本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種可溶性T細胞受體及其制法、和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

僅僅有兩種類型的分子能夠以特異性的方式識別抗原。其中一種是免疫球蛋白或抗體；另一種是T細胞受體(TCR)，它是由α鏈/β鏈或者γ鏈/δ鏈以異二聚體形式存在的細胞膜表面的糖蛋白。在95％的T細胞中TCR異質(zhì)二聚體由α和β鏈組成，而5％的T細胞具有由γ和δ鏈組成的TCR。天然αβ異質(zhì)二聚TCR具有α鏈和β鏈，α鏈和β鏈構(gòu)成αβ異源二聚TCR的亞單位。TCR的α和β鏈一般看作各有兩個“結(jié)構(gòu)域”，即TCRα鏈可變域(Vα)和TCRα鏈恒定域(Cα)，TCRβ鏈可變域(Vβ)和TCRβ鏈恒定域(Cβ)。

TCR是呈遞在主組織相容性復(fù)合體(MHC)上的特異性抗原肽的唯一受體，這種外源肽或內(nèi)源肽可能會是細胞出現(xiàn)異常的唯一跡象。在免疫系統(tǒng)中，通過抗原特異性的TCR與pMHC復(fù)合物的結(jié)合引發(fā)T細胞與抗原呈遞細胞(APC)直接的物理接觸，然后T細胞及APC兩者的其他細胞膜表面分子就發(fā)生相互作用，這就引起了一系列后續(xù)的細胞信號傳遞和其他生理反應(yīng)，從而使得不同抗原特異性的T細胞對其靶細胞發(fā)揮免疫效應(yīng)。因此，TCR對免疫系統(tǒng)的細胞免疫功能是至關(guān)重要的。

如同免疫球蛋白(抗體)作為抗原識別分子一樣，TCR也可以被開發(fā)應(yīng)用于診斷和治療?？扇苄訲CR有很廣泛的用途，它不僅可用于研究TCR-pMHC的相互作用，也可用作檢測感染的診斷工具或作為自身免疫病的標志物。類似地，可溶性TCR可以被用來將治療劑(如細胞毒素化合物或免疫刺激性化合物)輸送到呈遞特異性抗原的細胞，或者用來抑制T細胞(如那些與自身免疫性肽抗原進行反應(yīng)的T細胞)。另外，可溶性TCR還可與其他分子(如，抗-CD3抗體)結(jié)合來重新定向T細胞，從而使其靶向呈遞特定抗原的細胞,起到殺傷作用。

天然存在的TCR是一種膜蛋白，通過其跨膜區(qū)得以穩(wěn)定，對于獲得可溶性TCR蛋白而言，當(dāng)TCR與膜分離開時，獲得保持與其原配體(即pMHC)結(jié)合能力的可溶且穩(wěn)定的TCR是一件非常困難的事情(Shin,et al.,(1993)science259:1901)。其不穩(wěn)定性和蛋白產(chǎn)量低成為用TCR或其片段來開發(fā)治療劑或診斷試劑的主要障礙。有些文獻描述了截短形式的TCR，它僅僅包含胞外區(qū)或者僅僅包含胞外和胞質(zhì)區(qū)，盡管這樣的TCR可以被TCR特異性的抗體識別，但是產(chǎn)率很低，并且低濃度時不能識別主組織相容性復(fù)合體-肽復(fù)合物，說明其很容易變性，不夠穩(wěn)定。本領(lǐng)域技術(shù)人員致力于開發(fā)出可溶的、穩(wěn)定性T細胞受體。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種可溶且穩(wěn)定的異質(zhì)二聚TCR及其應(yīng)用。

本發(fā)明的第一方面，提供了一種αβ異質(zhì)二聚TCR，所述TCR的α鏈可變區(qū)與β鏈恒定區(qū)之間含有人工鏈間二硫鍵。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR的人工鏈間二硫鍵位于α鏈可變區(qū)的FR2及β鏈的恒定區(qū)之間。

在另一優(yōu)選例中，形成所述TCR的人工鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基取代了位于 TRAV的第46位或第47位氨基酸殘基。

在另一優(yōu)選例中，形成所述TCR的人工鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基取代了TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位或第61位氨基酸殘基。

在另一優(yōu)選例中，形成所述TCR的人工鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基取代了：

TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位氨基酸；

TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的61位氨基酸；

TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位氨基酸；或

TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位氨基酸。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR是可溶的。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR包含α鏈可變域和β鏈可變域以及除跨膜結(jié)構(gòu)域以外的全部或部分β鏈恒定域，但其不包含α鏈恒定域，所述TCR的α鏈可變域與β鏈形成異質(zhì)二聚體。

在另一優(yōu)選例中，β鏈恒定域中形成天然鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基被替換為另一氨基酸，優(yōu)選地，被替換為丙氨酸或絲氨酸。

在另一優(yōu)選例中，在所述TCRβ鏈恒定域的C末端截短以去除形成天然鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR包含(ⅰ)除其跨膜結(jié)構(gòu)域以外的全部或部分TCRα鏈，和(ⅱ)除其跨膜結(jié)構(gòu)域以外的全部或部分TCRβ鏈，其中(ⅰ)和(ⅱ)均包含TCR鏈的可變域和至少一部分恒定域。

在另一優(yōu)選例中，所述TCRα與β鏈恒定域之間不存在天然鏈間二硫鍵。

在另一優(yōu)選例中，在所述TCRα鏈和/或β鏈恒定區(qū)的C末端截短以去除形成天然鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基。

在另一優(yōu)選例中，所述TCRα鏈和/或β鏈恒定區(qū)中形成天然鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基被替換為另一殘基。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR的α鏈恒定區(qū)與β鏈恒定區(qū)之間含有人工鏈間二硫鍵。

在另一優(yōu)選例中，在TCRα鏈恒定區(qū)與β鏈恒定區(qū)之間形成人工鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基取代了：

TRAC*01外顯子1的48T和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的57S；

TRAC*01外顯子1的45T和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的77S；

TRAC*01外顯子1的10Y和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的17S；

TRAC*01外顯子1的45T和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的59D；

TRAC*01外顯子1的15S和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的15E；

TRAC*01外顯子1的53R和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的54S；

TRAC*01外顯子1的89P和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的19A；或

TRAC*01外顯子1的10Y和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的20E。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR的α鏈和/或β鏈的C-或N-末端結(jié)合有偶聯(lián)物。

在另一優(yōu)選例中，與所述TCR結(jié)合的偶聯(lián)物為可檢測標記物、治療劑、PK修飾部分或其組合。

在另一優(yōu)選例中，與所述TCR結(jié)合的治療劑為連接于所述TCR的α或β鏈的C-或N-末端的抗-CD3抗體。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR的Tm值≥45℃，優(yōu)選地≥50℃，更優(yōu)選地≥52℃，最優(yōu)選的≥55℃。

本發(fā)明的第二方面，提供了一種核酸分子，所述核酸分子包含編碼本發(fā)明第一方面所述的TCR的α鏈和/或β鏈的核酸序列或其互補序列。

本發(fā)明的第三方面，提供了一種載體，所述的載體含有本發(fā)明第二方面所述的核酸分子。

本發(fā)明的第四方面，提供了一種宿主細胞或遺傳改造的工程細胞，所述的細胞含有本發(fā)明第三方面所述的載體或染色體中整合有外源的本發(fā)明第二方面所述的核酸分子。

本發(fā)明的第五方面，提供了一種分離的細胞，其表達本發(fā)明第一方面所述的TCR。

本發(fā)明的第六方面，提供了一種制備本發(fā)明第一方面所述的T細胞受體的方法，包括步驟：

(i)培養(yǎng)本發(fā)明第四方面所述的宿主細胞，從而表達本發(fā)明第一方面所述的T細胞受體的α鏈和/或β鏈；

(ii)分離或純化出所述的α鏈和/或β鏈；

(iii)重折疊所述的α鏈和/或β鏈，獲得所述T細胞受體。

本發(fā)明的第七方面，提供了一種T細胞受體復(fù)合物，所述的復(fù)合物含有一個或多個本發(fā)明第一方面所述的TCR。

本發(fā)明的第八方面，提供了本發(fā)明第一方面所述的TCR的用途，用于制備治療腫瘤、病毒感染或自身免疫疾病的藥物或用于制備檢測MHC-肽復(fù)合體的試劑。

本發(fā)明的第九方面，提供了一種藥物組合物，其含有藥學(xué)上可接受的載體以及安全有效量的本發(fā)明第一方面所述的TCR、本發(fā)明第五方面所述的細胞或本發(fā)明第七方面所述的T細胞受體復(fù)合物。

本發(fā)明的第十方面，提供了一種治療疾病的方法，包括給需要治療的對象施用本發(fā)明第一方面所述的TCR、本發(fā)明第五方面所述的細胞、本發(fā)明第七方面所述的T細胞受體復(fù)合物或本發(fā)明第九方面所述的藥物組合物；

較佳地，所述的疾病包括：腫瘤、自身免疫疾病和病毒感染性疾病。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1a和圖1b分別是在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位形成人工鏈間二硫鍵的三結(jié)構(gòu)域1G4TCR分子的α鏈可變域氨基酸序列及β鏈氨基酸序列。

圖2a和圖2b分別是圖1a和圖1b中氨基酸所對應(yīng)的核苷酸序列。

圖3為圖1a和圖1b中所示TCRα鏈可變域與β鏈重折疊后經(jīng)凝膠過濾層析柱的洗脫曲線。

圖4為圖1a和圖1b中所示TCRα鏈可變域與β鏈經(jīng)重折疊及蛋白純化后的SEC圖譜。

圖5為圖1a和圖1b中所示TCRα鏈可變域與β鏈經(jīng)重折疊及蛋白純化后測得的 DSC熱譜圖。

圖6為圖1a和圖1b中所示TCRα鏈可變域與β鏈經(jīng)重折疊及蛋白純化后所得不同濃度的1G4TCR分子與其相應(yīng)抗原的結(jié)合曲線。

圖7a和圖7b分別是在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位形成人工鏈間二硫鍵的三結(jié)構(gòu)域JM22TCR分子的α鏈可變域氨基酸序列及β鏈氨基酸序列。

圖8a和圖8b分別是圖7a和圖7b中氨基酸所對應(yīng)的核苷酸序列。

圖9為圖7a和圖7b中所示TCRα鏈可變域與β鏈重折疊后經(jīng)凝膠過濾層析柱的洗脫曲線。

圖10為圖7a和圖7b中所示TCRα鏈可變域與β鏈經(jīng)重折疊及蛋白純化后的SEC圖譜。

圖11為圖7a和圖7b中所示TCRα鏈可變域與β鏈經(jīng)重折疊及蛋白純化后測得的DSC熱譜圖。

圖12為圖7a和圖7b中所示TCRα鏈可變域與β鏈經(jīng)重折疊及蛋白純化后所得不同濃度的JM22TCR分子與其相應(yīng)抗原的結(jié)合曲線。

圖13a和圖13b分別是在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位形成人工鏈間二硫鍵的三結(jié)構(gòu)域LC13TCR分子的α鏈可變域氨基酸序列及β鏈氨基酸序列。

圖14a和圖14b分別是圖13a和圖13b中氨基酸所對應(yīng)的核苷酸序列。

圖15為圖13a和圖13b中所示TCRα鏈可變域與β鏈重折疊后經(jīng)凝膠過濾層析柱的洗脫曲線。

圖16為圖13a和圖13b中所示TCRα鏈可變域與β鏈經(jīng)重折疊及蛋白純化后的SEC圖譜。

圖17為圖13a和圖13b中所示TCRα鏈可變域與β鏈經(jīng)重折疊及蛋白純化后測得的DSC熱譜圖。

圖18為圖13a和圖13b中所示TCRα鏈可變域與β鏈經(jīng)重折疊及蛋白純化后所得不同濃度的LC13TCR分子與其相應(yīng)抗原的結(jié)合曲線。

圖19是在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位形成人工鏈間二硫鍵的四結(jié)構(gòu)域1G4分子的α鏈氨基酸序列。

圖20是圖19中氨基酸所對應(yīng)的核苷酸序列。

圖21為在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位形成人工鏈間二硫鍵的四結(jié)構(gòu)域1G4TCRα鏈與β鏈重折疊后經(jīng)凝膠過濾層析柱的洗脫曲線。

圖22為在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位形成人工鏈間二硫鍵的四結(jié)構(gòu)域1G4TCRα鏈與β鏈重折疊及蛋白純化后的SEC圖譜。

圖23為在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位形成人工鏈間二硫鍵的四結(jié)構(gòu)域1G4TCRα鏈與β鏈重折疊及蛋白純化后測得的DSC熱譜圖。

圖24為在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位形成人工鏈間二硫鍵的四結(jié)構(gòu)域TCRα鏈與β鏈重折疊及蛋白純化后所得不同濃度的1G4TCR分子與其相應(yīng)抗原的結(jié)合曲線。

圖25是在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位形成人工鏈間二硫鍵的四結(jié)構(gòu)域JM22分子的α鏈氨基酸序列。

圖26是圖25中氨基酸所對應(yīng)的核苷酸序列。

圖27為在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位形成人工鏈間二硫鍵的四結(jié)構(gòu)域JM22TCRα鏈與β鏈重折疊后經(jīng)凝膠過濾層析柱的洗脫曲線。

圖28為在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位形成人 工鏈間二硫鍵的四結(jié)構(gòu)域JM22TCRα鏈與β鏈重折疊及蛋白純化后的SEC圖譜。

圖29為在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位形成人工鏈間二硫鍵的四結(jié)構(gòu)域JM22TCRα鏈與β鏈重折疊及蛋白純化后測得的DSC熱譜圖。

圖30為在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位形成人工鏈間二硫鍵的四結(jié)構(gòu)域TCRα鏈與β鏈重折疊及蛋白純化后所得不同濃度的JM22TCR分子與其相應(yīng)抗原的結(jié)合曲線。

圖31是在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位形成人工鏈間二硫鍵的四結(jié)構(gòu)域LC13分子的α鏈氨基酸序列。

圖32是圖31中氨基酸所對應(yīng)的核苷酸序列。

圖33為在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位形成人工鏈間二硫鍵的四結(jié)構(gòu)域LC13TCRα鏈與β鏈重折疊后經(jīng)凝膠過濾層析柱的洗脫曲線。

圖34為在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位形成人工鏈間二硫鍵的四結(jié)構(gòu)域LC13TCRα鏈與β鏈重折疊及蛋白純化后的SEC圖譜。

圖35a和圖35b分別為IMGT中列出的TRBC1*01和TRBC2*01的氨基酸序列。

圖36為在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位形成人工鏈間二硫鍵的四結(jié)構(gòu)域TCRα鏈與β鏈重折疊及蛋白純化后所得不同濃度的LC13TCR分子與其相應(yīng)抗原的結(jié)合曲線。

圖37a和圖37b分別是在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位形成人工鏈間二硫鍵的三結(jié)構(gòu)域1G4TCR分子的α鏈可變域氨基酸序列及β鏈氨基酸序列。

圖38a和圖38b分別是圖37a和圖37b中氨基酸所對應(yīng)的核苷酸序列。

圖39為圖37a和圖37b中所示TCRα鏈可變域與β鏈重折疊后經(jīng)凝膠過濾層析柱的洗脫曲線。

圖40為圖37a和圖37b中所示TCRα鏈可變域與β鏈經(jīng)重折疊及蛋白純化后的SEC圖譜。

圖41為圖37a和圖37b中所示TCRα鏈可變域與β鏈經(jīng)重折疊及蛋白純化后測得的DSC熱譜圖。

圖42為圖37a和圖37b中所示TCRα鏈可變域與β鏈經(jīng)重折疊及蛋白純化后所得不同濃度的TCR分子與其相應(yīng)抗原的結(jié)合曲線。

圖43是在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位形成人工鏈間二硫鍵的四結(jié)構(gòu)域1G4TCR分子的α鏈氨基酸序列。

圖44是圖43中氨基酸所對應(yīng)的核苷酸序列。

圖45為在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位形成人工鏈間二硫鍵的四結(jié)構(gòu)域TCRα鏈與β鏈重折疊后經(jīng)凝膠過濾層析柱的洗脫曲線。

圖46為在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位形成人工鏈間二硫鍵的四結(jié)構(gòu)域TCRα鏈與β鏈重折疊及蛋白純化后的SEC圖譜。

圖47為在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位形成人工鏈間二硫鍵的四結(jié)構(gòu)域TCRα鏈與β鏈重折疊及蛋白純化后測得的DSC熱譜圖。

圖48為在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位形成人工鏈間二硫鍵的四結(jié)構(gòu)域TCRα鏈與β鏈重折疊及蛋白純化后所得不同濃度的TCR分子與其相應(yīng)抗原的結(jié)合曲線。

圖49為在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位形成人工鏈間二硫鍵的三結(jié)構(gòu)域TCRα鏈與β鏈重折疊后經(jīng)凝膠過濾層析柱的洗脫曲線。

圖50為在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位形成人 工鏈間二硫鍵的三結(jié)構(gòu)域TCRα鏈與β鏈重折疊及蛋白純化后的SEC圖譜。

圖51為在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位形成人工鏈間二硫鍵的三結(jié)構(gòu)域TCRα鏈與β鏈重折疊及蛋白純化后測得的DSC熱譜圖。

圖52為在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位形成人工鏈間二硫鍵的三結(jié)構(gòu)域TCRα鏈與β鏈重折疊及蛋白純化后所得不同濃度的TCR分子與其相應(yīng)抗原的結(jié)合曲線。

圖53為在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位形成人工鏈間二硫鍵的四結(jié)構(gòu)域TCRα鏈與β鏈重折疊后經(jīng)凝膠過濾層析柱的洗脫曲線。

圖54為在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位形成人工鏈間二硫鍵的四結(jié)構(gòu)域TCRα鏈與β鏈重折疊及蛋白純化后的SEC圖譜。

圖55為在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位形成人工鏈間二硫鍵的四結(jié)構(gòu)域TCRα鏈與β鏈重折疊及蛋白純化后測得的DSC熱譜圖。

圖56為在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位形成人工鏈間二硫鍵的四結(jié)構(gòu)域TCRα鏈與β鏈重折疊及蛋白純化后所得不同濃度的TCR分子與其相應(yīng)抗原的結(jié)合曲線。

圖57為在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位形成人工鏈間二硫鍵的三結(jié)構(gòu)域TCRα鏈與β鏈重折疊后經(jīng)凝膠過濾層析柱的洗脫曲線。

圖58為在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位形成人工鏈間二硫鍵的三結(jié)構(gòu)域TCRα鏈與β鏈重折疊及蛋白純化后的SEC圖譜。

圖59為在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位形成人工鏈間二硫鍵的三結(jié)構(gòu)域TCRα鏈與β鏈重折疊及蛋白純化后測得的DSC熱譜圖。

圖60為在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位形成人工鏈間二硫鍵的三結(jié)構(gòu)域TCRα鏈與β鏈重折疊及蛋白純化后所得不同濃度的TCR分子與其相應(yīng)抗原的結(jié)合曲線。

圖61為在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位形成人工鏈間二硫鍵的四結(jié)構(gòu)域TCRα鏈與β鏈重折疊后經(jīng)凝膠過濾層析柱的洗脫曲線。

圖62為在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位形成人工鏈間二硫鍵的四結(jié)構(gòu)域TCRα鏈與β鏈重折疊及蛋白純化后的SEC圖譜。

圖63為在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位形成人工鏈間二硫鍵的四結(jié)構(gòu)域TCRα鏈與β鏈重折疊及蛋白純化后測得的DSC熱譜圖。

圖64為在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位形成人工鏈間二硫鍵的四結(jié)構(gòu)域TCRα鏈與β鏈重折疊及蛋白純化后所得不同濃度的TCR分子與其相應(yīng)抗原的結(jié)合曲線。

圖65為在1G4TCR分子α鏈可變區(qū)與β鏈恒定區(qū)之間不同位置含有人工鏈間二硫鍵的三結(jié)構(gòu)域可溶蛋白的膠圖。

圖66為在不同TCR分子α鏈可變區(qū)與β鏈恒定區(qū)之間含有人工鏈間二硫鍵的三結(jié)構(gòu)域可溶蛋白的膠圖。

圖67為在1G4TCR分子α鏈可變區(qū)與β鏈恒定區(qū)之間不同位置含有人工鏈間二硫鍵的四結(jié)構(gòu)域可溶蛋白的膠圖。

圖68為在不同TCR分子α鏈可變區(qū)與β鏈恒定區(qū)之間含有人工鏈間二硫鍵的四結(jié)構(gòu)域可溶蛋白的膠圖。

圖69為本發(fā)明三結(jié)構(gòu)域TCR的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖70為本發(fā)明四結(jié)構(gòu)域TCR的結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實施方式

本發(fā)明通過廣泛而深入的研究，意外地獲得了一種可溶且穩(wěn)定的T細胞受體。 具體地，本發(fā)明TCR為αβ異質(zhì)二聚體，并且本發(fā)明TCR的α鏈可變區(qū)與β鏈恒定區(qū)之間含有共價的人工鏈間二硫鍵。更具體地，本發(fā)明TCR的人工鏈間二硫鍵位于α鏈的FR2及β鏈的恒定區(qū)之間。本發(fā)明還提供了所述TCR的用途，及其制備方法。

在描述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于所述的具體方法和實驗條件，因為這類方法和條件可以變動。還應(yīng)當(dāng)理解本文所用的術(shù)語其目的僅在于描述具體實施方案，并且不意圖是限制性的，本發(fā)明的范圍將僅由所附的權(quán)利要求書限制。

除非另外定義，否則本文中所用的全部技術(shù)與科學(xué)術(shù)語均具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

雖然在本發(fā)明的實施或測試中可以使用與本發(fā)明中所述相似或等價的任何方法和材料，本文在此處例舉優(yōu)選的方法和材料。

術(shù)語

T細胞受體

天然αβ異質(zhì)二聚TCR具有α鏈和β鏈，α鏈和β鏈構(gòu)成αβ異質(zhì)二聚TCR的兩個亞單位。TCR的α和β鏈一般看作各有兩個“結(jié)構(gòu)域”，即TCRα鏈可變域(Vα)和TCRα鏈恒定域(Cα)，TCRβ鏈可變域(Vβ)和TCRβ鏈恒定域(Cβ)。在天然TCR的近膜區(qū)Cα與Cβ鏈間存在一組二硫鍵，本發(fā)明中稱為“天然鏈間二硫鍵”。在本發(fā)明中，將人工引入的，位置與天然鏈間二硫鍵的位置不同的鏈間共價二硫鍵稱為“人工鏈間二硫鍵”。在本發(fā)明中，術(shù)語“本發(fā)明多肽”、“本發(fā)明的TCR”、“本發(fā)明的T細胞受體”可互換使用，都指在α鏈可變區(qū)與β鏈恒定區(qū)之間含有本發(fā)明人工鏈間二硫鍵的異質(zhì)二聚TCR。

廣義上講，TCRα和β鏈各包含可變區(qū)、連接區(qū)和恒定區(qū)，β鏈通常還在可變區(qū)和連接區(qū)之間含有短的多變區(qū)，但該多變區(qū)常視作連接區(qū)的一部分。TCR的α和β鏈一般看作各有兩個“結(jié)構(gòu)域”即可變域和恒定域，可變域由連接的可變區(qū)和連接區(qū)構(gòu)成，恒定域還包含跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)，胞質(zhì)區(qū)很短。

本發(fā)明TCR的命名方式采用國際免疫遺傳學(xué)信息系統(tǒng)(IMGT)中對TCR的命名方式。即，在該系統(tǒng)中，“TRAC*01”表示TCR的α鏈恒定區(qū)，其中“TR”表示T細胞受體基因，“A”表示α鏈基因，C表示恒定區(qū)，“01”表示等位基因1。同樣地，“TRBC1*01”或“TRBC2*01”表示β鏈恒定結(jié)構(gòu)域。在β鏈中存在兩個可能的恒定區(qū)基因“C1”和“C2”。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員廣為知曉并可得到IMGT中給出的TRAC*01與TRBC1*01或TRBC2*01的序列，例如可在IMGT的公開數(shù)據(jù)庫中找到(http://www.imgt.org/)。

“TRAV”表示TCR的α鏈可變區(qū)，其中“TR”表示T細胞受體基因，“A”表示α鏈基因，V表示可變區(qū)。同樣地，“TRBV”表示TCR的β鏈可變區(qū)。各可變區(qū)包含3個骨架結(jié)構(gòu)(framework regions，F(xiàn)R)以及嵌合在骨架結(jié)構(gòu)中的3個CDR(complementary determining region，互補決定區(qū))，CDR1、CDR2和CDR3。CDR區(qū)，尤其是CDR3決定了TCR的多樣性以及TCR與pMHC復(fù)合物的結(jié)合。3個骨架結(jié)構(gòu)分別為FR1，其在IMGT中的位置編號為1-26；FR2，其在IMGT中的位置編號為39-55；FR3，其在IMGT中的位置編號為66-104。不同TCR分子的骨架結(jié)構(gòu)是十分相似的(K.Christopher Garcia,et al.,Annu.Rev.Immunol.1999.17:369-397)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員廣為知曉并可得到IMGT中給出的TCR可變區(qū)骨架結(jié)構(gòu)及其在IMGT中的位置編號，例如可在IMGT的公開數(shù)據(jù)庫中找到(http://www.imgt.org/)。

為方便描述，本發(fā)明中TRAC*01與TRBC1*01或TRBC2*01氨基酸序列的位置編號按從N端到C端依次的順序進行位置編號，如TRBC1*01或TRBC2*01中，按從N端到C端依次的順序第60個氨基酸為P(脯氨酸)，則本發(fā)明中可將其描述為TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的60P，也可將其表述為TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位氨基酸，又如TRBC1*01或TRBC2*01中，按從N端到C端依次的順序第61個氨 基酸為Q(谷氨酰胺)，則本發(fā)明中可將其描述為TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的61Q，也可將其表述為TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位氨基酸，其他以此類推。TRBC1*01和TRBC2*01從N端到C端的氨基酸序列分別如圖35a和35b所示。本發(fā)明中，可變區(qū)TRAV與TRBV的氨基酸序列的位置編號，按照IMGT中列出的位置編號。如TRAV中的某個氨基酸，IMGT中列出的位置編號為46，則本發(fā)明中將其描述為TRAV第46位氨基酸，其他以此類推。綜上，本發(fā)明中提及的TRAV中氨基酸的位置是按照IMGT中列出的氨基酸序列的位置編號，TRBC1*01或TRBC2*01中氨基酸的位置則是按其從N端到C端依次的順序進行的位置編號。應(yīng)注意，IMGT中列出的氨基酸序列的位置編號與將氨基酸的序列按從N端到C端依次的順序進行的位置編號并不完全相同。

TCR的α鏈具有唯一的恒定區(qū)TRAC*01，β鏈的兩種恒定區(qū)僅有微小差別，TRBC1*01在其外顯子1中具有4N、5K和37F，而TRBC2*01在其外顯子1中具有4K、5N和37Y。因此，TCR分子β鏈的恒定區(qū)為TRBC1*01或為TRBC2*01基本沒有區(qū)別。本發(fā)明實施例中選用的β鏈的恒定區(qū)為TRBC2*01。

穩(wěn)定性

術(shù)語“穩(wěn)定性”指蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的任何方面。包括復(fù)性能力、表達能力、蛋白復(fù)性收率、熱穩(wěn)定性、抗聚集及抗解折疊等方面；更佳地，是指蛋白復(fù)性收率及熱穩(wěn)定性方面。

三結(jié)構(gòu)域TCR

術(shù)語“三結(jié)構(gòu)域TCR”指所述TCR包含α鏈可變域和β鏈可變域以及除跨膜結(jié)構(gòu)域以外的全部或部分β鏈恒定域，但其不包含α鏈恒定域，α鏈可變域與β鏈形成異質(zhì)二聚體，人工鏈間二硫鍵連接所述TCR的α鏈可變區(qū)與β鏈恒定區(qū)。本發(fā)明三結(jié)構(gòu)域TCR的結(jié)構(gòu)示意圖如圖69所示。應(yīng)注意，該示意圖僅用于說明本發(fā)明，并不能限制本發(fā)明的范圍。

四結(jié)構(gòu)域TCR

術(shù)語“四結(jié)構(gòu)域TCR”指所述TCR包含(ⅰ)除其跨膜結(jié)構(gòu)域以外的全部或部分TCRα鏈，和(ⅱ)除其跨膜結(jié)構(gòu)域以外的全部或部分TCRβ鏈，其中(ⅰ)和(ⅱ)均包含TCR鏈的可變域和至少一部分恒定域，α鏈與β鏈形成異質(zhì)二聚體，人工鏈間二硫鍵連接所述TCR的α鏈可變區(qū)與β鏈恒定區(qū)。本發(fā)明四結(jié)構(gòu)域TCR的結(jié)構(gòu)示意圖如圖70所示。應(yīng)注意，該示意圖僅用于說明本發(fā)明，并不能限制本發(fā)明的范圍。

發(fā)明詳述

本發(fā)明通過在TCR的α鏈可變區(qū)與β鏈恒定區(qū)之間引入共價人工鏈間二硫鍵，獲得了一種可溶且穩(wěn)定的異質(zhì)二聚T細胞受體。具體地，本發(fā)明TCR的人工鏈間二硫鍵位于α鏈可變區(qū)(TRAV)的FR2及β鏈的恒定區(qū)之間。更具體地，形成人工鏈間二硫鍵的位點可在TRAV的第46位或第47位氨基酸殘基與β鏈恒定區(qū)適宜的位點之間。同樣地，形成人工鏈間二硫鍵的位點也可在TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位或第61位氨基酸殘基與α鏈可變區(qū)適宜的位點之間。

在本發(fā)明的優(yōu)選例中，形成本發(fā)明TCR的人工鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基取代了：

TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位氨基酸；

TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位氨基酸；

TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位氨基酸；或

TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位氨基酸。

優(yōu)選地，TRAV的第46位氨基酸可以是D、A、P、T、S、C、L、H、Y或K；TRAV的第47位氨基酸可以是G、N、S、R、W、A或K。

在本發(fā)明的一個較佳實施方式中，本發(fā)明的TCR為三結(jié)構(gòu)域TCR，即所述TCR包含α鏈可變域和β鏈可變域以及除跨膜結(jié)構(gòu)域以外的全部或部分β鏈恒定域，但其不包含α鏈恒定域，α鏈可變域與β鏈形成異質(zhì)二聚體，人工鏈間二硫鍵連接所述TCR的α鏈可變區(qū)與β鏈恒定區(qū)。

優(yōu)選地，本發(fā)明的三結(jié)構(gòu)域TCR的β鏈包含除跨膜結(jié)構(gòu)域以外的全部恒定結(jié)構(gòu)域(即包含胞外和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域)。在這種情況下，β鏈中形成天然鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基優(yōu)選突變?yōu)椴粎⑴c二硫鍵形成的其他氨基酸殘基，優(yōu)選地，丙氨酸或絲氨酸。

更優(yōu)選地，本發(fā)明的三結(jié)構(gòu)域TCR的β鏈包含除跨膜結(jié)構(gòu)域以外的部分恒定結(jié)構(gòu)域，在這種情況下，β鏈中形成天然鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基優(yōu)選突變?yōu)椴粎⑴c二硫鍵形成的其他氨基酸殘基，優(yōu)選地，丙氨酸或絲氨酸?；蛘?，也可以在所述TCRβ鏈恒定域的C末端截短以去除形成天然鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基。優(yōu)選地，可在距形成天然鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個或更多個氨基酸處截短，以去掉形成天然鏈間二硫鍵的半胱氨酸。

在本發(fā)明的另一較佳實施方式中，本發(fā)明的TCR為四結(jié)構(gòu)域TCR，即所述TCR包含(ⅰ)除其跨膜結(jié)構(gòu)域以外的全部或部分TCRα鏈，和(ⅱ)除其跨膜結(jié)構(gòu)域以外的全部或部分TCRβ鏈，其中(ⅰ)和(ⅱ)均包含TCR鏈的可變域和至少一部分恒定域，α鏈與β鏈形成異質(zhì)二聚體，人工鏈間二硫鍵連接所述TCR的α鏈可變區(qū)與β鏈恒定區(qū)。

優(yōu)選地，本發(fā)明的四結(jié)構(gòu)域TCR中不包含天然鏈間二硫鍵。一方面，本發(fā)明的四結(jié)構(gòu)域TCR的α和/或β鏈可以包含除跨膜結(jié)構(gòu)域以外的全部恒定結(jié)構(gòu)域(即包含胞外和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域)。在這種情況下，各鏈中形成天然鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基優(yōu)選突變?yōu)椴粎⑴c二硫鍵形成的其他氨基酸殘基，優(yōu)選地，丙氨酸或絲氨酸。另一方面，本發(fā)明的四結(jié)構(gòu)域TCR的α和/或β鏈可以包含除跨膜結(jié)構(gòu)域以外的部分恒定結(jié)構(gòu)域，在這種情況下，各鏈中形成天然TCR鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基優(yōu)選突變?yōu)椴粎⑴c二硫鍵形成的其他氨基酸殘基，優(yōu)選地，丙氨酸或絲氨酸。更優(yōu)選地，在所述TCRα和/或β鏈恒定域的C末端截短以去除形成天然鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基。優(yōu)選地，可在距形成天然鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個或更多個氨基酸處截短，以去掉形成天然鏈間二硫鍵的半胱氨酸。但應(yīng)當(dāng)指出，本發(fā)明的TCR中也可包含天然的鏈間二硫鍵。

本發(fā)明的四結(jié)構(gòu)域TCR的α和β鏈恒定域間也可以包含人工鏈間二硫鍵，形成上述人工鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基取代了：

TRAC*01外顯子1的48T和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的57S；

TRAC*01外顯子1的45T和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的77S；

TRAC*01外顯子1的10Y和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的17S；

TRAC*01外顯子1的45T和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的59D；

TRAC*01外顯子1的15S和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的15E；

TRAC*01外顯子1的53R和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的54S；

TRAC*01外顯子1的89P和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的19A；或

TRAC*01外顯子1的10Y和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的20E。

應(yīng)注意，在某些情況下，僅一條TCR鏈具有形成天然鏈間二硫鍵的半胱氨酸，該半胱氨酸用于連接具有本發(fā)明人工鏈間二硫鍵的TCR分子與另外的分子。在TCR的β鏈中含有一個游離的未配對半胱氨酸殘基，在本發(fā)明中優(yōu)選將該半胱氨酸突變?yōu)榱硪话被?，如突變?yōu)榻z氨酸或丙氨酸。

應(yīng)理解，TCR的恒定結(jié)構(gòu)域并不直接參與TCR與pMHC的結(jié)合，在恒定域的C末端截短一定數(shù)量的氨基酸殘基基本不會對TCR的功能產(chǎn)生影響，因此本發(fā)明TCR的各條鏈還可以更短。可通過任何合適的方法測定本發(fā)明TCR與其相應(yīng)抗原的結(jié)合親和力 (與解離平衡常數(shù)KD成反比)。在本發(fā)明的優(yōu)選例中，TCR與其相應(yīng)pMHC的結(jié)合通過forteBIO Oke進行測定，如在本發(fā)明實施例4中所述。

可在本發(fā)明TCR鏈中引入適量的突變而不影響其功能性。突變形式包括(但不限于)：1-6個(通常為1-5個，較佳地1-3個，更佳地1-2個，最佳地1個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為5個以內(nèi)，較佳地為3個以內(nèi)，更佳地為2個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。

在TCR的α鏈可變區(qū)與β鏈恒定區(qū)之間引入人工鏈間二硫鍵可以獲得可溶且穩(wěn)定的本發(fā)明T細胞受體。進一步，本發(fā)明還鑒定出了α鏈可變區(qū)與β鏈恒定區(qū)中能夠突變?yōu)榘腚装彼嵋孕纬扇斯ゆ滈g二硫鍵的合適位點。本發(fā)明的TCR不僅包含人類的TCR，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明提供的信息，獲得其他物種的可溶且穩(wěn)定的TCR。

雖然其他物種的TCR的α鏈可變區(qū)和/或β鏈恒定區(qū)可能與人類TCR鏈的相應(yīng)部分不具有100％相同性，但本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠鑒定出相應(yīng)TCR的等同部分而得到待突變的半胱氨酸殘基。比如，可利用歐洲生物信息學(xué)學(xué)院網(wǎng)站獲得的ClustalW來將其他物種的TCR鏈與人類TCR鏈的相應(yīng)部分進行比對，來得到相應(yīng)的位點。

本發(fā)明包含人工鏈間二硫鍵連接的人類的可溶且穩(wěn)定的αβ異質(zhì)二聚TCR，以及其他哺乳動物的人工鏈間二硫鍵連接的αβTCR，所述哺乳動物包括但不限于山羊、綿羊、豬、小鼠和大鼠。

應(yīng)理解，本文中氨基酸名稱用國際通用的單英文字母標識，與其相對應(yīng)的氨基酸名稱三英文字母簡寫分別是：Ala(A)、Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Cys(C)、Gln(Q)、Glu(E)、Gly(G)、His(H)、Ile(I)、Leu(L)、Lys(K)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Ser(S)、Thr(T)、Trp(W)、Tyr(Y)、Val(V)。

本發(fā)明還包括本發(fā)明多肽的活性片段、衍生物和類似物。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)本發(fā)明TCR與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(與前導(dǎo)序列、分泌序列或6His等標簽序列融合而形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。

一類優(yōu)選的活性衍生物指具有至多5個，較佳地至多3個，更佳地至多2個，最佳地1個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表A進行氨基酸替換而產(chǎn)生。

表A

發(fā)明還提供本發(fā)明TCR的類似物。這些類似物與本發(fā)明原TCR多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。

修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括：體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。

本發(fā)明多肽還可以由藥學(xué)上或生理學(xué)可接受的酸或堿衍生的鹽形式使用。這些鹽包括(但不限于)與如下酸形成的鹽：氫氯酸、氫溴酸、硫酸、檸檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富馬酸、馬來酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羥乙磺酸。其他鹽包括：與堿金屬或堿土金屬(如鈉、鉀、鈣或鎂)形成的鹽，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常規(guī)的“前體藥物”的形式。

本發(fā)明的多肽可以多價復(fù)合體的形式提供。本發(fā)明的多價TCR復(fù)合體包含兩個、三個、四個或更多個與另一分子相連的T細胞受體分子。

本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明TCR的多核苷酸。本發(fā)明的核苷酸全長序列或其片段通常可以用但不限于PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(如載體)和細胞中。

本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細胞。

編碼序列

本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明TCR的多核苷酸，包括編碼本發(fā)明所述的T細胞受體的α鏈和/或β鏈的多核苷酸。

本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。例如，編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO:3、4、7、8、11、12、14、16、18、21、22、24所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO:1、2、5、6、9、10、13、15、17、19、20、23所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，但與上述相應(yīng)編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。

本發(fā)明的核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂玫幌抻赑CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(如載體)和細胞中。

本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細胞。

制備方法

形成人工鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基的引入可采用任何合適的方法，包括但不限于依據(jù)聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)的那些、依據(jù)限制性酶的克隆或不依賴連接的克隆(LIC)方法。許多標準分子生物學(xué)教材詳述了這些方法。聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)誘變和依據(jù)限制性酶的克隆的更多細節(jié)可參見Sambrook和Russell,(2001)分子克隆-實驗室手冊(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第三版)CSHL出版社。LIC方法的更多信息可見(Rashtchian,(1995)Curr Opin Biotechnol 6(1):30-6)。

本發(fā)明多肽可以是重組多肽或合成多肽。本發(fā)明的多肽可以是化學(xué)合成的，或重組的。相應(yīng)地，本發(fā)明多肽可用常規(guī)方法人工合成，也可用重組方法生產(chǎn)。

通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)，可利用本發(fā)明的多核苷酸來表達或生產(chǎn)重組的本發(fā)明多肽。一般來說有以下步驟：

(1)用編碼本發(fā)明TCR多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細胞；

(2)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細胞；

(3)從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化出本發(fā)明TCR多肽。

優(yōu)選地，可通過在細菌如大腸桿菌中以包涵體形式表達并進行體外重折疊來獲得本發(fā)明的可溶且穩(wěn)定的TCR。

藥物組合物和施用方法

本發(fā)明的TCR和本發(fā)明TCR轉(zhuǎn)染的T細胞可與藥學(xué)上可接受的載體一起在藥物組合物中提供。本發(fā)明的TCR、多價TCR復(fù)合物和細胞通常作為無菌藥物組合物的一部分提供，所述組合物通常包括藥學(xué)上可接受的載體。該藥物組合物可以是任何合適的形式(取決于給予患者的所需方法)。其可采用單位劑型提供，通常在密封的容器中提供，可作為試劑盒的一部分提供。此類試劑盒(但非必需)包括使用說明書。其可包括多個所述單位劑型。

本發(fā)明的TCR可以單獨使用，也可與偶聯(lián)物結(jié)合，優(yōu)選地以共價方式結(jié)合。所述偶聯(lián)物包括可檢測標記物、治療劑、PK(蛋白激酶)修飾部分或任何以上這些物質(zhì)的組合。

用于診斷目的的可檢測標記物包括但不限于：熒光或發(fā)光標記物、放射性標記物、MRI(磁共振成像)或CT(電子計算機X射線斷層掃描技術(shù))造影劑、或能夠產(chǎn)生可檢測產(chǎn)物的酶。

可與本發(fā)明TCR結(jié)合或偶聯(lián)的治療劑包括但不限于：1.放射性核素(Koppe等，2005，癌轉(zhuǎn)移評論(Cancer metastasis reviews)24，539)；2.生物毒素(Chaudhary等，1989，自然(Nature)339，394；Epel等，2002，癌癥免疫學(xué)和免疫治療(Cancer Immunology and Immunotherapy)51，565)；3.細胞因子(Gillies等，1992，美國國家科學(xué)院院刊(PNAS)89，1428；Card等，2004，癌癥免疫學(xué)和免疫治療(Cancer Immunology and Immunotherapy)53，345；Halin等，2003，癌癥研究(Cancer Research)63，3202)；4.抗體Fc片段(Mosquera等，2005，免疫學(xué)雜志(The Journal Of Immunology)174，4381)；5.抗體scFv片段(Zhu等，1995，癌癥國際期刊 (International Journal of Cancer)62,319)；6.金納米顆粒/納米棒(Lapotko等，2005，癌癥通信(Cancer letters)239，36；Huang等，2006，美國化學(xué)學(xué)會雜志(Journal of the American Chemical Society)128，2115)；7.病毒顆粒(Peng等，2004，基因治療(Gene therapy)11，1234)；8.脂質(zhì)體(Mamot等，2005，癌癥研究(Cancer research)65，11631)；9.納米磁粒；10.前藥激活酶(例如，DT-心肌黃酶(DTD)或聯(lián)苯基水解酶-樣蛋白質(zhì)(BPHL))；11.化療劑(例如，順鉑)等。

與本發(fā)明TCR結(jié)合(優(yōu)選地,共價結(jié)合)的抗體或其片段包括抗-T細胞或NK-細胞決定抗體，如抗-CD3或抗-CD28或抗-CD16抗體，優(yōu)選地抗-CD3抗體，上述抗體或其片段與TCR的結(jié)合能夠?qū)π?yīng)細胞進行定向更好地靶向靶細胞。

藥物組合物還可含有藥學(xué)上可接受的載體。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體：它們本身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對接受該組合物的個體有害的抗體，且給藥后沒有過分的毒性。這些載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在雷明頓藥物科學(xué)(Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991))中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的賦形劑的充分討論。這類載體包括但并不限于：鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐劑、及其組合。

治療性組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。

通常，可將治療性組合物制成可注射劑，例如液體溶液或懸液；還可制成在注射前適合配入溶液或懸液中、液體載體的固體形式。

一旦配成本發(fā)明的組合物，可將其通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)：眼內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。待預(yù)防或治療的對象可以是動物；尤其是人。

當(dāng)本發(fā)明的藥物組合物被用于實際治療時，可根據(jù)使用情況而采用各種不同劑型的藥物組合物。較佳地，可以例舉的有針劑、口服劑等。

這些藥物組合物可根據(jù)常規(guī)方法通過混合、稀釋或溶解而進行配制，并且偶爾添加合適的藥物添加劑，如賦形劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑、稀釋劑、緩沖劑、等滲劑(isotonicities)、防腐劑、潤濕劑、乳化劑、分散劑、穩(wěn)定劑和助溶劑，而且該配制過程可根據(jù)劑型用慣常方式進行。

本發(fā)明的藥物組合物還可以緩釋劑形式給藥。例如，本發(fā)明多肽可被摻入以緩釋聚合物為載體的藥丸或微囊中，然后將該藥丸或微囊通過手術(shù)植入待治療的組織。作為緩釋聚合物的例子，可例舉的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、聚羥基甲基丙烯酸酯(polyhydrometaacrylate)、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、乳酸聚合物、乳酸-乙醇酸共聚物等，較佳地可例舉的是可生物降解的聚合物如乳酸聚合物和乳酸-乙醇酸共聚物。

當(dāng)本發(fā)明的藥物組合物被用于實際治療時，作為活性成分的本發(fā)明多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽的劑量，可根據(jù)待治療的每個病人的體重、年齡、性別、癥狀程度而合理地加以確定。

本發(fā)明TCR的用途

本發(fā)明的TCR可用作藥物或診斷試劑?？赏ㄟ^修飾或其他改進以使其獲得更適于作為藥物或診斷試劑使用的特征。該藥物或診斷試劑可用于治療或診斷多種不同的疾病，所述疾病包括但不限于：癌癥(例如腎癌、卵巢癌、頭和頸癌、睪丸癌、肺癌、胃癌、子宮頸癌、膀胱癌、前列腺癌或黑素瘤等)、自身免疫病、病毒感染性疾病、移植排斥和移植物抗宿主病。

通過本發(fā)明TCR的特異性可實現(xiàn)藥物定位或靶向給藥，從而提高多種疾病的治療或診斷效果。

對于癌癥，定位于腫瘤或轉(zhuǎn)移癌的附近可提高毒素或免疫刺激物的效果。在自身免疫病中，可特異性地抑制對正常細胞或組織的免疫反應(yīng),或緩慢釋放免疫抑制藥，使其在更長的時間范圍內(nèi)產(chǎn)生更多的局部效果,從而對受試者的整體免疫能力的影響減至最小。在防止移植排斥中，可以同樣的方式優(yōu)化免疫抑制的作用。對于已存在藥物的病毒性疾病，例如HIV、SIV、EBV、CMV、HCV、HBV，藥物在感染細胞區(qū)域附近釋放或發(fā)揮激活功能也是有益的。

本發(fā)明的TCR可用于調(diào)節(jié)T細胞激活，本發(fā)明的TCR通過結(jié)合特異的pMHC并由此抑制T細胞活化。涉及T細胞介導(dǎo)的炎癥和/或組織損傷的自身免疫病可適于此方法，例如Ⅰ型糖尿病。

本發(fā)明的TCR也可用于將細胞毒性劑遞送至癌細胞的目的，或可用于轉(zhuǎn)染T細胞，從而使得它們能夠破壞呈遞HLA復(fù)合物的腫瘤細胞，以便在稱為過繼免疫治療的治療過程中給予患者。

本發(fā)明的TCR也可用作診斷試劑。用可檢測標記物對本發(fā)明的TCR進行標記，如用適用于診斷目的的標記物標記，來檢測MHC-肽與MHC-肽特異性的本發(fā)明TCR之間的結(jié)合。熒光標記的TCR多聚體適用于FACS分析，可用來檢測攜帶TCR特異性的肽的抗原呈遞細胞。

另外，可溶性的本發(fā)明TCR還可與其他分子，優(yōu)選地抗-CD3抗體，結(jié)合來重新定向T細胞，從而使其靶向呈遞特定抗原的靶細胞并進行殺傷。

工業(yè)應(yīng)用性

本發(fā)明可溶且穩(wěn)定的T細胞受體，可用于研究TCR與pMHC(肽-主組織相容性復(fù)合體)之間的相互作用及用于疾病的診斷和治療等目的。

本發(fā)明的主要優(yōu)點在于：

(1)本發(fā)明獲得了可溶且穩(wěn)定的T細胞受體，本發(fā)明的TCR能夠被很好地復(fù)性、重折疊、純化同時能夠與其原配體特異性結(jié)合。

(2)本發(fā)明的T細胞受體具有較高的Tm值。

(3)本發(fā)明的T細胞受體的蛋白復(fù)性收率高，易于大規(guī)模制備，并有利于降低生產(chǎn)成本。

下面結(jié)合具體實施例，進一步詳陳本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook和Russel l等人，分子克隆：實驗室手冊(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第三版)(2001)CSHL出版社中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。本發(fā)明實施例中所用的實驗材料如無特殊說明均可從市售渠道獲得。

實施例1 在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位形成人工鏈間二硫鍵的三結(jié)構(gòu)域1G4分子的引物設(shè)計和PCR突變

將TCR分子1G4(針對抗原短肽HLA-A2/SLLMWITQC(SEQ ID NO:25)，NY-ESO-1腫瘤特異性抗原)TRAV的第46位氨基酸突變?yōu)榘腚装彼?，并將其TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位氨基酸突變?yōu)榘腚装彼幔孕纬扇斯ゆ滈g二硫鍵。

上述TCR的TRAV的第46位氨基酸突變?yōu)榘腚装彼釙r，所設(shè)計的引物如下：

5’-3’

GTGGTTTCGTCAAGATTGCGGTAAAGGTCTGACC(SEQ ID NO:26)

GGTCAGACCTTTACCGCAATCTTGACGAAACCAC(SEQ ID NO:27)

上述TCR的TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位氨基酸突變?yōu)榘腚装彼釙r， 所設(shè)計的引物如下：

5’-3’

GGTGTTTCTACCGATTGCCAGCCGCTGAAAGAAC(SEQ ID NO:28)

GTTCTTTCAGCGGCTGGCAATCGGTAGAAACACC(SEQ ID NO:29)

進行PCR的步驟如下：

含1G4TCRα可變域和β鏈基因的表達質(zhì)粒pET28a+(Novagene)分別用上述α鏈可變域和β鏈引物進行如下突變。每個PCR點突變反應(yīng)中，將10-30ng的質(zhì)粒DNA與5μL 10×KOD plus緩沖液、5μL 2.5mM dNTP Mix、3μL 2mM MgSO4、1單位的KOD plus聚合酶(東洋紡上海生物科技有限公司)，10μM的上、下游引物各1μL，最終以H₂O補充至50μL?；靹蚝螅劣贐io-Rad PCR儀中反應(yīng)。94℃2min初始變性之后，進行18個循環(huán)的擴增(94℃15sec變性、55℃30sec退火和68℃6min延伸)。然后用10單位的DpnⅠ限制酶(New England Biolabs)37℃消化1小時。將10μL消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E.col i DH5α細菌中并在37℃下生長16小時。挑取單克隆在5mL LB+卡納青霉素中過夜培養(yǎng)。根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書應(yīng)用Zyppy質(zhì)粒小提試劑盒(ZYMO RESEARCH)純化質(zhì)粒DNA，并送至Invitrogen公司測序驗證，正確突變后用于下游表達。

含有本發(fā)明人工鏈間二硫鍵的三結(jié)構(gòu)域TCR分子1G4的α鏈可變域與β鏈胞外氨基酸序列分別如圖1a和1b所示，其對應(yīng)的核苷酸序列分別如圖2a和2b所示，引入的半胱氨酸殘基以加粗并帶下劃線的字母表示。

通過《分子克隆實驗室手冊》(Molecular Cloning a Laboratory Manual)(第三版，Sambrook和Russell)中描述的標準方法將上述TCRα和β鏈的目的基因序列經(jīng)合成后分別插入到表達載體pET28a+(Novagene)，上下游的克隆位點分別是NcoI和NotI。插入片段經(jīng)過測序確認無誤。

實施例2 TCR的表達、重折疊和純化及其結(jié)果測定

TCR蛋白的表達

將含有TCRα鏈可變域與β鏈的表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株BL21(DE3)中，涂布LB平板(卡那霉素50μg/ml)置于37℃培養(yǎng)過夜。次日，挑克隆接種至10ml LB液體培養(yǎng)基(卡那霉素50μg/ml)培養(yǎng)2-3h，按體積比1:100接種至1L LB培養(yǎng)基(卡那霉素50μg/ml)中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.5-0.8，然后使用終濃度為1mM的IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達。誘導(dǎo)4小時以后，以6000rpm離心10min收獲細胞。PBS緩沖液洗滌菌體一次，并且分裝菌體，取相當(dāng)于200ml的細菌培養(yǎng)物的菌體用5ml BugBuster Master Mix(Novagen)裂解細菌，以6000g離心15min收集包涵體。然后進行4次洗滌劑洗滌以去除細胞碎片和膜組分。然后，用緩沖液如PBS洗滌包涵體以除去洗滌劑和鹽。最終，將包涵體用含6M鹽酸胍緩沖溶液溶解，并測定包涵體濃度，將其分裝后置于-80℃冷凍保存。

TCR蛋白的重折疊

從-80℃超低溫冰箱中取出包涵體解凍，加二硫蘇糖醇(DTT)至終濃度為10mM，在37℃中溫育30min到1小時以確保二硫鍵完全打開。然后將包涵體樣品溶液(9.2mgα鏈和10mgβ鏈)先后滴入200ml 4℃預(yù)冷重折疊緩沖液(100mM Tris pH 8.1，400mM L-精氨酸，2mM EDTA，5M尿素，6.5mM鹽酸半胱胺和1.87mM二鹽酸胱胺)，4℃緩慢攪拌約30分鐘。復(fù)性溶液用8倍體積預(yù)冷的H₂O透析16-20小時。再用8倍體積的20mM Tris pH 8.0透析兩次，4℃繼續(xù)透析約8小時，透析后樣品過濾后進行以下純化。

TCR蛋白的第一步純化

經(jīng)過透析的重折疊物(20mM Tri s pH 8.0中)使用GE Hitrap Q陰離子交換層析預(yù)裝柱(GE Healthcare)，在AKTA純化儀(GE Healthcare)用0-600mM NaCl進行 梯度洗脫。通過考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE分析各個組分，然后合并。

TCR蛋白的第二步純化

將第一步純化合并的樣品溶液濃縮以供此步純化，利用在PBS緩沖液中預(yù)平衡的Superdex 100 160/300 GL凝膠過濾層析預(yù)裝柱(GE Healthcare)純化蛋白，在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位引入本發(fā)明的人工鏈間二硫鍵后得到的三結(jié)構(gòu)域TCR分子的洗脫曲線如圖3所示。考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE分析出峰的組分，其還原和非還原膠圖如圖65的泳道1和泳道6所示。根據(jù)洗脫峰及膠圖可知，洗脫單峰為人工鏈間二硫鍵連接的可溶性TCR分子，該分子在SDS凝膠中形成單一條帶并穩(wěn)定存在，經(jīng)還原后形成分開的α鏈可變域和β鏈。

HPLC法測定TCR蛋白的純度

TCR蛋白在經(jīng)過兩步純化合并后，將洗脫組分用HPLC測試其純度。條件為：Agilent 1260,色譜柱Bio SEC-3(300A，φ7.8×300mm)，流動相為150mM磷酸鹽緩沖液，流速0.5mL/min，柱溫25℃，紫外檢測波長214nm。TCR分子的SEC(空間排阻色譜)譜圖如圖4所示。含有本發(fā)明人工鏈間二硫鍵的三結(jié)構(gòu)域TCR分子的HPLC洗脫峰單一且對稱，說明該蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，并沒有聚集或解折疊等現(xiàn)象的發(fā)生，純度非常高。

TCR蛋白復(fù)性收率的計算

本發(fā)明中TCR蛋白復(fù)性收率的計算方式如下：

蛋白復(fù)性收率(％)＝100*純化完成后所得蛋白量(mg)/復(fù)性所用包涵體的量(mg)。根據(jù)上述計算方式，在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位之間形成人工鏈間二硫鍵的1G4TCR分子的蛋白復(fù)性收率為49％。收率很高，說明在TCR的α鏈可變區(qū)與β鏈恒定區(qū)具有本發(fā)明人工鏈間二硫鍵三結(jié)構(gòu)域TCR分子可溶且穩(wěn)定。

實施例3 TCR的α鏈可變區(qū)與β鏈恒定區(qū)含有人工鏈間二硫鍵的TCR的穩(wěn)定性測試

將實施例2中獲得的1G4TCR蛋白(濃度0.5mg/ml)1ml透析至PBS中，利用美國TA(waters)公司的差示掃描量熱儀(Nano DSC)對TCR蛋白進行熱穩(wěn)定性測定。檢測的溫度范圍為10-90℃，升溫速率為1℃/min。用透析外液PBS作為對照，測定基線3次，待基線穩(wěn)定之后，再檢測蛋白樣品。采集數(shù)據(jù)之后，用分析軟件TA_DSC_NanoAnalyze測定TCR的Tm值，并得到其DSC熱譜圖。本發(fā)明的α鏈可變區(qū)與β鏈恒定區(qū)含有人工鏈間二硫鍵的TCR的DSC熱譜圖如圖5所示，其Tm值可以達到53℃。該熱譜圖能夠反映在室溫下，甚至溫度達到43-44℃，含有本發(fā)明人工鏈間二硫鍵的TCR分子都能維持正確折疊，并保持應(yīng)有的活性，說明其穩(wěn)定性很高。

實施例4 結(jié)合表征及特異性檢測

使用forteBIO Oke實時分析系統(tǒng)檢測TCR蛋白與其對應(yīng)抗原pMHC復(fù)合物的結(jié)合活性。

在SA傳感器表面固定了約2nm的生物素化的pMHC復(fù)合物，再將0.05mM的生物素以10μL/min的流速流過芯片120s，封閉鏈霉親和素剩余的結(jié)合位點。采用動力學(xué)分析方法測定其親和力，使用PBST緩沖液(PBS+0.005％吐溫20，pH 7.4)將TCR蛋白稀釋成幾個不同的濃度(一般為64、32、16、8、4、0uM)，測定與其相對應(yīng)的pMHC的親和力。使用Evaluation軟件以1:1結(jié)合的模型擬合計算動力學(xué)參數(shù)。

上述pMHC復(fù)合物的制備過程如下：

a.純化

收集100ml誘導(dǎo)表達重鏈或輕鏈的E.col i菌液，于4℃8000g離心10min后用10ml PBS洗滌菌體一次，之后用5ml BugBuster Master Mix Extraction Reagents(Merck)劇烈震蕩重懸菌體，并于室溫旋轉(zhuǎn)孵育20min，之后于4℃，6000 g離心15min，棄去上清，收集包涵體。

將上述包涵體重懸于5ml BugBuster Master Mix中，室溫旋轉(zhuǎn)孵育5min；加30ml稀釋10倍的BugBuster，混勻，4℃6000g離心15min；棄去上清，加30ml稀釋10倍的BugBuster重懸包涵體，混勻，4℃6000g離心15min，重復(fù)兩次，加30ml 20mM Tris-HCl pH 8.0重懸包涵體，混勻，4℃6000g離心15min，最后用20mM Tris-HCl 8M尿素溶解包涵體，SDS-PAGE檢測包涵體純度，BCA試劑盒測濃度。

b.復(fù)性

合成所需的短肽(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司)溶解于DMSO至20mg/ml的濃度。輕鏈和重鏈的包涵體用8M尿素、20mM Tris pH 8.0、10mM DTT來溶解，復(fù)性前加入3M鹽酸胍、10mM醋酸鈉、10mM EDTA進一步變性。將短肽以25mg/L(終濃度)加入復(fù)性緩沖液(0.4M L-精氨酸、100mM Tris pH 8.3、2mM EDTA、0.5mM氧化性谷胱甘肽、5mM還原型谷胱甘肽、0.2mM PMSF，冷卻至4℃)，然后依次加入20mg/L的輕鏈和90mg/L的重鏈(終濃度，重鏈分三次加入，8h/次)，復(fù)性在4℃進行至少3天至完成，SDS-PAGE檢測能否復(fù)性成功。

c.復(fù)性后純化

用10體積的20mM Tri s pH 8.0作透析來更換復(fù)性緩沖液，至少更換緩沖液兩次來充分降低溶液的離子強度。透析后用0.45μm醋酸纖維素濾膜過濾蛋白質(zhì)溶液，然后加載到HiTrap Q HP(GE通用電氣公司)陰離子交換柱上(5ml床體積)。利用Akta純化儀(GE通用電氣公司)，20mM Tris pH 8.0配制的0-400mM NaCl線性梯度液洗脫蛋白，pMHC約在250mM NaCl處洗脫，收集諸峰組分，SDS-PAGE檢測純度。

d.生物素化

用Millipore超濾管將純化的pMHC分子濃縮，同時將緩沖液置換為20mM Tris pH 8.0，然后加入生物素化試劑0.05M Bicine pH 8.3、10mM ATP、10mM MgOAc、50μM D-Biotin、100μg/ml BirA酶(GST-BirA)，室溫孵育混合物過夜，SDS-PAGE檢測生物素化是否完全。

e.純化生物素化后的復(fù)合物

用Millipore超濾管將生物素化標記后的pMHC分子濃縮至1ml，采用凝膠過濾層析純化生物素化的pMHC，利用Akta純化儀(GE通用電氣公司)，用過濾過的PBS預(yù)平衡HiPrepTM 16/60S200HR柱(GE通用電氣公司)，加載1ml濃縮過的生物素化pMHC分子，然后用PBS以1ml/min流速洗脫。生物素化的pMHC分子在約55ml時作為單峰洗脫出現(xiàn)。合并含有蛋白質(zhì)的組分，用Millipore超濾管濃縮，BCA法(Thermo)測定蛋白質(zhì)濃度，加入蛋白酶抑制劑cocktail(Roche)將生物素化的pMHC分子分裝保存在-80℃。

不同濃度的含有本發(fā)明人工鏈間二硫鍵的1G4 TCR分子與其相應(yīng)抗原的結(jié)合曲線如圖6所示。從該結(jié)合曲線中可以看出，濃度的降低并沒有影響本發(fā)明TCR分子與其相應(yīng)抗原的結(jié)合，低濃度的TCR分子表現(xiàn)出與高濃度TCR分子相同的結(jié)合時間，也能夠從側(cè)面說明具有本發(fā)明人工鏈間二硫鍵的可溶性三結(jié)構(gòu)域TCR分子是較穩(wěn)定的。

TCR蛋白的特異性檢測

應(yīng)用forteBIO Oke實時分析系統(tǒng)檢測TCR蛋白對其相應(yīng)抗原pMHC復(fù)合物的特異性。含有本發(fā)明人工鏈間二硫鍵的TCR蛋白的特異性檢測方式如下：將TCR的相應(yīng)抗原pMHC復(fù)合物(已生物素化)及選定的幾種其他無關(guān)抗原pMHC復(fù)合物(已生物素化)分別加載到SA傳感器的表面，然后，與各個待測的TCR蛋白相互作用；最后，分析其互作所產(chǎn)生的信號。

按上述測定方法，含本發(fā)明人工鏈間二硫鍵的1G4 TCR蛋白只與其相應(yīng)抗原有 結(jié)合，與其他無關(guān)抗原均無相互作用。

實施例5 在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位形成人工鏈間二硫鍵的三結(jié)構(gòu)域TCR分子

本實施例進一步驗證了在TCR分子TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位形成人工鏈間二硫鍵后，能夠獲得可溶且穩(wěn)定的三結(jié)構(gòu)域TCR分子。

將TCR分子JM22(針對抗原短肽HLA-A2/GILGFVFTL(SEQ ID NO:30)，源自流感病毒基質(zhì)蛋白)和LC13(針對抗原短肽HLA-B4405：EEYLKAWTF(SEQ ID NO:31))TRAV的第46位氨基酸突變?yōu)榘腚装彼?，并將其TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位氨基酸突變?yōu)榘腚装彼?，以形成人工鏈間二硫鍵。

上述JM22TCR的TRAV的第46位氨基酸突變?yōu)榘腚装彼釙r，所設(shè)計的引物如下：

5’-3’

GTGGTATCGTCAAGAATGCGGTGAAGGTCCGGTC(SEQ ID NO:32)

GACCGGACCTTCACCGCATTCTTGACGATACCAC(SEQ ID NO:33)

上述JM22 TCR的TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位氨基酸突變?yōu)榘腚装彼釙r，所設(shè)計的引物如下：

5’-3’

GGTGTTTCTACCGATTGCCAGCCGCTGAAAGAAC(SEQ ID NO:34)

GTTCTTTCAGCGGCTGGCAATCGGTAGAAACACC(SEQ ID NO:35)

上述LC13TCR的TRAV的第46位氨基酸突變?yōu)榘腚装彼釙r，所設(shè)計的引物如下：

5’-3’

CATTGGTACCGTCAGCTGTGCAGCCAAGGTCCGG(SEQ ID NO:36)

CCGGACCTTGGCTGCACAGCTGACGGTACCAATG(SEQ ID NO:37)

上述LC13TCR的TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位氨基酸突變?yōu)榘腚装彼釙r，所設(shè)計的引物如下：

5’-3’

GGTGTTTCTACCGATTGCCAGCCGCTGAAAGAAC(SEQ ID NO:38)

GTTCTTTCAGCGGCTGGCAATCGGTAGAAACACC(SEQ ID NO:39)

采用實施例1至實施例4中所述方式對TCR進行PCR、復(fù)性及性能測試。

含有人工鏈間二硫鍵的本發(fā)明三結(jié)構(gòu)域TCR分子JM22的α鏈可變域與β鏈胞外氨基酸序列分別如圖7a和7b所示，其對應(yīng)的核苷酸序列分別如圖8a和8b所示，引入的半胱氨酸殘基以加粗并帶下劃線字母表示。其洗脫曲線和膠圖分別如圖9和圖66的泳道2(還原膠)和泳道5(非還原膠)所示。HPLC洗脫峰單一且對稱如圖10所示。蛋白復(fù)性收率達到了25％。其Tm值為54℃，對應(yīng)的DSC譜圖如圖11所示。JM22分子與其相應(yīng)抗原的結(jié)合曲線如圖12所示。

含有人工鏈間二硫鍵的本發(fā)明三結(jié)構(gòu)域TCR分子LC13的α鏈可變域與β鏈胞外氨基酸序列分別如圖13a和13b所示，其對應(yīng)的核苷酸序列分別如圖14a和14b所示，引入的半胱氨酸殘基以加粗并帶下劃線字母表示。其洗脫曲線和膠圖分別如圖15和圖66的泳道1(還原膠)和泳道4(非還原膠)所示。HPLC洗脫峰單一且對稱如圖16所示。蛋白復(fù)性收率也相當(dāng)高，達到了21％。其Tm值可以達到60℃，對應(yīng)的DSC譜圖如圖17所示。LC13分子與其相應(yīng)抗原的結(jié)合曲線如圖18所示。

由以上幾種分子的洗脫曲線和SDS膠圖可知，洗脫峰組份為本發(fā)明人工鏈間二硫鍵連接的可溶性TCR分子，在SDS凝膠中形成單一條帶并穩(wěn)定存在，經(jīng)還原后形成分開的α鏈可變域和β鏈。蛋白復(fù)性收率也都較高。另外，由本發(fā)明人工鏈間二硫鍵連接的TCR分子的Tm值也都很高，說明在較高的溫度下它們都能維持正確折疊，并保持應(yīng)有的活性，顯示其穩(wěn)定性很高。同時，TCR分子與其原配體的結(jié)合曲線顯示，TCR濃度的降低并沒有影響與其配體的結(jié)合，也能夠從側(cè)面說明具有本發(fā)明鏈間二硫 鍵的TCR分子是穩(wěn)定的。在特異性測試中，這些引入人工鏈間二硫鍵的本發(fā)明TCR分子只與其相應(yīng)抗原結(jié)合，與其他幾種無關(guān)抗原并無相互作用，展示了很好的特異性。因此，上述實驗數(shù)據(jù)證明了在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位引入人工鏈間二硫鍵，可以獲得可溶且穩(wěn)定的本發(fā)明三結(jié)構(gòu)域TCR蛋白。

實施例6 在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位形成人工鏈間二硫鍵的四結(jié)構(gòu)域TCR分子

本實施例驗證了在TCR分子TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位形成人工鏈間二硫鍵后，能夠獲得可溶且穩(wěn)定的四結(jié)構(gòu)域TCR分子。

分別將TCR分子1G4(針對抗原短肽HLA-A2/SLLMWITQC，NY-ESO-1腫瘤特異性抗原)、JM22(針對抗原短肽HLA-A2/GILGFVFTL，源自流感病毒基質(zhì)蛋白)和LC13(針對抗原短肽HLA-B4405：EEYLKAWTF)TRAV的第46位氨基酸突變?yōu)榘腚装彼?，并將其TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位氨基酸突變?yōu)榘腚装彼幔孕纬扇斯ゆ滈g二硫鍵。突變所用引物及步驟參照上述實施例。

采用實施例1至實施例4中所述方式對TCR進行PCR、復(fù)性及性能測試。稍有不同之處在于，實施例2中TCR重折疊步驟中，所用TCRα鏈與β鏈的包涵體的量分別為15mg及10mg。

含有人工鏈間二硫鍵的本發(fā)明四結(jié)構(gòu)域TCR分子1G4的α鏈與β鏈胞外氨基酸序列分別如圖19和1b所示，其對應(yīng)的核苷酸序列分別如圖20和2b所示，引入的半胱氨酸殘基以加粗并帶下劃線字母表示。其洗脫曲線和膠圖分別如圖21和圖67的泳道1(還原膠)和泳道6(非還原膠)所示。HPLC洗脫峰單一且對稱如圖22所示。蛋白復(fù)性收率達到了35％。其Tm值為56℃，對應(yīng)的DSC譜圖如圖23所示。1G4分子與其相應(yīng)抗原的結(jié)合曲線如圖24所示。

含有人工鏈間二硫鍵的本發(fā)明四結(jié)構(gòu)域TCR分子JM22的α鏈與β鏈胞外氨基酸序列分別如圖25和7b所示，其對應(yīng)的核苷酸序列分別如圖26和8b所示，引入的半胱氨酸殘基以加粗并帶下劃線字母表示。其洗脫曲線和膠圖分別如圖27和圖68的泳道2(還原膠)和泳道5(非還原膠)所示。HPLC洗脫峰單一且對稱如圖28所示。蛋白復(fù)性收率達到了20％。其Tm值為53℃，對應(yīng)的DSC譜圖如圖29所示。JM22分子與其相應(yīng)抗原的結(jié)合曲線如圖30所示。

含有人工鏈間二硫鍵的本發(fā)明四結(jié)構(gòu)域TCR分子LC13的α鏈可變域與β鏈胞外氨基酸序列分別如圖31和13b所示，其對應(yīng)的核苷酸序列分別如圖32和14b所示，引入的半胱氨酸殘基以加粗并帶下劃線字母表示。其洗脫曲線和膠圖分別如圖33和圖68的泳道1(還原膠)和泳道4(非還原膠)所示。HPLC洗脫峰單一且對稱如圖34所示。蛋白復(fù)性收率也相當(dāng)高，達到了22％。其Tm值可以達到60℃。LC13分子與其相應(yīng)抗原的結(jié)合曲線如圖36所示。

由以上幾種分子的洗脫曲線和SDS膠圖可知，洗脫峰組份為本發(fā)明人工鏈間二硫鍵連接的可溶性四結(jié)構(gòu)域TCR分子，在SDS凝膠中形成單一條帶并穩(wěn)定存在，經(jīng)還原后形成分開的α鏈和β鏈。蛋白復(fù)性收率也都較高。另外，由本發(fā)明人工鏈間二硫鍵連接的TCR分子的Tm值也都很高，說明在較高的溫度下它們都能維持正確折疊，并保持應(yīng)有的活性，顯示其穩(wěn)定性很高。同時，TCR分子與其原配體的結(jié)合曲線顯示，TCR濃度的降低并沒有影響與其配體的結(jié)合，也能夠從側(cè)面說明具有本發(fā)明鏈間二硫鍵的TCR分子是穩(wěn)定的。在特異性測試中，這些引入本發(fā)明人工鏈間二硫鍵的TCR分子只與其相應(yīng)抗原結(jié)合，與其他幾種無關(guān)抗原并無相互作用，展示了很好的特異性。因此，上述實驗數(shù)據(jù)證明了在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位引入人工鏈間二硫鍵，可以獲得可溶且穩(wěn)定的本發(fā)明四結(jié)構(gòu)域TCR蛋白。

實施例7 在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位形成人工鏈間二硫鍵的三結(jié)構(gòu)域TCR分子

本實施例驗證了在TCR分子TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位形成人工鏈間二硫鍵后，能夠獲得可溶且穩(wěn)定的本發(fā)明三結(jié)構(gòu)域TCR分子。

將1G4TCR分子TRAV的第47位氨基酸突變?yōu)榘腚装彼?，并將其TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位氨基酸突變?yōu)榘腚装彼?，以形成人工鏈間二硫鍵。

上述TCR的TRAV的第47位氨基酸突變?yōu)榘腚装彼釙r，所設(shè)計的引物如下：

5’-3’

GTTTCGTCAAGATCCGTGCAAAGGTCTGACCAGC(SEQ ID NO：40)

GCTGGTCAGACCTTTGCACGGATCTTGACGAAAC(SEQ ID NO：41)

上述TCR的TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位氨基酸突變?yōu)榘腚装彼釙r，所設(shè)計的引物如下：

5’-3’

GTTTCTACCGATCCGtgcCCGCTGAAAGAACAG(SEQ ID NO：42)

CTGTTCTTTCAGCGGgcaCGGATCGGTAGAAAC(SEQ ID NO：43)

采用實施例1至實施例4中所述方式對TCR進行PCR、復(fù)性及性能測試。

含有人工鏈間二硫鍵的本發(fā)明三結(jié)構(gòu)域TCR分子的α鏈可變域與β鏈胞外氨基酸序列分別如圖37a和37b所示，其對應(yīng)的核苷酸序列分別如圖38a和38b所示，引入的半胱氨酸殘基以加粗并帶下劃線字母表示。其洗脫曲線和膠圖分別如圖39和圖65的泳道4(還原膠)和泳道9(非還原膠)所示。HPLC洗脫峰單一且對稱如圖40所示。蛋白復(fù)性收率達到了36％。其Tm值為52℃，對應(yīng)的DSC譜圖如圖41所示。TCR分子與其相應(yīng)抗原的結(jié)合曲線如圖42所示。

由以上的洗脫曲線和SDS膠圖可知，洗脫峰組份為本發(fā)明人工鏈間二硫鍵連接的可溶性三結(jié)構(gòu)域TCR分子，在SDS凝膠中形成單一條帶并穩(wěn)定存在，經(jīng)還原后形成分開的α鏈可變域和β鏈。蛋白復(fù)性收率也較高。另外，由本發(fā)明人工鏈間二硫鍵連接的TCR分子的Tm值很高，說明在較高的溫度下它們都能維持正確折疊，并保持應(yīng)有的活性，顯示其穩(wěn)定性很高。同時，TCR分子與其原配體的結(jié)合曲線顯示，TCR濃度的降低并沒有影響與其配體的結(jié)合，也能夠從側(cè)面說明具有本發(fā)明鏈間二硫鍵的TCR分子是穩(wěn)定的。在特異性測試中，這些引入本發(fā)明人工鏈間二硫鍵的TCR分子只與其相應(yīng)抗原結(jié)合，與其他幾種無關(guān)抗原并無相互作用，展示了很好的特異性。因此，上述實驗數(shù)據(jù)證明了在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位引入人工鏈間二硫鍵，可以獲得可溶且穩(wěn)定的本發(fā)明三結(jié)構(gòu)域TCR蛋白。

實施例8 在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位形成人工鏈間二硫鍵的四結(jié)構(gòu)域TCR分子

本實施例驗證了在TCR分子TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位形成人工鏈間二硫鍵后，能夠獲得可溶且穩(wěn)定的本發(fā)明四結(jié)構(gòu)域TCR分子。

將TCR分子TRAV的第47位氨基酸突變?yōu)榘腚装彼?，并將其TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位氨基酸突變?yōu)榘腚装彼?，以形成人工鏈間二硫鍵。突變所用引物及步驟參照上述實施例。

采用實施例1至實施例4中所述方式對TCR進行PCR、復(fù)性及性能測試。稍有不同之處在于，實施例2中TCR重折疊步驟中，所用TCRα鏈與β鏈的包涵體的量分別為15mg及10mg。

含有人工鏈間二硫鍵的本發(fā)明四結(jié)構(gòu)域TCR分子α鏈與β鏈胞外氨基酸序列分別如圖43和37b所示，其對應(yīng)的核苷酸序列分別如圖44和38b所示，引入的半胱氨酸殘基以加粗并帶下劃線字母表示。其洗脫曲線和膠圖分別如圖45和圖67的泳道4(還原膠)和泳道9(非還原膠)所示。HPLC洗脫峰單一且對稱如圖46所示。蛋白復(fù)性收率達到了43％。其Tm值為56℃，對應(yīng)的DSC譜圖如圖47所示。TCR分子與其相應(yīng)抗原的結(jié)合曲線如圖48所示。

由以上的洗脫曲線和SDS膠圖可知，洗脫峰組份為本發(fā)明人工鏈間二硫鍵連接的可溶性四結(jié)構(gòu)域TCR分子，在SDS凝膠中形成單一條帶并穩(wěn)定存在，經(jīng)還原后形成分開的α鏈和β鏈。蛋白復(fù)性收率也較高。另外，由本發(fā)明人工鏈間二硫鍵連接的TCR分子的Tm值很高，說明在較高的溫度下它們都能維持正確折疊，并保持應(yīng)有的活性，顯示其穩(wěn)定性很高。同時，TCR分子與其原配體的結(jié)合曲線顯示，TCR濃度的降低并沒有影響與其配體的結(jié)合，也能夠從側(cè)面說明具有本發(fā)明鏈間二硫鍵的TCR分子是穩(wěn)定的。在特異性測試中，這些引入本發(fā)明人工鏈間二硫鍵的TCR分子只與其相應(yīng)抗原結(jié)合，與其他幾種無關(guān)抗原并無相互作用，展示了很好的特異性。因此，上述實驗數(shù)據(jù)證明了在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位引入人工鏈間二硫鍵，可以獲得可溶且穩(wěn)定的本發(fā)明四結(jié)構(gòu)域TCR蛋白。

實施例9 在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位形成人工鏈間二硫鍵的三結(jié)構(gòu)域TCR分子

本實施例驗證了在TCR分子TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位形成人工鏈間二硫鍵后，能夠獲得可溶且穩(wěn)定的本發(fā)明三結(jié)構(gòu)域TCR分子。

將1G4TCR分子TRAV的第46位氨基酸突變?yōu)榘腚装彼幔⑵銽RBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位氨基酸突變?yōu)榘腚装彼?，以形成人工鏈間二硫鍵。突變所用引物及步驟參照上述實施例。

采用實施例1至實施例4中所述方式對TCR進行PCR、復(fù)性及性能測試。

含有人工鏈間二硫鍵的本發(fā)明三結(jié)構(gòu)域TCR分子的其洗脫曲線和膠圖分別如圖49和圖65的泳道2(還原膠)和泳道7(非還原膠)所示。HPLC洗脫峰單一且對稱如圖50所示。蛋白復(fù)性收率達到了37％。其Tm值為48℃，對應(yīng)的DSC譜圖如圖51所示。TCR分子與其相應(yīng)抗原的結(jié)合曲線如圖52所示。

由以上的洗脫曲線和SDS膠圖可知，洗脫峰組份為本發(fā)明人工鏈間二硫鍵連接的可溶性三結(jié)構(gòu)域TCR分子，在SDS凝膠中形成單一條帶并穩(wěn)定存在，經(jīng)還原后形成分開的α鏈可變域和β鏈。蛋白復(fù)性收率也較高。另外，由本發(fā)明人工鏈間二硫鍵連接的TCR分子的Tm值很高，說明在較高的溫度下它們都能維持正確折疊，并保持應(yīng)有的活性，顯示其穩(wěn)定性很高。同時，TCR分子與其原配體的結(jié)合曲線顯示，TCR濃度的降低并沒有影響與其配體的結(jié)合，也能夠從側(cè)面說明具有本發(fā)明鏈間二硫鍵的TCR分子是穩(wěn)定的。在特異性測試中，這些引入本發(fā)明人工鏈間二硫鍵的TCR分子只與其相應(yīng)抗原結(jié)合，與其他幾種無關(guān)抗原并無相互作用，展示了很好的特異性。因此，上述實驗數(shù)據(jù)證明了在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位引入人工鏈間二硫鍵，可以獲得可溶且穩(wěn)定的本發(fā)明三結(jié)構(gòu)域TCR蛋白。

實施例10 在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位形成人工鏈間二硫鍵的四結(jié)構(gòu)域TCR分子

本實施例驗證了在TCR分子TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位形成人工鏈間二硫鍵后，能夠獲得可溶且穩(wěn)定的本發(fā)明四結(jié)構(gòu)域TCR分子。

將1G4TCR分子TRAV的第46位氨基酸突變?yōu)榘腚装彼?，并將其TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位氨基酸突變?yōu)榘腚装彼幔孕纬扇斯ゆ滈g二硫鍵。突變所用引物及步驟參照上述實施例。

采用實施例1至實施例4中所述方式對TCR進行PCR、復(fù)性及性能測試。稍有不同之處在于，實施例2中TCR重折疊步驟中，所用TCRα鏈與β鏈的包涵體的量分別為15mg及10mg。

含有人工鏈間二硫鍵的本發(fā)明四結(jié)構(gòu)域TCR分子的其洗脫曲線和膠圖分別如圖53和圖67的泳道2(還原膠)和泳道7(非還原膠)所示。HPLC洗脫峰單一且對稱如圖54所示。蛋白復(fù)性收率達到了38％。其Tm值為50℃，對應(yīng)的DSC譜圖如圖55所示。TCR分子與其相應(yīng)抗原的結(jié)合曲線如圖56所示。

由以上的洗脫曲線和SDS膠圖可知，洗脫峰組份為本發(fā)明人工鏈間二硫鍵連接的可溶性四結(jié)構(gòu)域TCR分子，在SDS凝膠中形成單一條帶并穩(wěn)定存在，經(jīng)還原后形成分開的α鏈和β鏈。蛋白復(fù)性收率也較高。另外，由本發(fā)明人工鏈間二硫鍵連接的TCR分子的Tm值很高，說明在較高的溫度下它們都能維持正確折疊，并保持應(yīng)有的活性，顯示其穩(wěn)定性很高。同時，TCR分子與其原配體的結(jié)合曲線顯示，TCR濃度的降低并沒有影響與其配體的結(jié)合，也能夠從側(cè)面說明具有本發(fā)明鏈間二硫鍵的TCR分子是穩(wěn)定的。在特異性測試中，這些引入本發(fā)明人工鏈間二硫鍵的TCR分子只與其相應(yīng)抗原結(jié)合，與其他幾種無關(guān)抗原并無相互作用，展示了很好的特異性。因此，上述實驗數(shù)據(jù)證明了在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位引入人工鏈間二硫鍵，可以獲得可溶且穩(wěn)定的本發(fā)明四結(jié)構(gòu)域TCR蛋白。

實施例11 在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位形成人工鏈間二硫鍵的三結(jié)構(gòu)域TCR分子

本實施例驗證了在TCR分子TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位形成人工鏈間二硫鍵后，能夠獲得可溶且穩(wěn)定的本發(fā)明三結(jié)構(gòu)域TCR分子。

將1G4 TCR分子TRAV的第47位氨基酸突變?yōu)榘腚装彼?，并將其TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位氨基酸突變?yōu)榘腚装彼?，以形成人工鏈間二硫鍵。突變所用引物及步驟參照上述實施例。

采用實施例1至實施例4中所述方式對TCR進行PCR、復(fù)性及性能測試。

含有人工鏈間二硫鍵的本發(fā)明三結(jié)構(gòu)域TCR分子的其洗脫曲線和膠圖分別如圖57和圖65的泳道3(還原膠)和泳道8(非還原膠)所示。HPLC洗脫峰單一且對稱如圖58所示。蛋白復(fù)性收率達到了22％。其Tm值為48℃，對應(yīng)的DSC譜圖如圖59所示。TCR分子與其相應(yīng)抗原的結(jié)合曲線如圖60所示。

由以上的洗脫曲線和SDS膠圖可知，洗脫峰組份為本發(fā)明人工鏈間二硫鍵連接的可溶性三結(jié)構(gòu)域TCR分子，在SDS凝膠中形成單一條帶并穩(wěn)定存在，經(jīng)還原后形成分開的α鏈可變域和β鏈。蛋白復(fù)性收率也較高。另外，由本發(fā)明人工鏈間二硫鍵連接的TCR分子的Tm值很高，說明在較高的溫度下它們都能維持正確折疊，并保持應(yīng)有的活性，顯示其穩(wěn)定性很高。同時，TCR分子與其原配體的結(jié)合曲線顯示，TCR濃度的降低并沒有影響與其配體的結(jié)合，也能夠從側(cè)面說明具有本發(fā)明鏈間二硫鍵的TCR分子是穩(wěn)定的。在特異性測試中，這些引入本發(fā)明人工鏈間二硫鍵的TCR分子只與其相應(yīng)抗原結(jié)合，與其他幾種無關(guān)抗原并無相互作用，展示了很好的特異性。因此，上述實驗數(shù)據(jù)證明了在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位引入人工鏈間二硫鍵，可以獲得可溶且穩(wěn)定的本發(fā)明三結(jié)構(gòu)域TCR蛋白。

實施例12 在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位形成人工鏈間二硫鍵的四結(jié)構(gòu)域TCR分子

本實施例驗證了在TCR分子TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位形成人工鏈間二硫鍵后，能夠獲得可溶且穩(wěn)定的本發(fā)明四結(jié)構(gòu)域TCR分子。

將1G4 TCR分子TRAV的第46位氨基酸突變?yōu)榘腚装彼?，并將其TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位氨基酸突變?yōu)榘腚装彼幔孕纬扇斯ゆ滈g二硫鍵。突變所用引物及步驟參照上述實施例。

采用實施例1至實施例4中所述方式對TCR進行PCR、復(fù)性及性能測試。稍有不同之處在于，實施例2中TCR重折疊步驟中，所用TCRα鏈與β鏈的包涵體的量分別為15mg及10mg。

含有人工鏈間二硫鍵的本發(fā)明四結(jié)構(gòu)域TCR分子的其洗脫曲線和膠圖分別如圖61和圖67的泳道3(還原膠)和泳道8(非還原膠)所示。HPLC洗脫峰單一且對稱如圖62所示。蛋白復(fù)性收率達到了31％。其Tm值為52℃，對應(yīng)的DSC譜圖如圖63所示。TCR分子與其相應(yīng)抗原的結(jié)合曲線如圖64所示。

由以上的洗脫曲線和SDS膠圖可知，洗脫峰組份為本發(fā)明人工鏈間二硫鍵連接的可溶性四結(jié)構(gòu)域TCR分子，在SDS凝膠中形成單一條帶并穩(wěn)定存在，經(jīng)還原后形成分開的α鏈和β鏈。蛋白復(fù)性收率也較高。另外，由本發(fā)明人工鏈間二硫鍵連接的TCR分子的Tm值很高，說明在較高的溫度下它們都能維持正確折疊，并保持應(yīng)有的活性，顯示其穩(wěn)定性很高。同時，TCR分子與其原配體的結(jié)合曲線顯示，TCR濃度的降低并沒有影響與其配體的結(jié)合，也能夠從側(cè)面說明具有本發(fā)明鏈間二硫鍵的TCR分子是穩(wěn)定的。在特異性測試中，這些引入本發(fā)明人工鏈間二硫鍵的TCR分子只與其相應(yīng)抗原結(jié)合，與其他幾種無關(guān)抗原并無相互作用，展示了很好的特異性。因此，上述實驗數(shù)據(jù)證明了在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位引入人工鏈間二硫鍵，可以獲得可溶且穩(wěn)定的本發(fā)明四結(jié)構(gòu)域TCR蛋白。

在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。