功能減退、Dressler氏綜合癥、自身免疫性血小板減少癥、特發(fā)性血小板減少性紫癜、溶血性貧血、尋常型天皰瘡、天皰瘡、斑禿(alopecia arcata)、類天皰瘡、硬皮病、進行性全身性硬化癥、成人發(fā)病型糖尿病(例如，II型糖尿病)、男性和女性自身免疫性不育、強直性脊椎炎、潰瘍性結(jié)腸炎、Crohn氏病、混合性結(jié)締組織病、結(jié)節(jié)性多動脈炎、全身性壞死性血管炎、少年發(fā)病性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、腎小球腎炎、特應(yīng)性皮炎、特應(yīng)性鼻炎、Goodpasture氏綜合癥、Chagas氏綜合癥、肉狀瘤病、風(fēng)濕熱、哮喘、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、抗磷脂綜合癥、farmer氏肺、多形性紅斑、心切開后綜合癥、Cushing氏綜合癥、自身免疫性慢性活躍肝炎、bird-fancier氏肺、過敏性疾病、過敏性腦脊髓炎、中毒性表皮壞死松解癥、禿頭癥、Alport氏綜合癥、肺泡炎、過敏性肺泡炎、纖維化性肺泡炎、間質(zhì)性肺疾病、結(jié)節(jié)性紅斑、壞疽性膿皮病、輸血反應(yīng)、麻風(fēng)病、瘧疾、利什曼病、錐蟲病、高安氏動脈炎、風(fēng)濕性多肌痛、顳動脈炎、血吸蟲病、巨細(xì)胞動脈炎、蛔蟲病、曲霉病、 Sampter氏綜合癥、濕疹、淋巴瘤樣肉芽腫、Behcet氏病、Caplan氏綜合癥、川崎氏病、登革熱、心內(nèi)膜炎、心內(nèi)膜纖維化、眼內(nèi)炎、持久性隆起性紅斑(erythema elevatum et diutinum)、胎兒紅細(xì)胞增多癥、嗜酸性筋膜炎、Shulman氏綜合癥、Felty氏綜合癥、絲蟲病、睫狀體炎、慢性睫狀體炎、異時睫狀體炎、 Fuch氏睫狀體炎、IgA腎病、Henoch-Schonlein紫癜、移植物抗宿主病、移植排斥、人免疫缺陷病毒感染、?？刹《靖腥?、心肌病、阿爾茨海默氏病、細(xì)小病毒感染、風(fēng)疹病毒感染、接種疫苗后綜合癥、先天性風(fēng)疹感染、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、腎細(xì)胞癌、多發(fā)性骨髓瘤、Eaton-Lambert綜合癥、復(fù)發(fā)性多軟骨炎、惡性黑色素瘤、冷球蛋白血癥、Waldenstrom氏巨球蛋白血癥、Epstein-Barr病毒感染、腮腺炎、Evan氏綜合癥和自身免疫性性腺衰竭。

免疫抑制劑

本文所述的抗體和抗體片段可以與免疫抑制劑組合配制或施用。免疫抑制劑的實例包括，但不限于，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑(例如，環(huán)孢素A(Sandimmune^?)、環(huán)孢素G他克莫司(Prograf^?、Protopic^?))、mTor抑制劑(例如，西羅莫司(Rapamune^?、Neoral^?)、替西羅莫司(Torisel^?)、佐他莫司和依維莫司(Certican^?))、芬戈莫德(Gilenya?)、多球殼菌素、阿侖單抗(Campath^?、MabCampath^?、Campath-1H^?)、利妥昔單抗(Rituxan^?、MabThera^?)、抗CD4單克隆抗體(例如，HuMax-CD4)、抗LFA1單克隆抗體(例如，CD11a)、抗LFA3單克抗體、抗CD45抗體(例如，抗CD45RB抗體)、抗CD19抗體(參見，例如，美國專利公開2006/0280738)、monabatacept(Orencia^?)、 貝拉西普(belatacept)、吲哚基-ASC (他克莫司和子囊霉素的32-吲哚醚衍生物)、硫唑嘌呤(Azasan^?、Imuran^?)、淋巴細(xì)胞免疫球蛋白和抗胸腺細(xì)胞球蛋白[馬] (Atgam^?)、嗎替麥考酚酯(Cellcept^?)、麥考酚鈉(myfortic^?)、達利珠單抗(Zenapax^?)、巴利昔單抗(Simulect^?)、環(huán)磷酰胺(Endoxan^?、Cytoxan^?、Neosar?、Procytox?、Revimmune?)、潑尼松、潑尼松龍、來氟米特(Arava^?)、FK778、FK779、 15-脫氧精胍菌素(DSG)、白消安(Myleran^?、Busulfex^?)、氟達拉濱(Fludara^?)、甲氨蝶呤(Rheumatrex^?、Trexall^?)、6-巰基嘌呤(Purinethol^?)、15-脫氧精胍菌素(Gusperimus)、LF15-0195、布雷青霉素、布喹那和莫羅單抗-CD3 (Orthoclone^?)。

用于評估藥劑的免疫抑制活性的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，在有和沒有藥理學(xué)干預(yù)下移植器官在體內(nèi)的存活時間長度可充當(dāng)對免疫應(yīng)答的抑制的定量量度。也可使用體外測定，例如混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)測定法(參見例如，F(xiàn)athman等人， J. Immunol. 118:1232-8, 1977);CD3測定(經(jīng)由抗CD3抗體特異性活化免疫細(xì)胞(例如，OKT3))(參見例如，Khanna等人，Transplantation 67:882-9, 1999; Khanna等人(1999) Transplantation67:S58); 及IL-2R測定(用外源加入的細(xì)胞因子IL-2特異性活化免疫細(xì)胞) (參見例如，F(xiàn)arrar等人， J. Immunol. 126:1120-5, 1981)。

環(huán)孢菌素A (CsA; CAS號59865-13-3; 美國專利號3,737,433)及其類似物可以用作免疫抑制劑。許多顯示免疫抑制活性的其他環(huán)孢菌素及其衍生物和類似物是已知的。環(huán)孢菌素及其制劑描述于例如，2004 Physicians’ Desk Reference^? (2003) Thomson Healthcare, 58th ed., 和美國專利號5,766,629; 5,827,822; 4,220,641; 4,639,434; 4,289,851; 4,384,996; 5,047,396; 4,388,307; 4,970,076; 4,990,337; 4,822,618; 4,576,284; 5,120,710; 和4,894,235。

他克莫司(FK506)是大環(huán)內(nèi)酯，其在其作用的分子模式和其臨床功效兩方面發(fā)揮很大程度上類似于CsA的作用(Liu, Immunol. Today 14:290-5, 1993; Schreiber等人，Immunol. Today, 13:136-42, 1992); 但是，這些作用是在比CsA低20-100倍的劑量下顯示的(Peters等人，Drugs 46:746-94, 1993)。他克莫司及其制劑描述于例如，2004 Physicians’ Desk Reference^? (2003) Thomson Healthcare, 58th ed., 和美國專利號4,894,366; 4,929,611; 和5,164,495。

西羅莫司(雷帕霉素)是免疫抑制性內(nèi)酰胺大環(huán)內(nèi)酯，可例如由吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)產(chǎn)生。多種西羅莫司衍生物和其類似物及它們的制劑是已知的且描述于例如，2004 Physicians’ Desk Reference^? (2003) Thomson Healthcare, 58th ed., 歐洲專利EP 0467606; PCT專利號WO 94/02136, WO 94/09010, WO 92/05179, WO 93/11130, WO 94/02385, WO 95/14023, 和WO 94/02136, 以及美國專利號5,023,262; 5,120,725; 5,120,727; 5,177,203; 5,258,389; 5,118,677; 5,118,678; 5,100,883; 5,151,413; 5,120,842; 和 5,256,790。

CD40片段

本發(fā)明的特征還在于包括被2C10抗體特異性結(jié)合的表位的CD40片段。2C10抗體針對CD40多肽的胞外部分而產(chǎn)生；因此，據(jù)信該抗體與該序列(SEQ ID NO:5和6)的部分反應(yīng)。

因此，本發(fā)明的特征在于被2C11抗體特異性結(jié)合的小于150 (例如，小于120、100、80、70、60、50、40、30、20、18、15、12、11、10、9、8、或7)個氨基酸長度的CD40片段。在某些實施方案中，該片段是8-10、8-12、8-15、8-20、8-30、8-40、8-50、8-60、8-70、8-80、或8-100個氨基酸長度。在其他實施方案中，該片段是7-10、7-12、7-15、7-20、7-30、7-40、7-50、7-60、7-70、7-80、或7-100個氨基酸長度。

融合蛋白

本發(fā)明的特征還在于包括本文所述片段和異源序列的融合蛋白。在某些實施方案中，融合伴侶之一是Fc蛋白(例如，小鼠Fc或人Fc)。融合體也可以是可用于產(chǎn)生抗體的序列，例如，麥芽糖結(jié)合蛋白或GST。在其他實施方案中，所述融合蛋白是純化或檢測標(biāo)簽，例如，可以直接或間接地檢測的蛋白質(zhì)(諸如綠色熒光蛋白、血球凝集素或堿性磷酸酶)、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如，GAL4或LexA)、基因活化結(jié)構(gòu)域(例如，GAL4或VP16)、純化標(biāo)簽或分泌信號肽(例如，前胰蛋白酶原(preprotyrypsin)信號序列)。在其他實施方案中，融合伴侶可以是標(biāo)簽，諸如c-myc、聚組氨酸或FLAG 。每個融合伴侶可以含有一個或多個結(jié)構(gòu)域，例如，前胰蛋白酶原信號序列和FLAG標(biāo)簽。

CD40片段和融合蛋白的產(chǎn)生

通過在適宜的表達載體中用編碼多肽片段或融合蛋白的多核苷酸分子轉(zhuǎn)化適宜的宿主細(xì)胞，可以生產(chǎn)本文所述的CD40片段和融合蛋白。

分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解可以使用的各種各樣的表達系統(tǒng)的任何一種并且所使用的確切系統(tǒng)或宿主細(xì)胞對于本發(fā)明不是關(guān)鍵的。示例性表達系統(tǒng)包括原核宿主(例如大腸桿菌)和真核宿主(例如，釀酒酵母、昆蟲細(xì)胞例如Sf21細(xì)胞，或哺乳動物細(xì)胞例如NIH 3T3、HeLa或優(yōu)選地COS細(xì)胞)。這樣的細(xì)胞可以從廣泛的來源獲得(例如，美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas, VA)。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的方法和表達載體的選擇將取決于選擇的宿主系統(tǒng)。例如，在Kucherlapati等人(CRC Crit. Rev. Biochem. 16:349-379, 1982)中和在 DNA Transfer to Cultured Cells (eds., Ravid and Freshney, Wiley-Liss, 1998)中描述了轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染方法；且可以從例如Vectors: Expression Systems: Essential Techniques (ed., Jones, Wiley & Sons Ltd., 1998)中提供的那些中選擇表達載體。

一旦表達重組CD40多肽片段或融合蛋白，可以使用例如親和層析來分離它。在一個實例中，針對片段或融合蛋白產(chǎn)生的抗體(例如，2C10抗體)可以連接到管柱上并用于分離多肽片段或融合蛋白。親和層析之前含有片段或融合蛋白的細(xì)胞的裂解和分離可以用標(biāo)準(zhǔn)方法進行(參見例如，Methods in Enzymology, volume 182, eds., Abelson, Simon, and Deutscher, Elsevier, 1990)。

一旦分離，如果需要，CD40多肽片段或融合蛋白可以進一步純化，例如通過高效液相色譜(參見例如，F(xiàn)isher, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, eds., Work and Burdon, Elsevier, 1980; 和Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Third Edition, ed., Cantor, Springer, 1994)。

也可以通過化學(xué)合成產(chǎn)生CD40多肽片段或融合蛋白 (例如，通過Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, IL; 和Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide, ed., Kates and Albericio, Marcel Dekker Inc., 2000中所述方法)。

其他實施方案

在本說明書中提及的所有專利、專利申請和出版物通過引用并入本文，其程度與特定的或單獨的指示通過引用并入的每個單獨的專利、專利申請或出版物相同。