本發(fā)明涉及蛋白制備領(lǐng)域，尤其涉及綜合利用Cohn組分四的方法。

背景技術(shù)：

Cohn組分四(Cohn Fraction IV)是常規(guī)工業(yè)化血漿蛋白生產(chǎn)過(guò)程中(低溫乙醇法)的副產(chǎn)物，現(xiàn)在通常作為廢棄物處理，其中含有多種功能血漿蛋白，如白蛋白、載脂蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等。

載脂蛋白A-I(ApolipoproteinA-I，apoA-I)是人體高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)的重要組成部分，維持HDL的正常結(jié)構(gòu)，在人體內(nèi)具有活化卵磷脂膽固醇轉(zhuǎn)酰酶的作用，也可以直接作用于動(dòng)脈壁，促進(jìn)膽固醇從動(dòng)脈壁流出，防止動(dòng)脈硬化的發(fā)生。除此之外，apoA-I在人體中還具有抗炎抗內(nèi)毒素的功能。另外apoA-I在藥學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用越來(lái)越多，可提高藥物納米粒的靶向性，Simon Mathew等人通過(guò)應(yīng)用HDL中apoA-I靶向SR-BI受體這一特點(diǎn)，將釓雙(萘)復(fù)合物包載于HDL中，實(shí)現(xiàn)腫瘤光熱療效的作用(Mathew S，Murakami T，Nakatsuji H，et al.Exclusive photothermal heat generation by a gadolinium bis(naphthalocyanine)complex and inclusion into modified high-density lipoprotein nanocarriers for therapeutic applications.[J].Acs Nano，2013，7(10)：8908-16.)。在靶向藥物研究中具有良好的應(yīng)用前景。載脂蛋白B(Apolipoprotein B，apoB)存在于低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)表面，是結(jié)合其受體(LDLr)的決定因子。它通過(guò)與LDLr結(jié)合介導(dǎo)LDL代謝，對(duì)人體內(nèi)的血脂平衡起到重要作用，臨床中，apoB/apoA1比值是檢測(cè)血脂的“金指標(biāo)”。除此之外，apoB通過(guò)與LDLr受體結(jié)合達(dá)到藥物載體的靶向效果。Jin-Ho Kim等人應(yīng)用低密度脂蛋白固體脂質(zhì)納米粒包載紫杉醇靶向腫瘤組織。(Kim J H，KimY，Bae K H，et al.Tumor-targeted Delivery of Paclitaxel using Low Density Lipoprotein-mimetic Solid Lipid Nanoparticles.[J].Molecular Pharmaceutics，2015，12(4)：1230-41.)載脂蛋白E(Apolipoprotein E，apoE)主要存在于血漿的乳糜微粒(chylomicron，CM)和極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)中，能與LDLr結(jié)合，在血漿膽固醇和甘油三酯的代謝中發(fā)揮作用。大部分藥物很難透過(guò)的血腦屏障(Blood-brain barrier，BBB)由于apoE能夠與LDL受體結(jié)合，因此，以連接了apoE的脂質(zhì)體作為載體，可以幫助藥物透過(guò)BBB。Qingxiang Song等人通過(guò)載脂蛋白E3-重組高密度脂蛋白來(lái)靶向大腦，并透過(guò)BBB，來(lái)達(dá)到治療阿爾茨海默病(Song Q，Huang M，Yao L，et al.Lipoprotein-based nanoparticles rescue the memory loss of mice with Alzheimer′s disease by acceleratingthe clearance of amyloid-beta.[J].AcsNano，2014，8(3)：2345-59.)。

白蛋白是血漿中含量最為豐富的蛋白，占血漿總蛋白量的60％。蛋白制劑給藥的主要目的是保持循環(huán)血量，改善組織和器官的微循環(huán)，從而解除休克，也可用于因白蛋白濃度暫時(shí)低下而出現(xiàn)的病態(tài)。在手術(shù)后對(duì)患者進(jìn)行白蛋白注射，可以減少水腫的出現(xiàn)，促進(jìn)傷口的愈合。同時(shí)白蛋白降解為氨基酸，可以補(bǔ)充體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)需求。白蛋白能與血液中的金屬離子如二價(jià)三價(jià)鐵離子結(jié)合，阻止他們作為自由基對(duì)于組織的破壞，在腦中輸入中等或大劑量的人血白蛋白可以有效保護(hù)腦皮層神經(jīng)細(xì)胞，減少梗死面積。

轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin，TRF)主要參與鐵在體內(nèi)的運(yùn)輸，而由于自由鐵參與催化氧化反應(yīng)，導(dǎo)致組織損傷，這使得不帶有鐵的TRF具有治療效果。已有報(bào)道采用TRF治療先天性無(wú)轉(zhuǎn)鐵蛋白血癥，從而減緩缺鐵性貧血癥狀。Zhi-Lan Chen等人應(yīng)用轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的脂質(zhì)體中，透過(guò)BBB將α-倒捻子素遞送到大腦中治療阿爾茨海默病(Chen ZL，Huang M，Wang XR，等.Transferrin-modified liposome promotesα-Mangostin to penetrate the blood-brain barrier.[J].Nanomedicine Nanotechnology Biology&Medicine，2015，12(2)：421-430)。α1-蛋白酶抑制劑在體內(nèi)主要由肝臟合成，是體內(nèi)最重要的蛋白酶抑制物。70％的血漿總蛋白酶抑制活性來(lái)源于a1-蛋白酶抑制劑，主要抑制胰蛋白酶和彈性蛋白酶的活性，還可抑制糜蛋白酶、纖維蛋白溶酶、凝血酶和膠原酶等。現(xiàn)在已經(jīng)有多個(gè)通過(guò)審批的a1-蛋白酶抑制劑濃縮劑，來(lái)補(bǔ)充肺氣腫病人缺乏的a1-蛋白酶抑制劑。

綜上，血漿功能蛋白具有的重要的臨床價(jià)值和關(guān)鍵的臨床療效；另外，由于各自都能與特定的受體結(jié)合，具有高效的靶向性，對(duì)于靶向藥物設(shè)計(jì)具有十分重要的作用；因此這四種蛋白是血漿蛋白中功能性極高的一部分蛋白。

目前利用Cohn組分四提純蛋白質(zhì)的報(bào)道主要為針對(duì)其中單一蛋白進(jìn)行分離，中國(guó)專利CN 102731642A中公開(kāi)了一種利用DEAE sepharose FF層析和Butyl疏水層析提取apoA-I的方法。該方法過(guò)程中大量使用尿素，吐溫80及磷酸三丁酯等試劑，引入其他化學(xué)雜質(zhì)。

此外還有報(bào)道是針對(duì)Cohn組分四中含量較高的幾種蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，中國(guó)專利CN 102977180A利用離子交換層析、疏水層析和親和層析等方法分步驟提取白蛋白、免疫球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、結(jié)合珠蛋白、α2-巨球蛋白、α1-抗胰蛋白酶、銅藍(lán)蛋白、抗凝血酶III、載脂蛋白A1、C1酯酶抑制劑等蛋白的方法。其一個(gè)完整的生產(chǎn)周期中，多次使用層析方法，步驟繁多，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，不適合工業(yè)放大。除此之外，層析使用較多，不僅降低了分離柱使用效率，對(duì)于樣品的濃集效果較差，加大了生產(chǎn)成本同時(shí)延長(zhǎng)了生產(chǎn)周期。并且并未對(duì)Cohn組分四中的藥用價(jià)值血漿蛋白進(jìn)行選擇性的分離，并不適合工業(yè)生產(chǎn)中“綠色生產(chǎn)”概念。

因此，本領(lǐng)域非常需要一種能夠充分利用Cohn組分四中功能蛋白的方法，該方法工藝步驟簡(jiǎn)單，能實(shí)現(xiàn)“流水線”式生產(chǎn)，自動(dòng)化程度高，生產(chǎn)成本較低，消耗工時(shí)少，提高企業(yè)利益。適合機(jī)械化大生產(chǎn)。工藝過(guò)程中采用的試劑為生理環(huán)境緩沖液，一方面對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)影響小，活性不變，增加了臨床應(yīng)用以及科學(xué)研究的真實(shí)價(jià)值度，另一方面，產(chǎn)品中引入雜質(zhì)少，樣品純度高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在以血漿蛋白生產(chǎn)過(guò)程中的副產(chǎn)物Cohn組分四為原料，提供一種操作簡(jiǎn)單，成本低廉，得率高，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的高純度蛋白的方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明所述Cohn組分四是本領(lǐng)域公知的有關(guān)生物制品企業(yè)制備血漿制品所廢棄的血漿副產(chǎn)物。作為優(yōu)選，Cohn組分四固體與緩沖溶液質(zhì)量比為1∶2～1∶10。作為優(yōu)選，所述緩沖溶液可為馬來(lái)酸緩沖液、丙二酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、乳酸緩沖液、甲酸緩沖液、丁二酸緩沖液、乙酸緩沖液、丙二酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、哌嗪緩沖液、L-組氨酸緩沖液、Tris緩沖液、三乙醇胺緩沖液、二乙醇胺緩沖液、乙醇胺緩沖液以及雙胺丙烷緩沖液。

該方法包括下列步驟：

(1)Cohn組分四預(yù)處理：將Cohn組分四固體溶解于緩沖液中，充分溶解后低溫高速離心得到上清液I。調(diào)節(jié)上清液I的pH值，低溫高速離心除去雜蛋白，收集得到上清液II。

(2)分離：上清液II過(guò)層析柱，梯度洗脫分離，依次收集白蛋白、抗凝血酶III、銅藍(lán)蛋白、α1-抗胰蛋白酶、載脂蛋白B、轉(zhuǎn)鐵蛋白、載脂蛋白E、載脂蛋白A-I。

(3)滅菌，凍干，得各蛋白干粉。

作為優(yōu)選，所述步驟(1)中低溫高速離心條件為：轉(zhuǎn)速4000～10000rpm，溫度-10～15℃，離心時(shí)間10～120min；所述步驟(2)上清液I的pH值范圍為1.0～11.0；pH調(diào)節(jié)劑可為：氫氧化鈉水溶液、氫氧化鉀水溶液、鹽酸水溶液、醋酸水溶液等；所述步驟(2)中層析柱的填料包括下列一種：Sephadex系列凝膠過(guò)濾填料、Superdex系列凝膠過(guò)濾填料、Sephacryl系列凝膠過(guò)濾填料、Sepharose系列凝膠過(guò)濾填料、Superose系列凝膠過(guò)濾填料、Sepharose基架離子交換填料、Source基架離子交換填料、Capto基架離子交換填料、Sephadex基架離子交換填料、Source 15系列疏水層析填料、Sepharose系列疏水層析填料，層析柱體積優(yōu)選20～50mL；洗脫流速小于10mL/min；洗脫方式為pH梯度洗脫以及離子強(qiáng)度梯度洗脫；所述步驟(3)中滅菌方法為下列一種或者多種：巴斯德消毒法、干熱法、膜過(guò)濾法以及低pH孵放法；所述步驟(3)中冷凍干燥步驟中加入凍干保護(hù)劑，所述凍干保護(hù)劑為：甘露醇、乳糖、葡萄糖、海藻糖、山梨醇以及蔗糖，其含量為0％～25％。

本發(fā)明的特點(diǎn)在于：

本發(fā)明利用了層析技術(shù)，對(duì)Cohn組分四中的多種功能性血漿蛋白進(jìn)行了同一流程梯度分離純化。分離純化出的多種蛋白具有較高的純度和活性，純度可達(dá)98％以上。該工藝制備過(guò)程中不涉及有機(jī)試劑，操作安全，成本較低。且該過(guò)程工藝過(guò)程操作方便，提純周期短，便于工業(yè)化自動(dòng)生產(chǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1：本發(fā)明的工藝生產(chǎn)流程圖；

圖2：實(shí)施例3層析譜圖，其中橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo)為280nm處的吸光度。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所述的具體實(shí)施例用以說(shuō)明本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

將Cohn組分四固體50g溶解于100mL Tris緩沖液(pH 7.5～8.0)中，充分溶解。然后10000rpm，0℃條件下離心20min，去除助濾劑，得到上清液I。調(diào)節(jié)上清液I的pH值至2.0，分離雜蛋白得到上清液II，采用S-SOURCE 30裝柱，層析柱體積40mL。先用pH 2.0的馬來(lái)酸緩沖液平衡柱子，平衡10個(gè)柱體積，進(jìn)樣上清液II，以濃度為0至10M的pH 2.0馬來(lái)酸緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集圖譜上的各峰。

實(shí)施例2

將Cohn組分四固體50g溶解于150mL磷酸鹽緩沖液(pH 7.0～7.5)中，充分溶解。然后8000rpm，4℃條件下離心25min，去除助濾劑，得到上清液I。調(diào)節(jié)上清液I的pH值至4.0，分離雜蛋白得到上清液II，采用SP-Sepharose HP裝柱，層析柱體積40mL。先用pH 4.0的甲酸緩沖液平衡柱子，平衡10個(gè)柱體積，進(jìn)樣上清液II，以濃度為0至4M的pH 4.0甲酸緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集圖譜上的各峰。

實(shí)施例3

將Cohn組分四固體50g溶解于120mL pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中，充分溶解。然后8000rpm，4℃條件下離心20min，去除助濾劑，得到上清液I。調(diào)節(jié)上清液I的pH值至7.8，分離雜蛋白得到上清液II，采用Q瓊脂糖裝柱，層析柱體積50mL。先用pH 7.8的磷酸緩沖液平衡柱子，平衡10個(gè)柱體積，進(jìn)樣上清液II，以濃度為0至2M的pH 7.8磷酸緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集圖譜上的各峰。層析圖譜見(jiàn)圖2。

實(shí)施例4

將Cohn組分四固體50g溶解于120mLpH 7.4的磷酸鹽緩沖液中，充分溶解。然后8000rpm，4℃條件下離心20min，去除助濾劑，得到上清液I。調(diào)節(jié)上清液I的pH值至8.0，分離雜蛋白得到上清液II，采用DEAE-Sepharose FF裝柱，層析柱體積40mL。先用pH 8.0的磷酸緩沖液平衡柱子，平衡10個(gè)柱體積，進(jìn)樣上清液II，以濃度為0至3M的pH 8.0磷酸緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集圖譜上的各峰。

實(shí)施例5

將Cohn組分四固體500g溶解于1.5LpH 7.4的磷酸鹽緩沖液中，充分溶解。然后8000rpm，0℃條件下離心30min，去除助濾劑，得到上清液I。調(diào)節(jié)上清液I的pH值至10.0，分離雜蛋白得到上清液II，采用Q-Sepharose FF裝柱。先用pH 10.0的磷酸緩沖液平衡柱子，平衡10個(gè)柱體積，進(jìn)樣上清液II，以濃度為0至2M的pH 10.0磷酸緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，根據(jù)圖譜收集各峰。