本發(fā)明涉及一種肽，尤其涉及一種EZH2-CTL表位肽及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

多發(fā)性骨髓瘤是造血系統(tǒng)來源于B細(xì)胞的惡性腫瘤，在美國多發(fā)性骨髓瘤是排在非霍奇金淋巴瘤之后發(fā)病率第二的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，它占所有腫瘤的1％及血液系統(tǒng)惡性腫瘤的13％。多發(fā)性骨髓瘤是由漿細(xì)胞在骨髓內(nèi)的惡性克隆性增殖并侵潤引起，最終導(dǎo)致高丙種球蛋白血癥、免疫機(jī)能下降及各靶器官損害。對于大多數(shù)患者而言這種疾病是無法治愈的。接受常規(guī)化療患者的中位生存在3-4年，而在接受自體外周血造血干細(xì)胞移植后，有50％的患者可以達(dá)到完全緩解，這些患者的中位生存可以延長到5-7年。但是，絕大部分患者最終會復(fù)發(fā)。

目前認(rèn)為這些患者復(fù)發(fā)的根源是因為體內(nèi)存在微小殘留病灶，因此，需要一種有效的方法，能使接受化療或自體造血干細(xì)胞移植之后患者體內(nèi)的微小殘留病灶被有效清除。

免疫治療就是一種非常合適的選擇。骨髓瘤細(xì)胞分泌的獨特型抗原是一種腫瘤特異性抗原。有學(xué)者用這種獨特型抗原給多發(fā)性骨髓瘤患者接種以進(jìn)行免疫治療，但是這種治療療效讓人失望，一部分原因被歸咎于這種獨特型抗原的免疫原性不夠強(qiáng)。因此，我們迫切的需要發(fā)現(xiàn)一種大部分患者共有的新型的腫瘤抗原來改善免疫治療對多發(fā)性骨髓瘤的療效。理想的腫瘤抗原應(yīng)該在不同起源的腫瘤細(xì)胞表明表達(dá)，在正常組織中低表達(dá)或者不表達(dá)，而且在腫瘤細(xì)胞的生長及生存中不可或缺，這樣腫瘤細(xì)胞才不可能通過不表達(dá)或者下調(diào)表達(dá)該抗原以逃避免疫攻擊。

免疫治療一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點，眾多研究者尋找到許多多發(fā)性骨髓瘤的靶點，比如熱休克蛋白(HSP)、未折疊蛋白(XBP1)及CD138+等，但這些靶點都有各自的局限性，比如CD138+理論上表達(dá)于所有骨髓瘤細(xì)胞表面，但是近期的一些研究卻認(rèn)為，骨髓瘤干細(xì)胞可能存在于一群CD138-的細(xì)胞中，而XBP1及Hsp在患者中的表達(dá)率也無法達(dá)到100％。這就需要我們不斷尋找新的骨髓瘤治療靶點，以最終達(dá)到個體化治療的目的，即：對于每位患者檢測其體內(nèi)各種腫瘤抗原的表達(dá)情況，根據(jù)其強(qiáng)弱選擇合適的靶點，以達(dá)到最佳的治療效果，這種個體化的有差異的治療也許是今后腫瘤免疫治療的發(fā)展方向。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種EZH2表位肽，以及所述表位肽的應(yīng)用。

本發(fā)明第一個方面是提供一種EZH2表位肽，所述表位肽含有、并優(yōu)選組成為如下序列：

1)YMCSFLFNL(SEQ ID No.1)；或者

2)序列1)經(jīng)過取代、缺失、或添加一個或多個氨基酸、且具有EZH2抗原表位肽功能的氨基酸序列。

本發(fā)明第二個方面是提供所述EZH2表位肽的應(yīng)用，所說應(yīng)用包括制備藥物、疫苗中的應(yīng)用。

其中，所述藥物或疫苗以所述EZH2表位肽為作用靶點。

其中，所述藥物或疫苗為治療/預(yù)防腫瘤的藥物。

所述腫瘤優(yōu)選為至少包括前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌及血液腫瘤(如淋巴瘤和骨髓瘤等)。

更優(yōu)選地，所述藥物為治療骨髓瘤和/或血液腫瘤的藥物。

其中，所述疫苗為預(yù)防骨髓瘤和/或血液腫瘤的疫苗。

其中，所述藥物和/或疫苗還可以包括佐劑、輔料。

在本發(fā)明一種優(yōu)選實施例中，所述EZH2表位肽誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞作為藥物的全部或部分活性成分。

本發(fā)明還提供一種所述EZH2表位肽誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞(EZH2-CTLs)。

本發(fā)明提供了一種EZH2表位肽，該EZH2表位肽能夠誘導(dǎo)出EZH2-CTLs，在體外試驗中有明確殺傷HLA-A0201+骨髓瘤細(xì)胞作用，并且對正常造血細(xì)胞沒有殺傷。

附圖說明

圖1 EZH2肽段與T2細(xì)胞結(jié)合力預(yù)實驗結(jié)果，A為EZH2肽段與其他肽對T2細(xì)胞結(jié)合力對比預(yù)實驗結(jié)果，B為EZH2肽段與其他肽對T2細(xì)胞結(jié)合穩(wěn)定性預(yù)實驗結(jié)果；

圖2為健康供者及患者外周血中EZH2-CTLs水平測定；

圖3為T細(xì)胞增殖實驗；

圖4為乳酸脫氫酶釋放試驗檢測EZH2-CTL對靶細(xì)胞殺傷作用；

圖5為EZH2-CTLs細(xì)胞殺傷骨髓瘤細(xì)胞時的脫顆粒作用。

具體實施方式

EZH2蛋白氨基酸序列(SEQ ID No.3)，Genbank登錄號為：AAC51520.1，如下所述：

mgqtgkksek gpvcwrkrvk seymrlrqlk rfrradevks mfssnrqkil erteilnqew kqrriqpvhiltsvsslrgt recsvtsdld fptqviplkt lnavasvpim yswsplqqnf mvedetvlhn ipymgdevldqdgtfieeli knydgkvhgd recgfindei fvelvnalgq yndddddddg ddpeereekq kdledhrddkesrpprkfps dkifeaissm fpdkgtaeel kekykelteq qlpgalppec tpnidgpnak svqreqslhsfhtlfcrrcf kydcflhpfh atpntykrkn tetaldnkpc gpqcyqhleg akefaaalta eriktppkrpggrrrgrlpn nssrpstpti nvleskdtds dreagtetgg enndkeeeek kdetssssea nsrcqtpikmkpnieppenv ewsgaeasmf rvligtyydn fcaiarligt ktcrqvyefr vkessiiapa paedvdtpprkkkrkhrlwa ahcrkiqlkk dgssnhvyny qpcdhprqpc dsscpcviaq nfcekfcqcs secqnrfpgcrckaqcntkq cpcylavrec dpdlcltcga adhwdsknvs ckncsiqrgs kkhlllapsd vagwgifikdpvqknefise ycgeiisqde adrrgkvydk ymcsflfnln ndfvvdatrk gnkirfanhs vnpncyakvmmvngdhrigi fakraiqtge elffdyrysq adalkyvgie remeip

本發(fā)明提供了兩種EZH2表位肽：YMCSFLFNL(SEQ ID No.1)、SQADALKYV(SEQ ID No.2)。

表1，EZH2表位肽及其與人HLA-A0201親和力預(yù)測積分

表1中：a：NIH BIMAS http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind

b：SYFPEITHI http://www.syfpeithi.de/

本發(fā)明選取合成了兩條HLA A0201陽性肽HIV-1pol肽段(序列：ILKEPVHGV)、流感病毒基質(zhì)蛋白肽段(序列：GILGFVFTL)作為本實驗的陽性對照。

T2細(xì)胞表位肽結(jié)合親和及穩(wěn)定性實驗

1)T2細(xì)胞親和實驗

收集T2細(xì)胞，用4℃的無菌PBS離心洗滌三次，加入無血清1640培養(yǎng)基，2×10⁵/孔細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，設(shè)立實驗組及對照組，每組重復(fù)三個副孔，將未加肽刺激的T2細(xì)胞作為空白對照，每孔加入相應(yīng)的候選肽段及對照肽段(終濃度50uM)，同時加入β2微球蛋白(終濃度2.5ug/ml)，將細(xì)胞置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育18h，再次收集細(xì)胞，4℃、PBS洗滌三次，加入FITC標(biāo)記的HLA-A0201單克隆抗體BB7.2(2ul/孔)，4℃避光孵育15分鐘，4℃、PBS洗滌3次，流式細(xì)胞儀檢測平均熒光強(qiáng)度。

用熒光指數(shù)(FI，熒光系數(shù))作為衡量親和力指標(biāo)，熒光系數(shù)>1的表位肽被認(rèn)為與HLA-A0201分子具有高親和力，熒光系數(shù)由以下公式計算得到：

用熒光指數(shù)(FI)＝(樣本平均熒光強(qiáng)度-空白對照平均熒光強(qiáng)度)/空白對照平均熒光強(qiáng)度

參照圖1A，YMCSFLFNL序列(aa661)熒光系數(shù)大于1，達(dá)到1.4左右，說明該表位肽與HLA-A0201親和力高。

2)T2細(xì)胞表位肽結(jié)合穩(wěn)定性實驗

收集T2細(xì)胞，1×10⁵/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入無血清1640培養(yǎng)基、β2微球蛋白、以及相應(yīng)的候選肽段及對照肽段，將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中孵育18h，再次收集細(xì)胞，洗滌后加入無血清1640培養(yǎng)基、胞外布雷菲德菌素共同孵育1h，收集細(xì)胞，洗滌后再次加入含有胞外布雷菲德菌素(0.5ug/ml)的無血清1640培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中孵育，于不同的時間點(0,2,4,8,12,24h)收集細(xì)胞。每一個實驗組設(shè)置三個副孔，加入FITC標(biāo)記的HLA-A0201單克隆抗體BB7.2，流式細(xì)胞儀檢測平均熒光強(qiáng)度，計算出每點的FI，用此衡量表位肽誘導(dǎo)的HLA-A0201的表達(dá)情況。

參照圖1B，各個時間點上，YMCSFLFNL序列(aa661)熒光系數(shù)均明顯高于aa729序列，因此與HLA-A0201結(jié)合穩(wěn)定。

在健康供者及患者體內(nèi)檢測所篩選肽段相應(yīng)五聚體陽性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTLS)

收集健康供者及兩名多發(fā)性骨髓瘤確診未緩解患者外周血5ml，用淋巴細(xì)胞分離液分離方法提取外周血單個核細(xì)胞，將細(xì)胞計數(shù)后取1×10⁶個細(xì)胞，溶于100ulPBS中，加入2ul所篩選表位肽對應(yīng)的PE標(biāo)記的五聚體及同型對照，常溫避光孵育40分鐘，后冰面放置1分鐘，加入FITC標(biāo)記的CD8+單克隆抗體，4℃避光15分鐘，取出后以4℃PBS洗3次，用500ulPBS重懸后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

參照圖2，健康供者體內(nèi)EZH2-CTLS水平明顯低于骨髓瘤患者，說明，本發(fā)明表位肽是生理狀態(tài)下產(chǎn)生的表位肽片段。

體外驗證EZH2蛋白特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞對骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞溶解作用

1)誘導(dǎo)生成細(xì)胞毒性T細(xì)胞：包括HLA-A0201+健康供者外周血單個核細(xì)胞分離、DC細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)、細(xì)胞毒性T細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.1)獲取HLA-A0201+健康供者外周血單個核細(xì)胞

1.2)誘導(dǎo)生成DC細(xì)胞

(1).將提取的單個核細(xì)胞按照每孔1×10⁶個加入24孔板中靜置2h，使單核細(xì)胞貼壁。

(2).吸盡24孔板中的細(xì)胞懸液，并用含有10％FBS的1640培養(yǎng)基0.5ml輕輕沖刷每孔。

(3).每孔加入含有GM-CSF及IL-4 10的培養(yǎng)基。

(4).每3日半量換液一次，加入GM-CSF及IL-4，第5日半量換液，加入GM-CSF 10、IL-4 10及TNF-α10，48h后DC細(xì)胞成熟。

(5).加入EZH2肽段靜置2-4h。

(6).30Gy伽馬射線照射成熟的DC細(xì)胞。

(7).吸除所有上清，加入淋巴細(xì)胞或者誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞。

1.3).PBMC來源CTLs的產(chǎn)生

(1).淋巴細(xì)胞與DC細(xì)胞共培養(yǎng)時，加入有IL-2 50IU/ml、IL-7 2.5ng/ml及IL-15 5ng/ml的10％FBS的1640培養(yǎng)基，將淋巴細(xì)胞計數(shù)后與成熟DC細(xì)胞按照10：1比例混合。

(2).每2-3日半量換液一次，同時加入IL-2、IL-7及IL-15。

(3).第7日將淋巴細(xì)胞移入新生成DC孔中并與之共培養(yǎng)。

(4).每次與新的DC細(xì)胞共培養(yǎng)前，需取樣檢測特異性。

1.4)CTL細(xì)胞CD8及五聚體雙陽性率的檢測

(1).取5×10⁵個培養(yǎng)的CTL細(xì)胞離心后以100ul無菌PBS重懸。

(2).用帶有熒光標(biāo)記的MHC/肽多聚體(Epimer)標(biāo)記細(xì)胞后加入抗-CD8-FITC。

(3).PBS洗滌液洗細(xì)胞后重懸于適量PBS洗滌液中。

(4).細(xì)胞流式儀分析。

2)CTL細(xì)胞表型測定：

(1).取3×10⁶個培養(yǎng)的CTL細(xì)胞，同時取未經(jīng)過與DC共培養(yǎng)的外周血PBMC作為對照組。

(2).用帶有熒光標(biāo)記的MHC/肽多聚體(Epimer)標(biāo)記后加入抗-CD8-FITC及抗-CD45RA-APC或抗CD45RO-APC。

(3).PBS洗滌液洗細(xì)胞后重懸于適量PBS洗滌液中。

(4).細(xì)胞流式儀分析。

3)CTL細(xì)胞增殖實驗：取經(jīng)過與DC細(xì)胞共培養(yǎng)四周的CTLs細(xì)胞進(jìn)行實驗：

a、取10×10⁶個培養(yǎng)的CTL細(xì)胞，加入無菌PBS5ml，以1000轉(zhuǎn)10分鐘離心，棄上清，以10ml無菌PBS重懸，使其達(dá)到每1ml有1×106個細(xì)胞。

b、加入CFSE使其終濃度為3μM，放入37℃二氧化碳培養(yǎng)箱孵育15分鐘，每5分鐘搖勻細(xì)胞。

c、取出細(xì)胞后加入等量胎牛血清放入4℃冰箱終止10分鐘。

d、用PBS洗滌三次，每次為1000轉(zhuǎn)10分鐘。

e、用含有10％FBS的1640重懸，使細(xì)胞濃度達(dá)到1×106/ml。

f、將細(xì)胞分組移入24孔培養(yǎng)板中，每孔CTL細(xì)胞為1×106個。A組為空白CTL細(xì)胞，B組為CTL細(xì)胞按10：1比例加入(HLA-A0201+骨髓瘤細(xì)胞株)，C組為CTL細(xì)胞按10：1比例加入(HLA-A0201-骨髓瘤細(xì)胞株)，每組設(shè)3個復(fù)孔。

g、96小時后收集三組細(xì)胞即9孔，用PBS洗滌兩次，每次為1000轉(zhuǎn)10分鐘，后進(jìn)行流式細(xì)胞檢測。

4)CTL細(xì)胞因子分泌測定：

a、取經(jīng)過與DC細(xì)胞共培養(yǎng)四周的EZH2-CTLs 1×10⁶個細(xì)胞進(jìn)行實驗，每組設(shè)3個副孔；

b、將培養(yǎng)基(包含細(xì)胞)移入10ml無菌離心管中，以1000轉(zhuǎn)10分鐘離心；

c、將上清培養(yǎng)基吸出，與捕獲微球共孵育，加入包被了抗體的微球混合物孵育2h，以PBS洗滌；

d、加入標(biāo)記生物素?zé)晒馓綔y試(PE標(biāo)記)劑孵育1h，以PBS洗滌；

流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測；

e、用FlowCytomix Pro軟件計算被測樣本中相應(yīng)細(xì)胞因子的濃度。

5)CTL細(xì)胞殺傷實驗：取經(jīng)過與DC細(xì)胞共培養(yǎng)四周的CTLs細(xì)胞進(jìn)行實驗：

a、取10×106個培養(yǎng)的CTL細(xì)胞，調(diào)整濃度至1×10⁶個細(xì)胞/ml。

b、加入CFSE使其終濃度為3μM，放入37℃二氧化碳培養(yǎng)箱孵育15分鐘。

c、取出細(xì)胞后加入等量胎牛血清放入4℃冰箱終止10分鐘。

d、用無菌PBS洗滌三次。

e、用含有10％FBS的1640重懸，使細(xì)胞濃度達(dá)到1×10⁶/ml。

f、將細(xì)胞分組移入24孔培養(yǎng)板中，每孔CTL細(xì)胞為1×10⁶個。設(shè)置空白CTL細(xì)胞組，ARH-77(HLA-A0201+骨髓瘤細(xì)胞株)組，及LP1(HLA-A0201-骨髓瘤細(xì)胞株)組。

g、效靶細(xì)胞混合培養(yǎng)4小時后混合離心；

h、重懸后避光加入PI，4℃避光15分鐘后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

6)EZH2-CTLs細(xì)胞功能測定：

6.1.CTLs與HLA-A0201+靶細(xì)胞混合實驗測定CD107a表達(dá)情況(該實驗重復(fù)三次)：

a、取1×10⁶個培養(yǎng)的CTLs細(xì)胞；

b、取2×10⁶個培養(yǎng)的(HLA-A0201+)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞；

c、將CTL細(xì)胞與靶細(xì)胞混合。

d、將效靶細(xì)胞混合液放入V型底96孔培養(yǎng)板中。

e、將放有細(xì)胞的96孔板放入37℃5％二氧化碳培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4小時。

f、培養(yǎng)4h后取出培養(yǎng)板，吹勻并吸出每孔細(xì)胞懸液，將10孔細(xì)胞混合。

g、以100ul無菌PBS重懸效靶細(xì)胞混合液，加入2ul抗-CD8-FITC及10ul抗-CD107a-PC5。

h、用無菌PBS洗滌液洗細(xì)胞后重懸。

i、用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

6.2.CTLs與HLA-A0201-靶細(xì)胞混合實驗測定CTLs細(xì)胞CD107a表達(dá)情況(該實驗重復(fù)三次)：

a、取1×10⁶個培養(yǎng)的CTLs細(xì)胞，以1000轉(zhuǎn)10分鐘離心，棄上清，用含有10％FBS的1640重懸，使體積為333ul。

b、取2×10⁶個培養(yǎng)的(HLA-A0201-)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞，以1000轉(zhuǎn)10分鐘離心，棄上清，用含有10％FBS的1640重懸，使體積為667ul。

c、將CTLs細(xì)胞333ul與靶細(xì)胞667ul混合，共1ml。

d、將效靶細(xì)胞混合液放入V型底96孔培養(yǎng)板中，每孔100ul，共10孔。

e、將放有細(xì)胞的96孔板放入37℃5％二氧化碳培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4小時(對96孔板進(jìn)行離心1000轉(zhuǎn)5分鐘)。

f、培養(yǎng)4h后取出培養(yǎng)板，吹勻并吸出每孔細(xì)胞懸液，將10孔細(xì)胞混合。

g、向效靶細(xì)胞混合液中加入5ml無菌PBS，混勻后以1000轉(zhuǎn)10分鐘離心，棄上清。以100ul無菌PBS重懸效靶細(xì)胞混合液，加入2ul抗-CD8-FITC及10ul抗-CD107a-PC5在冰上避光反應(yīng)20分鐘。

h、用無菌PBS洗滌液洗細(xì)胞3次，400xg 5分鐘，細(xì)胞沉淀重懸于500ulPBS中。

i、用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

參照圖3，經(jīng)過本發(fā)明肽刺激的DC細(xì)胞(pulsedDC)具有誘導(dǎo)相應(yīng)EZH2-CTLS細(xì)胞增殖的能力，OD值明顯高于未經(jīng)本發(fā)明肽刺激的DC細(xì)胞(unpulsedDC)。

抗原特異性CTLS細(xì)胞表達(dá)CO45RO和CD45RA情況如下：

CD8+CD45RA-細(xì)胞占所有CTLS細(xì)胞88％。

CD8+CD45RO+細(xì)胞占所有CTLS細(xì)胞90％。

細(xì)胞因子測定結(jié)果如表2所示。

表2，細(xì)胞因子測定結(jié)果

EZH2-CTLs對骨髓瘤殺傷作用

參照圖4，細(xì)胞毒性分析表明，CTLS可特異性殺傷HLA-A0201陽性骨髓瘤細(xì)胞株及原代細(xì)胞，而對HLA-A0201陰性骨髓瘤細(xì)胞株無殺傷作用

為了衡量EZH2-CTLs細(xì)胞殺傷骨髓瘤細(xì)胞株的效能，借助測量CD107a在EZH2-CTLs細(xì)胞表面的表達(dá)，評估其細(xì)胞殺傷骨髓瘤細(xì)胞時的脫顆粒作用，如圖5所示，CD107a在EZH2-CTLs細(xì)胞釋放細(xì)胞毒顆粒時會短暫的在CTLs細(xì)胞膜表面表達(dá)。

上述實驗證明，本發(fā)明提供了一種新型的腫瘤特異性抗原的CTL表位肽，其能夠誘導(dǎo)出EZH2-CTLs，證實其在體外試驗中有明確殺傷HLA-A0201+骨髓瘤細(xì)胞作用，并且對正常造血細(xì)胞沒有殺傷，可以作為靶點達(dá)到體內(nèi)/體外殺傷骨髓瘤細(xì)胞的目的。

同樣的，由于EZH2在其他眾多腫瘤(如前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、血液腫瘤、淋巴瘤等)中都有高表達(dá)，與腫瘤的惡性進(jìn)程、侵襲性、轉(zhuǎn)移能力關(guān)系密切，因此該EZH2表位肽也可以作為靶點治療/預(yù)防前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌及其他血液腫瘤如淋巴瘤等多種腫瘤。

以上對本發(fā)明的具體實施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。