合成環(huán)氧琥珀酸鈣懸濁液的方法和生產(chǎn)L-(+)-酒石酸的方法技術領域本發(fā)明屬于生物催化制備有機酸領域，具體說是合成環(huán)氧琥珀酸鈣懸濁液的方法以及利用該懸濁液生產(chǎn)L-(+)-酒石酸的方法。

背景技術：
L-(+)-酒石酸是一種天然有機酸，是一種重要的食品添加劑和化工原料。傳統(tǒng)的酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-(+)-酒石酸一般以順式環(huán)氧琥珀酸鈉為催化底物，在順式環(huán)氧琥珀酸水解酶(ESH)的催化作用下，生成L-(+)-酒石酸鈉，然后再采用鈣鹽法來提取L-(+)-酒石酸(即，在含有L-(+)-酒石酸鈉的轉(zhuǎn)化液中加入鈣中和劑使之生成L-(+)-酒石酸鈣，經(jīng)反復結(jié)晶、洗凈后加入硫酸酸解提取L-(+)-酒石酸，并需通過活性炭脫色、離子交換去除雜離子后才可得到精純產(chǎn)品)。該方法原料成本較高，且產(chǎn)生大量的含高濃度鈉離子的廢水。

技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明以順式環(huán)氧琥珀酸鈣鹽為催化底物，使之在順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的催化作用下直接生成L-(+)-酒石酸鈣。為克服傳統(tǒng)的順式環(huán)氧琥珀酸鈣批次轉(zhuǎn)化效率低等缺陷，本發(fā)明采用連續(xù)流加的方式，并在順式環(huán)氧琥珀酸鈣轉(zhuǎn)化過程中加入硫酸鈉助溶劑，使得反應體系中的各種離子處于“順式環(huán)氧琥珀酸鈣-硫酸鈣-順式環(huán)氧琥珀酸鈉-硫酸鈉”的動態(tài)平衡狀態(tài)，進而提高了順式環(huán)氧琥珀酸鈣的轉(zhuǎn)化效率及L-(+)-酒石酸的生產(chǎn)效率。該方法不僅在化學合成步驟減少了碳酸鈉、氫氧化鈉的使用，還減少了含鈉離子廢水的排放，可以大大降低L-(+)-酒石酸的生產(chǎn)成本以及可能造成的環(huán)境污染。本發(fā)明第一方面的目的在于提供一種順式環(huán)氧琥珀酸鈣懸濁液的合成方法，該方法包括以下步驟：步驟(1)：將順丁烯二酸酐和碳酸鈣在預熱后的水中攪拌混勻；步驟(2)：向步驟(1)得到的混合液中加入鎢酸鈉催化劑，并流加雙氧水，于加熱條件下保溫；步驟(3)：將步驟(2)得到的反應液用氫氧化鈣調(diào)節(jié)pH至堿性，得到所述順式環(huán)氧琥珀酸鈣懸濁液。本發(fā)明第二方面的目的在于提供一種生產(chǎn)L-(+)-酒石酸的方法，該方法包括以下步驟：步驟(4)：向加入有硫酸鈉助溶劑的反應釜中連續(xù)流加通過權利要求1-4中任一項所述的方法制得的順式環(huán)氧琥珀酸鈣懸濁液，同時加入順式環(huán)氧琥珀酸水解酶催化劑，于37℃下攪拌，產(chǎn)生L-(+)-酒石酸鈣懸濁液；步驟(5)：從步驟(4)得到的L-(+)-酒石酸鈣懸濁液中分離出固態(tài)的L-(+)-酒石酸鈣粗產(chǎn)品，然后用硫酸酸解，再分離去除硫酸鈣，最后經(jīng)純化步驟制得最終產(chǎn)品L-(+)-酒石酸。有益效果本發(fā)明直接以順式環(huán)氧琥珀酸鈣鹽為催化底物來生產(chǎn)L-(+)-酒石酸，相比于傳統(tǒng)的順式環(huán)氧琥珀酸鈉鹽催化工藝，具有如下特點和優(yōu)點：(1)兩種催化工藝均以順丁烯二酸酐為初始原料，但在環(huán)氧底物合成過程中，本發(fā)明所采用的工藝無需使用碳酸鈉、氫氧化鈉。傳統(tǒng)鈉鹽工藝的反應流程示意圖如下：本發(fā)明鈣鹽工藝的反應流程示意圖如下：(注：原料順丁烯二酸實際是以酸酐的形式存在)(2)本發(fā)明采取的L-(+)-酒石酸生產(chǎn)方法，由于無需鈣鹽沉淀步驟，因此，減少了一個操作單元。(3)本發(fā)明采取的L-(+)-酒石酸生產(chǎn)方法，由于采用連續(xù)流加模式，并引入硫酸鈉助溶劑，提高了L-(+)-酒石酸的生產(chǎn)效率。(4)本發(fā)明采取的L-(+)-酒石酸生產(chǎn)方法，由于在底物合成時無需使用鈉鹽，且硫酸鈉助溶劑可以反復套用，因此降低了原料成本。同時，其廢水中不含有高濃度的鈉鹽，減少了排放量，降低了生產(chǎn)成本。表1：本發(fā)明所采用的鈣鹽轉(zhuǎn)化工藝與傳統(tǒng)鈉鹽轉(zhuǎn)化工藝的主要原料投入/產(chǎn)出(均為理論值，以生產(chǎn)每噸L-(+)-酒石酸計)綜上所述，本發(fā)明具有顯著的工業(yè)應用價值和環(huán)境效益。附圖說明圖1示出了在現(xiàn)有技術的實施方式中，利用鈉鹽轉(zhuǎn)化工藝制備L-(+)-酒石酸時的主要操作單元。圖2示出了在本發(fā)明的一個實施方式中，利用鈣鹽轉(zhuǎn)化工藝制備L-(+)-酒石酸時的主要操作單元。具體實施方式在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，步驟(1)中使用順丁烯二酸酐與碳酸鈣的摩爾比為1:1至1:0.5。當二者的摩爾比為1:1時，在步驟(2)后得到的反應液的主要成分為順式環(huán)氧琥珀酸鈣；當二者的摩爾比為1:0.5時，在步驟(2)后得到的反應液的主要成分為順式環(huán)氧琥珀酸氫鈣；當二者的摩爾比在1:1至1:0.5之間(不含端值)時，在步驟(2)后得到的反應液的主要成分為順式環(huán)氧琥珀酸氫鈣和順式環(huán)氧琥珀酸鈣的混合物。無論哪種情況，將上述反應液在步驟(3)中用氫氧化鈣調(diào)節(jié)pH至堿性(例如8.5～9.0)后，都會得到堿性的順式環(huán)氧琥珀酸鈣懸濁液。在一個實施方式中，步驟(1)中使用的預熱后的水的溫度為52-58℃、優(yōu)選55℃。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，相對于1重量份的鎢酸鈉催化劑，步驟(1)中使用的順丁烯二酸酐為400重量份，和/或步驟(2)中使用的雙氧水以H2O2分子計為1512.5重量份。優(yōu)選地，雙氧水的質(zhì)量濃度為27.5％。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，步驟(2)中雙氧水的流加時間為25-40min、優(yōu)選30min?；谏鲜隽骷訒r間，可根據(jù)反應體系的規(guī)模對流加速度進行具體控制。例如，對于反應體系的體積為5L的實驗室規(guī)模，雙氧水的流加速度可為2.5-3.5L/h、優(yōu)選3L/h；對于反應體系的體積為2000L級別的中試規(guī)模，雙氧水的流加速度可為800～1000L/h。如果流加時間過短、流加速度過快，可能會造成反應體系的局部放熱過多，使合成的環(huán)氧琥珀酸鈣發(fā)生酸水解和/或熱水解，從而生成外消旋的酒石酸，即等比例的L-(+)-酒石酸和D-(-)-酒石酸混合物；如果流加時間過長、流加速度過慢，則會使得整個反應工藝的效率降低。因此，在這一優(yōu)選的實施方式中，之所以對步驟(2)中的雙氧水流加時間和流加速度進行控制，是為了保證反應更安全、順暢、高效地進行。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，步驟(2)中的保溫在65～69℃的溫度下進行。在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方式中，步驟(2)中的保溫進行的時間為至少3h、優(yōu)選至少4.5h。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，加入到所述反應釜中的所述硫酸鈉助溶劑的濃度為1.2M。在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方式中，步驟(4)中所述順式環(huán)氧琥珀酸鈣懸濁液的流加速度為0.5L/h。在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方式中，步驟(4)在200rpm的攪拌下進行。通過順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的催化作用，將順式環(huán)氧琥珀酸鈣轉(zhuǎn)化為L-(+)-酒石酸鈣在本領域中是已知的，因而其中所使用的酶對于本領域技術人員而言也是已知的，例如在Wangetal.發(fā)表的文章Purificationandcharacterizationofacis-epoxysuccinicacidhydrolasefromNocardiatartaricansCAS-52,andexpressioninEscherichiacoli(ApplMicrobiolBiotechnol(2013)97:2433–2441)中公開的ESH。在本發(fā)明中，“順式環(huán)氧琥珀酸水解酶催化劑”這一術語既可以表示游離的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶，也可以表示產(chǎn)順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的菌體細胞(野生菌或大腸桿菌工程菌)?？捎糜诒景l(fā)明的菌體細胞在本領域中也是已知的，例如在US4,017,362專利中公開的諾卡氏菌、Willaertetal.發(fā)表的文章ContinuousproductionofL-(+)-tartaricacidfromcis-epoxysuccinateusingamembranerecyclereactor(ApplMicrobiolBiotechnol(2006)71:155–163)中公開的紅球菌、以及Wangetal.發(fā)表的文章Expressionandproductionofrecombinantcis-epoxysuccinatehydrolaseinEscherichiacoliunderthecontroloftemperature-dependentpromoter(JBiotechnol(2012)162:232-236)中公開的大腸桿菌工程菌等。特別是在本發(fā)明的實施例和對比例中，所使用的是大腸桿菌工程菌菌體細胞，具體例如通過如下方法制備：將能夠?qū)-ESH進行編碼的基因片段連接至質(zhì)粒載體上，并導入E.coli細胞，獲得重組工程菌。工程菌的宿主細胞為北京全式金生物技術有限公司以商品名BL21ChemicallyCompetentCell銷售的大腸桿菌感受態(tài)細胞，表達質(zhì)粒為上海閃晶分子生物科技有限公司以商品名pBV220銷售的質(zhì)粒載體，編碼基因例如GenBank數(shù)據(jù)庫中注冊號為JQ267565的DNA片段(具體為下述SEQIDNO：1)。SEQIDNO：1ATGCAACTGAACAATGCGAACGACAACACGCAGTTCCGGGCCCTGCTTTTCGACGTGCAGGGGACTCTGACAGATTTCCGTTCCACACTCATCGAGCACGGCTTATCGATTCTCGGAGACAGAGTGGATCGAGAACTCTGGGAGGAATTGGTCGACCAATGGCGCGGCTGCTATCGAGACGAGCTCGATTCCTTGGTCAAACAGGAGAAATGGCGCTCGGTCCGCGCCGTGTACCGAGATTCTCTTATCAATCTTCTCGCAAAATTCTCTGACAGTTTCTGCGCCACCTCGGCCGAAGTGGAATTGCTGACCGATGGTTGGGAACGTCTTCGGTCGTGGCCGGACGTCCCCTCTGGATTGGAACAGCTGCGGTCTAAGTACCTCGTCGCGGCACTGACGAATGCGGACTTTTCTGCCATCGTCAACGTCGGGCGTAGCGCCAAACTGCAATGGGACGCTGTTCTTTCAGCTCAACTCTTTGGAGCCTACAAGCCCCACCGGTCAACATATGAGGGAGCCGCGACACTCCTGGGTATCGCTCCGTCAGAGATCCTCATGGTCGCCTCCCATGCATACGATCTCGAAGCGGCGCGGGAAGTGGGAGCCGGCACAGCGTACGTCAGACGGCCACTGGAATACGGACCGACGGGGCGAACCGAGGACGTTCCCGATGGACGTTTCGATTTCTTGGTCGACAGCATCAGTGAACTGGCTGATCAGCTGGGCTGCCCACGACTCGGTGGAACTGCCGGTATCGATTGA在一個優(yōu)選的實施方式中，順式環(huán)氧琥珀酸水解酶催化劑的用量為160-300酶活力/100mL底物，優(yōu)選240U酶活力/100mL底物。對于順式環(huán)氧琥珀酸水解酶催化劑為游離ESH的情況，上述用量即表示ESH本身的用量。對于順式環(huán)氧琥珀酸水解酶催化劑為產(chǎn)ESH的菌體細胞的情況，則意味著根據(jù)該菌體細胞的產(chǎn)酶能力進行折算，使得所產(chǎn)出的ESH滿足上述用量。在本發(fā)明的一個實施方式中，步驟(5)中的兩次分離相互獨立地采用帶濾機和/或離心機進行。在本發(fā)明的一個實施方式中，步驟(5)中的純化步驟是指常規(guī)的濃縮、結(jié)晶、干燥等步驟。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，硫酸鈉助溶劑可以反復套用(即，將硫酸鈉助溶劑從所述步驟(5)的廢液中回收，并重新用于所述步驟(4))，從而減少了排放量。實施例接下來，通過實施例對本發(fā)明進行進一步詳細地說明，但本發(fā)明不僅限于這些實施例。實施例1順式環(huán)氧琥珀酸鈣懸濁液的合成將2.5L純凈水預熱至55℃，然后加入0.8kg順丁烯二酸酐，用機械攪拌器攪拌，并緩慢加入0.8kg碳酸鈣，待其充分混合后，加入2g鎢酸鈉，同時流加雙氧水(3L/h，共1.5L，含量為27.5％)，然后，將溫度升至65～69℃之間，保溫反應約4.5h后結(jié)束，得到約4.5L順式環(huán)氧琥珀酸鈣懸濁液。硫酸鈉助溶劑促進順式環(huán)氧琥珀酸鈣的連續(xù)催化水解首先在轉(zhuǎn)化反應釜中加入2L1.2M的硫酸鈉助溶劑，然后將上一步驟中所制得的順式環(huán)氧琥珀酸鈣懸濁液以0.5L/h連續(xù)流加入反應釜中，同時加入一定量的產(chǎn)順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的大腸桿菌工程菌(按照其所能產(chǎn)生的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶折算，加入量為240U酶活力/100mL底物)，控制反應溫度為37℃，攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，利用酶的催化作用產(chǎn)生L-(+)-酒石酸鈣懸濁液。L-(+)-酒石酸鈣形成L-(+)-酒石酸將上一步驟中所制得的L-(+)-酒石酸鈣懸濁液送入帶濾機，分離出固態(tài)的L-(+)-酒石酸鈣粗產(chǎn)品，然后用硫酸酸解，再利用帶濾機分離去除硫酸鈣，然后經(jīng)濃縮、結(jié)晶、干燥等步驟，得到最終產(chǎn)品L-(+)-酒石酸。總體工藝流程如圖2所示。整個反應過程中L-(+)-酒石酸的平均產(chǎn)率為18.25g/(L·h)，ESH的催化效率為7.84×10-3g/(U·h)。對比例1：反應時間對順式環(huán)氧琥珀酸鈣合成的影響按照與實施例1相同的物料比和反應溫度合成順式環(huán)氧琥珀酸鈣懸濁液，考察不同反應時間對順式環(huán)氧琥珀酸鈣合成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當反應時間為3h時，約有30％的順丁烯二酸酐殘留，反應進行不徹底；當反應時間大于4.5h時，反應進行的很徹底，順丁烯二酸酐的反應率達到98.5％以上。對比例2：反應溫度對順式環(huán)氧琥珀酸鈣合成的影響按照與實施例1相同的物料比和反應時間合成順式環(huán)氧琥珀酸鈣懸濁液，考察不同反應溫度對順式環(huán)氧琥珀酸鈣合成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當溫度低于65℃時，反應進行的不徹底，順丁烯二酸酐的殘留達到20％；當溫度高于69℃時，反應可以完成進行，但由于溫度過高，會導致產(chǎn)物順式環(huán)氧琥珀酸鈣的水解，形成外消旋的酒石酸鈣，即等量的D-(-)-酒石酸鈣和L-(+)-酒石酸鈣，從而影響最終產(chǎn)品的純度和質(zhì)量。由順丁烯二酸酐的反應率和產(chǎn)物順式環(huán)氧琥珀酸鈣的水解角度來看，順式環(huán)氧琥珀酸鈣的最適反應溫度為65-69℃。對比例3：順式環(huán)氧琥珀酸鈣的單一批次轉(zhuǎn)化按照與實施例1相同的方式進行順式環(huán)氧琥珀酸鈣懸濁液的合成。將上一步驟中所制得的順式環(huán)氧琥珀酸鈣懸濁液加入反應釜中，同時加入一定量的產(chǎn)順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的大腸桿菌工程菌(按照其所能產(chǎn)生的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶折算，加入量為240U酶活力/100mL底物)，控制反應溫度為37℃，攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，利用酶的催化作用產(chǎn)生L-(+)-酒石酸鈣懸濁液。上述過程以單一批次進行。按照與實施例1相同的方式，由上一步驟中所制得的L-(+)-酒石酸鈣懸濁液得到最終產(chǎn)品L-(+)-酒石酸。整個反應過程中L-(+)-酒石酸的平均產(chǎn)率為6.25g/(L·h)，ESH的催化效率為1.26×10-3g/(U·h)。對比例4：不使用硫酸鈉助溶劑情況下的連續(xù)催化水解按照與實施例1相同的方式進行順式環(huán)氧琥珀酸鈣懸濁液的合成。將上一步驟中所制得的順式環(huán)氧琥珀酸鈣懸濁液連續(xù)流加入反應釜中(50L/h)，同時加入一定量的產(chǎn)順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的大腸桿菌工程菌(按照其所能產(chǎn)生的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶折算，加入量為240U酶活力/100mL底物)，控制反應溫度為37℃，攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，利用酶的催化作用產(chǎn)生L-(+)-酒石酸鈣懸濁液。按照與實施例1相同的方式，由上一步驟中所制得的L-(+)-酒石酸鈣懸濁液得到最終產(chǎn)品L-(+)-酒石酸。整個反應過程中L-(+)-酒石酸的平均產(chǎn)率為11.25g/(L·h)，ESH的催化效率為4.69×10-3g/(U·h)。由L-(+)-酒石酸的平均產(chǎn)率和ESH的催化效率可見，相比于順式環(huán)氧琥珀酸鈣的單批次轉(zhuǎn)化效率和無助溶劑時的連續(xù)轉(zhuǎn)化效率，本發(fā)明所述方法的轉(zhuǎn)化效率明顯更高。