本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體的涉及一種神經(jīng)生長因子的提取方法。
背景技術(shù)：
：鼠神經(jīng)生長因子(mousenervegrowthfactor，mNGF)是最早發(fā)現(xiàn)的NGF，也是研究最為透徹的NGF。完整的mNGF由α、β、γ三種亞基以α2β2γ2的形式組成。其中，兩個β亞基是mNGF的生物活性中心，具有mNGF的全部生物學(xué)功能；α和γ亞基能夠保護β亞基免于小鼠頜下腺中蛋白酶的剪切作用以及抑制β亞基與NGF受體的結(jié)合。兩個β亞基以非共價鍵形成二聚體，即β-NGF。建立β-NGF的分離純化工藝是其應(yīng)用開發(fā)的基礎(chǔ)。1960年Cohen首先提出并建立了小鼠頜下腺中β-NGF的分離純化方法。隨后，多篇文獻報道了從鼠頜下腺中分離純化NGF的改進方法。根據(jù)其分離策略的差異，這些方法可以分為兩類：一類是先分離得到完整的7SNGF，再解聚7SNGF釋放出具有生物活性的β亞基二聚體(β-NGF)，然后進一步分離得到β-NGF；另一類是直接分離具有生物活性的NGF的β亞基二聚體，即2.5SNGF。目前國內(nèi)共有四家注射用鼠NGF上市，各公司純化β-mNGF的方法大多基于兩步陽離子(CMsepharoseFF)交換層析，方法的主要流程包括：組織破碎---充分透析----CM反吸附層析---充分透析或超濾---酸化解離---CM吸附層析—排阻層析。詳細過程可參見任晚瓊等發(fā)表的文章“凍干鼠神經(jīng)生長因子中試制備及幾點問題的探討”中介紹的方法，具體為將小鼠頜下腺組織勻漿，離心后得勻漿上清液，將勻漿上清液充分透析后，進行反吸附離子交換層析，收集流穿液；流穿液 再次透析或超濾后進行酸化解離、離心，得酸解上清液；酸解上清液在進行吸附離子交換層析，收集目標蛋白峰，目的蛋白液經(jīng)排阻層析得NGF提取液。但是該工藝中包含兩步透析，透析步驟耗時且操作繁瑣。每步透析耗時長達20多個小時，透析體積較大時還易出現(xiàn)滲漏和破裂。另外由于小鼠頜下腺中富含β-NGF內(nèi)肽酶和類羧肽酶B蛋白酶，這兩種酶會剪切β-NGF氨基端或羧基端的氨基酸，所以透析步驟的時間越長，NGF被剪切的幾率越大，易造成NGF兩端部分氨基酸的缺失比例增加，影響產(chǎn)品的均一性與活性，同時多種剪切形式的存在不利于產(chǎn)品的質(zhì)量控制。因此有必要提供一種快速、簡便的神經(jīng)生長因子提取方法，以獲得均一性高、活性強、質(zhì)量好的神經(jīng)生長因子。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷，提供一種鼠NGF的制備方法。本發(fā)明的發(fā)明人在研究過程中很意外的發(fā)現(xiàn)，在NGF提取步驟中加入疏水層析過程，可在不使用常規(guī)方法中兩步透析的前提下達到與常規(guī)提取方法相近甚至更好的提取效果，可以大大節(jié)省提取所需時間，同時產(chǎn)品的均一性與活性也得以提高。基于以上發(fā)現(xiàn)本發(fā)明提供了一種神經(jīng)生長因子的提取方法，所述方法包括：將小鼠頜下腺組織勻漿后離心收集勻漿上清液；對所述勻漿上清液進行CM反吸附陽離子交換層析后收集流穿液；對所述流穿液進行酸化離心后收集酸解上清液；對所述酸解上清液進行吸附陽離子交換層析收集目標蛋白峰對應(yīng)的目的蛋白液；對所述目的蛋白液進行疏水層析，獲得疏水層析后的目的蛋白液?？蛇x的，所述疏水層析中使用的疏水柱的平衡液為含鹽濃度為0.5-3.0mol/L的pH值為6.0-9.0的緩沖液?？蛇x的，所述疏水層析中使用的疏水柱的平衡液是將選自氯化鈉、硫酸銨和硫酸鈉中的一種鹽溶解于磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液獲得的，在平衡液中溶解的鹽的終濃度為0.5-3.0mol/L、pH值為6.0-9.0?？蛇x的，當所述鹽為氯化鈉時，氯化鈉的終濃度為0.5-3.0mol/L；當所述鹽為硫酸銨時，硫酸銨的終濃度為0.5-2.0mol/L；當所述鹽為硫酸鈉時，硫酸鈉的終濃度為0.5-2.0mol/L?？蛇x的，所述磷酸鹽緩沖液的pH值為6.0-8.0，所述Tris-HCl緩沖液的pH值為7.1-9.0?？蛇x的，所述疏水層析中的疏水柱介質(zhì)為Butyl-S-FF、PhenylFF、PhenylHP、ButylFF、OctylFFButylHP、PhenylHSFF或FractogelEMDPhenyl(S)?？蛇x的，疏水層析過程中上樣流速為5-300cm/hr，優(yōu)選為80-200cm/hr?？蛇x的，疏水層析過程的柱溫為2～8℃?？蛇x的所述方法還包括進行排阻層析步驟?？蛇x的，所述勻漿上清液的pH值為6.0-7.0?？蛇x的，勻漿上清液的獲得方法包括以下步驟：將小鼠頜下腺與純化水混合后充分勻漿，離心收集上清液，用pH6.0～7.0的濃度為0.5mol/L的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)上清液的pH后獲得勻漿上清液。可選的，CM反吸附陽離子交換層析過程中使用的平衡液為濃度0.01-0.1mol/L、pH6.0-7.0的磷酸鹽緩沖液；上樣流速為5-700cm/h。可選的，所述酸化離心包括以下步驟：向流穿液中加入酸性緩沖液調(diào)節(jié)pH值至3.5-4.5，再加入NaCl，使體系中NaCl的終濃度為0.1-0.5mol/L，靜置離心獲得酸解上清液?？蛇x的，流穿液中加入的酸性緩沖液是pH為3.5-4.5的乙酸鹽緩沖 液或檸檬酸鹽緩沖液?？蛇x的，所述吸附陽離子交換層析的步驟包括：用吸附陽離子交換層析平衡液對填料進行平衡，將酸解上清液上樣后，首先用陽離子交換層析平衡液洗脫，吸附的蛋白質(zhì)用pH8.5～9.5、濃度0.01～0.10mol/L的Tris-HC1洗雜緩沖液洗雜，再用pH8.5～9.5的0.01～0.10mol/LTris-HC1-0.2～0.8mol/LNaCl洗脫緩沖液進行梯度洗脫；其中，所述吸附陽離子交換層析平衡液中含有濃度為0.01-0.1mol/L的乙酸鹽和0.1-0.5mol/L的NaCl，pH值為3.5-4.5。本發(fā)明所提供的方法具有以下優(yōu)點：1、從工藝流程上，本發(fā)明將下頜腺組織勻漿后直接進行上樣，CM反吸附鹽離子交換層析后直接酸化，不涉及透析溶液置換或超濾步驟，生產(chǎn)操作時間大大減少，與常規(guī)方法相比節(jié)省了14～48小時。2、提取獲得的完整型β-NGF比例明顯提高，樣品均一度大大提高：從等電點判斷，從以前的三條代減少為兩條帶；從質(zhì)譜結(jié)果看，從先前的四個峰減少為兩個峰；等電點和質(zhì)譜分子量分析結(jié)果表明本發(fā)明的工藝能夠有效地抑制羧肽酶對NGF的C端精氨酸的降解作用，也能夠有效降低N端AA被剪切形式的比例。3、疏水層析后獲得的目的蛋白液的純度可達到99％以上甚至100％。綜上，本發(fā)明的工藝簡化了工藝步驟，流程簡單，不僅大大縮短了制備所用的時間，同時提高了產(chǎn)品的均一性與活性，并且樣品純度也得到了進一步的提高，為NGF的分離純化提供了新的途徑。附圖說明圖1為實施例1中HPLC純度檢測結(jié)果圖；圖2為對比例1中HPLC純度檢測結(jié)果圖；圖3為實施例1中SDS-PAGE純度檢測結(jié)果圖；圖4為實施例1中SDS-PAGE分子量檢測結(jié)果圖；圖5為實施例1及對比例中等電聚焦電泳對比圖；圖6為實施例1中質(zhì)譜分子量檢測結(jié)果圖；圖7為對比例1中質(zhì)譜分子量檢測結(jié)果圖；圖8為等電聚焦電泳結(jié)果。具體實施方式下面將通過具體實施方式對本發(fā)明進行詳細說明。需要理解的是以下實施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進行各種修改和替換。本發(fā)明提供了一種神經(jīng)生長因子的提取方法，將小鼠頜下腺組織勻漿后離心收集勻漿上清液；對所述勻漿上清液進行CM反吸附陽離子交換層析后收集流穿液；對所述流穿液進行酸化離心后收集酸解上清液；對所述酸解上清液進行吸附陽離子交換層析收集目標蛋白峰對應(yīng)的目的蛋白液；對所述目的蛋白液進行疏水層析，獲得疏水層析后的目的蛋白液。在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法還包括調(diào)節(jié)所述勻漿上清液的pH值至6.0-7.0后再進行CM反吸附陽離子交換層析。所述勻漿上清液的獲得方法包括以下步驟：將小鼠頜下腺與預(yù)冷至4℃的純化水按照1:1-20的質(zhì)量體積比混合后進行壓力均質(zhì)，將均質(zhì)后的組分在8000-12000g下離心20-60min收集上清液，用pH6.0～7.0的濃度為0.5mol/L的磷酸鹽溶液對所述勻漿上清液的pH進行調(diào)節(jié)。其中，在將小鼠頜下腺與純化水混合后可以先用組織粉碎機進行初步破碎，然后用高壓均質(zhì)機進行壓力均質(zhì)。本發(fā)明的實施方式中，對于CM反吸附陽離子交換層析的方法沒有特別的限制，可以采用本領(lǐng)域常規(guī)的方法進行，例如可以使用CM32、CMSepharoseFF或其它等效介質(zhì)。所述CM反吸附陽離子交換層析過程中使用的平衡液為0.01-0.1mol/L、pH6.0-7.0的磷酸鹽緩沖 液；上樣流速為5-700cm/h。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實施方式中，在用平衡液進行平衡后可以將所述勻漿上清液上CM-32柱(4.5×15cm)，然后用濃度為0.02mol/L，pH6.8的磷酸鹽緩沖液以300ml/h的流速洗脫，收集的不吸附的蛋白峰為流穿液。在本發(fā)明中，所述酸化離心可以包括以下步驟：向流穿液中加入酸性緩沖液調(diào)節(jié)pH值至3.5-4.5，再加入NaCl，使體系中NaCl的終濃度為0.1-0.5mol/L，靜置后于8000-16000g離心20-60min獲得酸解上清液。優(yōu)選的，流穿液中加入的酸性緩沖液是pH為3.5-4.5的乙酸鹽緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液。具體的，為了獲得更好的酸化離心效果，可以向流穿液中直接加入pH4.0濃度為0.5mol/L的乙酸鹽緩沖液使體系的pH降至4.5以下，再加入NaCl，使體系中NaCl的終濃度為0.4mol/L，靜置10min后，于4℃16000g離心40min，收集上清得到酸解上清液。在本發(fā)明的一種實施方式中，吸附陽離子交換層析，可以采用常規(guī)方法進行。即將所述酸解上清液上樣至充分平衡后的陽離子交換層析柱，上樣完成后用平衡液沖洗至基線，用洗雜緩沖液洗脫雜峰至基線，再用洗脫緩沖液進行梯度洗脫，在紫外檢測儀上顯示數(shù)字從基線開始上升時收集，降為基線時停止收集目標蛋白峰。例如，可以采用任晚瓊等發(fā)表的文章“凍干鼠神經(jīng)生長因子中試制備及幾點問題的探討”中介紹的方法進行所述吸附陽離子交換層析步驟。其中，所述吸附陽離子交換層析填料包括但不限于CMSepharoseFF、SPSepharoseHP、CaptoMMC和FractogelEMDSO3-650。在本發(fā)明的一種實施方式中，所述吸附陽離子交換層析可以通過以下步驟進行：用吸附陽離子交換層析平衡液對填料進行平衡，將酸解上清液以70-400cm/hr的流速上樣后，首先用陽離子交換層析平衡液洗脫，吸附的蛋白質(zhì)用pH8.5～9.5、濃度0.01～0.10mol/L的Tris-HC1洗雜緩沖液洗雜，再用pH8.5～9.5的0.01～0.10mol/LTris-HC1-0.2～0.8mol/LNaCl洗脫緩沖液進行梯度洗脫；其中，所述吸 附陽離子交換層析平衡液中含有濃度為0.01-0.1mol/L的乙酸鹽和0.1-0.5mol/L的NaCl，pH值為3.5-4.5。在本發(fā)明的一種實施方式中，所述疏水層析中使用的疏水柱的平衡液是將選自氯化鈉、硫酸銨和硫酸鈉中的一種鹽溶解于磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液獲得的，在疏水柱的平衡液中溶解的鹽的終濃度為0.5-3.0mol/L、疏水柱的平衡液的pH值為6.0-9.0。在本發(fā)明的一種實施方式中，將氯化鈉溶解于磷酸緩沖液或Tris-HCl緩沖液獲得疏水柱的平衡液，氯化鈉的終濃度為0.5-3.0mol/L，優(yōu)選為1-2mol/L。在本發(fā)明的另一種實施方式中，將硫酸銨溶解于磷酸緩沖液或Tris-HCl緩沖液獲得疏水柱的平衡液，硫酸銨的終濃度為0.5-2.0mol/L，優(yōu)選為0.8-1.6mol/L在本發(fā)明的又一種實施方式中，將硫酸鈉溶解于磷酸緩沖液或Tris-HCl緩沖液獲得疏水柱的平衡液，硫酸鈉的終濃度為0.5-2.0mol/L，優(yōu)選為0.8-1.6mol/L。其中，所述磷酸鹽緩沖液的pH值為6.0-8.0，濃度為0.01-0.1mol/L，所述Tris-HCl緩沖液的pH值為7.1-9.0，濃度為0.01-0.1mol/L。在疏水層析前，首先將所述目的蛋白液中鹽離子的濃度進行調(diào)整，調(diào)整的方法可以為通過添加相同的固體鹽的方式使得所述目的蛋白液中離子的種類和濃度與疏水柱的平衡液中的離子濃度和種類一致。上樣完成后用疏水柱的平衡液沖洗至基線，然后用不含鹽的相應(yīng)緩沖液進行洗脫，在紫外檢測儀上顯示數(shù)字開始上升時開始收集，降為基線時停止收集目標蛋白峰。其中，所述疏水層析中的疏水柱介質(zhì)為Butyl-S-FF、PhenylFF、PhenylHP、ButylFF、OctylFF、ButylHP、PhenylHSFF或FractogelEMDPhenyl(S)。優(yōu)選的情況下，所述疏水層析中的疏水柱介質(zhì)為 ButylFF。在本發(fā)明中，疏水層析中上樣流速為5-300cm/h，優(yōu)選為80-200cm/h，柱溫為2～8℃。優(yōu)選的，本發(fā)明所提供的方法還包括在疏水層析后進行排阻層析獲得NGF提取液。排阻層析可采用常規(guī)方法，排阻層析時選用的平衡液可以為常見的排阻層析緩沖液，優(yōu)選為0.01～0.1mol/L的磷酸鹽(含0.1～0.2mol/L氯化鈉，pH6.5～7.0)緩沖液，在紫外檢測儀上顯示數(shù)字從基線開始上升時收集目標蛋白峰，降為基線時停止收集目標蛋白峰。排阻層析介質(zhì)可采用Superdex75prepgrade層析、G25層析等其它等效介質(zhì)。如采用任晚瓊等發(fā)表的文章“凍干鼠神經(jīng)生長因子中試制備及幾點問題的探討”中介紹的方法，SephadexG-75柱層析柱2.6×110cm，用0.05mol/L，pH4.0乙酸鹽洗脫，流速78ml/h，收集洗脫峰主峰，即為純化路線B所得2.5SNGF。優(yōu)選的，獲得的NGF提取液用0.1μm膜進行預(yù)過濾后，還需要用除病毒膜過濾除病毒，收集濾過液，經(jīng)檢驗合格后即為產(chǎn)品NGF提取液。本文中所述的層析都在常規(guī)層析裝置中進行，最常見的層析柱圓柱形或近似于圓柱形的中空管，使用時一般使其直立?？筛鶕?jù)具體生產(chǎn)規(guī)模選擇選用層析柱的高度及直徑。層析柱中填充的介質(zhì)根據(jù)需要來選擇。本發(fā)明所提供的方法還可以包括一些提取制備藥物的常規(guī)步驟，如病毒滅活、除病毒過濾等步驟。所述的病毒滅活方法可以使用本領(lǐng)域常規(guī)的病毒滅活方法進行，例如可以使用低pH值病毒滅活法、S/D病毒滅活法和辛酸鈉病毒滅活法。本發(fā)明對于進行病毒滅活的時機沒有特別的限制，可以在本發(fā)明所述方法的任何階段進行。所述除病毒過濾步驟可使用本領(lǐng)域常規(guī)過濾方法，多使用濾膜過濾，一般在提取步驟完成后最后進行過濾。本發(fā)明所提供的方法通過在NGF制備步驟中加入疏水層析步驟的方式獲得節(jié)省時間、提高產(chǎn)品的均一性與活性的有益效果，為了使得整個提取方法形成一個高效的整體、更好的實現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，發(fā)明人對勻漿上清液的收集方法、CM反吸附陽離子交換層析方法、酸化離心方法、吸附陽離子交換層析步驟均進行了如上所述的大量的調(diào)整，使得整個制備體系與疏水層析步驟形成相互配合的整體，能夠更好的適用于通過疏水層析步驟提取神經(jīng)生長因子的技術(shù)方案。但是應(yīng)當理解的是，上述具體實施方案僅為本發(fā)明的優(yōu)選情況而并非唯一情況，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以合理的預(yù)測說明書給出的具體實施方式之外的其他等同替代方式或明顯變形方式都是可以實現(xiàn)的。下面的實施例將對本發(fā)明做進一步的說明。實施例11)勻漿：取小鼠頜下腺，加入預(yù)冷純化水充分勻漿，勻漿液經(jīng)11000×g、1hr、4℃條件離心，4℃離心，收集離心上清液，加適量0.5mol/L磷酸鹽溶液(pH6.5)調(diào)節(jié)離心上清液pH至6.8±0.2待用。2)CM反吸附：將步驟1)得到的離心上清液進行CMSepharoseFastFlow陽離子交換層析，CMSepharoseFastFlow層析柱用0.02mol/L、pH6.8磷酸鹽緩沖液充分平衡后上樣，上樣完成后用平衡液沖洗，收集蛋白流出峰，流速為150cm/h。3)酸化：在流穿液中加1mol/L乙酸鹽緩沖液(pH4.0)迅速降低pH至4.0，然后加NaCl使體系中的NaCl的終濃度達到0.4mol/L，靜置約5min后于4℃10000g離心30min，取酸解上清液。4)CM2柱：CMSepharoseFF層析柱用0.05mol/L乙酸鹽緩沖液(pH4.0)充分平衡后上樣，上樣完成后，用平衡液沖洗至基線，用0.05mol/LTris-HC1(pH9.0)緩沖液洗脫雜峰至基線，再用 0.05mol/LTris-HC1和0.05mol/LTris-HC1-0.4mol/LNaCl(pH9.0)梯度洗脫，根據(jù)紫外吸收情況收集目標峰，在紫外檢測儀上顯示數(shù)字開始上升時開始收集，降為基線時停止收集目標蛋白峰。5)疏水層析：ButylSepharose4FF層析柱經(jīng)0.02mol/L磷酸鹽(pH6.8)-1.5mol/L氯化鈉緩沖液充分平衡。在步驟4)獲得的料液中加入氯化鈉固體使料液中氯化鈉的終濃度為1.5mol/L，待氯化鈉充分溶解后上樣，速度為120cm/h，上樣完成后用平衡液沖洗至基線，然后用0.02mol/L磷酸鹽(pH6.8)洗脫收集目標峰。6)除病毒：將5)中的疏水層析洗脫峰料液用0.1μm膜過濾后，再用孔徑20nm除病毒膜過濾除病毒，收集濾過液，即為NGF提取液。對比例11)勻漿：取頜下腺，加入預(yù)冷純化水充分勻漿，勻漿液經(jīng)11000×g、1hr、4℃條件離心，收集離心上清液。2)透析：離心上清液在20mol/L、pH6.8磷酸鹽緩沖液中充分透析24hr。3)CM反吸附層析：CMSepharoseFF層析柱用20mmol/L、pH6.8磷酸鹽緩沖液充分平衡后上樣。上樣完成后用平衡液沖洗，收集蛋白流出峰。4)透析：蛋白流穿液置0.25mmol/L、pH6.8磷酸鹽緩沖液中透析24h，其間置換透析液2次5)酸化：透析后液加1mol/L乙酸鹽緩沖液(pH4.0)迅速降低pH至4.0，然后加NaCl使成0.4mol/L，靜置約5min后10000g離心30min，取上清。6)CM2柱：CMSepharoseFF層析柱用50mmol/L乙酸鹽緩沖液(pH4.0)充分平衡后上樣，上樣完成后，用平衡液沖洗至基線，用50mmol/LTris-HC1(pH9.0)緩沖液洗脫雜峰至基線，再用 50mmol/LTris-HC1和50mmol/LTris-HC1-0.4mol/LNaCl(pH9.0)梯度洗脫，根據(jù)紫外吸收情況收集目標峰，在紫外檢測儀上顯示數(shù)字開始上升時開始收集，降為基線時停止收集目標蛋白峰。7)Superdex75prepgrade層析柱用pH6.8、0.05mol/L磷酸鹽-0.15mol/L氯化鈉緩沖液充分平衡后上樣，在紫外檢測儀上顯示數(shù)字從基線開始上升時開始收集，降為基線時停止收集目標蛋白峰。8)目標蛋白液用0.1μm膜預(yù)過濾后，再用孔徑20nm除病毒膜過濾除病毒，收集濾過液，即為NGF提取液。測試例1實施例1與對比例1的NGF提取液的各項指標檢測1、HPLC檢測NGF提取液的純度將實施例1和對比例1制得的NGF提取液進行HPLC檢測，檢測方法參照專利ZL200510130348.3，對實施例1及對比例1的NGF提取液的檢測結(jié)果分別見圖1和圖2。從HPLC檢測結(jié)果圖可以得知，實施例1的樣品純度為100％，對比例1的樣品純度為93.29％。2、SDS-PAGE電泳檢測NGF的分子量及純度利用SDS-PAGE電泳上樣緩沖液，在加或不加入巰基乙醇的情況下，將低分子量Marker及10μg的實施例1得到的mNGF分別上樣，進行電泳，電泳條件為200V恒電壓，45分鐘。用考馬斯亮藍G-25進行染色，檢測NGF分子量及純度，結(jié)果見圖3、4所示。由圖3、4可知，mNGF分子量約為13kDa，說明所獲得的的目的蛋白正確，只有一條帶無其他雜帶，純度可達到100％。3、等電聚焦電泳根據(jù)任晚瓊等發(fā)表的文章“凍干鼠神經(jīng)生長因子中試制備及幾點問題的探討”中介紹的方法進行等電聚焦電泳，結(jié)果如圖5所示，等電聚焦電泳結(jié)果分析如表1所示。表1由圖5和表1的結(jié)果可知，1泳道為使用實施例1方法得到的NGF，等電點為9.1、8.9，主要為兩條帶，全長NGF的含量(等電點為9.1條帶)達到了77.8％；4泳道為對比例1方法得到的NGF，等電點為9.1、8.9、8.6，等電點為3條帶，均一性只能達到51.5％，并且其中全長NGF(等電點為9.1的條帶)的含量只能達到13.5％，說明本發(fā)明制備得到的mNGF均一性更高。4、用LC-MS質(zhì)譜法進行mNGF的分子量測定及其均一性驗證液相色譜儀使用Agilent1290InfinityLC反相層析體系，色譜柱使用Poroshell300SB-C8、2.1mm×75mm、5μm，柱溫為室溫。流動相組成：A:0.1％甲酸/水，B：0.1％甲酸/乙腈。進樣量：0.1mg/ml、20μl。用5％B平衡該柱5min，用30分鐘從5％B線性洗脫到95％B。質(zhì)譜儀使用Agilent6530ESI-Q-TOFMS。掃描范圍：m/z100～3200。紫外可見光波長為A280nm。對實施例1及對比例1得到的目的蛋白mNGF測定總離子圖譜和紫外光譜，結(jié)果分別如圖6和圖7所示。從圖6可看出，其包含兩個峰，其中：峰1實測分子量為12357.18，理論分子量為12358.04，對應(yīng)的單體形式為N端剪切8個AA的NGF。峰2實測分子量為13251.78，理論分子量為13251.01，應(yīng)對單體形式為全長118AA的NGF。從圖7可看出，其包含4個峰，其中：除了與圖6對應(yīng)的N端剪切8個AA的NGF(峰2)和全長118AA的NGF(峰4)，還有另外兩種形式的單體。由上可知，實施例1獲得的目的蛋白NGF中完整型NGF的含量遠遠高于對比例1中完整型NGF的含量，利用本發(fā)明所提供的方法提取的NGF在產(chǎn)品均一性和完整性上優(yōu)于對比例1中的NGF。5、雞胚背根神經(jīng)節(jié)法及TF-1細胞法測量mNGF活性1)雞胚背根神經(jīng)節(jié)法測量mNGF活性將NGF樣品進行稀釋：A液：6ng提取的mNGF樣品加1ml無血清DMEM培養(yǎng)液溶解；B液：取A液50μl加無血清DMEM培養(yǎng)液4.95ml；C液：取B液60μl加無血清DMEM培養(yǎng)液2.94ml(總量3ml)使終濃度為(3AU/ml)。A、B液稀釋在離心管中，C液在細胞瓶內(nèi)，將C液作為1號瓶，再3倍梯度稀釋為：2號、3號、4號、5號、6號待測液。每個待測液加入1個培養(yǎng)瓶，2ml/瓶。同時以無血清DMEM培養(yǎng)液為空白對照，以購自中檢院的標準品為陽性對照(參考品)。加入8日齡的雞胚背根神經(jīng)節(jié)后置于5％CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中，24小時后觀察結(jié)果。以生長最好時每毫升待測樣品中NGF的含量作為1個活性單位(AU)。從出現(xiàn)陰性對照結(jié)果的稀釋度開始往回數(shù)第3和第4兩個稀釋度中取生長最好的作為判定終點計算效價。參考品為購自中檢院的標準品，每支裝量為1000AU。NGF比活的計算公式為：待測樣品的比活(AU/mg)＝參考品活性(AU/ml)×[樣品預(yù)稀釋倍數(shù)×對應(yīng)參考品稀釋點處的活性(AU/ml)/參考品實測活性(AU/ml)]使用上述方法同時進行實施例1及對比例1提取得到的目的蛋白的活性測定。結(jié)果，實施例1及對比例1的NGF活性均達到了50萬AU/mg，結(jié)果見表2。2)TF-1細胞法測量mNGF活性詳細操作方法按照專利公開號為CN103376248A，
專利名稱：為“神 經(jīng)生長因子活性定量測定方法”中實施例1中的方法進行操作，比活性檢測結(jié)果見表2。表2批號雞胚法比活TF-1細胞法比活實施例15×105AU/mg11.7×105U/mg對比例15×105AU/mg5.0×105U/mg由表2可知，由于背根神經(jīng)節(jié)方法靈敏度較低，所以兩個實施例mNGF比活沒有差別，但是通過靈敏度高的TF-1細胞法檢測比活，能看出實施例1的比活性有很大程度的提高。6、疏水層析前后目標蛋白峰純度對比使用前述HPLC檢測疏水層析步驟前后目標蛋白峰純度，數(shù)據(jù)統(tǒng)計見下表3，純度從70％左右提高到100％，疏水層析步驟效果明顯。表3料液純度疏水步驟前收集的目標蛋白峰72.7％疏水層析后收集的目標蛋白峰100％7、實施例1和對比例1總體檢測結(jié)果對比表見下表4表4實施例2按照與實施例1相同的方法制備mNGF，區(qū)別在于除疏水層析步 驟外，CM反吸附陽離子交換層析、酸化離心、吸附陽離子交換層析和排阻層析步驟均參照任晚瓊等發(fā)表的文章“凍干鼠神經(jīng)生長因子中試制備及幾點問題的探討”中介紹的方法中的路線B制備mNGF。測試例2測試例2用于說明實施例2的mNGF提取液的各項指標，檢測方法同測試例1相同，各檢測項目的結(jié)果列于表5和表6(表6為均一性檢測結(jié)果)。表5表6由以上結(jié)果可知，使用實施例2方法得到的NGF，等電點為9.1、8.9，主要為兩條帶，均一性達到了69.4％，說明本發(fā)明制備得到的mNGF均一性高且主要為完整性NGF。實施例3按照與實施例1相同的方法制備mNGF，區(qū)別在于在疏水層析步驟后插入以下步驟：Superdex75prepgrade層析柱用pH6.8、0.05mol/L磷酸鹽-0.15mol/L氯化鈉緩沖液充分平衡后上樣，在紫外檢測儀上顯示數(shù)字開始上升時開始收集，降為基線時停止收集目標蛋白峰，獲得凝膠過濾層析樣品。測試例3測試例3用于說明實施例3的NGF提取液的各項指標檢測。對凝膠過濾層析樣品進行檢測，與對比例1結(jié)果相對比，結(jié)果統(tǒng)計如下表7。表7檢測項目實施例3實施例1對比例1HPLC純度100.0％100.0％93.00％等電點8.9、9.18.9、9.18.6、8.9、9.1分子量(kD)13.013.012.1殘余宿主蛋白(ng/mg)80250300DNA殘留(ng/mg)8100310由表中數(shù)據(jù)可知，實施例3的工藝與實施例1相比，產(chǎn)品的殘余宿主蛋白及DNA殘留顯著降低；與對比例1相比，不僅產(chǎn)品的均一性明顯提高，殘余宿主蛋白及DNA殘留也顯著降低，專利工藝優(yōu)勢明顯，尤其體現(xiàn)了凝膠過濾層析可明顯的降低產(chǎn)品中內(nèi)毒素及DNA殘留量。實施例4-9按照與實施例1相同的方法制備mNGF，區(qū)別在于利用表8中給出的參數(shù)進行疏水層析步驟：表8(2)實驗結(jié)果1、對各疏水實驗獲得的樣品進行純度、等電點及細胞比活法活性檢測，結(jié)果見下表9。表9實施例HPLC純度等電點TF-1細胞法活性(萬U/mg)499.5％9.1，8.99.9×1055100.0％9.1，8.910.8×105699.6％9.1，8.99.7×1057100.0％9.1，8.910.0×1058100.0％9.1，8.910.2×105999.7％9.1，8.99.9×105由表中數(shù)據(jù)可知，各疏水層析實驗的樣品純度都達到了99.0％以上，活性都在9.5×105U/mg以上，等電聚焦分析都只有兩條帶，產(chǎn)品均一性較舊工藝都有明顯提升。等電聚焦電泳結(jié)果見圖8，其中A圖和B圖中右側(cè)有三條帶的泳道是對比例1中的樣品。2、均一性測試結(jié)果由圖8(圖8A和圖8B)可知，實驗1-6分別為該使用實施例4-9中的方法得到的NGF，等電點為9.1、8.9，主要為兩條帶，全長NGF的含量(等電點為9.1條帶)達到了65％以上；對比例1方法得到的NGF，等電點為9.1、8.9、8.6，等電點為3條帶，均一性差，并且其中全長NGF(等電點為9.1的條帶)的含量只能達到13.5％，說明本發(fā)明制備得到的mNGF均一性更高。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。當前第1頁1 2 3