本發(fā)明是有關(guān)抗癌疫苗領(lǐng)域。具體來說，本發(fā)明涉及用作抗癌疫苗的癌胚抗原免疫原的優(yōu)化多肽，增強(qiáng)T細(xì)胞免疫應(yīng)答。

背景技術(shù)：

癌胚抗原(CEA)是一種酸性蛋白。癌旁正常粘膜CEA含量很少或?yàn)殛幮?。胃癌的CEA陽性率85.58％。其中粘液腺癌及印戒細(xì)胞癌(粘液細(xì)胞癌)為100％。及癌細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白合成及轉(zhuǎn)運(yùn)的細(xì)胞器(如核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基器及其分泌小泡)中，提示癌細(xì)胞合成CEA增加，電鏡下見CEA同時(shí)分布于癌細(xì)胞膜，因此進(jìn)入腺腔的CEA也增加，由于CEA位于圍繞細(xì)胞膜的糖包膜易于釋入周圍體液中，故體液及胃液中CEA濃度高于血清。癌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)CEA含量較多的原因與癌細(xì)胞CEA合成增加及CEA排出受阻有關(guān)。當(dāng)癌細(xì)胞變性壞死時(shí)，細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)受損破裂，CEA可出現(xiàn)在胞質(zhì)的基質(zhì)內(nèi)。免疫電鏡觀察，見粘液細(xì)胞癌CEA分布在整個(gè)細(xì)胞膜和胞漿的膜結(jié)構(gòu)中，CEA抗原決定基為糖蛋白，而腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移均與細(xì)胞膜糖蛋白的糖基化改變有關(guān)。另外粘液細(xì)胞癌還能分泌釋放大量蛋白水解酶，破壞癌細(xì)胞鈣橋，溶解癌巢周圍軟組織。因此胃印戒細(xì)胞癌侵襲力強(qiáng)，轉(zhuǎn)移率高。因此，癌胚抗原是一個(gè)廣譜性腫瘤標(biāo)志物，它能向人們反映出多種腫瘤的存在，對(duì)大腸癌、乳腺癌和肺癌的療效判斷、病情發(fā)展、監(jiān)測(cè)和預(yù)后估計(jì)是一個(gè)較好的腫瘤標(biāo)志物。

CEA可以作為腫瘤細(xì)胞免疫療中的特異性腫瘤疫苗。腫瘤細(xì)胞免疫治療是一種新興的、具有顯著療效的腫瘤治療模式，是一種自身免疫抗癌的新型治療方法。它是運(yùn)用生物技術(shù)和生物制劑對(duì)從病人體內(nèi)采集的免疫細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)和擴(kuò)增后回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)的方法，來激發(fā)，增強(qiáng)機(jī)體自身免疫功能，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。腫瘤細(xì)胞免疫療法是繼手術(shù)、放療和化療之后的第四大腫瘤治療技術(shù)。然而，CEA由702個(gè)氨基酸的蛋白，分子量較大，較難得到純度高的CEA。這樣，不僅會(huì)給后期的特異性T細(xì)胞免疫帶來困難，而且會(huì)導(dǎo)致患者的自身免疫。因此，本發(fā)明提供了一種特異性強(qiáng)，純度較高的小分子多肽作為免疫原。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的

本發(fā)明提供一種CEA免疫原多肽，可用于腫瘤細(xì)胞免疫的免疫原，增強(qiáng)T細(xì)胞免疫應(yīng)答，具有分子量小、特異性免疫原性強(qiáng)的特點(diǎn)。

技術(shù)方案

本發(fā)明的技術(shù)方案在于提供一種癌胚抗原免疫原多肽，序列為L(zhǎng)RLGP YECGISSNLSVDHSDPVILNVLDDYPDDPTI PSYTYYR(SEQ ID NO：1)。該氨基酸序列為全新的序列，在制備用于治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。尤其在制備用于腫瘤免疫細(xì)胞，增強(qiáng)T細(xì)胞免疫應(yīng)答藥物中的應(yīng)用，以及在制備用于CAR-T細(xì)胞免疫治療的應(yīng)用。

有益效果

本發(fā)明的癌胚抗原免疫原多肽，為全新的序列，可用于腫瘤免疫細(xì)胞技術(shù)中的免疫原。有益效果在于(1)促進(jìn)T細(xì)胞增殖，(2)促進(jìn)CD8+免疫應(yīng)答，(3)能與T細(xì)胞表面的MHC有效的特異性結(jié)合，(4)促進(jìn)T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合，(5)在荷瘤小鼠體內(nèi)，能抑制腫瘤的生長(zhǎng)。作為細(xì)胞療法的靶標(biāo)分子，應(yīng)用于CAR-T等細(xì)胞療法。

具體實(shí)施方式

多肽由上海生工吉爾合成。

實(shí)施例1

用腫瘤模型檢測(cè)CEA免疫原多肽的體內(nèi)活力。

6-8w齡C57BL/6小鼠，小鼠隨機(jī)分成4組，雌雄各半，每組10只。(1)空白組；(2)多肽低劑量組；(3)多肽中劑量組；(4)多肽高劑量組。建立胃癌腫瘤模型，在接種腫瘤細(xì)胞后的第3、5、7天，分別進(jìn)行免疫。方案為：空白組加入相同體積的溶劑，實(shí)驗(yàn)組多肽設(shè)3個(gè)劑量：5、10、20mg/Kg，在腫瘤周圍多點(diǎn)注射。21天后，觀察小鼠存活數(shù)量，計(jì)算存活率。結(jié)果顯示，多肽可有效地保護(hù)小鼠，提高荷瘤小鼠的生存率，20mg/Kg組的生存率達(dá)到91.2％。

實(shí)施例2

應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性受體-配體親和法測(cè)試多肽與MHC的結(jié)合能力：

將多肽與HLA各型的結(jié)合能力由競(jìng)爭(zhēng)性受體-配體親和法判斷。將固定濃度為50μmol/L的標(biāo)記¹²⁵I的多肽以及不同濃度(1-50μmol/L)的多肽加入反應(yīng)體系(磷酸鹽緩沖液和MHC，所述的MHC試劑盒購自上海泛柯生物科技有限公司，試劑盒內(nèi)有HLA-A1、A2、A3、A11和A24)，在反應(yīng)體系中形成兩種復(fù)合物，即待測(cè)多肽MHC復(fù)合物和¹²⁵I標(biāo)記多肽復(fù)合物。待測(cè)多肽與¹²⁵I標(biāo)記多肽競(jìng)爭(zhēng)與MHC的結(jié)合。用超過濾(產(chǎn)品型號(hào)Microcon 30，Amicon公司)分離游離多肽和多肽MHC復(fù)合物，然后測(cè)定多肽MHC復(fù)合物的¹²⁵I放射量，將此放射量與沒有競(jìng)爭(zhēng)性抑制的多肽MHC復(fù)合物(沒有加待測(cè)多肽的樣本)的放射量比較，求待測(cè)多肽在抑制50％標(biāo)記多肽與MHC結(jié)合時(shí)的濃度，即IC50。由此得到，多肽對(duì)HLA-A1、A2、A3、A11和A24的IC50值分別為0.81、6.29、4.58、7.76和3.41μmol/L，均符合陽性多肽的標(biāo)準(zhǔn)(≤10μM)。因此，多肽為具有有效結(jié)合能力的免疫原多肽。

實(shí)施例3

T淋巴細(xì)胞的增殖作用：無菌取小鼠脾臟，1640培養(yǎng)基清洗3次，5ml注射器芯研磨，200目篩網(wǎng)過濾，制成單細(xì)胞懸液，離心(1000r/min，5min)，棄上清，Tris-NH₄CL破解紅細(xì)胞，冰水浴靜置3-5min，離心(1000r/min,5min)，棄上清，用無菌冷PBS洗滌細(xì)胞兩次。最后加入10％小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液(5ml)懸浮細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10⁶個(gè)/ml，于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組、模型組(刀豆蛋白A，sigma公司購買)、多肽各劑量(5、10、20mg/ml)組。各組分別加入脾臟淋巴細(xì)胞懸液100μl/孔后，空白對(duì)照組加入1640培養(yǎng)液100μl，模型組加入ConA(終濃度為5μg/ml)，多肽各劑量組在加入不同濃度的多肽基礎(chǔ)上加ConA(終濃度為5μg/ml)。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱靜止培養(yǎng)48h，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入20μl MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，最后棄掉每孔所有溶液，每孔加入100μlDMSO，震蕩，用酶標(biāo)儀檢測(cè)570nm處OD值，每孔設(shè)5個(gè)平行。

表1多肽對(duì)T淋巴細(xì)胞的增殖作用

*P<0.05，**P<0.01與模型組相比。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，與模型組比較，多肽能促進(jìn)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖，在劑量為5～20mg/ml的范圍呈現(xiàn)很好的劑量依賴關(guān)系，以20mg/ml的增殖率最高，為72.70％。

實(shí)施例4

CEA免疫原多肽的免疫原性測(cè)定：采用流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定免疫原多肽對(duì)CD8+T細(xì)胞的影響。6-8w齡C57BL/6小鼠，雌雄各半，小鼠隨機(jī)分成4組，每組10只。(1)空白組；(2)免疫原多肽低劑量組；(3)免疫原多肽中劑量組；(4)多肽高劑量組。在試驗(yàn)的第0、7、14天，分別進(jìn)行免疫。方案為：空白組加入相同體積的溶劑，實(shí)驗(yàn)組多肽設(shè)3個(gè)劑量：5、10、20mg/Kg，在小鼠背部淋巴結(jié)附近多點(diǎn)注射。30天后，眼球取血0.8ml，肝素抗凝，將血離心后取血細(xì)胞層，用紅細(xì)胞裂解液破解紅細(xì)胞，洗去裂解的紅細(xì)胞，再用熒光標(biāo)記的單克隆抗CD8+-FITC(購自北京華泰昕生物醫(yī)療技術(shù)有限公司)孵育、固定后，進(jìn)行流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定，評(píng)價(jià)免疫原多肽對(duì)CD8+T細(xì)胞的影響。

表2多肽對(duì)CD8+T淋巴細(xì)胞的作用

*P<0.05，**P<0.01與空白組相比。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，與空白組比較，多肽能促進(jìn)小鼠CD8+T淋巴細(xì)胞，在劑量為5～20mg/Kg的范圍呈現(xiàn)很好的劑量依賴關(guān)系。

實(shí)施例5

CEA免疫原多肽的T細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)：采用玫瑰花環(huán)試驗(yàn)評(píng)價(jià)T細(xì)胞與人胃癌細(xì)胞MKN28的結(jié)合能力。無菌取豚鼠胸腺，1640培養(yǎng)基清洗3次，5ml注射器芯研磨，200目篩網(wǎng)過濾，制成單細(xì)胞懸液，離心1000轉(zhuǎn)/分，10分鐘，棄上清，以Hank’s液調(diào)細(xì)胞濃度為3×10⁶/ml。于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組、多肽各劑量(5、10、20mg/ml)組。各組分別加入胸腺淋巴細(xì)胞懸液100μl/孔后，空白對(duì)照組加入1640培養(yǎng)液500μl，多肽各劑量組在加入不同濃度的多肽。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48h，培養(yǎng)結(jié)束后每孔中加入100μl/孔MKN28細(xì)胞(細(xì)胞濃度為1×10⁶/ml，含10％胎牛血清)，混勻，500轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘。棄上清，加少量戊二醛，輕輕晃動(dòng)，使細(xì)胞懸浮，加甲紫染色，400倍顯微鏡觀察。凡結(jié)合3個(gè)以上腫瘤細(xì)胞的T淋巴細(xì)胞為花環(huán)陽性細(xì)胞。記數(shù)100個(gè)T細(xì)胞中形成花環(huán)的淋巴細(xì)胞百分率，即為T細(xì)胞與MKN28細(xì)胞的結(jié)合率。每孔設(shè)5個(gè)平行。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，CEA免疫原多肽可以顯著性增加T細(xì)胞與MKN28細(xì)胞的結(jié)合率(P<0.01)，低中高劑量組的結(jié)合率分別為37.3、57.30和92.12％。在劑量為5～20mg/ml的范圍呈現(xiàn)很好的劑量依賴關(guān)系。

SEQUENCE LISTING

<110> 蘇州普羅達(dá)生物科技有限公司

<120> 一種癌胚抗原免疫原多肽及其用途

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 43

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Leu Arg Leu Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Ser Ser Asn Leu Ser Val

1 5 10 15

Asp His Ser Asp Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Asp Asp Tyr Pro Asp

20 25 30

Asp Pro Thr Ile Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg

35 40