進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。所述JM8ES細(xì)胞已經(jīng)示出有能力大量提供體細(xì)胞組織和種系，并用于Sanger Institute的大量小鼠誘變程序如 EUCOMM 和 KOMP(Pettitt, S.J.，Liang, Q.，Rairdan, X.Y.，Moran, J.L., Prosser, Η.M., Beier, D.R., Lloyd, K.C., Bradley, A., and Skarnes, ff.C.(2009).Agouti C57BL/6N embryonic stem celIs for mouse genetic resources.NatureMethods.)。將 JM8ES 細(xì)胞(1.0 X 107)用 10 μ g 1-Scel 線性化人 BAC DNA 電穿孔(500 μ F，230V ;B1Rad)。用嘌呤霉素(3 μ g/ml)或者G418 (150 μ g/ml)選擇轉(zhuǎn)染子。在電穿孔后24小時(shí)(用G418)或48小時(shí)(用嘌呤霉素)開始選擇，進(jìn)行5天。10 μ g線性化人BAC DNA可產(chǎn)生直至500個(gè)嘌呤霉素抗性或G418抗性ES細(xì)胞集落。挑取抗生素抗性ES細(xì)胞集落置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行基因分型以鑒別被靶向的克隆。
[0266]—旦被靶向的小鼠ES細(xì)胞克隆被鑒別，通過陣列比較基因組雜交(CGH)分析其總體基因組完整性(Chung, Y.J., Jonkers, J., Kitson, Η., Fiegler, Η., Humphray, S., Scott, C, Hunt, S., Yu, Y., Nishi jima, 1., Velds, A., et al.(2004).A whole-genome mouseBAC microarray with l_Mb resolut1n for analysis of DNA copy number changesby array comparative genomic hybridizat1n.Genome research 14, 188-196.及Liang,Q., Conte, N., Skarnes, ff.C, and Bradley, A.(2008).Extensive genomic copynumber variat1n in embryonic stem cells.Proceedings of the Nat1nal Academy ofSciences of the United States of America 105, 17453-17456)。具有異?；蚪M的 ES細(xì)胞不能有效提供嵌合小鼠種系。BAC完整性通過PCR擴(kuò)增BAC中每個(gè)已知功能性V基因檢查。例如，在一種方法中，針對IgH基因座選擇的第一人BAC具有6個(gè)功能性V基因。為了證實(shí)這個(gè)BAC存在這6個(gè)IGH V基因的完整性，設(shè)計(jì)至少14對PCR引物并用于PCR擴(kuò)增來自被靶向的ES細(xì)胞的基因組DNA。這些片段的人野生型大小和序列保證插入的BAC不重排。
[0267]更詳細(xì)的CGH將也證實(shí)插入的BAC的完整性。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用由Agilent Technologies, Inc.開發(fā)的oligo aCGH平臺(tái)。這個(gè)平臺(tái)不僅能高分辨度地研究基因組規(guī)模 DNA 拷貝數(shù)變化(Barrett, MT., Scheffer, A., Ben-Dor, A., Sampas, N., Lipson, D.,Kincaid, R., Tsang, P., Curry, B., Baird, K., Meltzer, P.S., et al.(2004).Comparativegenomic hybridizat1n using oligonucleotide microarrays and total genomic DNA.Proceedings of the Nat1nal Academy of Sciences of the United States of America101，17765-17770.)，而且可以使用常規(guī)設(shè)計(jì)的陣列檢查特定基因組區(qū)域。對比依賴于cDNA探針或者完整BAC特征的傳統(tǒng)aCGH技術(shù)，60聚體寡核苷酸探針可保證特異性雜交和高敏感性及精確性以用于檢測我們制備的工程化的染色體改變。例如，設(shè)計(jì)為沿著插入的BAC全長每隔一定間隔雜交的寡聚物將能檢測甚至非常短的缺失、插入或者其它重排。這個(gè)平臺(tái)也提供了定制微陣列設(shè)計(jì)的最大靈活性。被靶向的ES細(xì)胞基因組DNA和正常的人個(gè)體基因組DNA將用染料各自獨(dú)立地標(biāo)記并與該陣列雜交。使用Aglient Technologies DNA微陣列掃描儀掃描陣列玻片。每個(gè)陣列圖像上染料Cy5和染料Cy3的熒光強(qiáng)度的倒數(shù)及l(fā)og2比值將通過使用Bluefuse軟件(Bluegnome)提取。具有不一致熒光模式的斑點(diǎn)(“置信度”〈0.29或者“質(zhì)量(quality)，，= 0)在校正所有l(wèi)og2比值之前被排除。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，對于來自任何寡聚物探針的信號的log2比率在-0.29和+0.29之間被認(rèn)為無拷貝數(shù)變化。對于“復(fù)制”的log2比率閾值通常>0.29999，對于確實(shí)其為〈0.29999。
[0268]一旦將第一人BAC插入小鼠IgH基因座中并證實(shí)是完整的天然構(gòu)型，則將可以通過使用Flp位點(diǎn)特異性重組酶切除側(cè)翼為FRT的BAC主鏈。如果常規(guī)的Flp-催化的FRT重組不夠高，可以使用Flo，這是改良形式的Flpo重組酶，其在一些檢測中比原始Flp在ES細(xì)胞中的效力高3-4倍。在切除BAC主鏈之后，ES細(xì)胞將變成對嘌呤霉素(或G418)敏感及對FIAU是抗性的(喪失TK盒)。所述切除事件將通過使用人基因組DNA引物對連接片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增進(jìn)一步鑒定。這些不含側(cè)翼為FRT側(cè)翼的BAC主鏈的ES細(xì)胞將用于下一輪人BAC插入及用于胚泡注射。
[0269]靶向ES細(xì)胞基因組以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠可以通過使用參考附圖1-18所述方案進(jìn)行。
[0270]圖1例證了三種基本主鏈載體，分別為起始盒和2個(gè)大插入載體1和2。所述起始盒包含與希望的插入小鼠基因組中的位點(diǎn)同源的序列，這些位點(diǎn)在選擇標(biāo)記和用于基于PCR的基因分型的填充引物序列側(cè)翼以證實(shí)BAC的正確插入。所述填充-引物序列提供了基因分型每個(gè)BAC添加步驟的基礎(chǔ)。這個(gè)序列被認(rèn)為提供了 PCR引物的充分確認(rèn)的(robustwell validated)序列模板，其可以位于IScel位點(diǎn)，理想地與BAC插入序列相距?lkb。
[0271]所述大插入載體包含在具有選擇標(biāo)記的質(zhì)粒上的人DNA及獨(dú)特的限制位點(diǎn)以線性化所述質(zhì)粒以助于同源重組進(jìn)ES細(xì)胞基因組中。
[0272]圖2例證了通過在小鼠J4與C alpha外顯子之間同源重組而將起始盒插入小鼠基因組中。嘌呤霉素選擇可以鑒別具有插入該盒的ES細(xì)胞。pu(Delta) tk是一種在嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(Puro)與截短形式的單純皰疹病毒1型胸苷激酶(DeltaTk)之間的雙功能融合蛋白。用pu (Delta) tk轉(zhuǎn)染的鼠胚胎干(ES)細(xì)胞變得對嘌呤霉素有抗性并且對1-(-2-脫氧-2-氟-Ι-β-D-阿糖-呋喃基)-5-碘尿嘧啶(FIAU)具有敏感性。與其它HSVltk轉(zhuǎn)基因不同，puDe 1 tatk易于通過雄性種系傳遞。因此，pu (De 1 ta) tk是方便的陽性/陰性選擇標(biāo)記，其可以廣泛用于許多ES細(xì)胞應(yīng)用中。
[0273]圖3例證了大插入載體1靶向小鼠ES細(xì)胞基因組。載體的線性化是在與填充引物序列相同位置進(jìn)行，其允許缺口修復(fù)基因分型策略，如本領(lǐng)域公知那樣-見Zheng et alNAR 1999, Vo 1 27，11，2354 _ 2360。本質(zhì)上，將靶向載體隨機(jī)插入基因組中將不“修復(fù)”缺口，而同源重組事件將修復(fù)該缺口。合適PCR引物序列的并列使得可以逐個(gè)篩選集落的陽性PCR片段，表明正確插入。使用G418的陽性選擇使得可以鑒別含有neo選擇標(biāo)記的小鼠ES細(xì)胞?？梢詫λ嘘P(guān)鍵的V、D和J區(qū)進(jìn)行PCR確認(rèn)。陣列比較基因組雜交可用于證實(shí)所述BAC結(jié)構(gòu)。
[0274]圖4例證了使用Flpe缺失puro-delta-tk盒及BAC質(zhì)粒主鏈并且在FIAU中選擇。由于Flpe在小鼠ES細(xì)胞中無效(瞬時(shí)Flpe表達(dá)5%缺失)，預(yù)期在大多數(shù)情況中所述重組發(fā)生在BAC主鏈側(cè)翼的兩個(gè)FRT位點(diǎn)之間。也可以檢測Flpo以發(fā)現(xiàn)相距10kb的兩個(gè)FRT位點(diǎn)之間的重組效率。
[0275]鑒于FRT缺失步驟是可選擇的，因此可以集合FIAU抗性克隆并立即進(jìn)行與克隆分析平行的下一步驟?；蛘?，可能希望通過短范圍PCR示出所述人序列目前與小鼠的那些序列相鄰(Hu-引物1和Mo-引物)。
[0276]在此階段將已經(jīng)插入200kb人基因座。
[0277]圖5例證了第二大插入載體靶向ES細(xì)胞基因組。使用相同起始盒將所述人BAC靶向小鼠IgH基因座，隨后進(jìn)行IScelBAC線性化，BAC靶向起始盒以及缺口修復(fù)基因分型策略。如前進(jìn)行BAC插入證實(shí)。
[0278]圖6例證了大插入載體2的側(cè)翼為FRTY的BAC主鏈以及neo標(biāo)記通過Flpo缺失。注意這不是可選擇的，因此將需要在這點(diǎn)進(jìn)行克隆分析。這將可以證實(shí)人2插入物與人1插入物的并列及其它確認(rèn)結(jié)果。
[0279]在此階段，將已經(jīng)插入大約200kb人基因座。
[0280]圖7例證了接下來大插入載體革巴向小鼠IgH基因座。然后除去pu-delta TK盒，如圖4所示。可以重復(fù)進(jìn)行該程序以摻入其它BAC。
[0281 ] 圖8例證了最終預(yù)測的ES細(xì)胞構(gòu)建體。
[0282]圖9 - 18提供了關(guān)于這種方法的進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0283]實(shí)施例2
[0284]在本發(fā)明進(jìn)一步的方法中，也可以采用位點(diǎn)特異性重組。位點(diǎn)特異性重組(SSR)在近20年已經(jīng)廣泛用于將轉(zhuǎn)基因整合進(jìn)指定染色體基因座中。SSR包括在同源DNA序列之間的重組。
[0285]第一代基于SSR的染色體靶向包括在(i)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒中的單個(gè)重組靶位點(diǎn)(RT)如ΙοχΡ或FRT和(ii)通過預(yù)先整合提供的染色體RT位點(diǎn)之間的重組。這種方法的主要問題是插入事件很少見，因?yàn)榍谐偸潜炔迦敫行?。稱作RMCE(重組酶介導(dǎo)的盒置換)的第二代 SSR 是由 Schlake 和 Bode 在 1994 年揭示的(Schlake, T.J.Bode (1994)."Useof mutated FLP-recognit1n-target-(FRT_)sites for the exchange of express1ncassettes at defined chromosomal loci〃.B1chemistry 33:12746-12751)。 該方法基于在轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒中使用兩個(gè)異種特異性和不相容RT，其可以與染色體上相容的RT位點(diǎn)重組，導(dǎo)致一段DNA與另一段DNA的交換-或者盒交換。這種方法已經(jīng)成功用于許多有效的染色體靶向中，包括整合大于50kb的BAC插入物(Wal lace, H.A.C.etal.(2007)."Manipulating the mouse genome to engineering precise funct1nalsyntenic replacements with human sequence".Cell 128:197-209 ；Prosser, Η.M.etal.(2008).〃Mosaic complementat1n demonstrates a regulatory role for myosinVila in actin dynamics of Stereocilia".Mol.Cell.B1l.28:1702-12)。
[0286]BAC的最大插入大小是大約300-kb，因此這給用于RMCE的盒大小設(shè)置了上限。
[0287]在本發(fā)明中，我們利用稱作順序RMCE (sequential RMCE, SRMCE)的新的基于SSR的技術(shù)，這種技術(shù)可以將BAC插入物連續(xù)插入同一基因座中。
[0288]所述方法包括如下步驟:
[0289]1.將形成起始盒的DNA (本文也稱作著陸墊(landing pad))插入到細(xì)胞基因組中，
[0290]2.將第一 DNA片段插入到所述插入位點(diǎn)，所述第一 DNA片段包含人DNA的第一部分和含有第一選擇標(biāo)記或者在插入時(shí)產(chǎn)生選擇標(biāo)記的第一載體部分，
[0291]3.除去部分載體DNA，
[0292]4.將第二 DNA片段插入到第一 DNA片段的載體部分，所述第二 DNA片段含有人DNA的第二部分及第二載體部分，所述第二載體部分含有第二選擇標(biāo)記或者在插入時(shí)產(chǎn)生第二選擇標(biāo)記，
[0293]5.除去任何載體DNA，以使得第一和第二人DNA片段形成連續(xù)序列，及
[0294]6.根據(jù)需要重復(fù)進(jìn)行插入部分人V(D)J DNA及除去載體DNA的步驟，以產(chǎn)生具有全部或部分人VDJ或VJ區(qū)的細(xì)胞，其結(jié)合宿主恒定區(qū)足以能產(chǎn)生嵌合抗體，
[0295]其中至少一個(gè)DNA片段的插入使用位點(diǎn)特異性重組。
[0296]在一特定方面，所述方法利用三個(gè)異種特異性和不相容ΙοχΡ位點(diǎn)。所述方法包括如下步驟，并如圖22-26所例證:
[0297]1.將著陸墊靶向指定基因座。將含有側(cè)翼為反向piggyBac(PB)ITR的HPRT小基因的進(jìn)入載體靶向指定區(qū)域(例如IGHJ與Ε μ或者IGKJ與Εκ或者IGLC1與Ε λ 3_1之間的區(qū)域)作為BAC靶向的著陸墊。所述HPRT小基因包含兩個(gè)合成外顯子和相關(guān)內(nèi)含子。所述5’HPRT外顯子的側(cè)翼是彼此相反方向的兩個(gè)異種特異性和不相容ΙοχΡ位點(diǎn)(一個(gè)是野生型的，另一個(gè)是突變的位點(diǎn)，loX5171)(圖22)。這兩個(gè)ΙοχΡ位點(diǎn)提供了通過RMCE插入BAC的重組位點(diǎn)。
[0298]2.將第一修飾的BAC插入被靶向的著陸墊。第一 BAC具有一段側(cè)翼為工程化修飾的待插入到基因組中的DNA。所述5’修飾(loxP-neo基因-lox2272_PGK啟動(dòng)子-PB 5’ LTR)和3’修飾(PB3’LTR-puroATK基因_1οχ5171)在圖23中示出，同時(shí)示出了 lox位點(diǎn)和PBLTR的相對方向。通過從共電穿孔的載體的瞬時(shí)CRE表達(dá)，所述DNA序列將通過RMCE插入指定基因座。其中已經(jīng)發(fā)生正確插入的細(xì)胞可以如下選擇:(i)嘌呤霉素抗性(puroATK基因從所述著陸墊獲得一個(gè)啟動(dòng)子-PGK)，(ii) 6TG-抗性(HPRT小基因已經(jīng)被破壞)，及(iii)G418-抗性(選擇通過5’區(qū)PGK-neo排列的任意插入)。可以使用這些選擇方案的任意組合。G418-和6TG-抗性選擇5’末端上的正確事件，而嘌呤霉素抗性選擇3’末端上的正確事件。
[0299]3.消除(除去)第一插入物的3’修飾。適當(dāng)插入的第一 BAC導(dǎo)致3’末端具有puroATK基因，側(cè)翼是反向PB LTR(圖24)-基本上正確的轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)。然后這個(gè)轉(zhuǎn)座子可以通過piggyBac轉(zhuǎn)座酶的瞬時(shí)表達(dá)而被除去(從電穿孔的載體中)。通過FIAU抗性可以選擇具有正確切除事件的細(xì)胞-即沒有來自puroATK基因的胸苷激酶活性。這完全除去了 3’修飾，未遺留微量核苷酸。
[0300]4.在第一插入物的5’末端插入第二修飾的BAC。第二 BAC具有一段側(cè)翼是工程化修飾的待插入基因組中的DNA(通常與第一 BAC插入的DNA是連續(xù)的)。所述5’修飾(ΙοχΡ - HPRT小基因5’部分-lox5171_PGK啟動(dòng)子-PB5’ LTR)和3’修飾(PB3，LTR-puro Δ TK-lox2272)如圖25所示，同時(shí)示出了 lox位點(diǎn)和PB LTR的相對方向。通過從共電穿孔載體的瞬時(shí)CRE表達(dá)，所述DNA序列將通過RMCE插入指定基因座。其中已經(jīng)發(fā)生正確插入的細(xì)胞可以如下選擇:(i) HAT-抗性(HPRT小基因通過正確插入事件重建，即5’和3’外顯子結(jié)構(gòu)被帶到一起)，及(ii)嘌呤霉素抗性(puroATK基因從著陸墊獲得啟動(dòng)子-PGK)。
[0301]5.消除(除去)第二插入物的3’修飾。正確插入的第二 BAC導(dǎo)致3’末端具有puroATK基因，側(cè)翼是反向PB LTR(圖26)-基本上正確的轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)，與成功的第一 BAC插入物的結(jié)果完全相似。因此這個(gè)轉(zhuǎn)座子可同樣通過PiggyBac轉(zhuǎn)座酶的瞬時(shí)表達(dá)而被除去(從電穿孔載體中)。具有正確切除事件的細(xì)胞可以通過FIAU抗性選擇，即沒有來自puroATK基因的胸苷激酶活性。這完全除去了 3’修飾，未遺留微量核苷酸。
[0302]6.在消除了第二 BAC插入物的3’修飾之后，所述著陸墊