本發(fā)明屬于生物技術(shù)及醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及蛋白Bach1的新用途，具體涉及一種蛋白Bach1在用于制備細(xì)胞Wnt信號(hào)通路抑制劑中的用途。

背景技術(shù)：

現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了Wnt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)十分重要的信號(hào)通路，它與腫瘤、血管再生、細(xì)胞增殖、組織再生、胚胎發(fā)育、以及神經(jīng)、骨骼的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。研究顯示，Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要分為依賴(lài)于β-catenin/TCF轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(Wnt/β-catenin途徑)及不依賴(lài)于β-catenin/TCF轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的非經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(Wnt/Ca²⁺途徑和Wnt/JNK途徑)。在經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，轉(zhuǎn)錄激活子β-Catenin是核心成分；在沒(méi)有Wnt信號(hào)的情況下，細(xì)胞質(zhì)中的β-Catenin和許多蛋白形成多蛋白復(fù)合物，β-Catenin被泛素化降解；當(dāng)Wnt信號(hào)通路活化時(shí)，Wnt與受體Fzd結(jié)合激活細(xì)胞內(nèi)的一些蛋白阻止了β-Catenin的降解。有研究報(bào)道了β-Catenin在細(xì)胞內(nèi)積累并進(jìn)入細(xì)胞核與T細(xì)胞因子TCF淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子家族的轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物激活下游基因的轉(zhuǎn)錄。業(yè)內(nèi)技術(shù)人員認(rèn)為，由于Wnt/β-catenin信號(hào)途徑與眾多的癌癥和疾病有關(guān)系，所以調(diào)節(jié)失控的Wnt/β-catenin信號(hào)途徑可以作為治療與Wnt/β-catenin信號(hào)途徑相關(guān)疾病的一個(gè)重要手段，因此，Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑的研究與應(yīng)用對(duì)于異常Wnt信號(hào)通路相關(guān)疾病的治療具有重要意義。

BTB-CNC同源體1(BTB and CNC homology 1，Bach1)是一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制因子，屬于堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族，其結(jié)構(gòu)高度保守，廣泛存在于哺乳動(dòng)物各種組織中；人的Bach1蛋白含736個(gè)氨基酸，分子量為92kDa。已知Bach1調(diào)控的下游基因有血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)等，但是，目前還未見(jiàn)有關(guān)Bach1作為Wnt信號(hào)通路抑制劑以及相關(guān)應(yīng)用的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供蛋白Bach1的新用途，具體涉及蛋白Bach1在用于制備細(xì)胞Wnt信號(hào)通路抑制劑中的用途。

本發(fā)明所述的Bach1蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽。

本發(fā)明中，進(jìn)行了Bach1抑制細(xì)胞Wnt/β-catenin調(diào)控路徑實(shí)驗(yàn)，其中包括：通過(guò)Bach1抑制Wnt/β-catenin報(bào)告基因TOPFlash的活性和靶基因的表達(dá)，Bach1抑制β-catenin與TCF4的蛋白結(jié)合，Bach1抑制β-catenin與CBP/P300的蛋白結(jié)合，和通過(guò)招募HDAC1與Wnt靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合等試驗(yàn)；以及進(jìn)行了Bach1誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡，抑制細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，其中包括：細(xì)胞周期分析實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)，和細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所述的Bach1通過(guò)直接阻斷β-catenin/TCF的蛋白結(jié)合干擾轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的形成以實(shí)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路抑制；Bach1通過(guò)抑制Wnt信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路報(bào)告基因和靶基因表達(dá)抑制；Bach1通過(guò)選擇性抑制Wnt信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞增殖抑制。

本發(fā)明公開(kāi)了蛋白Bach1能用于抑制細(xì)胞經(jīng)典Wnt信號(hào)途徑的新用途，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Bach1能抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的報(bào)告基因或目的基因的表達(dá)活性，Bach1蛋白通過(guò)直接阻斷β-catenin/TCF的蛋白結(jié)合干擾轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的形成從而抑制Wnt信號(hào)通路靶基因表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蛋白Bach1可作為干預(yù)異常Wnt信號(hào)通路有關(guān)的疾病(例如，與Wnt信號(hào)通路激活相關(guān)的疾病或是Wnt信號(hào)通路組分突變所致的遺傳疾病)的藥物靶點(diǎn)；進(jìn)一步用于制備調(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt信號(hào)途徑的藥物，和用于制備細(xì)胞Wnt信號(hào)通路抑制劑，尤其是用于制備預(yù)防和/或治療與異常Wnt信號(hào)通路有關(guān)的疾病的藥物。

本發(fā)明所述的與Wnt信號(hào)通路激活相關(guān)的疾病，選自：癌癥，血管發(fā)生，異常細(xì)胞增殖，糖尿病性視網(wǎng)膜病，肺纖維化，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，硬皮病，霉菌或病毒感染，骨或軟骨疾病，阿爾茨海默病或骨關(guān)節(jié)炎等；

本發(fā)明所述的Wnt信號(hào)通路組分突變所致的遺傳疾病，選自：結(jié)腸息肉病、骨質(zhì)疏松-假性神經(jīng)膠質(zhì)瘤綜合征、家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜血管發(fā)生、早期冠心病、先天性四肢切斷綜合征、2型糖尿病、富爾曼綜合征、維爾姆斯瘤、骨骼發(fā)育異常、灶性皮膚發(fā)育不全、常染色體隱性甲缺如、神經(jīng)管缺陷或α地中海貧血(ATRX)綜合征。

附圖說(shuō)明

圖1為Bach1抑制細(xì)胞經(jīng)典Wnt信號(hào)途徑報(bào)告基因TOPFlash的活性和靶基因 的表達(dá)，其中，

圖1A顯示，Bach1基因過(guò)表達(dá)抑制Wnt3a激活的TOPFlash報(bào)告基因活性；圖1B顯示，Bach1基因過(guò)表達(dá)抑制β-catenin激活的TOPFlash報(bào)告基因活性；圖1C顯示，Bach1基因抑制增加基礎(chǔ)或Wnt3a激活的TOPFlash報(bào)告基因活性；圖1D顯示，Bach1基因過(guò)表達(dá)抑制，Bach1基因減少促進(jìn)Wnt/β-catenin信號(hào)途徑靶基因的表達(dá)。

圖2為Bach1與TCF4結(jié)合，抑制β-catenin與TCF4的蛋白結(jié)合，

其中，圖2A顯示了利用免疫共沉淀法分析Bach1與TCF4的相互作用，Bach1全長(zhǎng)或Bach1N-段與TCF4有結(jié)合；圖2B顯示Bach1對(duì)β-catenin與TCF4結(jié)合的影響，Bach1抑制β-catenin與TCF4的蛋白結(jié)合。

圖3為利用免疫共沉淀法分析Bach1對(duì)β-catenin與CBP/P300結(jié)合的影響，

其中，圖3A和3B顯示了Bach1抑制β-catenin與CBP/P300的蛋白結(jié)合；圖3C顯示了Bach1抑制β-catenin的乙?；?。

圖4為Bach1通過(guò)招募HDAC1與Wnt靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，抑制靶基因轉(zhuǎn)錄，

其中，圖4A顯示了利用免疫共沉淀法分析Bach1與HDCA1的相互作用，結(jié)果表明，Bach1與組蛋白去乙?；?(HDCA1)有結(jié)合；圖4B顯示了Bach1對(duì)組蛋白去乙酰化酶活性的影響，結(jié)果表明，Bach1過(guò)表達(dá)增加組蛋白去乙?；富钚?，酶活性的增加可以被特異性的組蛋白去乙?；敢种苿㏕richostatin A(TSA)所抑制；圖4C顯示了利用染色質(zhì)免疫共沉淀法分析Bach1是否與IL-8啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，結(jié)果表明，Bach1與IL-8啟動(dòng)子區(qū)(-1—-193)有結(jié)合；圖4D顯示了利用染色質(zhì)免疫共沉淀法分析Bach1過(guò)表達(dá)對(duì)β-catenin，HDAC1與IL-8啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合的影響，結(jié)果表明，Bach1過(guò)表達(dá)招募HDAC1與IL-8的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，抑制β-catenin與IL-8的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，從而抑制IL-8基因轉(zhuǎn)錄。

圖5為Bach1誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡，抑制細(xì)胞增殖，

其中，圖5A顯示了Bach1過(guò)表達(dá)引起細(xì)胞S期阻滯；圖5B顯示了Bach1過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡；圖5C顯示了Bach1過(guò)表達(dá)在48和72小時(shí)后抑制細(xì)胞增殖。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1 Bach1抑制細(xì)胞Wnt/β-catenin調(diào)控路徑試驗(yàn)

試驗(yàn)例1-1:Bach1抑制Wnt/β-catenin報(bào)告基因TOPFlash的活性和靶基因的表達(dá)

(1)細(xì)胞培養(yǎng)

HEK293T細(xì)胞在含10％胎牛血清的DMEM(美國(guó)Invitrogen公司)培養(yǎng)液中培養(yǎng)，37℃，CO₂濃度5％，人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMVEC)由美國(guó)馬薩諸塞大學(xué)邵榮教授贈(zèng)予，在ECM培養(yǎng)液中培養(yǎng)；Wnt3a條件培養(yǎng)基從Wnt3a細(xì)胞株(CRL-2647，購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù))制備：采用加10％胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)Wnt3a細(xì)胞4天，然后離心收集上清培養(yǎng)基，對(duì)照條件培養(yǎng)基從L細(xì)胞株(CRL-2648，購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù))制備：采用加10％小牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)L細(xì)胞4天，然后離心收集上清培養(yǎng)基，經(jīng)液氮速凍后-80℃長(zhǎng)期保存；

(2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染和熒光素酶(Luciferase，Luc)分析

細(xì)胞用脂質(zhì)體lipofectamin2000(美國(guó)Invitrogen公司)按照說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染TOPFlash或FOPFlash報(bào)告基因質(zhì)粒(美國(guó)Millipore公司)或者Bach1siRNA或?qū)φ誷iRNA，同時(shí)共轉(zhuǎn)染pCMV-β-galactosidase(β-gal)質(zhì)粒作為內(nèi)參；轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)18-20小時(shí)后，加入加有小于等于20μM的小分子藥物的Wnt3a條件培養(yǎng)基刺激16-20小時(shí)，然后用reporter lysis buffer(Promega公司)裂解細(xì)胞，用熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)(Promega公司)檢測(cè)；β-gal活性用分析緩沖液在37℃孵育1小時(shí)后，分光光度計(jì)測(cè)定420nm吸光度，Luc/β-gal比值為相對(duì)的Luc活性(定義為T(mén)OPFlash報(bào)告基因活性)，并以FOPFlash報(bào)告基因?yàn)閷?duì)照校正；

(3)RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄－實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)

細(xì)胞總RNA的提取按照說(shuō)明書(shū)用Tripure試劑制備；用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，以oligo(dT)18為引物，將2μg的總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；用特異性的引物擴(kuò)增VEGF，IL-8，c-Myc，cyclin D1，MMP-3和GAPDH的基因，引物序列如下：

VEGF上游引物(5’-ATCTTCAAGCCATCCTGTGTGC-3’)，

VEGF下游引物(5’-CAAGGCCCACAGGGATTTTC-3’)；

IL-8上游引物(5’-CTCTCTTGGCAGCCTTCCTGA-3’)，

IL-8下游引物(5’-CCCTCTGCACCCAGTTTTCCTT-3’)；

c-Myc上游引物(5’-ACAGCGTCTGCTCCACCT-3’)，

c-Myc下游引物(5’-CCTCATCTTCTTGTTCCTCCT-3’)；

cyclin D1上游引物(5’-TGGAGGTCTGCGAGGAACA-3’)，

cyclin D1下游引物(5’-CCTTCATCTTAGAGGCCACGAA-3’)；

MMP-3上游引物(5’-TGCTGTTTTTGAAGAATTTGGGTT-3’)，

MMP-3下游引物(5’-AGTTCCCTTGAGTGTGACTCG-3’)；

GAPDH上游引物(5’-CCATCTTCCAGGAGCGAGATC-3’)，

GAPDH下游引物(5’-GCCTTCTCCATGGTGGTGAA-3’)；

進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(方法按照SYBR green PCR master mix試劑盒的說(shuō)明書(shū))，用2^-△△Ct方法進(jìn)行定量分析；結(jié)果顯示，Bach1基因過(guò)表達(dá)抑制Wnt3a激活的TOPFlash報(bào)告基因活性；Bach1基因過(guò)表達(dá)抑制β-catenin激活的TOPFlash報(bào)告基因活性；Bach1基因抑制增加基礎(chǔ)或Wnt3a激活的TOPFlash報(bào)告基因活性；Bach1基因過(guò)表達(dá)抑制，Bach1基因減少促進(jìn)Wnt/β-catenin信號(hào)途徑靶基因的表達(dá)。

試驗(yàn)例1-2：Bach1抑制β-catenin與TCF4的蛋白結(jié)合

(1)蛋白免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)

HEK293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染TCF4-HA和Bach1-flag全長(zhǎng)或N-段或C-段Bach1質(zhì)粒，48小時(shí)后收集細(xì)胞裂解液用于免疫沉淀和免疫印記實(shí)驗(yàn)；免疫沉淀具體的步驟為：將細(xì)胞裂解液蛋白(1-1.5mg)與抗Flag的抗體(10μg)混合，4℃孵育3小時(shí)，然后加入蛋白A/G瓊脂糖珠20μl 4℃孵育過(guò)夜，將黏附有Flag抗原抗體復(fù)合物的瓊脂糖珠用RIPA緩沖液洗1次，PBS洗4次。最后加入2×SDS上樣緩沖液，將捕捉的蛋白100℃變性5分鐘，然后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印記；

(2)蛋白免疫印記實(shí)驗(yàn)

通過(guò)步驟：細(xì)胞RIPA緩沖液(150mM NaCl，100mM Tris，pH8.0，1％Triton X-100，1％脫氧膽酸鈉，1％SDS，5mM EDTA，10mM NaF，含蛋白酶抑制劑) 裂解細(xì)胞，冰上孵育30分鐘，12000rpm離心10分鐘收集含有總蛋白的上清，用Bio-Rad蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，等量蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，用含0.05％Tween 20，5％脫脂奶粉的PBS緩沖液封閉1小時(shí)，特定的抗體4℃孵育過(guò)夜，次日洗膜后用二抗孵育1小時(shí)，洗膜3-4次，用化學(xué)發(fā)光試(PE公司)按照說(shuō)明書(shū)操作，在化學(xué)發(fā)光儀上檢測(cè)特定蛋白條帶；

(3)TCF4融合蛋白與Bach1的結(jié)合實(shí)驗(yàn)

將構(gòu)建的TCF4原核表達(dá)載體PGEX-TCF4轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，挑取單菌落接種于含有100納克/毫升氨卞的2×YT培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜活化菌種，37℃放大培養(yǎng)至OD600約為0.9時(shí)，加入IPTG至終濃度為1mM，18℃誘導(dǎo)培養(yǎng)24小時(shí)后離心收集菌體；該菌體超聲裂解上清液即為T(mén)CF4融合蛋白，與GST-beads 4℃孵育過(guò)夜，再與轉(zhuǎn)染Bach1或β-catenin的HEK293T細(xì)胞裂解液4℃孵育過(guò)夜，結(jié)合在beads上的蛋白進(jìn)行Western blot，用抗體檢測(cè)相應(yīng)蛋白；結(jié)果表明，Bach1全長(zhǎng)或Bach1N-段與TCF4有結(jié)合。

試驗(yàn)例1-3:Bach1抑制β-catenin與CBP/P300的蛋白結(jié)合，抑制β-catenin的乙?；?/p>

已知CBP/P300是兩種組蛋白乙?；?，它們可以與β-catenin結(jié)合，促進(jìn)β-catenin的乙?；?，激活下游基因的轉(zhuǎn)錄，本實(shí)施例中，利用免疫共沉淀法分析Bach1對(duì)β-catenin與CBP/P300結(jié)合的影響，結(jié)果表明，Bach1抑制β-catenin與CBP/P300的蛋白結(jié)合；Bach1抑制β-catenin的乙酰化水平；

試驗(yàn)例1-4:Bach1通過(guò)招募HDAC1與Wnt靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，抑制靶基因轉(zhuǎn)錄

(1)組蛋白去乙酰化酶分析實(shí)驗(yàn)

用細(xì)胞核蛋白抽提試劑盒抽提HEK293T細(xì)胞的細(xì)胞核，按照說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞核中的組蛋白去乙?；富钚?美國(guó)Millipore公司)，在激發(fā)波長(zhǎng)360nm，發(fā)射波長(zhǎng)450nm讀熒光值；

(2)染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)

HEK293T細(xì)胞加入甲醛固定液，室溫固定10分鐘，收集將細(xì)胞沉淀超聲破碎染色質(zhì)，將DNA與Protein G磁珠，Bach1抗體4℃孵育過(guò)夜，結(jié)合在beads上的DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，引物序列如下：IL-8ChIP(-1—-193)上游引物(5’-TATTTTAAAGATCAAAGAAAACTTTCG-3’)，IL-8ChIP(-1—-193)下游引物(5’-TGCTCCGGTGGCTTTTTATATC-3’)；IL-8ChIP(-309—-418)上游引物(5’-TGGCTGGCTTATCTTCAC-3’)，IL-8ChIP(-309—-418)下游引物(5’-TAGAGTGGCAGGTGTTAG-3’)；IL-8ChIP(-833—-939)上游引物(5’-CTGGAGCATAAACATACC-3’)，IL-8ChIP(-833—-939)下游引物(5’-AATAGGAGGGCTTCAATA-3’)；

用免疫共沉淀法分析Bach1與HDCA1的相互作用，結(jié)果表明，Bach1與組蛋白去乙?；?(HDCA1)有結(jié)合；；Bach1過(guò)表達(dá)增加組蛋白去乙?；富钚?，酶活性的增加可以被特異性的組蛋白去乙酰化酶抑制劑Trichostatin A(TSA)所抑制；Bach1與IL-8啟動(dòng)子區(qū)(-1—-193)有結(jié)合；Bach1過(guò)表達(dá)招募HDAC1與IL-8的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，抑制β-catenin與IL-8的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，從而抑制IL-8基因轉(zhuǎn)錄。

實(shí)施例2：Bach1誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡，抑制細(xì)胞增殖試驗(yàn)

(1)細(xì)胞周期分析實(shí)驗(yàn)

利用Bach1腺病毒或?qū)φ障俨《靖腥救宋⒀軆?nèi)皮細(xì)胞，Bach1腺病毒(Ad-Bach1)或?qū)φ詹《?Ad-GFP)由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)公司提供；72小時(shí)后，收集細(xì)胞，用冰乙醇固定，離心后棄上清，加入1ml DNA染色液(含PI和RNaseA)，室溫孵育30分鐘，送至流式細(xì)胞儀檢測(cè)；

(2)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

利用Annexin V/PI試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡，收集人微血管內(nèi)皮細(xì)胞，每100μl細(xì)胞懸液加入5μl Alexa488annexin V(Component A)和1μl 100μg/ml PI工作液；室溫孵育15分鐘；加入400μl 1×annexin-binding buffer(Component C)，混勻，送至流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析；

(3)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞的增殖用bromodeoxyuridine(BrdU)參入法檢測(cè)，將Bach1腺病毒感染 的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(5000個(gè))種在96孔板中，每6個(gè)孔為一組，以未處理的作為對(duì)照，在不同時(shí)間點(diǎn)向培養(yǎng)液中加入BrdU孵育6小時(shí)，BrdU參入量的檢測(cè)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法檢測(cè)，以450nm的平均吸光度值來(lái)比較細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果表明，Bach1過(guò)表達(dá)引起細(xì)胞S期阻滯；Bach1過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡；Bach1過(guò)表達(dá)在48和72小時(shí)后抑制細(xì)胞增殖。

SEQUENCE LISTING

<110> 復(fù)旦大學(xué)

<120> 蛋白Bach1在制備細(xì)胞Wnt信號(hào)通路抑制劑中的用途

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 736

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Ser Leu Ser Glu Asn Ser Val Phe Ala Tyr Glu Ser Ser Val His

1 5 10 15

Ser Thr Asn Val Leu Leu Ser Leu Asn Asp Gln Arg Lys Lys Asp Val

20 25 30

Leu Cys Asp Val Thr Ile Phe Val Glu Gly Gln Arg Phe Arg Ala His

35 40 45

Arg Ser Val Leu Ala Ala Cys Ser Ser Tyr Phe His Ser Arg Ile Val

50 55 60

Gly Gln Ala Asp Gly Glu Leu Asn Ile Thr Leu Pro Glu Glu Val Thr

65 70 75 80

Val Lys Gly Phe Glu Pro Leu Ile Gln Phe Ala Tyr Thr Ala Lys Leu

85 90 95

Ile Leu Ser Lys Glu Asn Val Asp Glu Val Cys Lys Cys Val Glu Phe

100 105 110

Leu Ser Val His Asn Ile Glu Glu Ser Cys Phe Gln Phe Leu Lys Phe

115 120 125

Lys Phe Leu Asp Ser Thr Ala Asp Gln Gln Glu Cys Pro Arg Lys Lys

130 135 140

Cys Phe Ser Ser His Cys Gln Lys Thr Asp Leu Lys Leu Ser Leu Leu

145 150 155 160

Asp Gln Arg Asp Leu Glu Thr Asp Glu Val Glu Glu Phe Leu Glu Asn

165 170 175

Lys Asn Val Gln Thr Pro Gln Cys Lys Leu Arg Arg Tyr Gln Gly Asn

180 185 190

Ala Lys Ala Ser Pro Pro Leu Gln Asp Ser Ala Ser Gln Thr Tyr Glu

195 200 205

Ser Met Cys Leu Glu Lys Asp Ala Ala Leu Ala Leu Pro Ser Leu Cys

210 215 220

Pro Lys Tyr Arg Lys Phe Gln Lys Ala Phe Gly Thr Asp Arg Val Arg

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Thr Gly Glu Ser Ser Val Lys Asp Ile His Ala Ser Val Gln Pro Asn

245 250 255

Glu Arg Ser Glu Asn Glu Cys Leu Gly Gly Val Pro Glu Cys Arg Asp

260 265 270

Leu Gln Val Met Leu Lys Cys Asp Glu Ser Lys Leu Ala Met Glu Pro

275 280 285

Glu Glu Thr Lys Lys Asp Pro Ala Ser Gln Cys Pro Thr Glu Lys Ser

290 295 300

Glu Val Thr Pro Phe Pro His Asn Ser Ser Ile Asp Pro His Gly Leu

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Tyr Ser Leu Ser Leu Leu His Thr Tyr Asp Gln Tyr Gly Asp Leu Asn

325 330 335

Phe Ala Gly Met Gln Asn Thr Thr Val Leu Thr Glu Lys Pro Leu Ser

340 345 350

Gly Thr Asp Val Gln Glu Lys Thr Phe Gly Glu Ser Gln Asp Leu Pro

355 360 365

Leu Lys Ser Asp Leu Gly Thr Arg Glu Asp Ser Ser Val Ala Ser Ser

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Asp Arg Ser Ser Val Glu Arg Glu Val Ala Glu His Leu Ala Lys Gly

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Ser Pro Ala Val Ala Lys Asp Gly Ser Glu Gln Ile Ser Gln Lys Arg

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Ser Glu Cys Pro Trp Leu Gly Ile Arg Ile Ser Glu Ser Pro Glu Pro

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Gly Gln Arg Thr Phe Thr Thr Leu Ser Ser Val Asn Cys Pro Phe Ile

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Ser Thr Leu Ser Thr Glu Gly Cys Ser Ser Asn Leu Glu Ile Gly Asn

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Leu Lys Met His Lys Leu Thr Pro Glu Gln Leu Asp Cys Ile His Asp

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