一種4-胺烷氧基-3-甲氧基肉桂酸苯酰胺類化合物、制備方法及其用途技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種治療和/或預(yù)防神經(jīng)退行性相關(guān)疾病藥物，具體涉及一種4-胺烷氧基-3-甲氧基肉桂酸苯酰胺類化合物、制備方法及其用途。

背景技術(shù)：
血管性癡呆(VascularDementia，VD)是由各種類型的腦血管疾病(包括缺血性腦血管病、出血性腦血管疾病、急性和慢性缺氧性腦血管疾病等)所致的智能及認知功能障礙的臨床綜合征，其主要臨床表現(xiàn)包括：認知能力、記憶力和社會生活能力的減退以及情感、性格的改變，是一種慢性進行性疾病。在中國、日本等亞洲國家血管性癡呆是老年期癡呆的第一位原因；隨著世界人口向老齡化的不斷推進，腦血管病日益增多，血管性癡呆發(fā)病率有逐漸上升的趨勢，嚴重影響老年人的工作和生活質(zhì)量，并給社會和家庭帶來沉重的經(jīng)濟和精神負擔(dān)。因此，VD已成為當(dāng)今老年醫(yī)學(xué)與精神醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中一個重要的研究熱點。血管性癡呆由于發(fā)病機制復(fù)雜，尚無能夠阻斷疾病發(fā)展的藥物，目前臨床治療以改善腦部血液循環(huán)和腦代謝，加強腦部營養(yǎng)為主。近年來，國內(nèi)外研究表明，在VD患者表現(xiàn)認知功能損傷的同時也經(jīng)常伴有膽堿能系統(tǒng)的異常。VD患者海馬區(qū)ChAT陽性神經(jīng)元及纖維密度降低，腦內(nèi)不同部位的ChAT活性下降，在VD患者腦脊液中的ACh濃度明顯低于正常水平，并且其濃度降低的程度與癡呆的嚴重程度呈正相關(guān)；而腦缺血可以導(dǎo)致腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性上升；同時也發(fā)現(xiàn)乙酰膽堿酯酶抑制劑如：HuperzineA和Revastigmine可以保護缺血造成的神經(jīng)元損傷，且可以促進腦缺血后神經(jīng)損傷和腦功能的恢復(fù)。這表明乙酰膽堿酯酶抑制劑也可用于血管性癡呆的治療。阿爾茨海默癥(Alzheimer’sdisease,AD)是老年人中發(fā)病率和致死率最高的疾病之一。阿爾茨海默癥國際協(xié)會(Alzheimer’sdiseaseInternational,ADI)發(fā)布的《2015全球阿爾茨海默癥報告》指出，2015年全球已有超過4600萬人患上癡呆癥，據(jù)預(yù)測，到2050年，全球?qū)⒂?.315億人口受到癡呆的困擾，其中中國癡呆癥患者的發(fā)病率已達到6.61％。隨著人均生存年齡的延長，本病已發(fā)展為社會和醫(yī)療保健系統(tǒng)的主要負擔(dān)，并且為社會、患者及家屬帶來了沉重的精神和經(jīng)濟壓力。因而，研究開發(fā)新型老年癡呆治療藥物意義重大。從市場需求來看，阿爾茨海默癥國際協(xié)會預(yù)測，到2050年老年癡呆癥治療藥物的全球銷售額將達6000億美元；在我國，隨著老年癡呆癥發(fā)病率的迅速上升，這類藥物的市場也快速膨脹。AD是一種慢性的、以進行性記憶和認知功能損害為特征的多病因、多環(huán)節(jié)參與的復(fù)雜神經(jīng)退行性疾病，其主要病理學(xué)特征為β-淀粉樣肽(β-amyloidpeptide,Aβ)大量沉積形成的老年斑(Senileplaque,SP)、tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)(Neurofibrillarytangle,NFT)，并伴隨神經(jīng)元的凋亡和神經(jīng)突觸的退化等。近年來，許多研究者致力于從分子和細胞水平來揭示AD的發(fā)病機理，提出了多種假說，如：膽堿能神經(jīng)元損傷、淀粉樣蛋白的沉積、tau蛋白過度磷酸化、炎癥、自由基氧化、金屬離子失調(diào)等，因此，針對這些發(fā)病機制來發(fā)展的新型治療途徑和手段，將有希望緩解和改善AD患者的病情。目前臨床上有效治療AD的藥物主要有兩類：(1)基于神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿不足導(dǎo)致認知功能失調(diào)的膽堿能假說，采用乙酰膽堿酯酶抑制劑來提高病人腦內(nèi)乙酰膽堿水平，如：Tacrine、Donepezil、Ravastigmine、Galantamine；(2)采用N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體抑制劑減少谷氨酸鹽對神經(jīng)細胞的損傷，如：MemantineHydrochloride。但這些藥物存在作用靶點單一、毒副作用較多、對AD患者的長期療效欠佳等問題。因此，研究開發(fā)具有新型化學(xué)結(jié)構(gòu)、新型作用機制、多作用靶點、低毒副作用的抗神經(jīng)退行性疾病治療藥物不僅符合社會老齡化進程的迫切需求，而且具有良好的市場前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種4-胺烷氧基-3-甲氧基肉桂酸苯酰胺類化合物、制備方法及其用途，開發(fā)了一種治療和/或預(yù)防神經(jīng)退行性相關(guān)疾病的藥物，包括但不限于血管性癡呆、阿爾茨海默氏病、帕金森癥、亨廷頓癥、HIV相關(guān)癡呆癥、多發(fā)性硬化癥、進行性脊髓側(cè)索硬化癥、神經(jīng)性疼痛、青光眼等神經(jīng)退行性疾病。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種4-胺烷氧基-3-甲氧基肉桂酸苯酰胺類化合物，其特征在于：該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)通式如(I)所示：式中：m表示1-12；R1表示H、C1～C12烷基；R2表示C1～C12烷基、芐基、取代芐基；R1NR2也表示四氫吡咯基、嗎啉基、哌啶基、4-位被C1～C12烷基所取代的哌啶基、4-位被芐基或取代芐基所取代的哌啶基、哌嗪基、4-位被C1～C12烷基所取代的哌嗪基、4-位被芐基或取代芐基所取代的哌嗪基；X表示C1～C12烷基、芐基或取代芐基、苯環(huán)上被1-4個選自下組的基團所取代的苯基：F、Cl、Br、I、C1-4烷基、C1-4烷氧基、三氟甲基、三氟甲氧基、硝基、氰基，取代基可在苯環(huán)的任意可能位置。本發(fā)明也提供了一種4-胺烷氧基-3-甲氧基肉桂酸苯酰胺類化合物的藥學(xué)上可接受的鹽，所述的藥學(xué)上可接受的鹽為4-胺烷氧基-3-甲氧基肉桂酸苯酰胺類化合物與鹽酸、氫溴酸、硝酸、硫酸、磷酸、C1-6脂肪羧酸、草酸、苯甲酸、水楊酸、馬來酸、富馬酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、C1-6烷基磺酸、樟腦磺酸、苯磺酸或?qū)妆交撬岬姆磻?yīng)所生成的鹽。本發(fā)明的一種4-胺烷氧基-3-甲氧基肉桂酸苯酰胺類化合物的制備方法，包括如下步驟：第一步、以阿魏酸為起始原料，在第一溶劑和縮合劑條件下與取代苯胺反應(yīng)，得到相應(yīng)的阿魏酸苯酰胺類化合物；第二步、阿魏酸苯酰胺類化合物在第二溶劑和第一堿性條件下與二鹵烷基化合物反應(yīng)，生成相應(yīng)的鹵化合物；第三步、鹵化合物在第三溶劑與有機胺類化合物反應(yīng)，即得到的4-胺烷氧基-3-甲氧基肉桂酸苯酰胺類化合物，其反應(yīng)方程式如下：進一步，本發(fā)明的一種優(yōu)選方案為：所述的第一步中：第一溶劑為：四氫呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、C3-8脂肪酮、苯、甲苯、乙腈或C1-8烷烴，優(yōu)選溶劑為二氯甲烷或甲苯；縮合劑為：二環(huán)己基碳二亞胺、4-二甲氨基吡啶、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和1-羥基苯并三唑中的一種或一種以上的混合物；阿魏酸：取代苯胺：縮合劑的摩爾投料比為1.0：1.0～10.0，優(yōu)選摩爾投料比為1.0：1.0～5.0；反應(yīng)溫度為25～150℃，優(yōu)選反應(yīng)溫度為25～100℃；反應(yīng)時間為1～72小時，優(yōu)選反應(yīng)時間為1～24小時。進一步，本發(fā)明的一種優(yōu)選方案為：所述的第二步中：第一堿性條件所用堿為：堿金屬或堿土金屬碳酸鹽、堿金屬或堿土金屬碳酸氫鹽、C1-8醇的堿金屬鹽、三乙胺、三丁胺、三辛胺、吡啶、N-甲基嗎啉、N-甲基哌啶、三乙烯二胺和四丁基氫氧化銨一種或者一種以上的混合物，優(yōu)選堿為碳酸鉀、碳酸鈉、三乙胺和吡啶一種或者一種以上的混合物；第二溶劑為乙醚、四氫呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、二氯甲烷、氯仿、C3-8脂肪酮、苯、甲苯、乙腈和C5-8烷烴一種或一種以上的混合物，優(yōu)選反應(yīng)溶劑為二氯甲烷、甲苯、乙腈和氯仿一種或者一種以上的混合物；阿魏酸苯酰胺類化合物：二鹵烷基化合物：堿的摩爾投料比為1.0:1.0～10.0:1.0～10.0，優(yōu)選摩爾投料比為1.0:1.0～5.0:1.0～5.0；反應(yīng)溫度為25～150℃，優(yōu)選反應(yīng)溫度為25～100℃；反應(yīng)時間為1～72小時，優(yōu)選反應(yīng)時間為1～24小時。進一步，本發(fā)明的一種優(yōu)選方案為：所述的第三步中第三溶劑為：乙醚、四氫呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、二氯甲烷、氯仿、C3-8脂肪酮、苯、甲苯、乙腈、C1-8醇和C5-8烷烴中一種或者一種以上的混合物，優(yōu)選溶劑為乙腈、N,N-二甲基甲酰胺或甲苯；鹵化合物：有機胺類化合物的摩爾投料比為1.0：1.0～10.0，優(yōu)選摩爾投料比為1.0：1.0～5.0；反應(yīng)溫度為25～150℃，優(yōu)選反應(yīng)溫度為25～100℃；反應(yīng)時間為1～72小時，優(yōu)選反應(yīng)時間為1～24小時。本發(fā)明的4-胺烷氧基-3-甲氧基肉桂酸苯酰胺類化合物的藥學(xué)上可接受的鹽的制備方法，包括以下步驟：4-胺烷氧基-3-甲氧基肉桂酸苯酰胺類化合物和丙酮攪拌均勻后加入酸，升溫回流攪拌反應(yīng)15-30分鐘，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，減壓蒸除溶劑，殘余物用丙酮重結(jié)晶，過濾析出的固體，即得4-胺烷氧基-3-甲氧基肉桂酸苯酰胺類化合物的藥學(xué)上可接受的鹽。本發(fā)明的4-胺烷氧基-3-甲氧基肉桂酸苯酰胺類化合物的藥學(xué)上可接受的鹽用于制備治療和/或預(yù)防神經(jīng)退行性相關(guān)疾病的藥物中的用途。進一步，本發(fā)明的一種優(yōu)選方案：所述的藥物中4-胺烷氧基-3-甲氧基肉桂酸苯酰胺類化合物占總重量比10％～99.5％。本發(fā)明也公開了一種藥物組合物包括治療有效量的一種或多種4-胺烷氧基-3-甲氧基肉桂酸苯酰胺類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，該藥物組合物可進一步含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。所述“治療有效量”是指引起研究者或醫(yī)生所針對的組織、系統(tǒng)或動物的生物或醫(yī)藥反應(yīng)的藥物或藥劑的量；所述“組合物”是指通過將一種以上物質(zhì)或組份混合而成的產(chǎn)品；所述“藥學(xué)上可接受的載體”是指藥學(xué)上可接受的物質(zhì)、組合物或載體，如：液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包囊物質(zhì)，它們攜帶或轉(zhuǎn)運某種化學(xué)物質(zhì)。本發(fā)明所提供的藥物組合物其理想的比例是，4-胺烷氧基-3-甲氧基肉桂酸苯酰胺類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽作為活性成分占總重量比10％～99.5％，其余部分為占總重量比90％以下。本發(fā)明的起始原料鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽、仲胺類化合物可用本領(lǐng)域常見的技術(shù)值得，包括但不局限于以下文獻中所公開的方法：Sang,Z.et.al.Eur.J.Med.Chem.,2015,94,348-366.LiuQ.et.al.Bioorg.Med.Chem.,2015,23,911-923。按照上述制備方法所得之4-胺烷氧基-3-甲氧基肉桂酸苯酰胺類化合物(I)分子中含有氨基，該氨基呈堿性，可與任何合適的酸通過藥學(xué)上常規(guī)的成鹽方法制得其藥物學(xué)上可接受的鹽。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明的化合物對乙酰膽堿酯酶均具有顯著抑制作用，其IC50為0.01μM～5μM，對乙酰膽堿酯酶的抑制活性大大高于對丁酰膽堿酯酶的抑制活性，說明本發(fā)明所公開的化合物對乙酰膽堿酯酶具有一定的選擇性抑制作用。本發(fā)明的化合物對過氧化氫誘導(dǎo)的PC12細胞損傷均有顯著的保護作用，且在10-5mol/L濃度下的抗氧化活性均強于阿魏酸。本發(fā)明的化合物對Aβ1-42自身誘導(dǎo)的聚集均具有顯著抑制作用，其IC50為0.1μM～20μM。本發(fā)明所公開的化合物對東莨菪堿致小鼠獲得記憶障礙具有劑量依賴性的改善作用，與模型組比較均具有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.01)。本發(fā)明所公開的化合物對乙醇所致小鼠記憶再現(xiàn)功能障礙均具有明顯改善作用，與模型組相比均有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.01)。具體實施方式下面將結(jié)合本發(fā)明具體實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。實施例1-15一種4-胺烷氧基-3-甲氧基肉桂酸苯酰胺類化合物的制備方法，包括以下步驟：第一步、在反應(yīng)瓶中加入阿魏酸、第一溶劑、縮合劑和苯胺，攪拌反應(yīng)，反應(yīng)進程用TLC跟蹤；反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸除溶劑，殘余物中加入二氯甲烷，依次用飽和碳酸鈉水溶液和飽和氯化鈉水溶液洗滌，有機層經(jīng)無水硫酸鈉干燥后過濾，減壓蒸除溶劑，殘余物經(jīng)柱層析純化(洗脫液：二氯甲烷：甲醇＝30：1v/v)，得相應(yīng)的阿魏酸苯酰胺類化合物；第二步、將上述阿魏酸苯酰胺類化合物溶于第二溶劑中，加入第一堿性條件所用堿和二溴乙烷，升溫回流攪拌反應(yīng)，反應(yīng)進程用TLC跟蹤，反應(yīng)結(jié)束后，壓蒸除溶劑和過量的二溴乙烷，殘余物經(jīng)柱層析純化(洗脫液：氯仿)，得溴化物中間體第三步、將溴化物中間體溶于第三溶劑中，加入有加入芐基甲基胺，升溫至回流攪拌反應(yīng)，反應(yīng)進程用TLC跟蹤；反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸除溶劑，殘余物中加入二氯甲烷，依次用5％氫氧化鈉水溶液和去離子水洗滌，有機層經(jīng)無水硫酸鈉干燥后過濾，減壓蒸除溶劑，殘余物經(jīng)柱層析純化(洗脫液：二氯甲烷：甲醇＝15：1v/v)，得相應(yīng)的4-胺烷氧基-3-甲氧基肉桂酸苯酰胺類化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)均經(jīng)1H-NMR，13C-NMR和ESI-MS確證。實施例1-15的具體工藝條件見表1-3。表1第一步工藝條件和結(jié)果由表1可知工藝條件對產(chǎn)物的收率具有嚴重的影響，選擇合適的工藝條件對產(chǎn)物收率具有重要的意思。由表1可知第一溶劑采用二氯甲烷：甲苯的體積比2:1，二環(huán)己基碳二亞胺：4-二甲氨基吡啶為2:1，摩爾投料比為1:3，反應(yīng)溫度為70℃，反應(yīng)時間為6h的條件下，收率較好，為83.8％。當(dāng)?shù)谝蝗軇┎捎枚燃淄椋杭妆降捏w積比2:1，縮合劑采用二環(huán)己基碳二亞胺：4-二甲氨基吡啶:氯化鋅為2:1：0.05，摩爾投料比為1:3，反應(yīng)溫度為70℃，反應(yīng)時間為6h的條件下，收率最高，為87.8％。表2第二步工藝條件和結(jié)果由表2可知工藝條件對產(chǎn)物的收率具有嚴重的影響，選擇合適的工藝條件對產(chǎn)物收率具有重要的影響。由表2可知第二溶劑采用二氯甲烷：甲苯：氯仿＝2:1：2，第一堿性條件所用堿為碳酸鉀：三乙胺：吡啶為2:1:1，摩爾投料比為1:3:2，反應(yīng)溫度為70℃，反應(yīng)時間為6h的條件下，收率為95.3％，收率最高，并且改變上述任何一個條件都會對收率產(chǎn)生巨大影響。表3第三步工藝條件和結(jié)果由表3可知工藝條件對產(chǎn)物的收率具有嚴重的影響，選擇合適的工藝條件對產(chǎn)物收率具有重要的影響。由表3可知第四溶劑采用二氯甲烷：甲苯為2:1，摩爾投料比為1:3，反應(yīng)溫度為70℃，反應(yīng)時間為12h的條件下，收率為97.8％，收率最高，并且改變上述任何一個條件都會對收率產(chǎn)生巨大影響。實施例16具體工藝條件與實施例7相同，不同之處再與考察不同取代基，具體取代基見表4，所得4-胺烷氧基-3-甲氧基肉桂酸苯酰胺類化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)均經(jīng)1H-NMR，13C-NMR和ESI-MS確證。表4不同取代基實驗實施例17一種4-胺烷氧基-3-甲氧基肉桂酸苯酰胺類化合物的藥學(xué)上可接受的鹽的制備方法，包括以下步驟：分別取表4中的4-胺烷氧基-3-甲氧基肉桂酸苯酰胺類化合物和丙酮攪拌均勻后加入相應(yīng)的酸，升溫回流攪拌反應(yīng)15-30分鐘，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，減壓蒸除溶劑，殘余物用丙酮重結(jié)晶，過濾析出的固體，即得4-胺烷氧基-3-甲氧基肉桂酸苯酰胺類化合物的藥學(xué)上可接受的鹽，其化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)1HNR、13CNMR和ESI-MS確證。實施例18采用實施例7所制備的產(chǎn)物進行生物活性篩選實驗(1)乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶抑制活性向96孔板中依次加入1.0mmol/L碘化硫代乙酰膽堿或硫代丁酰膽堿(均購自Sigma公司)30μL，pH7.4的PBS緩沖液40μL，待測化合物溶液20μL(DMSO含量小于1％)和10μL乙酰膽堿酯酶(大鼠腦皮層5％勻漿上清液，pH7.4的磷酸緩沖液作勻漿介質(zhì))，加畢混勻后，37℃孵育15min，向各孔中加入質(zhì)量分數(shù)為0.2％的5,5'-二硫代-雙(2-硝基)苯甲酸(DTNB，購自Sigma公司)溶液30μL顯色，用酶標儀測定405nm處各孔的光密度(OD值)，與不加待測樣品的空白孔比較，計算化合物對酶的抑制率[酶抑制率＝(1－樣品組OD值/空白組OD值)×100％]；選擇化合物的五至六個濃度，測定其酶抑制率，并以該化合物摩爾濃度的負對數(shù)與酶的抑制率線性回歸，求得50％抑制率時的摩爾濃度即為該化合物的IC50。測定結(jié)果表明，本發(fā)明實施例中所公開的化合物對乙酰膽堿酯酶均具有顯著抑制作用，其IC50為0.01μM～5μM，而陽性對照藥物——Rivastigmine對乙酰膽堿酯酶抑制的IC50為6.3μM；測定結(jié)果還表明，本項目實施例中所公開的化合物對乙酰膽堿酯酶的抑制活性大大高于對丁酰膽堿酯酶的抑制活性，說明本發(fā)明所公開的化合物對乙酰膽堿酯酶具有一定的選擇性抑制作用。(2)化合物對H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞損傷的保護作用篩選PC12細胞用含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，以1×105個/mL密度接種于96孔培養(yǎng)板上，接種體積為100mL/孔，隨后放入含5％CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時后，給藥組中加相應(yīng)濃度的化合物(終濃度為10-5mol/L，10-6mol/L)10mL/孔，預(yù)孵育2小時(對照組與損傷組分別加10μL/孔PBS，使其體積保持相等)。PC12細胞孵育2小時后，在給藥組與損傷組中分別加入100μΜH2O2損傷劑10μL/孔(對照組加10μL/孔PBS)，30分鐘后，將各組的培養(yǎng)液均換成無小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液繼續(xù)放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時，培養(yǎng)液體積認為100μL/孔。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，各組加入5mg/mL，MTT100μL/孔，進行活細胞染色。待3小時后，各組中加入100％DMSO終止液100μL/孔，充分溶解混勻。在490nm的波長下測定各組的OD值，測試結(jié)果重復(fù)3次，用Duncan’stest方法統(tǒng)計，各組數(shù)值表示為均數(shù)±S.E.M.，以對照組為100％，給藥組及損傷組值以對照組的百分比表示。測定結(jié)果表明，本發(fā)明實施例中所公開化合物對過氧化氫誘導(dǎo)的PC12細胞損傷均有顯著的保護作用，且在10-5mol/L濃度下的抗氧化活性均強于阿魏酸。(3)化合物抑制Aβ聚集活性測定取20μL的Aβ1-42溶液+20μL的待測化合物溶液、20μL的Aβ1-42溶液+20μLPBS緩沖液(含2％DMSO)、20μLPBS緩沖液(含2％DMSO)+20μLPBS緩沖液(含25％DMSO)于黑色96孔板中，化合物和Aβ1-42的最終濃度均為25μM。37℃孵育24h，然后加入160μL含有5μM硫黃素T的50mM的甘氨酸-NaOH緩沖液(pH＝8.5)，振搖5s后立即用VarioskanFlashMultimodeReader(ThermoScientific)多功能酶標儀在446nm激發(fā)波長和490nm發(fā)射波長下測定熒光值；Aβ1-42+待測化合物的熒光值記錄為IFi，Aβ1-42+PBS緩沖液的熒光值記錄為IFc，只含有PBS緩沖液的熒光值記錄為IF0，由化合物抑制Aβ1-42自身聚集的抑制率計算公式為：100-(IFi-IF0)/(IFc-IF0)*100。每個化合物每個濃度測定兩個復(fù)孔。測定結(jié)果表明，本發(fā)明實施例中所公開的化合物對Aβ1-42自身誘導(dǎo)的聚集均具有顯著抑制作用，其IC50為0.1μM～20μM，抑制率65-90％，而陽性對照藥物——姜黃素和阿魏酸在25μM濃度下對Aβ1-42自身誘導(dǎo)聚集的抑制率分別為56.2％和28.3％。(4)血腦屏障透過能力評價(PAMPA-BBB)將豬腦磷脂(PBL，購自AvantiPolarLipids,Inc.)溶在十二烷(Sigma)中(20mg/mL)，取4μL滴加在受體孔的親脂性濾膜上以模擬生物膜。在受體孔中加入350μLPBS/EtOH(70:30)緩沖液，在供體孔中加入200μL樣品液(化合物溶解在DMSO中得到5mg/mL儲備液，再用50倍PBS/EtOH(70:30)緩沖液稀釋至最終濃度為100mg/mL。放置96孔濾板于PVDF接收板(Millipore)上，使磷脂膜能剛好接觸到供體液，如此形成三明治結(jié)構(gòu)-底部是待測物的供體液，中間是人工磷脂膜，待測藥物分子從供體孔中擴散，穿過磷脂膜，進入到上層受體孔中。25℃靜止18h，孵育完畢后，輕輕移走供體板，分別吸取受體液和供體液，用VarioskanFlashMultimodeReader酶標儀測定濃度，每個樣品四孔，獨立測試三次，測試10個波長(250-450nm)下的OD值，依據(jù)公式得出有效透過率(Pe)。PAMPA有效滲透率Pe(cm·s-1)計算如下：Pe＝-VdVa/[(Vd+Va)At]ln(1-drugacceptor/drugequilibrium)其中，Vd是供體孔的體積，Va是受體孔的體積，A是人工磷脂膜的面積，t表示滲透時間，drugacceptor是供體孔液體的吸光度，drugequilibrium是理論平衡吸光度，結(jié)果以均值±標準誤差(Standerror,S.E.)表示。測試結(jié)果表明，在該實驗條件下本發(fā)明所公開的化合物均具有良好的血腦屏障透過能力，且強于阿魏酸。(5)化合物對東莨菪堿所致小鼠記憶獲得障礙的影響SPF級ICR雄性小鼠，25-30g，隨機分為：正常組、模型組、受試藥高、低劑量組(5.0、2.5mg/kg)，每組10只動物。一次性灌胃給予受試藥物，空白組和模型組給予溶媒0.5％CMC-Na，給藥體積均為0.1ml/10g；藥后45min，正常組小鼠腹腔注射生理鹽水，其余各組動物均注射東莨菪堿(5mg/kg)，給藥體積均為0.1ml/10g；造模30min后，將小鼠放入非電刺激Y迷宮進行行為學(xué)測試。測試時將小鼠放于一臂末端，讓其在迷宮內(nèi)自由穿行8min，記錄其進入各臂的次數(shù)和交替次數(shù)，按照以下公式計算交替率：交替率％＝[交替次數(shù)/(總進入次數(shù)-2)]×100，結(jié)果以均數(shù)±標準差表示，組間差異采用單因素方差分析。測定結(jié)果表明，在該實驗條件下，本發(fā)明所公開的化合物對東莨菪堿致小鼠獲得記憶障礙具有劑量依賴性的改善作用，與模型組比較均具有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.01)。行為實驗完畢立即將小鼠斷頭取腦，用預(yù)冷生理鹽水沖洗，在冰盒上迅速分離出腦海馬組織，稱取海馬組織重量，加9倍4℃生理鹽水制成10％的勻漿，3500r.min-1，4℃離心15min，-20℃儲存上清液待測，通過考馬斯亮藍測定總蛋白濃度。按照試劑盒規(guī)定的方法在412nm的波長下測定AChE含量，AChE活力表示為U/mg。ChAT的活力通過ChAT催化的ACh合成反應(yīng)來測定。操作方法同樣根據(jù)試劑盒的說明，在412nm波長下測定，ChAT的活力用U/mg來表示。測定結(jié)果表明，在該實驗條件下，本發(fā)明所公開的化合物能夠增強乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)的活力，與空白組比較均具有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.01)。(6)化合物對乙醇所致小鼠記憶再現(xiàn)障礙的影響SPF級ICR雄性小鼠，25-30g，隨機分為：正常組、模型組、受試藥高、低劑量組(5.0、2.5mg/kg)、卡巴拉汀組(3mg/kg)，每組10只動物。每天灌胃給受試藥物，空白組和模型組給予溶媒0.5％CMC-Na，給藥體積均為0.1ml/10g，連續(xù)給藥32天；在給藥1～24天期間，每日藥后30min，模型組和各給藥組灌胃0.1ml/10g乙醇(15％w/v)，連續(xù)給藥24天，撤掉乙醇進入乙醇洗凈期，藥物繼續(xù)給予；于給藥的31、32天進行動物跳臺實驗，藥后45min進行訓(xùn)練或測試實驗，訓(xùn)練時讓小鼠置于跳臺儀中，輕放于平臺上通電，當(dāng)動物從臺上調(diào)下時以雙足同時接觸銅柵為觸電，視為錯誤反應(yīng)，小鼠受到電擊后的正?；乇芊磻?yīng)為逃避到平臺上，記錄小鼠逃避至平臺上的潛伏期，并記錄5min內(nèi)觸電次數(shù)，以此作為學(xué)習(xí)成績。24小時后進行測試，記錄小鼠第一次跳下受電擊的時間(潛伏期)及其5min內(nèi)受電擊的次數(shù)(錯誤次數(shù))，以此作為記憶再現(xiàn)功能評價指標。測試結(jié)果以均數(shù)±標準差表示，組間差異采用單因素方差分析。測試結(jié)果表明，在該實驗條件下本發(fā)明所公開的化合物對乙醇所致小鼠記憶再現(xiàn)功能障礙均具有明顯改善作用，與模型組相比均有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.01)。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。