專利名稱：含血漿蛋白的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及供釋放水溶性不良、與血漿蛋白有牢固的結(jié)合親和力的治療活性化合物的新方法、產(chǎn)品和制劑，本發(fā)明也涉及這類產(chǎn)品和制劑的制備方法。
更具體的是，本發(fā)明的第一個(gè)對(duì)象是固體或液體形式的、主要供非胃腸道給藥的產(chǎn)品和藥物制劑，它包括或由下列物質(zhì)組成a)水溶性低、與血漿蛋白有牢固的結(jié)合親和力的治療活性物質(zhì)(在下文中為“活性物質(zhì)”)b)處于控制聚集狀態(tài)的血漿蛋白組分其中所述的活性物質(zhì)和所述的蛋白組分通過(guò)非共價(jià)鍵彼此結(jié)合，和c)進(jìn)一步任選的藥學(xué)上可接受的、主要是可用于制劑添加劑，如水，穩(wěn)定劑，蛋白聚集控制劑。
由所述蛋白和所述物質(zhì)構(gòu)成的本發(fā)明均相固體狀態(tài)產(chǎn)品是水溶性的，它們的水溶液可非胃腸道給藥，或可用來(lái)制備非胃腸道給藥的藥品。
本技術(shù)領(lǐng)域公知的是，一些生物活性化合物具有潛在的治療活性，但從不顯示出其益處，因?yàn)樗鼈冊(cè)谒橘|(zhì)中溶解度很差。對(duì)它們中的一些從沒有進(jìn)行配制，而一些沒有達(dá)到臨床開發(fā)“第一期”狀態(tài)。它們中的一些由于用于配制的材料引起的相對(duì)毒性高的“幾乎沒有生物相容性的”制劑。一個(gè)典型的例子由紫杉酮(taxones)組代表，特別是紫杉醇(paclitaxel)為強(qiáng)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，但其使用減少，這是由于在Klucel里已知的配方的毒性吐溫80或Klucel的和稀釋劑12，11 Cremaphor EL乙醇的混合物。[癌癥化療和藥理學(xué)(Cancer Chemotherapyand Pharmacology)(1994)34465-471；國(guó)家癌癥機(jī)構(gòu)雜志(1990)1247-1259]。Cremaphor EL(聚氧乙烷化的蓖麻油)具有內(nèi)在毒性，會(huì)導(dǎo)致血管擴(kuò)張、無(wú)生氣、低血壓等。為了降低溶劑和輔劑的毒性副作用，提議使用一系列特殊的方法在較長(zhǎng)時(shí)間里使用極少劑量，在治療前進(jìn)行藥物預(yù)處理等。(USP 5665761；USP5621001；USP 5670537等)。進(jìn)一步的建議是使活性物質(zhì)與包含于蛋白壁的殼里的分散劑結(jié)合(USP 5 560 933)，所述的蛋白壁的殼通過(guò)使蛋白質(zhì)與諸如豆油的油反應(yīng)而形成—這類制劑可用于紫杉醇和兩性霉素。但即使最近的文獻(xiàn)中也警告注意如紫杉醇的使用療程(參見，如“實(shí)用指南(Gudiance for Industry”，美國(guó)人類健康服務(wù)部(CDER)頒布，1997，9，OGD-L-8)，其中—由于反應(yīng)的過(guò)度敏感性—所有用紫杉醇治療的病人應(yīng)當(dāng)用皮質(zhì)類固醇、苯海拉明和H2拮抗劑預(yù)治療。
進(jìn)一步提議通過(guò)使其溶于有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑與水的混合物里，向所述的溶液里加入水性的HSP溶液，以使不溶的活性物質(zhì)析出的結(jié)晶最少來(lái)制備特定的水不溶的二氫吡啶的非胃腸道給藥制劑(匈牙利專利No.198381；DE申請(qǐng)3702105)。但是，所得的液體仍然不是澄清的溶液。
進(jìn)一步已知的是，一些水不溶活性物質(zhì)與蛋白質(zhì)或血清蛋白具有相當(dāng)大的親和力。一些文獻(xiàn)提及了對(duì)紫杉醇的結(jié)合[Cancer Chem. and Pharm.(1994)34465-471]；對(duì)雙氯苯咪唑、fluconazole、兩性霉素B的結(jié)合[感染(Infection)，23(5)292-297(1995)9月]；對(duì)氨甲酰氮的結(jié)合(J.Chromatogr.B Biomed.Appl.669(2)281-288(1995，7，21)]；硫唑嘌呤的結(jié)合[Ann.N.Y.Acad.Sci，685(1993)175-192]，對(duì)普魯泊福的結(jié)合[J.Chromatogr.Sci(1992)164-166]。根據(jù)新文獻(xiàn)[柳葉刀，第352卷(1998)540-542]，藥物Taxol使紅細(xì)胞發(fā)生卷軸，作為所述藥物溶劑的聚環(huán)氧乙烷蓖麻油也是這樣。一些水不溶藥物(環(huán)孢素，鬼臼噻吩甙，紫杉醇，兩性霉素B)用毒性的Cremaphor配制。根據(jù)我們的了解，對(duì)于，如ritonavit，氨甲酰氮，喜樹堿，硫唑嘌呤，雙氯苯咪唑，氟康唑等，目前市場(chǎng)上尚沒有活性高但水不溶的藥物供非胃腸道、靜脈內(nèi)給藥形式。
因此，需要解決存在的問題，從而使有治療價(jià)值的水不溶物質(zhì)可以水溶形式，優(yōu)選的是非胃腸道對(duì)需要以所述活性組分治療的病人進(jìn)行給藥。
本發(fā)明的目的是滿足實(shí)踐上具有對(duì)血漿蛋白有牢固結(jié)合親和力的水不溶活性組分的需要。
本發(fā)明基于這樣的認(rèn)知在給藥前活性物質(zhì)與帶有非共價(jià)鍵的合適的蛋白結(jié)合呈現(xiàn)了一種新穎的和高度有效的釋放系統(tǒng)，供水溶性差的活性組分給藥。根據(jù)本發(fā)明，產(chǎn)生均相的固體產(chǎn)品，然后溶于水，從而得到生物相容的、澄清的水溶液，它適合非胃腸道給藥。因此本發(fā)明提出了不需引入毒性元素給予所需水不溶活性組分的手段，在某些情況下，它比以前更為有效。
本申請(qǐng)所用的定義如下，不再重復(fù)R1代表叔丁基-氧基羧酸酰胺或苯甲酰胺；
R2代表氫或?；瑑?yōu)選的是乙?；?；低水溶解度表示，室溫下水中的溶解度＜1.10-4M)；與血漿蛋白質(zhì)牢固的結(jié)合親和力表示在室溫、自發(fā)平衡下，水介質(zhì)中＞90％物質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合；HSA人體血清白蛋白，WFI注射用水。
本發(fā)明的一個(gè)目的是主要供非胃腸道給藥、含水溶解度低、與控制聚集狀態(tài)下的人體血漿蛋白組分牢固結(jié)合親和力的水溶性人體藥物制劑。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是主要供非胃腸道給藥、含水溶解度低、與控制聚集狀態(tài)下的動(dòng)物血漿蛋白組分牢固結(jié)合親和力的水溶性獸藥制劑。
可在本發(fā)明產(chǎn)品和藥物制劑中存在的，因此能用于制備產(chǎn)品和組合物的人體或動(dòng)物血漿可為任何天然形成的蛋白質(zhì)或血漿組分，如血清白蛋白、免疫球蛋白、糖蛋白、干擾素和/或白介素以及它們的重組類似物?？墒褂萌梭w和動(dòng)物蛋白。在旨在治療人體的化合物和組合物中，優(yōu)選的是使用天然的人體血清和重組人體血清蛋白。
本發(fā)明實(shí)踐上水不溶的活性組分包括很大范圍的化合物，唯一的限制是它們必須對(duì)所選擇的血漿蛋白有牢固的親和力。這類活性組分的例子包括下列治療劑諸如紫杉類藥物(taxonoide)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，抗生素，維生素，抗炎劑，止痛藥，抗驚厥藥，免疫抑制劑，抗癲癇藥，抗焦慮藥，催眠藥，抗真菌藥，抗凝血藥，脂質(zhì)體過(guò)氧化酶抑制劑，冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張劑，抗心率失常藥，強(qiáng)心藥，促尿酸尿藥，抗血栓形成藥，類固醇激素(孕激素，雄激素，睪丸酮)和/或光敏劑。在仔細(xì)考慮治療劑量和對(duì)必須滿足這類改變的所選擇的蛋白的結(jié)合親和力后，幾個(gè)活性組分可同時(shí)給藥。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了含至少一種下列物質(zhì)的上述產(chǎn)品和藥物制劑兩性霉素B、阿霉素類似物、炎爽痛、硫唑嘌呤、溴吡二氮、喜樹堿、氨甲酰氮、氯硝安定、環(huán)孢素A、安定、雙香豆素、洋地黃毒甙、潘生丁、雙異丙吡胺、氟硝安定、二甲苯氧庚酸、ketochlorin、酮康唑、雙氯苯咪唑、氮氟滅酸、去甲羥基安定、苯巴比妥、苯妥英、孕酮、普魯泊福、ritonavir、苯磺唑酮、噻丙吩(suprofene)、tacrolimus、三苯氧胺、紫杉類藥物、睪丸酮、tirilazad、三甲補(bǔ)骨脂內(nèi)酯、丙戊酸和/或華法令。
本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案由含通式I的紫杉類藥物的上述產(chǎn)品或制劑構(gòu)成。
本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案包含或由紫杉醇(paclitaxel)和人體血清白蛋白、免疫球蛋白、糖蛋白、干擾素和/或白介素或一些其它的人體血清蛋白組分構(gòu)成。
本發(fā)明特別重要的代表方案是均相的、固體、水溶產(chǎn)品，所述的產(chǎn)品由至少一種選自兩性霉素B、阿霉素類似物、炎爽痛、硫唑嘌呤、溴吡二氮、喜樹堿、氨甲酰氮、氯硝安定、環(huán)孢素A、安定、雙香豆素、洋地黃毒甙、潘生丁、雙異丙吡胺、氟硝安定、二甲苯氧庚酸、ketochlorin、酮康唑、雙氯苯咪唑、氮氟滅酸、去甲羥基安定、苯巴比妥、苯妥英、孕酮、普魯泊福(propofol)、ritonavir、苯磺唑酮、噻丙吩(suprofene)、tacrolimus、三苯氧胺、紫杉類藥物、睪丸酮、tirilazad、三甲補(bǔ)骨脂內(nèi)酯、丙戊酸和/或華法令的至少一種活性物質(zhì)構(gòu)成，也由至少一種選自人體血清白蛋白、免疫球蛋白、糖蛋白、干擾素和/或白介素或一些其它天然或重組的人體血漿蛋白組分構(gòu)成，其中所述的活性物質(zhì)和蛋白組分通過(guò)非共價(jià)鍵彼此連接，其中所述活性物質(zhì)與所述蛋白組分的摩爾比范圍是1∶0.05到1∶100，優(yōu)選的是1∶0.1到1∶50。
上述優(yōu)選的代表是下列均相的、固體、水溶產(chǎn)品，由下列一對(duì)活性物質(zhì)和蛋白質(zhì)構(gòu)成通式I的紫杉類藥物—式I中，R1代表叔丁基-氧基-羧酸酰胺或苯甲酰胺，R2代表氫或任何?；?，優(yōu)選的是乙?；?和血漿蛋白組分；紫杉醇和人體血清白蛋白，重組人體血漿蛋白和/或γ-球蛋白；兩性霉素B和人體血清白蛋白，重組人體血漿白蛋白和/或γ-球蛋白；喜樹堿和人體血清白蛋白、重組人體血漿白蛋白和/或γ-球蛋白；氨甲酰氮和人體血清白蛋白、重組人體血漿白蛋白和/或γ-球蛋白；環(huán)孢素A和人體血清白蛋白、重組人體血漿白蛋白和/或γ-球蛋白；普魯泊福和人體血清白蛋白、重組人體血漿白蛋白和/或γ-球蛋白。
從上述解釋可清楚地了解到，本發(fā)明覆蓋了上述固體狀態(tài)和水溶液形式的藥物制劑。
由于它涉及其天然結(jié)構(gòu)，更具體地說(shuō)，涉及它們的化學(xué)組合物，蛋白質(zhì)分子趨于通過(guò)它們特異性的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行聚集。聚集程度根據(jù)蛋白質(zhì)存在其中的溶液參數(shù)而定(溫度、組成、組分的相對(duì)和絕對(duì)濃度、pH、離子強(qiáng)度)。
用于本發(fā)明的血漿蛋白優(yōu)選的為穩(wěn)定或控制的聚集狀態(tài)。其目的是避免抑制蛋白質(zhì)與所用的活性組分作最佳結(jié)合的蛋白質(zhì)聚集。通過(guò)存在的其它分子使能占據(jù)參與聚集的大分子上的一些或全部的結(jié)合位點(diǎn)，以避免多個(gè)蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)聯(lián)合來(lái)控制蛋白質(zhì)不需要的聚集。一些市售的蛋白質(zhì)為控制的聚集狀態(tài)含穩(wěn)定劑以避免聚集。但該狀態(tài)不總是本發(fā)明里進(jìn)入與活性物質(zhì)結(jié)合的最佳狀態(tài)。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“控制的聚集狀態(tài)”指蛋白質(zhì)能與活性物質(zhì)以所需的方式結(jié)合時(shí)的最佳結(jié)合狀態(tài)。當(dāng)活性物質(zhì)分子最大量結(jié)合于蛋白質(zhì)時(shí)不需要該狀態(tài)，但當(dāng)需要最高結(jié)合比例時(shí)則需要該狀態(tài)。
這表示，在一些情況下我們必須從，如市售的血清白蛋白組分里除去其它賦形劑，如穩(wěn)定劑、離子組分等。當(dāng)實(shí)施本發(fā)明方法時(shí)這可能是必須的起始步驟。建立合適聚集狀態(tài)的所需條件嚴(yán)格地根據(jù)真實(shí)的活性物質(zhì)和相關(guān)的蛋白質(zhì)組分而定。
下面提供的例子(如紫杉醇和環(huán)孢素A)顯示，沒有其它賦形劑(如穩(wěn)定劑、離子組分、鹽等)存在下，它們與血漿蛋白組分的結(jié)合較高。但是，其它的活性物質(zhì)(如兩性霉素B和普魯泊福)對(duì)在蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑存在下的結(jié)合沒有任何干擾。
因此，對(duì)本發(fā)明使用的每個(gè)和每對(duì)活性物質(zhì)/蛋白質(zhì)必須建立蛋白質(zhì)合適的特定聚集狀態(tài)。
當(dāng)使用紫杉醇和HSA對(duì)時(shí)重要的是消除市售HSA中所有的穩(wěn)定劑如N-乙?；?D，L-色氨酸，堿性辛酸鹽(在60℃下進(jìn)行巴斯德殺菌期間用于穩(wěn)定蛋白質(zhì))。兩性霉素B或普魯泊福也可在這些穩(wěn)定劑存在下與HSA結(jié)合。在某些場(chǎng)合下，當(dāng)所需的聚集狀態(tài)可通過(guò)水達(dá)到時(shí)，必須經(jīng)如下列實(shí)施例之一的方法除去其它組分。
必須考慮下列因素以使本發(fā)明的特定物質(zhì)與特定血漿蛋白組分的結(jié)合最佳a(bǔ))物質(zhì)在蛋白質(zhì)上占據(jù)的結(jié)合位點(diǎn)的特性；b)會(huì)占據(jù)相同結(jié)合位點(diǎn)，甚至競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的存在于溶液里可能的其它組分；c)證實(shí)真正結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合順序的理化條件；d)已知的治療方向，如i)在有單位(unic)運(yùn)送特性的HSA上的紫杉醇；ii)在有已證實(shí)的載體治療活性的白介素上的紫杉醇；iii)在有已證實(shí)的載體治療活性的γ-免疫球蛋白上的環(huán)孢素A；iv)在有已證實(shí)的載體治療活性的γ-免疫球蛋白上的ritonavir；制劑的穩(wěn)定性。
最簡(jiǎn)單的聚集控制劑之一是水。用適當(dāng)量的水可抑制不需要的聚集，使供本發(fā)明備用的蛋白質(zhì)—它呈“控制的聚集形式”。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，化合物和組合物可含蛋白質(zhì)聚集控制劑或穩(wěn)定劑和/或溶液穩(wěn)定的輔助添加劑。這類添加劑的例子如下水，氯化鈉，緩沖劑，多元醇(如甘油)，水溶性糖衍生物(優(yōu)選的是甘露醇，山梨醇和/或半乳糖醇和其它物質(zhì))。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的包括制備本發(fā)明的新的產(chǎn)品和藥物制劑的方法。該方法包括下列步驟a)使水溶解度低并與血漿蛋白有牢固結(jié)合親和力的治療活性化合物(“活性物質(zhì)”)溶于可與水混和的藥學(xué)上可接受的有機(jī)溶劑，b)使所述的溶液與處于聚集狀態(tài)的血漿蛋白組分的水溶液混合，任選的是c)另外的藥學(xué)上可接受的輔助添加劑—如蛋白質(zhì)聚集控制劑和/或穩(wěn)定劑—從而得到含所述活性物質(zhì)和通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合的血漿蛋白組分的的真實(shí)溶液；d)優(yōu)選地將溶液或其濃縮物進(jìn)行超濾、滲析、二次過(guò)濾和/或凍干法，或組合處理來(lái)除去有機(jī)溶劑從而得到含活性物質(zhì)和血漿蛋白組分的均勻的、水溶性液體或固體產(chǎn)品或藥物制劑；e)任選地用水溶解或稀釋固體或液體，從而得到適合于治療給藥的澄清、液體組合物，和f)任選地將產(chǎn)品制成非胃腸道給藥制劑(劑型)供直接使用。
當(dāng)按本發(fā)明制備由活性物質(zhì)和通過(guò)非共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)連接的蛋白質(zhì)構(gòu)成的均相固體產(chǎn)品時(shí)，優(yōu)選的是使用包括下列步驟的方法a)將治療活性化合物溶于可與水混和的、藥學(xué)上可接受的有機(jī)溶劑，b)使所述的溶液與處于控制聚集狀態(tài)的選定的血漿蛋白組分的水溶液混合，從而得到含所述活性物質(zhì)和通過(guò)非共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)組分結(jié)合在一起的所述蛋白組分的真溶液；c)除去有機(jī)溶劑，凍干該溶液或它的濃縮物。
消除有機(jī)溶劑的合適方法依據(jù)于所涉及的活性物質(zhì)和蛋白質(zhì)。它遵從于活性產(chǎn)物的性質(zhì)(包括活性物質(zhì)和蛋白質(zhì)的配對(duì)物)，以使施加方法的條件保證溫和。凍干得到了均相、固體狀態(tài)的水溶性產(chǎn)物，它能再溶于水，并可腹腔內(nèi)給藥。有利地使上述步驟進(jìn)行組合，如首先制備活性物質(zhì)/蛋白質(zhì)配對(duì)物，然后使所述濃縮物凍干可使該方法更為經(jīng)濟(jì)。一些活性物質(zhì)/蛋白質(zhì)配對(duì)物(如兩性霉素B/血清白蛋白對(duì))可通過(guò)超濾或滲析成功地進(jìn)行濃縮。其它配對(duì)物(如紫杉醇/HSA)優(yōu)選地通過(guò)凍干處理。一些配對(duì)物可應(yīng)當(dāng)首先進(jìn)行超濾，所得的濃縮物然后進(jìn)行凍干。
本技術(shù)領(lǐng)域人員很清楚，在用水制備非胃腸道藥物稀釋的進(jìn)程中包括用另外的含諸如氯化鈉的非胃腸道上可接受的添加劑的這類水溶液進(jìn)行稀釋。
本發(fā)明在上述步驟a)中用來(lái)溶解活性組分的合適溶劑應(yīng)當(dāng)具有下列性質(zhì)●它與水的混合物應(yīng)當(dāng)能完全溶解活性組分，●其水含量＞50％的混合物應(yīng)當(dāng)不會(huì)使所用的蛋白質(zhì)變性。
在開始用活性組分和蛋白質(zhì)實(shí)施例本發(fā)明方法前，必須根據(jù)上述基礎(chǔ)選擇合適的溶劑。適用的溶劑中，混合物含＞50％水仍能溶解活性組分。
可用于上述方法步驟a)的優(yōu)選溶劑是，如選自脂族C(2-4)一元醇或多元醇，70-100％乙醇，二甲基甲酰胺，甲基甲酰胺。
制備含蛋白質(zhì)的溶液時(shí)，可存在一種聚集控制劑和/或溶液穩(wěn)定劑。這類添加劑包括進(jìn)一步或優(yōu)選量的水。它們也包括一些試劑它們能部分占據(jù)一些蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，以避免下列試劑引起的聚集氯化鈉，緩沖劑，諸如甘油的多元醇和/或優(yōu)選的是甘露醇，山梨醇，半乳糖醇的水溶性糖衍生物。
當(dāng)對(duì)于任何活性組分選擇最佳條件時(shí)，應(yīng)通過(guò)初級(jí)測(cè)量來(lái)測(cè)定最佳結(jié)合親和力和相應(yīng)的聚集性質(zhì)。在下列實(shí)施例中，我們揭示了這類測(cè)定的完整的方法。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案，用于步驟a)的化合物是紫杉醇和天然血漿組分，如血清白蛋白、免疫球蛋白、糖蛋白、干擾素和/或白介素，或所述物質(zhì)的重組體。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施例方案包括使用了水不溶的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，(如紫杉類藥物)、抗生素、維生素、抗炎劑、止痛劑、抗充血?jiǎng)?、免疫抑制劑、抗癲癇藥、抗焦慮藥、催眠藥、抗真菌劑、抗凝血?jiǎng)?、脂質(zhì)體過(guò)氧化酶抑制劑、冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張劑、抗心率失常藥、強(qiáng)心藥、促尿酸尿藥、抗血栓形成藥類固醇激素(孕激素、雄性激素、睪丸酮)和/或光敏劑。可用于本發(fā)明方法的優(yōu)選的活性物質(zhì)包括下列兩性霉素B、阿霉素類似物、炎爽痛、硫唑嘌呤、溴吡二氮、喜樹堿、氨甲酰氮、氯硝安定、環(huán)孢素A、安定、雙香豆素、洋地黃毒甙、潘生丁、雙異丙吡胺、氟硝安定、二甲苯氧庚酸、ketochlorin、酮康唑、雙氯苯咪唑、氮氟滅酸、去甲羥基安定、苯巴比妥、苯妥英、孕酮、普魯泊福、ritonavir、苯磺唑酮、噻丙吩(suprofene)、tacrolimus、三苯氧胺、紫杉類藥物、睪丸酮、tirilazad、三甲補(bǔ)骨脂內(nèi)酯、丙戊酸和/或華法令。
本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案由制備均相、固體、水溶產(chǎn)品構(gòu)成，所述產(chǎn)品由紫杉醇和人體血清白蛋白構(gòu)成，其中活性組分和血漿蛋白組分為非共價(jià)結(jié)合。本發(fā)明再一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案包括制備由通式I的紫杉類藥物e和血漿蛋白組分構(gòu)成的均相固體、水溶的產(chǎn)物的方法，其中活性組分和血漿蛋白組分為非共價(jià)結(jié)合。
從上述解釋可以清楚地知道，本發(fā)明不限于上述列出的任何活性物質(zhì)，也不限于上述列出的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的再一個(gè)目的包括使用本發(fā)明產(chǎn)品和制劑來(lái)治療人類或獸類的患者人。該方法包括對(duì)需要這類治療的病人給予活性成分治療有效量的本發(fā)明組合物或根據(jù)本發(fā)明方法制備的組合物。給藥劑量根據(jù)所用的活性組分和蛋白質(zhì)而定。當(dāng)特定的已知活性通過(guò)其它給藥途徑給藥時(shí)，給藥劑量應(yīng)能保證至少有相同的有效血藥濃度。
用對(duì)血漿蛋白有牢固結(jié)合親和力的水不溶性治療活性物質(zhì)以非胃腸道途徑治療人類或獸類患者的優(yōu)選方法是用有效劑量的下列產(chǎn)物，優(yōu)選的是用下列劑量范圍(以活性物質(zhì)為基計(jì)算)的活性物質(zhì)對(duì)需要治療的病人非胃腸道給藥紫杉醇/白蛋白70-280毫克/治療；普魯泊福/白蛋白6-10毫克/kg/小時(shí)；喜樹堿/白蛋白，二甲苯氧庚酸/白蛋白，環(huán)孢素A/白蛋白3-5毫克/kg/天；兩性霉素B/白蛋白，最多為1.5毫克/kg/天，從而相同的劑量范圍用于含各自重組蛋白的化合物。
本發(fā)明的化合物、組合物和方法的優(yōu)點(diǎn)如下●可以避免使用生物上不相容的賦形劑，以消除或總的避免劑量限制的副作用，涉及這類組分的是如毒性溶劑、表面活性劑、乳化劑等。
●使用血漿蛋白組分作為藥物賦形劑沒有另外的毒性作用，相反的是它們改進(jìn)了病人的耐受力，如在化療情況下。
●在需要情況下，與市售的藥物相比本發(fā)明藥物可增加使用劑量，因此可以改進(jìn)治療的全面成果。
本發(fā)明在下列非限定性實(shí)施例中作更詳細(xì)的闡述
實(shí)施例I.制備方法，分析下列方法用于測(cè)定特定活性組分(物質(zhì))與蛋白質(zhì)的結(jié)合a)超濾使含控制聚集狀態(tài)的蛋白質(zhì)的水溶液和活性組分在合適溶劑里的溶液混合形成的澄清溶液1毫升樣品經(jīng)超濾膜(截留限定＞30000Da)過(guò)濾，測(cè)定超濾濾液組分里的活性組分。測(cè)定未過(guò)濾溶液里的活性組分濃度時(shí)，總量(＞90％)以未改變形式得到回收。
b)凍干使1毫升上述溶液凍干。凍干后使固體殘留物溶于約1.00毫升蒸餾水，得到澄清溶液。測(cè)定該溶液的活性組分濃度，在水相沒有發(fā)現(xiàn)活性組分，但從蛋白組分里可回收100％。
c)分析活性組分通過(guò)HPLC分析測(cè)定活性組分，用UV光譜檢測(cè)。
如在Waters Millennium(Waters，美國(guó)馬里蘭)HPLC系統(tǒng)上進(jìn)行HPLC分析。它的組成是Waters 616泵；Waters 600S控制器；Waters717+自動(dòng)樣品注射器，溫度穩(wěn)定設(shè)置在+5℃；Waters 996二極管排列UV/VIS檢測(cè)器。啟動(dòng)該系統(tǒng)，通過(guò)在Digital P486/166(Digital Equipments，英國(guó))個(gè)人電腦上運(yùn)行的WatersMillnnium v.2.02.0來(lái)獲取數(shù)據(jù)。對(duì)每個(gè)化合物進(jìn)行個(gè)體最優(yōu)化條件，下面例舉一些化合物。
d)證實(shí)化學(xué)結(jié)構(gòu)LC/MS方法用來(lái)證明從連接組分里回收的物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)不變。LC/MS分析在用ES或APCI+離子化模式的Finnigan Navigator(Finnigan，英國(guó)曼徹斯特)single quandrupole LC/MS質(zhì)譜儀上進(jìn)行，它帶有MassLab V.2.0數(shù)據(jù)獲取系統(tǒng)的Digital Venturis FX/166(Digital Equipments，英國(guó))個(gè)人電腦。根據(jù)參考文獻(xiàn)，應(yīng)用條件對(duì)于每個(gè)特定的物質(zhì)必須個(gè)體最優(yōu)化—下列實(shí)施例給出了一些例子。
e)樣品的制備下面是典型的樣品制備方法，通過(guò)HPLC和/或LC/MS分析從樣品中測(cè)定總濃度/物質(zhì)含量。
凍干瓶子的固體組分用水重新組成，該溶液與無(wú)水乙醇以1∶1(體積)比混合，沉淀去血漿蛋白，同時(shí)物質(zhì)溶解。迅速離心后，溶液適合進(jìn)行HPLC或LC/MS分析。在LC/MS里，通過(guò)直接樣品導(dǎo)入或經(jīng)HPLC通過(guò)組分彼此分離后進(jìn)行分析。兩種方法得到了母體化合物和/或可能降解產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)的有價(jià)值的信息，下面給出了一些產(chǎn)物的更詳細(xì)的方法。
來(lái)自HPLC和LC/MS研究的光譜數(shù)據(jù)和質(zhì)譜數(shù)據(jù)可證實(shí)用作起始物質(zhì)的已知生物活性物質(zhì)和根據(jù)本發(fā)明，與蛋白組分連接后回收的化合物之間的化學(xué)等價(jià)性。
f)所用的物質(zhì)所用的活性物質(zhì)為USP XXIII質(zhì)量。
下列血漿蛋白組分用于實(shí)驗(yàn) (*＝歐洲藥典質(zhì)量)人體白蛋白20％溶液* 人類RT.公司，匈牙利RecombuminTM25％ DELTA Biot.Ltd，英國(guó)諾丁漢人體白蛋白20％ Biotest Ph.，德國(guó)Albumeon USPCenteon Bio-Services，美國(guó)人體白蛋白20％Behring* Centeon Ph.GmbH，澳地利人體γ球蛋白16％* 人類RT.公司，匈牙利II.制備和化學(xué)或物理分析在下列實(shí)施例中，血漿蛋白基底結(jié)合比的平均范圍為1∶0.1-100。物質(zhì)HSA結(jié)合比根據(jù)HSA分子量＝＝66500，人體γ球蛋白分子量＝＝150000的推斷來(lái)計(jì)算。[參見11 Science，244.P.1195-1198，1989；Vox Sang，70203-209頁(yè)，1996]。
實(shí)施例II.1使20％(3.08×10-3M)控制聚集狀態(tài)下的人體血清白蛋白溶液和1mg/ml(1.17×10-3M)紫杉醇在無(wú)水乙醇里的溶液以4∶1比率混合，攪拌得到澄清溶液。
凍干該溶液；使固體殘留物再溶于足量水中以保證得到濃度為20％人體血清白蛋白的澄清溶液。從超濾濾液和保留組分中測(cè)定結(jié)合，顯示99％紫杉醇與人體血清白蛋白結(jié)合。這代表人體血清白蛋白∶紫杉醇為1∶0.1。
實(shí)施例II.2使4.44％(6.67×10-4M)處于控制的聚集狀態(tài)的人體血清白蛋白溶液和2.0mg/ml(2.34×10-3M)紫杉醇(分子量853.92)在無(wú)水乙醇里的溶液以9∶1的比率混合，攪拌直到得到澄清溶液。如實(shí)施例II.1所述進(jìn)-步處理溶液。
對(duì)來(lái)自超濾濾液和保留組分進(jìn)行結(jié)合測(cè)定，顯示紫杉醇與人體血清白蛋白結(jié)合達(dá)99％。這代表人體血清白蛋白∶紫杉醇比為1∶0.39。
實(shí)施例II.3使4.44％(6.67×10-4M)處于控制的聚集狀態(tài)的重組人體血清白蛋白溶液和2.0mg/ml(1.40×10-3M)紫杉醇在無(wú)水乙醇里的溶液以9∶1的比率混合，攪拌直到得到澄清溶液。凍干溶液；使固體殘留物再溶于足量水中以保證得到濃度為20％重組人體血清白蛋白的澄清溶液。從超濾濾液和保留組分中測(cè)定結(jié)合，顯示99％紫杉醇與人體血清白蛋白結(jié)合。這代表重組人體血清白蛋白∶紫杉醇為1∶0.24。
實(shí)施例II.4使2.25％(1.5×10-4M)處于控制的聚集狀態(tài)的人體γ球蛋白溶液和0.1mg/ml(1.171×10-4M)紫杉醇在無(wú)水乙醇里的溶液以9∶1的比率混合，攪拌直到得到澄清溶液。
凍干該溶液；使固體殘留物再溶于足量水中以保證得到濃度為16％人體γ球蛋白的澄清溶液。
從超濾濾液和保留組分中測(cè)定結(jié)合，顯示98％紫杉醇與人體血清白蛋白結(jié)合。這代表人體γ球蛋白∶紫杉醇之比為1∶0.71。
在上述實(shí)施例II.1到II.3中，用下列方法通過(guò)HPLC對(duì)紫杉醇定量柱MN Nucleosil C185微米250×2毫米流動(dòng)相乙腈∶水＝73∶27流速 0.30ml/分鐘溫度 室溫檢測(cè) 273納米下典型的保留時(shí)間 5.9分鐘 k’＝2.93用LC/MS測(cè)定物質(zhì)并發(fā)現(xiàn)沒有改變[參見質(zhì)譜分析里的快速信息(RapidCommunications in Mass Spectrometry)第11卷1025-1032頁(yè)，1997，和第9卷495-502頁(yè)，1995]。圖6顯示了對(duì)比結(jié)果圖6A顯示標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜，圖6B顯示再溶解樣品的曲線。圖6C顯示紫杉醇的碎片。
LC/MS參數(shù)離子化APCI+界面；氮?dú)饬魉?00升/小時(shí)；溶劑乙腈∶緩沖液＝60∶40，其中緩沖液是10mM甲酸銨，用10％甲酸調(diào)節(jié)到pH5。0；流速0.300毫升/分鐘。
紫杉醇含量測(cè)定C-18反相HPLC方法用來(lái)定量測(cè)定來(lái)自實(shí)施例II.1到II.27的不同溶液的紫杉醇。將樣品注入HPLC系統(tǒng)，樣品在≥50％乙醇溶液里，以防止物質(zhì)沉淀。
結(jié)合在8±2℃下平衡15分鐘后測(cè)定物質(zhì)與血漿蛋白的結(jié)合。
在經(jīng)合適膜(其截留必須大于蛋白質(zhì)分子量)超濾后可測(cè)量物質(zhì)的分布，測(cè)定超濾濾液組分(代表未結(jié)合的組分)里和超濾前溶液里的物質(zhì)濃度，蛋白質(zhì)變性時(shí)釋放了結(jié)合部分(代表總量)。為了使蛋白質(zhì)變性并釋放已結(jié)合的組分，以1∶1的比率使用預(yù)冷至8+2℃的無(wú)水乙醇。根據(jù)稀釋的倍數(shù)計(jì)算真正的濃度值和含量。
實(shí)施例II.5到II.21濃度范圍為20％(3.08×10-3M)到0.02％(3.08×10-6M)與濃度范圍為20毫克/毫升(2.34×10-2M)到0.01mg/ml(1.17×10-5M)的紫杉醇在無(wú)水乙醇中的溶液混合，得到總是澄清的溶液。詳細(xì)情況如表I所示。所有的測(cè)量進(jìn)行三次，對(duì)計(jì)算結(jié)果進(jìn)行平均。
表I

圖例[T]T 加入人體血清白蛋白后總的紫杉醇濃度[HSA] 人體血清白蛋白濃度n(TB)/n(HSA) 每摩爾人體血清白蛋白結(jié)合的紫杉醇摩爾數(shù)n(TB)/n/TT/×100％結(jié)合的紫杉醇百分?jǐn)?shù)圖7顯示了紫杉醇濃度變化(具有0.08％HSA，10％乙醇，0.002mg/ml紫杉醇)；圖8顯示了白蛋白濃度變化(具有0.004-16.0％HSA，20％乙醇，0.2mg/ml紫杉醇)。圖9顯示了與HSA結(jié)合的紫杉醇的變化(帶有0.8％HSA，10％乙醇，0.1-2.0mg/ml紫杉醇)在pH4.0到8.5時(shí)對(duì)pH的函數(shù)。圖中的符號(hào)相應(yīng)于下列實(shí)施例
實(shí)施例II.18-◆-◆-實(shí)施例II.19-○-○-實(shí)施例II.20-×-×-實(shí)施例II.15-◇-◇-實(shí)施例II.21-▲-▲-實(shí)施例II.22對(duì)于動(dòng)物血清白蛋白、免疫球蛋白、糖蛋白、干擾素和白介素用實(shí)施例II.2到實(shí)施例.21的相似方法。
實(shí)施例II.23處理市售的人體血清白蛋白或重組人體血清白蛋白(在白蛋白后)以得到控制聚集狀態(tài)，具有最好的分子結(jié)合條件，包括除去穩(wěn)定劑，如辛酸鈉、N-乙?；?D，L-色氨酸和其它離子組分和鹽。
a)超濾方法用鹽酸調(diào)節(jié)含10％白蛋白的溶液pH至3.0，用重蒸水稀釋到5％蛋白含量。用超濾(膜截留限度為30000kD)濃縮溶液，使蛋白質(zhì)含量為10％。
用1.0mM鹽酸再將溶液稀釋到5％蛋白質(zhì)含量。用超濾(膜截留限度30000kD)濃縮溶液到10％蛋白質(zhì)含量。
重復(fù)過(guò)程12×，然后用2.0M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH到6.9，用重蒸水稀釋溶液到5％濃度蛋白質(zhì)含量。再用超濾(膜截留限度為30000kD)使溶液濃縮到10％蛋白質(zhì)含量。
用重蒸水將溶液再稀釋回5％蛋白質(zhì)含量。用超濾(膜截留限度為30000kD)使溶液濃縮到10％蛋白質(zhì)含量、重復(fù)過(guò)程10×，得到純凈的蛋白質(zhì)組分，足以除去其它賦形劑。此時(shí)，超濾液的導(dǎo)電性接近于用于稀釋的重蒸水的傳導(dǎo)電性。該蛋白質(zhì)適合用于與諸，如紫杉醇或環(huán)孢素結(jié)合。
b)不使用超濾而用滲析得到相似的結(jié)果。處理需要約48小時(shí)。
實(shí)施例II.24使0.8％(1.203×10-4M)HSA溶液和4.0mg/ml(4.33×10-3M)兩性霉素B溶液(分子量＝924.09)在DMF里的溶液以9∶1混合，攪拌得到澄清溶液。
凍干該溶液；使固體殘留物再溶于足量水中以保證得到濃度為20％HSA的澄清溶液。從超濾濾液和保留組分中測(cè)定結(jié)合，顯示99.7％兩性霉素B與HSA結(jié)合。這代表HSA∶兩性霉素B之比為1∶4。
實(shí)施例II.25使0.8％(1.203×10-4M)重組人體血清白蛋白溶液和40.0mg/ml(4.33×10-2M)兩性霉素B溶液在DMF+HCl里的溶液以9∶1混合，攪拌得到澄清溶液。
凍干該溶液；使固體殘留物再溶于足量水中以保證得到濃度為20％重組HSA的澄清溶液。從超濾濾液和保留組分中測(cè)定結(jié)合，顯示99.5％兩性霉素B與HSA結(jié)合。這代表HSA∶兩性霉素B之比為1∶40。
兩性霉素B遵照下列方法的HPLC進(jìn)行測(cè)量柱 MN Nucleosil C185微米250×2mm流動(dòng)相 乙腈∶緩沖劑＝1∶1(緩沖劑用三乙胺調(diào)節(jié)到pH4.0的0.2％甲酸)流動(dòng)速率0.30ml/分鐘溫度 室溫檢測(cè)在365納米下典型的保留時(shí)間 5.3分鐘，k’＝1.41用LC/MS測(cè)定物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)沒有改變，圖2顯示了對(duì)比的結(jié)果圖2A顯示了標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)譜，圖2B顯示了再溶解樣品的曲線。圖2C顯示了兩性霉素B片段。
LC/MS參數(shù)離子化ESI+界面；氮?dú)饬鲃?dòng)速率300升/小時(shí)；溶劑20mM甲酸銨，用10％甲酸調(diào)節(jié)為pH4.0；流動(dòng)速率0.300ml/分鐘。
實(shí)施例II.26使0.4％(6.015×10-5M)處于控制聚集狀態(tài)的HSA溶液和0.14mg/ml(4.02×10-4M)喜樹堿(分子量＝348.36)在無(wú)水乙醇里的溶液以4∶1混合，攪拌得到澄清溶液。凍干該溶液；使固體殘留物再溶于足量的水，以保證得到濃度為20％HSA的澄清溶液。從超濾濾液和保留組分中測(cè)定結(jié)合，顯示98％喜樹堿與HSA結(jié)合。這代表HSA∶喜樹堿為1∶5.34。
實(shí)施例II.27使0.4％(6.015×10-5M)處于控制聚集狀態(tài)的重組HSA溶液和0.14mg/ml(4.02×10-4M)喜樹堿在無(wú)水乙醇里的溶液以4∶1混合，攪拌得到澄清溶液。
凍干該溶液；使固體殘留物再溶于足量的水，以保證得到濃度為20％重組HSA的澄清溶液。從超濾濾液和保留組分中測(cè)定結(jié)合，顯示98％喜樹堿與HSA結(jié)合。這代表重組HSA∶喜樹堿為1∶5.34。
我們按下列條件的HPLC測(cè)定喜樹堿柱 MN Nucleosil C185微米250×2mm流動(dòng)相 乙腈∶緩沖劑＝33∶67流動(dòng)速率 0.33ml/分鐘溫度 室溫檢測(cè) 在356納米下典型的保留時(shí)間 6.9分鐘，k’＝2.45用LC/MS測(cè)定物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)沒有改變[癌癥研究，第56卷3689-3694頁(yè)，1996]。
實(shí)施例II.29使0.4％(6.015×10-4M)處于控制聚集狀態(tài)的HSA溶液和8.0mg/ml(3.39×10-2M)氨甲酰氮(分子量236.27)在無(wú)水乙醇里的溶液以19∶1混合，攪拌得到澄清溶液。凍干該溶液；使固體殘留物再溶于足量的水，以保證得到濃度為20％HSA的澄清溶液。從超濾濾液和保留組分中測(cè)定結(jié)合，顯示98％氨甲酰氮與HSA結(jié)合。這代表HSA∶氨甲酰氮為1∶2.8。
我們按下列條件的HPLC測(cè)定氨甲酰氮柱 MN Nucleosil C185微米250×2mm流動(dòng)相 乙腈∶緩沖劑＝1∶1(緩沖液用三乙胺將pH調(diào)節(jié)到7的0.2％甲酸)流動(dòng)速率 0.25ml/分鐘溫度 室溫檢測(cè) 在285納米下典型的保留時(shí)間 5.3分鐘，k’＝1.12用LC/MS測(cè)定物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)沒有改變[Eur.J.Clin.Chem Clin.Biochem，第35卷(10)755-759頁(yè)，1997]。圖3顯示了比較結(jié)果圖3A顯示標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜，圖3B顯示再溶解樣品曲線，圖3C顯示氨甲酰氮的片段。
LC/MS參數(shù)離子化ESI+界面；氮?dú)饬魉?00升/小時(shí)；溶劑2mM甲酸銨；流速0.250ml/分鐘。
實(shí)施例II.30使4.0％(6.015×10-4M)處于控制聚集狀態(tài)的HSA溶液和1.0mg/ml(8.33×10-4M)環(huán)孢素A(分子量1202.63)在無(wú)水乙醇里的溶液以9∶1混合，攪拌得到澄清溶液。
凍干該溶液；使固體殘留物再溶于足量的水，以保證得到濃度為20％HSA的澄清溶液。從超濾濾液和保留組分中測(cè)定結(jié)合，顯示97％環(huán)孢素A與HSA結(jié)合。這代表HSA∶環(huán)孢素A為1∶0.14。
實(shí)施例II.31使2.0％(3.008×10-4M)處于控制聚集狀態(tài)的重組HSA溶液和1.0mg/ml(8.33×10-4M)環(huán)孢素A在無(wú)水乙醇里的溶液以9∶1混合，攪拌得到澄清溶液。
凍干該溶液；使固體殘留物再溶于足量的水，以保證得到濃度為20％重組HSA的澄清溶液。從超濾濾液和保留組分中測(cè)定結(jié)合，顯示98％環(huán)孢素A與重組HSA結(jié)合。這代表重組HSA∶環(huán)孢素A為1∶0.29。
實(shí)施例II.32使2.25％(1.50×10-4M)處于控制聚集狀態(tài)的人體γ球蛋白溶液和1.0mg/ml(8.33×10-4M)環(huán)孢素A在無(wú)水乙醇里的溶液以9∶1混合，攪拌得到澄清溶液。
凍干該溶液；使固體殘留物再溶于足量的水，以保證得到濃度為16％人體γ球蛋白的澄清溶液。從超濾濾液和保留組分中測(cè)定結(jié)合，顯示98％環(huán)孢素A與人體γ球蛋白結(jié)合。這代表人體γ球蛋白∶環(huán)孢素A為1∶0.56。
我們按下列條件的HPLC測(cè)定環(huán)孢素A柱 MN Nucleosil C185微米250×2mm流動(dòng)相 乙腈∶水∶甲醇∶磷酸＝700∶260∶40∶0.05流動(dòng)速率 0.350ml/分鐘溫度 80℃熱穩(wěn)定檢測(cè) 在205納米下典型的保留時(shí)間 7.5分鐘，k’＝2.95如結(jié)果顯示，用LC/MS測(cè)定物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)沒有改變[1]。圖4顯示了比較結(jié)果圖4A顯示標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜，圖4B顯示再溶解樣品曲線，圖4C顯示環(huán)孢素A的片段。
LC/MS參數(shù)離子化ESI+界面，氮?dú)饬魉?00升/小時(shí)；溶劑∶乙腈/水＝60/40；溶劑流速0.350ml/分鐘。
實(shí)施例II.33使0.4％(6.015×10-5M)HSA溶液和2.0mg/ml(1.12×10-2M)普魯泊福(分子量178.27)在無(wú)水乙醇里的溶液以9∶1混合，攪拌得到澄清溶液。
凍干溶液；使固體殘留物再溶于足量的水，以保證得到濃度為20％HSA的澄清溶液。從超濾濾液和保留組分中測(cè)定結(jié)合，顯示99％普魯泊福與HSA結(jié)合。這代表HSA∶普魯泊福為1∶18.3。
實(shí)施例II.34使0.4％(6.015×10-5M)重組HSA溶液和2.0mg/ml(1.12×10-2M)普魯泊福在無(wú)水乙醇里的溶液以9∶1混合，攪拌得到澄清溶液。
凍干該溶液；使固體殘留物再溶于足量的水，以保證得到濃度為20％重組HSA的澄清溶液。從超濾濾液和保留組分中測(cè)定結(jié)合，顯示99％普魯泊福與HSA結(jié)合。這代表重組HSA∶普魯泊福為1∶18.3。
我們按下列條件的HPLC測(cè)定普魯泊福柱 MN Nucleosil C185微米250×2mm流動(dòng)相 乙腈∶水＝73∶27流動(dòng)速率 0.30ml/分鐘溫度 室溫檢測(cè) 在273納米下典型的保留時(shí)間 6.1分鐘，k’＝1.77如結(jié)果顯示，用LC/MS測(cè)定物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)沒有改變[J.of Chromatography B，669358-365頁(yè)，1995]。圖5顯示了比較結(jié)果圖5A顯示標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜，圖5B顯示再溶解樣品曲線，圖5C顯示普魯泊福的片段。
LC/MS參數(shù)離子化APCI+界面，氮?dú)饬魉?00升/小時(shí)；溶劑乙腈/水＝73/23；溶劑流速0.300ml/分鐘。
實(shí)施例II.35使9.0毫升0.8％(1.213×10-4M)HSA溶液和1.0毫升4.0mg/ml(4.33×10-3M)兩性霉素B在二甲基甲酰胺里的溶液混合得到澄清溶液。在4℃下使該溶液對(duì)2.0升水(WFI)避光滲析達(dá)20小時(shí)。
用實(shí)施例II.24的測(cè)定方法測(cè)得，結(jié)合為99.6％，代表HSA∶兩性霉素B的比為1∶3.5。
滲析過(guò)程重復(fù)5次，使溶液中的DMF濃度降低到檢測(cè)限度(2×10-9M)下。
III.劑型實(shí)施例III.1到III.6按照如上所述的凍干制備方法得到合適的藥物劑型。將固體再溶于適量體積的注射用水以使溶液中HSA濃度為20％，下表綜述了一些活性物質(zhì)在適合治療使用的該溶液中的濃度

上述劑型可進(jìn)一步裝入安瓿供注射和輸液用。IV.生物實(shí)施例對(duì)生物等價(jià)的研究使本發(fā)明新制劑與已知用于治療的含水溶解度差的相同活性物質(zhì)的制劑進(jìn)行比較，測(cè)定生物等價(jià)。這類已知的制劑制備于聚環(huán)氧乙烷化的蓖麻油(CremophorEL)和無(wú)水乙醇里。
使用的物質(zhì)溶于聚環(huán)氧乙烷化的蓖麻油(Cremophor EL)∶無(wú)水乙醇＝1∶1混合物的紫杉醇與本發(fā)明實(shí)施例II.2制備的紫杉醇/HSA水溶液進(jìn)行比較。
實(shí)施例IV.1體外研究體外進(jìn)行比較研究以測(cè)定對(duì)人體腫瘤細(xì)胞系的抗增殖和細(xì)胞毒性活性。在K562人體骨髓白血病、MCF-7和MDA-231乳腺和OVCAR-5卵巢癌細(xì)胞系上比較紫杉醇的Cremophor EL/無(wú)水乙醇制劑和紫杉醇/HSA制劑[抗癌研究，第16卷2469-2478，1996]。
方法菌落生長(zhǎng)抑制分析用兩個(gè)上述制劑里的8個(gè)不同濃度的藥物加上在DMSO/鹽水溶液里的作為參照處理細(xì)胞系單層培養(yǎng)物。使培養(yǎng)物培養(yǎng)24、48、72、96和120小時(shí)。菌落用結(jié)晶紫染色，按由未處理細(xì)胞形成的菌落以百分?jǐn)?shù)來(lái)計(jì)算被處理細(xì)胞的存活率。表IIA到IVB顯示不同細(xì)胞系得到的結(jié)果。在每個(gè)研究中顯示了被處理細(xì)胞的存活率，按未處理細(xì)胞形成的菌落以百分?jǐn)?shù)來(lái)計(jì)算。所有的數(shù)值是三個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值。
表IIA細(xì)胞系MCF7乳腺癌制劑紫杉醇/Cremophor EL和無(wú)水乙醇

<p>表IIB細(xì)胞系MCF7乳腺癌制劑紫杉醇/HSA<

>表IIIA細(xì)胞系MDA-231乳腺癌制劑紫杉醇/Cremophor EL和無(wú)水乙醇<

<p>表IIIB細(xì)胞系MDA-231乳腺癌制劑紫杉醇/HSA

表IVA細(xì)胞系K562人體骨髓白血病制劑紫杉醇/Cremophor EL和無(wú)水乙醇

表IVB細(xì)胞系K562人體骨髓白血病樣品紫杉醇/HSA

實(shí)施例IV.2體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)從治療角度來(lái)看，可考慮生物等價(jià)，顯示出相等的藥代動(dòng)力學(xué)特征，如AUC(曲線下面積)、消除常數(shù)、對(duì)相同樣品給予相同劑量后血漿半衰期。在大鼠上對(duì)如實(shí)施例IV.1所述的兩個(gè)制劑進(jìn)行這類實(shí)驗(yàn)(Semin Oncol，第21卷(5增補(bǔ)8)53-62頁(yè)，1994)。
AUC表示血漿濃度對(duì)時(shí)間曲線下的面積。在不同時(shí)間點(diǎn)處測(cè)量給予的化合物的血藥濃度。
在大鼠上的藥代動(dòng)力學(xué)研究方法以2.5mg/kg紫杉醇劑量對(duì)CR.(Wi)BR大鼠(體重為380-420克)進(jìn)行1.0毫升靜脈注射成藥團(tuán)，如下面指出的時(shí)間點(diǎn)處從三個(gè)動(dòng)物里取出10毫升血樣，放入肝素化的試管里

通過(guò)5℃下快速離心分離血漿組分，在-70℃下冷凍到進(jìn)行分析測(cè)量為止。
樣品制備使冷凍血漿樣品溫?zé)岬?8℃，在5000轉(zhuǎn)/分鐘下離心5分鐘。取出0.300-0.500ml澄清血漿溶液，放置在Oasis HLB 1 cc SPE(固相)萃取柱上。在血漿樣品負(fù)載到柱體上前，柱用1毫升甲醇，然后用1毫升水進(jìn)行淋洗來(lái)預(yù)適應(yīng)環(huán)境。紫杉醇吸附在SPE柱上，而樣品組分的剩余部分則用1毫升水和1毫升30％乙腈/水溶液淋洗下來(lái)。柱用空氣吹干。用1毫升無(wú)水乙醇從SPE柱上洗脫紫杉醇。用氮?dú)庹舾蓸悠?，?-20℃)下放置供分析。殘留物溶于0.200毫升無(wú)水乙醇，注入供HPLC分析。
HPLC條件與同一物質(zhì)鑒定使用的條件相同。
結(jié)果得到的點(diǎn)是從三個(gè)個(gè)體動(dòng)物的三次測(cè)量中得到的平均值。結(jié)果，從等劑量的兩個(gè)不同制劑的藥代動(dòng)力學(xué)研究得到的兩個(gè)曲線之間的差別在個(gè)體樣品的差異范圍內(nèi)。相同的曲線由所有的單個(gè)數(shù)據(jù)繪制得到，表明兩種之間的藥物動(dòng)力學(xué)特征沒有差異或有很小的差異。
實(shí)施例IV.3抗增殖和細(xì)胞毒性活性研究的體內(nèi)評(píng)估顯示，新制劑對(duì)裸鼠里的人體腫瘤異種移植物CH1和CH1tax有陽(yáng)性作用。
實(shí)施例IV.4超敏性試驗(yàn)用紫杉醇治療的約45％病人有超敏反應(yīng)。據(jù)證明，這些副作用與制劑的一種賦形劑，Cremophor EL有關(guān)，這在含相同組分的其它藥物中也可觀察到。當(dāng)過(guò)敏性毒性通過(guò)Cremophor EL誘導(dǎo)組胺釋放來(lái)表達(dá)時(shí)決定了該超敏反應(yīng)。
我們的研究在體重為130-150克[14]的CRL(WI)BR雄性大鼠上進(jìn)行。給藥劑量對(duì)于紫杉醇是約7.0mg/kg，靜脈注射，其總體積為1毫升。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)和劑量的組包含5個(gè)動(dòng)物。在處理后2分鐘、5分鐘和10分鐘時(shí)血樣被收集到含肝素的試管里。通過(guò)快速離心分離血漿。在-70℃下貯存樣品。
通過(guò)特定的組胺-N-甲基-轉(zhuǎn)移酶使樣品中的組胺組分C14-甲基化。測(cè)量樣品中C14放射性來(lái)測(cè)定血漿樣品里的組胺水平。
得到的數(shù)據(jù)表明，Cremophor EL和含該組分的制劑會(huì)明顯誘導(dǎo)組胺釋放，而HSA、含HSA的制劑和紫杉醇本身沒有這類作用。
實(shí)施例IV.5用來(lái)自人體血樣的體外人體實(shí)驗(yàn)，根據(jù)對(duì)血液淋巴細(xì)胞的染色體活化的定量分析可發(fā)現(xiàn)與實(shí)施例IV.4相同的現(xiàn)象[方法分析和定量細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)，第8卷第1頁(yè)，1986]。
權(quán)利要求
1.一種固體或液體形式的、主要供非胃腸道給藥的水溶的產(chǎn)品或藥物制劑，含有a)水溶性低、與血漿蛋白有牢固的結(jié)合親合力的治療活性物質(zhì)(在下文中為“活性物質(zhì)”)b)處于控制聚集狀態(tài)的血漿蛋白組分其中所述的活性物質(zhì)和所述的蛋白組分通過(guò)非共價(jià)鍵彼此結(jié)合，和c)進(jìn)一步任選的藥學(xué)上可接受的、主要是非胃腸道可接受的制劑添加劑，如水，穩(wěn)定劑，蛋白聚集控制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水溶性產(chǎn)品或人用藥物制劑，它主要供非胃腸道給藥，含水溶性低的治療活性物質(zhì)和處于控制聚集狀態(tài)的人體血漿蛋白組分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水溶性產(chǎn)品或獸用藥物制劑，主要供非胃腸道給藥，含水溶性低的治療活性物質(zhì)和處于控制聚集狀態(tài)的動(dòng)物血漿蛋白組分。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一權(quán)利要求所述的產(chǎn)品或藥物制劑，它含天然—人體或動(dòng)物體—血漿，如血清白蛋白、免疫球蛋白、糖蛋白、干擾素和/或白介素，或所述血漿組分的重組體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的產(chǎn)品或藥物制劑，它供人體給藥，主要供非胃腸道給藥，它含天然—人體血漿，如血清白蛋白、免疫球蛋白、糖蛋白、干擾素和/或白介素，或所述血漿組分的重組體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的產(chǎn)品或藥物制劑，它含水不溶的活性物質(zhì)，諸如紫杉類藥物的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，抗生素，維生素，抗炎劑，止痛藥，抗病毒藥、抗驚厥藥，免疫抑制劑，抗癲癇藥，抗焦慮藥，催眠藥，抗真菌藥，抗凝血藥，脂質(zhì)體過(guò)氧化酶抑制劑，冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張劑，抗心率失常藥，強(qiáng)心藥，促尿酸尿藥，抗血栓形成藥，類固醇激素(孕激素，雄激素，睪丸酮)和/或光敏劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的產(chǎn)品或藥物制劑，它含至少一種下列活性物質(zhì)兩性霉素B、阿霉素類似物、炎爽痛、硫唑嘌呤、溴吡二氮、喜樹堿、氨甲酰氮、氯硝安定、環(huán)孢素A、安定、雙香豆素、洋地黃毒甙、潘生丁、雙異丙吡胺、氟硝安定、二甲苯氧庚酸、ketochlorin、酮康唑、雙氯苯咪唑、氮氟滅酸、去甲羥基安定、苯巴比妥、苯妥英、孕酮、普魯泊福、ritonavir、苯磺唑酮、噻丙吩(suprofene)、tacrolimus、三苯氧胺、紫杉類藥物、睪丸酮、tirilazad、三甲補(bǔ)骨脂內(nèi)酯、丙戊酸和/或華法令。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的產(chǎn)品或藥物制劑，它含通式I的紫杉類藥物—式中R1代表叔丁基-氧基羧酸酰胺或苯甲酰胺；R2代表氫或酰基，優(yōu)選的是乙酰基。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的產(chǎn)品或藥物制劑，含紫杉醇和人體血清白蛋白，免疫球蛋白，糖蛋白，干擾素和/或白介素，或一些其它天然或重組的人體血漿蛋白組分，其摩爾比為1∶0.05-1∶100，優(yōu)選的摩爾比是1∶0.1到1∶50。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一所述的產(chǎn)品或藥物制劑，它含硫唑嘌呤和人體血清白蛋白，免疫球蛋白，糖蛋白，干擾素和/或白介素，或一些其它天然或重組的人體血漿蛋白組分，其摩爾比為1∶0.05-1∶100，優(yōu)選的摩爾比是1∶0.1到1∶50。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一所述的制劑，它含喜樹堿和和人體血清白蛋白，免疫球蛋白，糖蛋白，干擾素和/或白介素，或一些其它天然或重組的人體血漿蛋白組分，其摩爾比為1∶0.05-1∶100，優(yōu)選的摩爾比是1∶0.1到1∶50。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-8任意所述的制劑，它含二甲苯氧庚酸和人體血清白蛋白，免疫球蛋白，糖蛋白，干擾素和/或白介素，或一些其它天然或重組的人體血漿蛋白組分，其摩爾比為1∶0.05-1∶100，優(yōu)選的摩爾比是1∶0.1到1∶50。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一所述的產(chǎn)品或藥物制劑，它含雙氯苯咪唑和人體血清白蛋白，免疫球蛋白，糖蛋白，干擾素和/或白介素，或一些其它天然或重組的人體血漿蛋白組分，其摩爾比為1∶0.05-1∶100，優(yōu)選的摩爾比是1∶0.1到1∶50。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一所述的產(chǎn)品或藥物制劑，它含普魯泊福和人體血清白蛋白，免疫球蛋白，糖蛋白，干擾素和/或白介素，或一些其它天然或重組的人體血漿蛋白組分，其摩爾比為1∶0.05-1∶100，優(yōu)選的摩爾比是1∶0.1到1∶50。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一所述的產(chǎn)品或藥物制劑，它含三苯氧胺和人體血清白蛋白，免疫球蛋白，糖蛋白，干擾素和/或白介素，或一些其它天然或重組的人體血漿蛋白組分，其摩爾比為1∶0.05-1∶100，優(yōu)選的摩爾比是1∶0.1到1∶50。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一所述的產(chǎn)品或藥物制劑，它含retonavir和人體血清白蛋白，免疫球蛋白，糖蛋白，干擾素和/或白介素，或一些其它天然或重組的人體血漿蛋白組分，其摩爾比為1∶0.05-1∶100，優(yōu)選的摩爾比是1∶0.1到1∶50。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一所述的藥物制劑，它含tacrolimus和人體血清白蛋白，免疫球蛋白，糖蛋白，干擾素和/或白介素，或一些其它天然或重組的人體血漿蛋白組分，其摩爾比為1∶0.05-1∶100，優(yōu)選的摩爾比是1∶0.1到1∶50。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一所述的藥物制劑，它含tirilazad和人體血清白蛋白，免疫球蛋白，糖蛋白，干擾素和/或白介素，或一些其它天然或重組的人體血漿蛋白組分，其摩爾比為1∶0.05-1∶100，優(yōu)選的摩爾比是1∶0.1到1∶50。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一所述的藥物制劑，它含三甲補(bǔ)骨脂內(nèi)酯和人體血清白蛋白，免疫球蛋白，糖蛋白，干擾素和/或白介素，或一些其它天然或重組的人體血漿蛋白組分，其摩爾比為1∶0.05-1∶100，優(yōu)選的摩爾比是1∶0.1到1∶50。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-19任一所述的藥物制劑，它具有固體狀態(tài)，或水溶液形式。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-20任一所述的藥物制劑，它含添加劑以穩(wěn)定溶液和/或蛋白質(zhì)。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的藥物制劑，它含的溶液和/或蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑是任何下述物質(zhì)氯化鈉、緩沖劑、如甘油的醇類和/或水溶性糖衍生物，優(yōu)選的是甘露醇、山梨醇、半乳糖醇。
23.制備如權(quán)利要求1-22所述的產(chǎn)品或藥物制劑或權(quán)利要求30-37所述的新產(chǎn)品的方法，其特征在于，a)使水溶解度低并與血漿蛋白有牢固結(jié)合親合力的治療活性化合物(“活性物質(zhì)”)溶于可與水溶混的藥學(xué)上可接受的有機(jī)溶劑，b)使所述的溶液與處于控制聚集狀態(tài)的血漿蛋白質(zhì)組分的水溶液混合，和任選的c)另一種藥學(xué)上可接受的輔助添加劑—如蛋白質(zhì)聚集控制劑和/或穩(wěn)定劑—混合，從而得到含所述活性物質(zhì)和所述血漿蛋白組分通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合的真實(shí)溶液d)優(yōu)選地通過(guò)使溶液或其濃縮物進(jìn)行超濾、滲析、二次過(guò)濾(diafiltrating)和/或凍干法，或通過(guò)使這些處理組合來(lái)除去有機(jī)溶劑從而得到含活性物質(zhì)和血漿蛋白組分的均相的水溶性液體或固體的藥物制劑；e)任選地用水溶解固體產(chǎn)品或用水稀釋液體產(chǎn)品，從而得到適合于治療給藥的澄清的液體組合物，和f)任選地將產(chǎn)品制成非胃腸道給藥制劑(劑型)供直接使用。
25.制備如權(quán)利要求1-24所述的產(chǎn)品或藥物制劑或權(quán)利要求30-37所述的新產(chǎn)品的方法，其特征在于，a)使治療活性化合物溶于可與水溶混的藥學(xué)上可接受的有機(jī)溶劑，b)使所述的溶液與處于控制聚集狀態(tài)的選定的血漿蛋白組分的水溶液混合，所述的溶液任選地含c)另一種的藥學(xué)上可接受的輔助添加劑—如蛋白質(zhì)聚集控制劑和/或穩(wěn)定劑從而得到含所述活性物質(zhì)和所述血漿蛋白組分通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合的真實(shí)溶液；d)除去有機(jī)溶劑，將溶液或它的濃縮物進(jìn)行凍干。
26.根據(jù)權(quán)利要求23-25任一所述的方法的步驟a)，其特征在于用來(lái)溶解活性物質(zhì)的溶劑有下列性質(zhì)a)在與水的混合物里能完全溶解活性物質(zhì)，和b)它與＜50％的水的混合物不會(huì)使所用的蛋白質(zhì)變性。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，使用選自脂族C(2-4)一元醇或多元醇，70-100％乙醇，二甲基甲酰胺，甲基甲酰胺的溶劑。
28.根據(jù)權(quán)利要求23-27所述的方法，其中步驟a)的特征在于，所用蛋白聚集控制劑或穩(wěn)定劑和/或溶液穩(wěn)定輔助添加劑選自任何下述物質(zhì)水，氯化鈉，緩沖劑，諸如甘油的多元醇和/或水溶性糖衍生物，優(yōu)選的是甘露醇、山梨糖醇和/或半乳糖醇。
29.根據(jù)權(quán)利要求23-28所述的方法，其中步驟a)的特征在于，使用紫杉醇和天然血漿組分，如血清白蛋白、免疫球蛋白、糖蛋白、干擾素和/或白介素或這些組分的重組體。
30.一種均相、固體、水溶產(chǎn)品，有至少一種選自兩性霉素B、阿霉素類似物、炎爽痛、硫唑嘌呤、溴吡二氮、喜樹堿、氨甲酰氮、氯硝安定、環(huán)孢素A、安定、雙香豆素、洋地黃毒甙、潘生丁、雙異丙吡胺、氟硝安定、二甲苯氧庚酸、ketochlorin、酮康唑、雙氯苯咪唑、氮氟滅酸、去甲羥基安定、苯巴比妥、苯妥英、孕酮、普魯泊福、ritonavir、苯磺唑酮、噻丙吩(suprofene)、tacrolimus、三苯氧胺、紫杉類藥物、睪丸酮、tirilazad、三甲補(bǔ)骨脂內(nèi)酯、丙戊酸和/或華法令的至少一種活性物質(zhì)，和至少一種選自人體血清白蛋白，免疫球蛋白，糖蛋白，干擾素和/或白介素，或一些其它天然或重組的人體血漿蛋白組分構(gòu)成，其中所述的活性物質(zhì)和所述的蛋白組分彼此通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合連接，其摩爾比為1∶0.05-1∶100，優(yōu)選的摩爾比是1∶0.1到1∶50。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的均相、固體、水溶的產(chǎn)品，它由通式I的紫杉類藥物和血漿蛋白組分構(gòu)成—式I中，R1代表叔丁基-氧基-羧酸酰胺或苯甲酰胺，R2代表氫或任何?；瑑?yōu)選的是乙?；?br> 32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的均相、固體、水溶的產(chǎn)品，它由紫杉醇和人體血清白蛋白，重組人體血漿白蛋白和/或γ-球蛋白構(gòu)成。
33.根據(jù)權(quán)利要求30所述的均相、固體、水溶的產(chǎn)品，它由兩性霉素B和人體血清白蛋白，重組人體血漿白蛋白和/或γ-球蛋白構(gòu)成。
34.根據(jù)權(quán)利要求30所述的均相、固體、水溶的產(chǎn)品，它由喜樹堿和人體血清白蛋白，重組人體血漿白蛋白和/或γ-球蛋白構(gòu)成。
35.根據(jù)權(quán)利要求28所述的均相、固體、水溶的產(chǎn)品，它由氨甲酰氮和人體血清白蛋白，重組人體血漿白蛋白和/或γ-球蛋白構(gòu)成。
36.根據(jù)權(quán)利要求28所述的均相、固體、水溶的產(chǎn)品，它由環(huán)孢素和人體血清白蛋白，重組人體血漿白蛋白和/或γ-球蛋白構(gòu)成。
37.根據(jù)權(quán)利要求30所述的均相、固體、水溶的產(chǎn)品，它由普魯泊福和人體血清白蛋白，重組人體血漿白蛋白和/或γ-球蛋白構(gòu)成。
38.一種用與血漿蛋白有牢固結(jié)合親合力的水不溶的治療活性物質(zhì)治療人類或獸類患者的方法，其特征在于對(duì)需要這類治療的患者給予活性物質(zhì)有效量的如權(quán)利要求1-37任一所述的或制得的產(chǎn)品或藥物制劑。
39.一種用與血漿蛋白有牢固結(jié)合親合力的水不溶的治療活性物質(zhì)非胃腸途徑治療人類或獸類患者的方法，其特征在于對(duì)需要這類治療的患者非胃腸道給予下列劑量范圍的產(chǎn)品(根據(jù)活性物質(zhì)計(jì)算)紫杉醇/白蛋白70-280mg/治療；普魯泊福/白蛋白6-10mg/kg/小時(shí)；喜樹堿/白蛋白，三苯氧胺/白蛋白，環(huán)孢素A/白蛋白3-5mg/kg/天；兩性霉素B/白蛋白，最多達(dá)1.5mg/kg/天，從而對(duì)含重組蛋白的化合物用相同的劑量。
40.對(duì)水溶性差、與血漿蛋白有牢固結(jié)合親和力的藥物活性組分治療時(shí)采用非胃腸道釋放的方法，其特征在于，對(duì)需要這類治療的病人給予所述活性物質(zhì)有效量的如權(quán)利要求1-19所述或制備的組合物。
41.一種產(chǎn)品或方法，它基本上如實(shí)施例任一所述。
全文摘要
本發(fā)明涉及主要供非胃腸道使用的固體或液體形式的水溶產(chǎn)品和藥物制劑。它們包括治療活性物質(zhì)(水溶解度低,與血漿蛋白有牢固結(jié)合親和力)和處于控制聚焦?fàn)顟B(tài)的血漿蛋白組分,或由它們構(gòu)成,從而所述的活性物質(zhì)和所述蛋白組分通過(guò)非共價(jià)結(jié)合彼此連接。本發(fā)明也覆蓋了制備產(chǎn)品和藥物制劑的方法。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1270529SQ9880925
公開日2000年10月18日 申請(qǐng)日期1998年9月17日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月18日
發(fā)明者L·赫格迪什, K·克倫普爾, K·帕爾, G·佩西赫 申請(qǐng)人:人類Rt·公司