動(dòng)物模型及治療分子的制作方法
【專利說(shuō)明】動(dòng)物模型及治療分子
[0001]本申請(qǐng)是2010年7月7日提交的題為“動(dòng)物模型及治療分子”的中國(guó)專利申請(qǐng)201080040055.5的分案申請(qǐng)。
[0002]發(fā)明背景
[0003]本發(fā)明涉及被工程化為含有外源DNA如人免疫球蛋白基因DNA的非人動(dòng)物和細(xì)胞，其在醫(yī)藥學(xué)和疾病研究中的應(yīng)用，產(chǎn)生非人動(dòng)物和細(xì)胞的方法，以及由這種動(dòng)物產(chǎn)生的抗體和抗體鏈及其衍生物。
[0004]為了解決人源化抗體的問(wèn)題，許多公司著手產(chǎn)生具有人免疫系統(tǒng)的小鼠。使用的策略是敲除ES細(xì)胞中的重鏈和輕鏈基因座，并用轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)這種遺傳損傷，所述轉(zhuǎn)基因被設(shè)計(jì)為表達(dá)人重鏈和輕鏈基因。盡管可以產(chǎn)生完全人抗體，但是這些模型具有一些主要限制:
[0005](i)重鏈和輕鏈基因座的大小(每個(gè)均幾個(gè)Mb)使得不能將全部基因座導(dǎo)入這些模型中。結(jié)果獲得的轉(zhuǎn)基因品系具有非常有限的V區(qū)庫(kù)(repertoire)，大多數(shù)恒定區(qū)缺失并且重要的遠(yuǎn)距離(distant)增強(qiáng)子區(qū)未包含在該轉(zhuǎn)基因中。
[0006](ii)產(chǎn)生大插入體轉(zhuǎn)基因品系的極低效率以及使其與重鏈和輕鏈敲除品系雜交及使其再次純合的復(fù)雜性和所需時(shí)間，限制了可以進(jìn)行分析最優(yōu)化表達(dá)的轉(zhuǎn)基因品系的數(shù)目。
[0007](iii)個(gè)體抗體親和性很少達(dá)到可以得自完整(非轉(zhuǎn)基因)動(dòng)物的那些親和性。
[0008]W02007117410揭示了表達(dá)嵌合抗體的嵌合構(gòu)建體。
[0009]W02010039900揭示了具有編碼嵌合抗體的基因組的敲入(knock in)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物。
[0010]本發(fā)明提供了在非人哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生包含人Ig可變區(qū)的抗體的方法，及進(jìn)一步提供了產(chǎn)生這種抗體的非人動(dòng)物模型。
[0011]發(fā)明概述
[0012]一方面，本發(fā)明涉及非人哺乳動(dòng)物，其基因組包含:
[0013](a)位于宿主非人哺乳動(dòng)物恒定區(qū)上游的多個(gè)人IgH V區(qū)、一或多個(gè)人D區(qū)及一或多個(gè)人J區(qū)，及
[0014](b)任選地，位于宿主非人哺乳動(dòng)物K恒定區(qū)上游的一或多個(gè)人Ig輕鏈K V區(qū)及一或多個(gè)人Ig輕鏈K J區(qū)和/或位于宿主非人哺乳動(dòng)物λ恒定區(qū)上游的一或多個(gè)人Ig輕鏈λ V區(qū)及一或多個(gè)人Ig輕鏈AJ區(qū)，
[0015]其中所述非人哺乳動(dòng)物能產(chǎn)生嵌合抗體庫(kù)或者嵌合輕鏈或重鏈庫(kù)，所述嵌合抗體或嵌合輕鏈或重鏈具有非人哺乳動(dòng)物恒定區(qū)和人可變區(qū)。
[0016]一方面，本發(fā)明涉及非人哺乳動(dòng)物，其基因組包含:
[0017](a)位于宿主非人哺乳動(dòng)物K恒定區(qū)上游的多個(gè)人Ig輕鏈K V區(qū)及一或多個(gè)人Ig輕鏈K J區(qū)和/或位于宿主非人哺乳動(dòng)物λ恒定區(qū)上游的多個(gè)人Ig輕鏈λ V區(qū)及一或多個(gè)人Ig輕鏈AJ區(qū)，及
[0018](b)任選地，位于宿主非人哺乳動(dòng)物恒定區(qū)上游的一或多個(gè)人IgH V區(qū)、一或多個(gè)人D區(qū)及一或多個(gè)人J區(qū)，
[0019]其中所述非人哺乳動(dòng)物能產(chǎn)生嵌合抗體庫(kù)或者嵌合輕鏈或重鏈庫(kù)，所述嵌合抗體或嵌合輕鏈或重鏈具有非人哺乳動(dòng)物恒定區(qū)和人可變區(qū)。
[0020]—方面，本發(fā)明涉及非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其基因組包含:
[0021](a)位于宿主非人哺乳動(dòng)物恒定區(qū)上游的多個(gè)人IgH V區(qū)、一或多個(gè)人D區(qū)及一或多個(gè)人J區(qū)，及
[0022](b)任選地，位于宿主非人哺乳動(dòng)物K恒定區(qū)上游的一或多個(gè)人Ig輕鏈K V區(qū)及一或多個(gè)人Ig輕鏈K J區(qū)和/或位于宿主非人哺乳動(dòng)物λ恒定區(qū)上游的一或多個(gè)人Ig輕鏈λ V區(qū)及一或多個(gè)人Ig輕鏈λ J區(qū)。
[0023]—方面，本發(fā)明涉及非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其基因組包含:
[0024](a)位于宿主非人哺乳動(dòng)物K恒定區(qū)上游的多個(gè)人Ig輕鏈K V區(qū)及一或多個(gè)人Ig輕鏈K J區(qū)和/或位于宿主非人哺乳動(dòng)物λ恒定區(qū)上游的多個(gè)人Ig輕鏈λ V區(qū)及一或多個(gè)人Ig輕鏈AJ區(qū)，及
[0025](b)任選地，位于宿主非人哺乳動(dòng)物恒定區(qū)上游的一或多個(gè)人IgH V區(qū)、一或多個(gè)人D區(qū)及一或多個(gè)人J區(qū)。
[0026]另一方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生非人細(xì)胞或哺乳動(dòng)物的方法，包括將如下結(jié)構(gòu)插入非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組如ES細(xì)胞基因組中:
[0027](a)位于宿主非人哺乳動(dòng)物恒定區(qū)上游的多個(gè)人IgH V區(qū)、一或多個(gè)人D區(qū)及一或多個(gè)人J區(qū)，及
[0028](b)任選地，位于宿主非人哺乳動(dòng)物K恒定區(qū)上游的一或多個(gè)人Ig輕鏈K V區(qū)及一或多個(gè)人Ig輕鏈K J區(qū)和/或位于宿主非人哺乳動(dòng)物λ恒定區(qū)上游的一或多個(gè)人Ig輕鏈λ V區(qū)及一或多個(gè)人Ig輕鏈AJ區(qū)，
[0029]所述插入使得非人細(xì)胞或哺乳動(dòng)物能產(chǎn)生具有非人哺乳動(dòng)物恒定區(qū)和人可變區(qū)的嵌合抗體庫(kù)，其中步驟(a)和(b)可以依次進(jìn)行，步驟(a)和(b)每個(gè)步驟可以逐步進(jìn)行或者單步進(jìn)行。
[0030]插入可以通過(guò)同源重組進(jìn)行。
[0031]另一方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生特異于希望的抗原的抗體或抗體鏈的方法，所述方法包括用希望的抗原免疫如本文揭示的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物及回收所述抗體或抗體鏈。
[0032]另一方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生完全人源化抗體的方法，所述方法包括用希望的抗原免疫如本文所述轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物，回收所述抗體或產(chǎn)生所述抗體的細(xì)胞，然后例如通過(guò)蛋白質(zhì)或DNA工程將所述非人哺乳動(dòng)物恒定區(qū)用人恒定區(qū)置換。
[0033]另一方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的人源化抗體和抗體鏈，其是嵌合的(如小鼠-人)和完全人源化形式的，本發(fā)明還涉及所述抗體和抗體鏈的片段和衍生物，以及所述抗體、抗體鏈及片段在醫(yī)藥學(xué)包括診斷中的應(yīng)用。
[0034]另一方面，本發(fā)明涉及本文所述非人哺乳動(dòng)物作為模型在檢測(cè)藥物和疫苗中的應(yīng)用。
[0035]附圖簡(jiǎn)述
[0036]圖1-8示出將一系列人BAC插入小鼠Ig基因座中的重復(fù)過(guò)程(iterativeprocess)。
[0037]圖9-18示出針對(duì)IgH和κ基因座的圖1_8的更詳細(xì)過(guò)程。
[0038]圖19和20示出在嵌合小鼠中抗體產(chǎn)生的原理。
[0039]圖21示出人DNA在小鼠染色體中的可能的插入位點(diǎn)。
[0040]圖22-26揭示了將一系列人BAC插入小鼠Ig基因座的另一種重復(fù)過(guò)程。
[0041 ] 圖27-29例證了宿主VDJ區(qū)倒位的機(jī)制。
[0042]圖30例證了使用RMCE方法插入質(zhì)粒的原理證明。
[0043]圖31例證了連續(xù)RMCE -整合進(jìn)著陸墊(landing pad)中。
[0044]圖32例證了成功插入著陸墊的證實(shí)。
[0045]圖33例證了 3’末端消除(Curing)的PCR證實(shí)。
[0046]圖34 例證了 BAC#1 和 PCR Diagnostics 的插入。
[0047]一般描述
[0048]小鼠的所有核苷酸坐標(biāo)均來(lái)自NCBI m37, April 2007 ENSEMBL Release 55.37h，小鼠 C57BL/6J 品系。人核苷酸來(lái)自 GRCh37，F(xiàn)eb 2009 ENSEMBL Release 55.37，大鼠核苷酸來(lái)自 RGSC 3.4 Dec 2004 ENSEMBL release 55.34w。
[0049]在本發(fā)明中，我們揭示了在非人哺乳動(dòng)物如小鼠中構(gòu)建嵌合人重鏈和輕鏈基因座的方法。本文中，在小鼠中進(jìn)行的研究工作只是舉例說(shuō)明，除非特別說(shuō)明，關(guān)于小鼠提及的也包括所有非人哺乳動(dòng)物，小鼠是優(yōu)選的非人哺乳動(dòng)物。
[0050]一方面，本發(fā)明涉及非人哺乳動(dòng)物，其基因組包含:
[0051](a)位于宿主非人哺乳動(dòng)物恒定區(qū)上游的多個(gè)人IgH V區(qū)、一或多個(gè)人D區(qū)及一或多個(gè)人J區(qū)，及
[0052](b)任選地，位于宿主非人哺乳動(dòng)物κ恒定區(qū)上游的一或多個(gè)人Ig輕鏈κ V區(qū)及一或多個(gè)人Ig輕鏈K J區(qū)和/或位于宿主非人哺乳動(dòng)物λ恒定區(qū)上游的一或多個(gè)人Ig輕鏈λ V區(qū)及一或多個(gè)人Ig輕鏈λ J區(qū)；
[0053]其中所述非人哺乳動(dòng)物能產(chǎn)生嵌合抗體或者抗體鏈庫(kù)，所述嵌合抗體或抗體鏈具有非人哺乳動(dòng)物恒定區(qū)和人可變區(qū)。
[0054]另一方面，本發(fā)明涉及非人哺乳動(dòng)物，其基因組包含:
[0055](a)位于宿主非人哺乳動(dòng)物κ恒定區(qū)上游的多個(gè)人Ig輕鏈κ V區(qū)及一或多個(gè)人Ig輕鏈K J區(qū)和/或位于宿主非人哺乳動(dòng)物λ恒定區(qū)上游的多個(gè)人Ig輕鏈λ V區(qū)及一或多個(gè)人Ig輕鏈AJ區(qū)，及
[0056](b)任選地，位于宿主非人哺乳動(dòng)物恒定區(qū)上游的一或多個(gè)人IgH V區(qū)、一或多個(gè)人D區(qū)及一或多個(gè)人J區(qū)；
[0057]其中所述非人哺乳動(dòng)物能產(chǎn)生嵌合抗體庫(kù)，所述嵌合抗體具有非人哺乳動(dòng)物恒定區(qū)和人可變區(qū)。
[0058]任選地，所述非人哺乳動(dòng)物基因組被修飾為防止完全宿主物種特異性抗體的表達(dá)。
[0059]一方面，插入的人DNA包含至少50%人重鏈可變(V)基因，如至少60%、至少70 %、至少80 %、至少90 %及在一個(gè)方面全部人V基因。
[0060]一方面，插入的人DNA包含至少50%人重鏈多樣性(D)基因，如至少60%、至少70%、至少80%、至少90%及在一個(gè)方面全部人D基因。
[0061]一方面，插入的人DNA包含至少50%人重鏈結(jié)合(J)基因，如至少60%、至少70 %、至少80 %、至少90 %及在一個(gè)方面全部人J基因。
[0062]一方面，插入的人DNA包含至少50%人輕鏈可變(V)基因，如至少60%、至少70 %、至少80 %、至少90 %及在一個(gè)方面全部人V基因。
[0063]一方面，插入的人DNA包含至少50%人輕鏈結(jié)合(J)基因，如至少60%、至少70 %、至少80 %、至少90 %及在一個(gè)方面全部人輕鏈J基因。
[0064]插入的人基因可以衍生自相同或不同個(gè)體，或者是合成的或代表人共有序列。
[0065]—方面，盡管V、D和J區(qū)的數(shù)目在人個(gè)體中是可變的，但是據(jù)認(rèn)為在重鏈上是51個(gè)人V基因，27個(gè)D基因和6個(gè)J基因，在κ輕鏈上是40個(gè)人V基因和5個(gè)J基因，在λ 輕鏈上是 29 個(gè)人 V 基因和 4 個(gè) J 基因(Janeway and Travers, Immunob1logy, Thirdedit1n)。
[0066]一方面，插入非人哺乳動(dòng)物中的人重鏈基因座含有人V、D和J區(qū)庫(kù)，其在基因組中與非人哺乳動(dòng)物恒定區(qū)功能性排列，由此在人可變區(qū)與非人哺乳動(dòng)物恒定區(qū)之間可以產(chǎn)生功能性嵌合抗體。這個(gè)全部的插入的人重鏈遺傳材料在本文被稱作人IgH VDJ區(qū)，包含來(lái)自編碼人V、D和J部分的所有外顯子及合適地相關(guān)內(nèi)含子的人基因組的DNA。相似地，人Ig輕鏈κ V和J區(qū)在本文是指人DNA，其包含編碼V和J區(qū)的所有外顯子及適當(dāng)?shù)厝嘶蚪M的相關(guān)內(nèi)含子。人Ig輕鏈λν和J區(qū)在本文是指人DNA，其包含編碼V和J區(qū)的所有外顯子及適當(dāng)?shù)厝嘶蚪M的相關(guān)內(nèi)含子。
[0067]人可變區(qū)被合適地插入在非人哺乳動(dòng)物恒定區(qū)上游，后者包含編碼全部恒定區(qū)或者足夠部分的恒定區(qū)所需的所有DNA，使得能形成能夠特異性識(shí)別抗原的有效嵌合抗體。
[0068]—方面，所述嵌合抗體或者抗體鏈具有一部分宿主恒定區(qū)，足以提供抗體在宿主哺乳動(dòng)物中天然發(fā)生的一或多種效應(yīng)物功能，例如其能與Fe受體相互作用，和/或結(jié)合補(bǔ)體。
[0069]具有宿主非人哺乳動(dòng)物恒定區(qū)的嵌合抗體或抗體鏈因此在本文不限于完整的恒定區(qū)，也包括嵌合抗體或抗體鏈，其具有全部宿主恒定區(qū)或者其足以提供一或多種效應(yīng)物功能的部分。這也適用于本發(fā)明的非人哺乳動(dòng)物和細(xì)胞及方法，其中人可變區(qū)DNA可以插入宿主基因組中，由此其形成具有全部或者部分宿主恒定區(qū)的嵌合抗體鏈。一方面，全部的宿主恒定區(qū)與人可變區(qū)DNA可操縱地連接。
[0070]本文中宿主非人哺乳動(dòng)物恒定區(qū)優(yōu)選是內(nèi)源宿主野生型恒定區(qū)，位于野生型基因座，與重鏈或輕鏈相適合。例如，人重鏈DNA合適地插入在小鼠第12號(hào)染色體上，合適地鄰近小鼠重鏈恒定區(qū)。
[0071]—方面，人DNA如人VDJ區(qū)的插入被靶向在小鼠基因組IgH基因座中J4外顯子與Cu基因座之間；在一個(gè)方面，插入在坐標(biāo)114,667,090與114,665，190之間，合適地在坐標(biāo)114，667，091。一方面，人DNA如人輕鏈κ VJ的插入被靶向在小鼠第6號(hào)染色體的坐標(biāo)70，673，899與70，675，515之間，合適地在第70，674，734位置，或者在λ小鼠基因座第16
號(hào)染色體上的等價(jià)位置上。
[0072]—方面，形成嵌合抗體的宿主非人哺乳動(dòng)物恒定區(qū)可以在不同的(非內(nèi)源)染色體基因座。在這種情況中，插入的人DNA如人可變VDJ或VJ區(qū)隨后可以插入非人基因組中與天然發(fā)生的重鏈或輕鏈恒定區(qū)的位點(diǎn)不同的位點(diǎn)。天然恒定區(qū)可以在位于與天然位置不同的染色體基因座插入該基因組中或者在該基因組中復(fù)制，由此其與人可變區(qū)功能性排列，由此仍可以產(chǎn)生本發(fā)明的嵌合抗體。
[0073]一方面，人DNA插入在內(nèi)源宿主野生型恒定區(qū)，位于宿主恒定區(qū)與宿主VDJ區(qū)之間的野生型基因座。
[0074]位于非人哺乳動(dòng)物恒定區(qū)上游的可變區(qū)的位置是指兩個(gè)抗體部分-可變區(qū)與恒定區(qū)-的適當(dāng)相對(duì)位置，使得所述可變區(qū)與恒定區(qū)在哺乳動(dòng)物體內(nèi)形成嵌合抗體或抗體鏈。因此，插入的人DNA與宿主恒定區(qū)是彼此功能性排列的，用以產(chǎn)生抗體或抗體鏈。
[0075]—方面，插入的人DNA通過(guò)同種型轉(zhuǎn)換能與不同的宿主恒定區(qū)表達(dá)。一方面，同種型轉(zhuǎn)換不需要或涉及反式轉(zhuǎn)換(trans switching)。人可變區(qū)DNA插入在與相關(guān)宿主恒定區(qū)相同染色體上意味著不需要反式轉(zhuǎn)換以產(chǎn)生同種型轉(zhuǎn)換。
[0076]如上所述，用于現(xiàn)有技術(shù)模型中的轉(zhuǎn)基因基因座是人源的，因此即使在所述轉(zhuǎn)基因能與小鼠基因座互補(bǔ)由此小鼠產(chǎn)生可產(chǎn)生完全人抗體的B細(xì)胞的情況中，各個(gè)抗體親和性也很少能達(dá)到可得自完整(非轉(zhuǎn)基因)小鼠的那些水平。這個(gè)原因是(除了上述庫(kù)和表達(dá)水平之外)所述基因座的控制元件是人的。因此，損害了信號(hào)傳導(dǎo)成分如激活高親和性抗體的超變和選擇的成分。
[0077]相反，在本發(fā)明中，宿主非人哺乳動(dòng)物恒定區(qū)被保留，并且優(yōu)選至少一個(gè)非人哺乳動(dòng)物增強(qiáng)子或者其它控制序列如轉(zhuǎn)換區(qū)被保留與非人哺乳動(dòng)物恒定區(qū)功能性排列，由此如在宿主哺乳動(dòng)物中可見的增強(qiáng)子或其它控制序列的作用在所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中完全或者部分發(fā)揮。
[0078]上述方法被設(shè)計(jì)為使得人基因座的全部多樣性均被取樣，使得通過(guò)非人哺乳動(dòng)物控制序列如增強(qiáng)子達(dá)到同樣高水平表達(dá)，由此在B細(xì)胞中的信號(hào)傳導(dǎo)例如使用轉(zhuǎn)換重組位點(diǎn)的同種型轉(zhuǎn)換將仍使用非人哺乳動(dòng)物序列。
[0079]具有這種基因組的哺乳動(dòng)物將產(chǎn)生嵌合抗體，其具有人可變區(qū)和非人哺乳動(dòng)物恒定區(qū)，但是這些抗體在例如一個(gè)克隆步驟中即可易于人源化。此外，這些嵌合抗體的體內(nèi)效力可以在這些相同動(dòng)物中評(píng)估。
[0080]一方面，插入的人IgH VDJ區(qū)包含以種系方式排列的(germline configurat1n)來(lái)自人的所有V、D和J區(qū)及間插序列。
[0081]—方面，將800-1000kb的人IgH VDJ區(qū)插入非人哺乳動(dòng)物IgH基因座，一方面，插入940、950或者960kb片段。合適地，這包括來(lái)自人第14號(hào)染色體105，400, 051-106, 368，585的堿基(對(duì)于人基因組，所有坐標(biāo)均參照NCBI36，對(duì)于小鼠基因組，坐標(biāo)參照ENSEMBL Release 54和NCB頂37，涉及小鼠株系C57BL/6J)。
[0082]—方面，插入的IgH人片段由來(lái)自第14號(hào)染色體105，400, 051-106，368，585的堿基組成。一方面，插入的人重鏈DNA如由來(lái)自第14號(hào)染色體105，400, 051-106, 368，585的堿基組成的DNA插入在小鼠第12號(hào)染色體的小鼠J4區(qū)末端與E μ區(qū)之間，合適地在坐標(biāo)114，667,091 與 114，665，190 之間，優(yōu)選在坐標(biāo) 114，667,091。
[0083]—方面，插入的人κ VJ區(qū)包含以種系方式排列的來(lái)自人的所有V和J區(qū)及間插序列。
[0084]合適地，這包括來(lái)自人第2號(hào)染色體88，940，356-89, 857，000堿基，合適地大約為917kb。另一方面，輕鏈VJ插入物可包含僅V節(jié)段和J節(jié)段的近端簇(proximal clusters)。這種插入物是大約473kb。
[0085]一方面，人輕鏈κ DNA如由來(lái)自人第2號(hào)染色體88，940, 356-89，857，000的堿基組成的人IgK