本發(fā)明屬于生化分離
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種豬皮中分離純化的皮抑素G1的活性成分四連接素及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：皮抑素G1具有明顯的抑制表皮細(xì)胞有絲分裂的活性，因此可以作為緩解銀屑病癥狀的藥物，但半個(gè)多世紀(jì)來(lái)皮抑素G1既未用于治療銀屑病，亦未得到純化，因此人們對(duì)其主要活性成分的化學(xué)性質(zhì)知之甚少。目前有關(guān)皮抑素G1的研究除發(fā)明專利ZL201410036118.X外,未見其他報(bào)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：：本發(fā)明需要解決的問題是探索皮抑素G1的主要活性成分，了解其化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)及其在制備治療銀屑病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明從豬皮經(jīng)部分純化得到的皮抑素G1開始，進(jìn)一步純化，通過陽(yáng)離子交換凝膠層析，制備性SDS-PAGE,分離后將活性成分抽提物送質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)在各蛋白成分中含量最高的成份為豬四連接素，和磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(PEBP)。通過DNA重組技術(shù)，在大腸桿菌中成功表達(dá)了四連接素(TN)和PEBP兩種蛋白，并證實(shí)了TN具有很高的抑制活性，TN的單體活性更高，而PEBP雖然也有肯定的活性；但與TN比較則活性較低；顯示皮抑素G1中主要的具有抑制活性的成分為TN。本發(fā)明所述豬四連接素由181個(gè)氨基酸組成，分子量19792.9，pI為5.75，其氨基酸序列為：本發(fā)明以皮抑素G1為起始材料，通過陽(yáng)離子交換凝膠SP-sepharosFF柱層析，層析柱用pH6.80.02mol/L,PBS平衡后，將皮抑素G1調(diào)節(jié)pH至6.8上柱分離，最早出現(xiàn)一個(gè)極大的穿過峰，改變洗脫緩沖液PBS的pH值為8.0，出現(xiàn)一個(gè)很小的尖峰，稱為洗脫峰1，再在此堿性緩沖液中加入0.5mNaCl，又得到洗脫峰2，層析圖見圖1.將三部分蛋白，分別對(duì)水透析、脫鹽、凍干，加入pH6.8的0.02mol/LPBS溶解，測(cè)定活性.1、皮抑素G1活性測(cè)定方法(1)采用待試樣品對(duì)人表皮永生細(xì)胞株(HaCat)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制百分率表示活性。HaCat細(xì)胞由上海復(fù)祥生物技術(shù)有限公司提供。(2)測(cè)定方法：將HaCat細(xì)胞在含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，在5％CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用0.25％胰酶從培養(yǎng)瓶壁上消化10分鐘左右，振動(dòng)培養(yǎng)瓶，收集細(xì)胞，離心洗去酶液，用培養(yǎng)液配成3×104/ml細(xì)胞懸液，加入96孔培養(yǎng)板中，每孔加160μL細(xì)胞懸液，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，加入待測(cè)樣品40μL，待測(cè)樣品的配制：樣品除菌后測(cè)定蛋白濃度，用培養(yǎng)液配成2.5μg/ml濃度(100ng/40μL)并作17次倍比稀釋，每種濃度在每孔中加入40μL，共三個(gè)平行孔，對(duì)照組加40μL培養(yǎng)液，設(shè)6個(gè)平行孔，96孔板四周36個(gè)孔，因誤差較大，一般只加200μLHank’s液,不參與實(shí)驗(yàn)，加樣后96孔板在CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)，每孔中加入20μL5mg/ml的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，傾去上清，每孔加入100μL二甲基亞砜，溶液顯藍(lán)紫色，在酶標(biāo)儀OD492nm處讀數(shù)，以3個(gè)平行樣品孔的平均OD值與6個(gè)對(duì)照孔的平均OD值，計(jì)算抑制百分比。(3)活性單位，中值(ED50值)及比活性的計(jì)算：活性單位：以蛋白質(zhì)倍比稀釋的次數(shù)為橫坐標(biāo)，以抑制百分率為縱坐標(biāo)作圖可得一S型曲線，畫出上下平臺(tái)，取上下平臺(tái)的中值(ED50)查出中值時(shí)的抑制百分?jǐn)?shù)，每抑制1％規(guī)定為1個(gè)毫單位(1mU),從中值處的蛋白含量可計(jì)算出該蛋白的比活性(U/mg)比活性＝活性單位(U)/mg蛋白從倍比稀釋數(shù)換算成為蛋白量：如果中值時(shí)的稀釋次數(shù)為6.95。起始蛋白濃度為100ng/孔。中值為6.95的蛋白量為2-6.95×100ng＝0.8088ng如中值ED50為27.7mU則比活性為27.7mU/0.8088ng＝34248.2U/mg(4)活性測(cè)定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)僅洗脫峰1表現(xiàn)高活性，穿過峰無(wú)活性，洗脫峰2的比活性極低。峰1的活性測(cè)定結(jié)果見圖2.(5)將洗脫峰1進(jìn)行制備性SDS-PAGE分離，按考瑪斯藍(lán)染色顯示有四群蛋白，見圖3，將四群相應(yīng)位置的蛋白膠條切下，置于玻璃瓶中，用平頭玻璃棒盡量壓碎，用0.02mol/L的pH6.8PBS4℃浸提過夜，次日吸出上清液，重復(fù)此過程三次，合并四次抽提液，透析，凍干，溶解，測(cè)蛋白，測(cè)活性，結(jié)果顯示僅分子量2萬(wàn)左右的第3蛋白群表現(xiàn)高活性，見圖4.(6)將帶3蛋白再次進(jìn)行SDS-PAGE,并在前沿溴酚藍(lán)色帶出膠后再繼續(xù)電泳一小時(shí)，凝膠染色后帶3出現(xiàn)分子量很接近的二條蛋白，將此二塊凝膠送蘇州普泰公司進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第一條帶含7種成分，第二條帶含6種成分，分析結(jié)果見下表。表1.質(zhì)譜分析3號(hào)蛋白群中帶1和帶2中各成分的性質(zhì)(帶1含7個(gè)成分)編號(hào)含量％分子量MW性質(zhì)110.496262.41豬未知蛋白21.641522.89豬未知蛋白343.922575.29豬四連接素4034388.22豬未知蛋白51.363287.39豬G-6-Pisomerarc637.921072.67豬磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白74.915086.84豬血紅蛋白亞基α(帶2含6個(gè)成分)編號(hào)含量％分子量MW性質(zhì)176.722575.29豬四連接素21.7122636.09豬未知蛋白33.118966.95豬磷酸丙酮酸水合酶414.816212.48豬血紅蛋白亞基β53.715086.84豬血紅蛋白亞基α60.196262.41豬未知蛋白其中含量最高的為豬四連接素(TN),其次為磷脂酰乙醇胺(PEBP)結(jié)合蛋白，其余含量較低的蛋白有的是參與新陳代謝中已知的酶和血紅蛋白亞基，還有幾種豬未知蛋白，顯然其中TN和PEBP是皮抑素G1的主要活性成分。2為了辨明皮抑素G1的活性成分是TN還是PEBP，或者二者都沒有活性，而是含量極低的豬未知蛋白，為此委托南京德泰公司進(jìn)行TN和PEBP的DNA重組，并在大腸桿菌中成功表達(dá)，南京德泰生物技術(shù)公司對(duì)二種蛋白通過DNA重組技術(shù)分別在大腸桿菌中成功表達(dá)了四連接素TN和PEBP(分離方法相同)。工程細(xì)菌在含50μg/ml卡那霉素的LB試管中搖床(37℃，15rpm)中生長(zhǎng)過夜，次日接種到含50μg/ml卡那霉素的1LTB培養(yǎng)基中在搖床中生長(zhǎng)至OD600nm＝0.6-0.8時(shí)，將溫度降至15℃，1小時(shí)后加入終濃度0.5mol/L,IPTG誘導(dǎo)生長(zhǎng)16小時(shí)，離心收集細(xì)菌,分離純化步驟如下。(1)菌泥破碎和初步純化用BufferA:50mMNaCl,2mMDTT,1％TritonX-100,1μg/mlpepstatinA,1μg/mlLeupeptinpH8.0裂解菌泥。(2)超聲裂解超聲3s間歇8s，總計(jì)20min,離心13000rpm，20分鐘，4℃離心取沉淀，重復(fù)此步驟2次。(3)用BufferB:50mMTris，150mMNaCl,2mMDTT,2mMEDTA,1％TritonX-100,pH8.0洗滌包涵體，離心取沉淀，重復(fù)兩次。(4)用BufferC:50mMTris，150mMNaCl,2mMDTT,2mMEDTA,2M尿素,pH8.0洗滌包涵體，離心取沉淀。(5)用BufferD:50mMTris，150mMNaCl,10mMDTT,6MGdmCl,pH8.0洗滌包涵體，離心取上清。(6)分子篩層析純化SuperdexTM200(prep級(jí))，層析柱25/100，流速：2ml/minBufferE:50mMTris，150mMNaCl,8M尿素，Ph8.0分離結(jié)果見圖5.合并純度較高的13-17管，用考馬斯亮藍(lán)G250測(cè)定濃度，然后進(jìn)行稀釋復(fù)性(7)稀釋復(fù)性將純化后的目標(biāo)蛋白緩慢加入到200ml復(fù)性液BufferF:50mMTris-HCl，150mMNaCl,2mMGSH,0.4MmGSSG,0.4ML-精氨酸，2mMCaCl2,pH8.0中，使其終濃度約為0.3mg/ml,用磁力攪拌器4℃旋轉(zhuǎn)，總計(jì)復(fù)性24小時(shí)。(8)復(fù)性后純化稀釋復(fù)性液用0.45um濾膜過濾，去除不溶物，用濃縮管濃縮至3ml.(9)分子篩層析，純化。填料類型SuperdexTM200，prepgradc.層析柱型號(hào)16/100流速1ml/min純化bufferG50mMTris,150mMNacl,Ph8.0.分子篩層析純化結(jié)果見圖6(10)合并收集，測(cè)蛋白后分裝，凍干。SDS-PAGE分析，稀釋復(fù)性樣品的純度，結(jié)果見圖7.得率：高密度培養(yǎng)70-80g濕菌/L3用人表皮永生細(xì)胞Hacat測(cè)定樣品對(duì)細(xì)胞有絲分裂的抑制活性。結(jié)果顯示TN具有很高的抑制活性，因TN為一同質(zhì)三聚體。在分離純化過程中有保護(hù)劑DTT存在下單體以非共價(jià)結(jié)合方式聚合為三聚體，純化過程如不加保護(hù)劑則以單體形式存在，無(wú)論聚體或單體均有很高活性，但單體的比活性，達(dá)到150430μ/mg.而聚體為主的蛋白比活性為34248.3μ/mg.顯然單體表現(xiàn)更高的比活性。而PEBP也有一定活性但與TN比較則比活性相對(duì)低很多。僅4834μ/mg.結(jié)果見圖8、9、10.本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明通過以上結(jié)果顯示TN顯然是皮抑素的主要抑制活性的貢獻(xiàn)者，皮抑素G1的主要活性成分為豬四連接素(TN)，PEBP的比活性雖比TN低，但不能排除在銀屑病的治療中PEBP也起著一定作用，因PEBP本身除了有抑制表皮細(xì)胞有絲分裂的活性，它還具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。TN是1986年Clemmensen等人從人血漿中發(fā)現(xiàn)的,2002年已通過DNA重組技術(shù)得到純品，但至今仍處在研究階段。已知TN與很多疾病相關(guān)。如心血管病，免疫，骨質(zhì)疏松，肥胖，癌癥如乳腺癌、宮頸癌，肺癌，但無(wú)人報(bào)導(dǎo)TN與銀屑病有關(guān)。本發(fā)明采用TN的單克隆抗體檢測(cè)試劑盒測(cè)定了16例正常人(體檢人員)。16例肺癌病人和22例銀屑病人血漿中TN含量。結(jié)果肺癌病人血漿中TN的含量和報(bào)導(dǎo)的結(jié)果一致，與正常人水平比較十分低下。而銀屑病人血漿中TN的含量竟然和肺癌病人一樣絕大多數(shù)都十分低下，接近于零。正常人(體檢人員)425pg/ml-1740pg/ml肺癌病人＜5pg/ml銀屑病人＜5pg/ml根據(jù)以上結(jié)果判斷TN與銀屑病之間應(yīng)該有緊密的關(guān)系，目前雖然還不清楚TN的降低與銀屑病的因果關(guān)系，但是為皮抑素G1可以緩解銀屑病的癥狀提供了有力的依據(jù)。TN為從豬皮制備的皮抑素G1的主要活性物質(zhì)，TN可以制備成治療銀屑病的藥物。四.附圖說明圖1皮抑素G1的SP-sepharoseFF凝膠層析圖圖2SP-sepharoseFF柱層析分離峰1(PI)的活性測(cè)定圖3洗脫峰1(P1)的SDS-PAGE圖4SDS-PAGE分離第3號(hào)和第4號(hào)蛋白質(zhì)的生物活性圖5SEC分離圖譜及SDS-PAGE純度檢查圖6SDS-PAGE分析分子篩層析純化結(jié)果圖7SDS-PAGE分析TN的純度(5為加保護(hù)劑，6未加保護(hù)劑)圖8TN(三聚體為主)的活性測(cè)定圖9rhu-TN單體的活性測(cè)定圖10PEBP的活性測(cè)定五、具體實(shí)施方式1、皮抑素G1的制備7.5kg去脂豬皮，絞肉機(jī)絞成肉皮糜，加水44kg,膠體磨磨成勻漿，紗布粗濾后，渣滓再次加水勻漿。最后將濾渣和濾液合并，總體積達(dá)80L，10℃以下攪拌3小時(shí)，細(xì)布過濾，濾渣再加水?dāng)嚢?小時(shí)，合并二次濾液，以截止分子量1萬(wàn)膜超濾，以去除小分子雜質(zhì)，體積濃縮至1/10左右，以1:0.46比例加入95％醫(yī)用乙醇，使乙醇終濃度為30％，冰箱過夜，次日離心取上清，再按1:5.5比例加入95％醫(yī)用乙醇，使乙醇終濃度達(dá)到85％，4℃冰箱過夜。次日吸去上清，離心取沉淀。沉淀溶解在PH7.4，0.02mol/LPBS中離心取上清，沉淀再次懸浮，離心取上清，合并二次上清液得4.1L上清液除菌測(cè)蛋白，測(cè)活性，比活性為3520U/mg，經(jīng)試驗(yàn)對(duì)皮膚無(wú)刺激等毒性反應(yīng)后，即為皮抑素G1，蛋白濃度為36.3mg/ml。2、皮抑素軟膏的制備皮抑素軟膏配方采用中國(guó)醫(yī)科院皮研所藥房配方略作修改，3kg軟膏中含白蠟419g，白凡士林2374g。加熱至65℃融化，冷卻至55℃加入防腐劑2，6-二叔丁基對(duì)甲酚3g，皮抑素207ml(7.5g蛋白)混合均勻后在無(wú)菌室中加入已經(jīng)消毒的藥盒中，每盒30g，每克含皮抑素2.5mg，共100盒，存放冰箱中，供病人使用。3、治療效果第一例志愿病人為南京大學(xué)教師，男性70多歲，患銀屑病50年，有家族史。其外祖父患銀屑病，但母代無(wú)患者，病人為全身性嚴(yán)重尋常型銀屑病。患處皮膚為死皮屑覆蓋，彎折處常出血，影響飲食、睡眠，十分痛苦，曾經(jīng)中西藥治療，都是暫時(shí)緩解，不久又復(fù)發(fā)。在英國(guó)治療用鈣泊三醇藥膏煤焦油油膏，煤焦油藥浴，也是緩解又復(fù)發(fā)。試用本發(fā)明研制的皮抑素軟膏，為慎重起見，建議先用一條腿治療，每日早晚擦一次藥，試用三星期后病人興奮地告知治療的腿皮屑完全脫落，皮膚恢復(fù)柔軟平滑，只殘留色素沉淀。另一條未治療的腿仍是白色死皮屑覆蓋，形成鮮明對(duì)照。病人反映，皮抑素是他所有用過的藥中效果最好，無(wú)色無(wú)味無(wú)副作用，是最容易被接受的一種治療藥物。在這一病例的鼓舞下，在志愿者的要求和醫(yī)生配合下，共進(jìn)行了10多例斑塊型銀屑病人的治療。絕大多數(shù)都取得明顯改善。有的醫(yī)生再三詢問藥物中是否加有激素，經(jīng)告知未加任何激素完全是天然分離的蛋白，醫(yī)生反映說效果比加激素的進(jìn)口藥更好，而且從未有副作用發(fā)生，是一種安全有效的外用藥物。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3